转录因子KLF9在IFITM3基因转录调控中的用途

转录因子klf9在ifitm3基因转录调控中的用途
技术领域
1.本发明属于基因工程领域，具体涉及转录因子klf9在ifitm3基因转录调控中的用途。


背景技术：

2.阿尔茨海默病(ad)是目前形势最为严峻的神经退行性疾病，影响着全世界数百万人。导致ad的神经病理学改变有许多，β-淀粉样蛋白(aβ)沉积和神经原纤维缠结(tau)是其中最主要的。aβ是β-分泌酶1(bace1)和γ-分泌酶对淀粉样蛋白前体蛋白(app)连续切割后产生的。由早老素(ps1)、nicastrin(nct)、aph-1和pen-2四个亚基组成的膜内蛋白酶复合物γ-分泌酶是aβ产生的关键环节。值得注意的是，编码ps1的基因中有200多个突变，而ps1作为γ-分泌酶成分之一则会导致其活性明显降低，从而影响app的加工和aβ的生成，最终导致大多数家族性ad(fad)病例。由此可见，在ad的发病机制中，γ-分泌酶起着至关重要的作用，目前以γ-分泌酶作为靶点的药物已被众多研究者所关注。
3.在病毒入侵宿主细胞后，细胞内产生干扰素(interferons，ifns)进而激活jak-stat信号，该信号通路通过促进干扰素刺激基因(ifn-stimulated genes，isgs)的广泛表达，从而阻止病毒的入侵。干扰素诱导跨膜蛋白(interferon-induced transmembrane protein，ifitm)家族是一类比较保守的isg，主要存在于胞质膜和内溶酶体膜上。ifitm家族有很多成员，人类主要是分ifitm1、ifitm2、ifitm3、ifitm5和ifitm10，但这ifitm5和ifitm10不被ifns所诱导。这些家族成员都具有2个外显子和1个内含子这样简单的基因结构。根据氨基酸序列和蛋白功能可将ifitm蛋白分为三类:第一类为免疫相关膜蛋白，比如ifitm1、ifitm2和ifitm3。第二类为ifitm5，与骨骼形成有关。第三类ifitm为ifitm10，其作用还有待研究。
4.干扰素诱导的跨膜蛋白3(ifitm3)是ifitm家族中最活跃的异构体。主要存在于核内体和溶酶体,可以被i、ii型干扰素强烈诱导，能够抵制多种病毒的入侵。此外，携带ifitm3的rs12252-c等位基因的个体，在甲型h1n1等病毒感染中显示出发病率和死亡率的增加。还有研究发现ifitm3在某些癌症中也有着较高的表达水平，且能影响癌组织的病理分级和分期。
5.kr
ü
ppel-like(klf)转录因子家族是细胞发育、分化和激活的重要调控因子。klf9作为家庭的一员,在其c端也有三个保守的c2h2锌指结构域，识别基因启动子和增强子中的“caccc”序列和gc盒的序列。n端有一个sid结构域，使其能够与支架辅阻遏子蛋白sina相互作用而激活转录。此外，klf9对于齿状颗粒神经元的晚期成熟是必需的，并有助于齿状回(dg)依赖的学习。
6.之前的研究已经将大脑中的某些病毒与ad联系起来，并指出aβ沉积可由多种病原体诱导。最近的研究表明，ifitm3作为γ-分泌酶的成分之一，能够上调其活性，进一步使aβ生成增多。所以我们有理由相信，在一定程度上病毒感染可以通过影响ifitm3的转录调控从而影响ad病理。但病毒感染如何影响ifitm3尚不清楚。我们推测，在病毒感染后可能产生
了一些转录因子影响了ifitm3的转录调控。


技术实现要素：

7.本发明所要解决的技术问题为：我们旨在探究转录因子klf9在ifitm3基因转录调控中的作用。
8.本发明的技术方案为：转录因子klf9或其编码基因在制备调控ifitm3基因表达的产品上的用途。
9.进一步地，所述转录因子klf9的氨基酸序列如seq id no.1所示。
10.进一步地，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
11.进一步地，所述调控为过表达转录因子klf9，从而上调ifitm3基因的启动子活性或ifitm3基因转录水平或ifitm3蛋白表达水平。
12.进一步地，所述ifitm3基因为人ifitm3基因。
13.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
14.在我们的研究中，我们首次提出了klf9能增强ifitm3基因转录的发现。通过分析启动子上游的一系列缺失，我们发现-1000～+47区域表现出启动子活性，-300～-200区域在ifitm3的表达调控中起重要作用。此前已有研究报道klf9可以识别启动子中的caccc序列。软件分析显示-300～-200区域存在一个klf9结合位点“ctggggtgtggag”。随后的emsa实验证实了klf9与该区域的物理结合。在klf9存在的情况下，ifitm3基因的启动子活性在mcf-7细胞中显著升高，而pifitm3-d位点定向突变失去了与klf9结合的能力，也显著降低了ifitm3基因的启动子活性。与ifitm3启动子荧光素酶检测结果一致，klf9过表达也增加了mcf-7细胞和u251细胞中ifitm3基因的内源性mrna和蛋白水平。这些结果表明klf9在人类ifitm3基因转录调控中发挥着重要作用。
15.综上所述，我们的研究表明ifitm3基因表达在转录水平上受到严格调控，其中klf9发挥着重要作用。它为ad的发病机制提供了新的见解。
附图说明
16.图1.ifitm3基因启动子区域不同长度的删切质粒构建示意图(以exon1第一个碱基为+1)。将一系列ifitm3基因启动子删切片段克隆到pgl4-basic载体中。tss为转录起始位点，
“→”
代表基因的转录方向，数字代表该片段的起始和终止的位置。
17.图2.ifitm3基因启动子删切质粒荧光素酶活性检测结果。结果用均值
±
标准误表示，每组进行至少3次独立重复实验，用one-way anova方法统计，*表示p《0.05vs pgl4.10组。
18.图3.ifitm3基因启动子区转录因子预测。+1为exon1的第一个碱基，下划线为相应的转录因子结合位点序列。
19.图4.过表达klf9可以上调ifitm3基因的mrna水平。结果用均值
±
标准误表示。每组进行3次独立实验，用student’s t-test和one-way anova方法统计，**表示p＜0.01，*表示p＜0.05vs对照组。
20.图5.过表达klf9可以上调ifitm3基因启动子的活性。结果用均值
±
标准误表示。每组进行3次独立实验，用one-way anova方法统计，*表示p＜0.05vs对照组。
21.图6.ifitm3基因启动子dna片段的凝胶迁移实验。
22.图7.过表达klf9可上调ifitm3基因的翻译。a、b分别是mcf-7和u-251细胞系中的结果。结果用均值
±
标准误表示。每组进行3次独立实验，用student’s t-test方法统计，**表示p＜0.05vs对照组。
具体实施方式
23.1材料与方法
24.1.1实验材料
25.1.1.1细胞
26.本研究中所用到的hek293t细胞来自宋伟宏教授ubc实验室，mcf-7和u-251细胞来自atcc细胞库。
27.1.1.2主要试剂配方
28.(1)lb培养基(液)
[0029][0030]
若是需要得到固体lb培养基，则需在上述基础上加入agar 1.5g。称量后用ddh2o定容至100ml，高压灭菌，然后按照0.1％比例加入氨苄青霉素，4℃保存。
[0031]
(2)质粒小提试剂
[0032]
p1：称取6.06g的tris base和3.72g的na2edta充分溶解于ddh2o中，naoh调节ph到8.0，然后ddh2o定容至1l，最后加入100mg rnasea，0.22μm过滤器过滤，4℃保存。
[0033]
p2：称取8.0gnaoh溶于950ml ddh2o中，加入50ml 20％sds，0.22μm过滤器过滤后，常温保存。
[0034]
p3：称取ch3cook 294.5g，用ddh2o充分溶解，加入ch3cooh调节ph至5.5，然后ddh2o定容至1l，0.22μm过滤器过滤后，常温保存。
[0035]
(3)10％细胞培养基
[0036][0037]
置于50ml离心管中，4℃保存。
[0038]
(4)running buffer
[0039][0040]
两种都用ddh2o定容至1l，常温保存。
[0041]
(5)transfer buffer
[0042][0043]
两种都用ddh2o定容至1l，4℃保存。
[0044]
(6)5
×
tge
[0045][0046]
配好后用ddh2o溶解，调节ph至8.5，然后定容至1l，常温保存。
[0047]
1.2实验方法
[0048]
1.2.1ifitm3基因相关质粒构建
[0049]
(1)ifitm3基因表达质粒的引物设计
[0050]
利用dnaman软件对ifitm3基因cds区进行酶切位点分析后，选择了pcdna4-myc/hisa载体上的bamhⅰ和xholⅰ两个酶切位点。
[0051]
利用同源重组的方法，将ifitm3基因cds序列插入bamhⅰ和xholⅰ之间，设计引物如下：
[0052][0053]
(2)ifitm3基因启动子区荧光素酶报告基因质粒的引物设计
[0054]
利用dnaman软件对ifitm3基因启动子-1000/+47区域进行酶切位点分析后，选择了pgl4.10载体上的nheⅰ和hindⅲ两个酶切位点。
[0055]
利用同源重组的方法，将ifitm3基因启动子一系列删切序列插入nheⅰ和hindⅲ酶切位点之间，设计引物如下：
[0056][0057][0058]
pifitm3-a、pifitm3-l质粒均为tsingke公司合成，同样以pgl4.10为载体，在nheⅰ和hindⅲ两个酶切位点间插入相应片段。引物如下：
[0059][0060]
(3)ifitm3基因相关序列扩增
[0061]
ifitm3基因cds区扩增以hek293t细胞的cdna为模板；ifitm3基因相关启动子序列扩增以hek293t细胞全基因组dna为模板。pcr体系如下：
[0062][0063]
pcr程序如下：
[0064][0065][0066]
(4)pcr产物胶回收
[0067]
(5)酶切
[0068]
用bamhi和xholi酶切载体pcdna4-myc/hisa，用nhei和hindⅲ酶切载体pgl4.10。酶切体系如下：
[0069][0070]
37℃恒温箱放置4h。
[0071]
(6)酶切产物胶回收，方法同(4)。
[0072]
(7)连接与转化
[0073]
a.连接
[0074]
将胶回收所得的pcr产物与酶切所得的载体相连接。体系如下：
[0075][0076]
插入片段：克隆载体＝2：1
[0077]
x＝[0.02
×
克隆载体碱基对数]ng，50-200ng之间
[0078]
y＝[0.04
×
插入片段碱基对数]ng，20-200ng之间
[0079]
37℃，30min，立即冰浴5min。
[0080]
b.转化
[0081]
1)将a中的连接产物(20μl体系)加入50μl感受态dh5α，冰浴30min。
[0082]
2)42℃，热击90s。
[0083]
3)继续冰浴10min。
[0084]
4)每管加入900μl lb(不加氨苄)。
[0085]
5)将ep管置于摇床上，37℃，250rpm，摇60-90min。
[0086]
6)12000g，1min，离心，弃上清。
[0087]
7)将剩余管底的近100μl混匀后涂在含固体lb(amp+)的培养皿上，置于37℃恒温箱12-16h。
[0088]
(8)挑克隆和质粒小提
[0089]
a.挑克隆
[0090]
1)12-16h后，从恒温箱中取出培养皿，每个质粒随机选取3个单克隆菌落，分别置于3个15ml离心管中，每管加入3ml lb(amp+)。
[0091]
2)将离心管置于摇床上，37℃，250rpm，12-16h。
[0092]
b.质粒小提(非去内)
[0093]
1)将菌液置于1.5ml ep管，12000rcf，1min离心，去上清，如此重复至3ml菌液全部离心完。
[0094]
2)加入p1 200μl，用枪头充分混匀(分散菌)
[0095]
3)加入p2 200μl，混匀，室温静置2min(裂解)
[0096]
4)加入p3 200μl，混匀(去蛋白)
[0097]
5)13000rcf，10min离心
[0098]
6)将5)中的上清约540μl移至ep管，加入300μl异丙醇，混匀，室温静置10min(析出dna)
[0099]
7)13000rcf，12min，离心，去上清
[0100]
8)加入1ml75％乙醇(无水乙醇配制)，用手轻弹沉淀掉落(无需混匀)
[0101]
9)13000rcf，5min，离心，去上清，扣干水分
[0102]
10)用提前65℃金属浴预热的ddh2o溶解，测浓度
[0103]
(9)酶切鉴定
[0104]
根据质粒构建过程中选择的位点限制性内切酶，对待鉴定的质粒进行酶切。体系如下：
[0105][0106][0107]
产物用琼脂糖凝胶显影。
[0108]
(10)酶切鉴定后，将连接成功的质粒送擎科公司测序。将测序结果在snapgene软件上比对分析，若序列正确，说明构建成功。质粒于-20℃保存。
[0109]
(11)质粒快转及去内毒素提取
[0110]
a.快转：
[0111]
1)将测序正确的质粒吸取1μl于1.5ml ep管中，加入10μl感受态dh5α
[0112]
2)冰浴5min，42℃热击90s，再冰浴5min
[0113]
3)将液体涂于lb培养皿上，于37℃恒温箱过夜。
[0114]
b.去内毒素提取
[0115]
根据所需质粒用量进行小提或中提实验。具体操作过程可参见promega公司试剂盒使用说明书。
[0116]
1.2.2细胞培养及转染
[0117]
(1)细胞培养
[0118]
a.细胞复苏
[0119]
从-80℃冰箱或液氮罐中取出冻存的细胞，于37℃水浴锅中快速溶解至还有一点小冰块时，置于超净工作台中，将细胞悬液移至ep管中，800g，4min离心。然后用1ml培养基(10％fbs)重悬细胞，然后加入细胞培养皿，“8字法”晃匀后于37℃，5％co2培养箱中培养。
[0120]
b.细胞传代
[0121]
当细胞长到培养皿面积的90％左右时，吸去培养基，pbs清洗2次，加入适量胰酶消化1-2min。然后加入等量的培养基终止消化，并轻轻吹打下来培养皿上的细胞，然后转移到新的ep管。800g，4min，离心。去上清，用1ml培养基重悬细胞，然后分装到细胞培养皿中，放入培养箱。
[0122]
c.细胞冻存
[0123]
当细胞长到90％左右时，用b中的方法消化和沉淀细胞，然后用无血清细胞冻存液重悬细胞，吸取细胞悬液到细胞冻存管中，于-80℃保存。
[0124]
(2)细胞转染
[0125]
a.细胞铺板
[0126]
转染前一天，根据实验需要将细胞铺在相应孔板中(48/6孔板or10 cm培养皿)。次日观察细胞生长情况，当细胞长到70％左右即可进行转染。
[0127]
b.细胞转染
[0128][0129]
6孔板转染转录因子，用于后续的qpcr和wb；48孔板转染的质粒包括了pcmv-rluc1.5μl(20ng/μl)、质粒2.7μl(100ng/μl)，启动子删切片段与转录因子共转时，删切质粒为1μl，转录因子为1.7μl，后续用于双荧光素酶实验；10cm培养皿转染转录因子，提取核蛋白，用于后面的emsa实验。
[0130]
先配制a液，室温静置10min，期间配制b液，后将两者混合，室温静置20min后加入孔板，放回培养箱。待转染6h后更换培养基。
[0131][0132]
上述表格的是用转染试剂lipo-3000转染u251细胞的配方。将a液、b液配好后混在一起，室温孵育20min，然后加入孔板中。转然后24h换液，48h收细胞，用于qpcr和wb实验。
[0133]
1.2.3双荧光素酶活性检测
[0134]
(1)收细胞：hek293t细胞的48孔板在转染质粒24h后，吸干净原有的培养基，加入200μl pbs洗一遍，吸去，然后每孔中加入60μl 1
×
passive lysis buffer(plb)(5
×
plb用ddh2o稀释)，于摇床上低速裂解30min。
[0135]
(2)试剂准备：从-80℃取出提前配制分装的luciferase assay reagentⅱ(larⅱ)避光环境下恢复至室温；配制stop&reagent(20μl原液+980μl ddh2o)，避光环境下恢复至室温。
[0136]
(3)上机检测：吸取孔板中的细胞裂解液2μl(避免吸到细胞碎片)于干净的1.5ml ep管中，先加入10μl萤火虫荧光素酶底物larⅱ，以同样大小的速度吹打10次后上机检测萤火虫荧光素酶发光值(fluc)，取出ep管，继续加入10μl stop&reagent，以同样大小的速度吹打10次后上机检测海肾荧光素酶发光值(rluc)。每个孔重复三次。最后的fluc/rluc值即为相对荧光素酶活性(relative luciferase unit，rlu)。
[0137]
1.2.4ifitm3基因启动子区转录因子预测
[0138]
人为规定以ifitm3基因exon1的第一个碱基为+1，从ncbi获取ifitm3基因启动子-1000～+47区域。利用jasper、encode、gtex等数据库对该区域进行转录因子预测。
[0139]
1.2.5转录因子质粒构建
[0140]
以pcdna4-myc/hisa为载体，在bamhⅰ和xholⅰ两个酶切位点间插入转录因子的cds区构建相关质粒。引物如下：
[0141][0142]
1.2.6ifitm3基因启动子突变质粒构建
[0143]
以pgl4.10为载体，选择酶切位点nheⅰ和hindⅲ。用snapgene设计引物。
[0144]
引物序列如下：
[0145][0146][0147]
按照如前所述的方法分别扩增两个片段，然后用多片段连接的方法构建ifitm3启动子突变质粒。连接慢转体系如下：
[0148][0149]
其中x，y，z的具体数值要根据载体长度、插入片段长度和插入片段浓度来计算。
[0150]
1.2.7核蛋白提取实验
[0151]
(1)收细胞：在铺有hek293t细胞的10cm的细胞培养皿中的转染转录因子质粒，24h后取出，吸干净原有的培养基，加入1ml pbs清洗一遍，加1ml胰酶消化1-2min，然后用等量
培养基终止消化，然后转移至ep管中，4℃，500g，5min离心。
[0152]
(2)弃上清，向细胞沉淀中加入1ml cer i及10μl 100
×
pi(细胞沉淀约为100μl)。
[0153]
(3)剧烈震荡15s，立即冰浴10min；
[0154]
(4)加入55μl预冷的cer ii，震荡5s，冰浴1min，再震荡5s，4℃，16,000g离心5min。
[0155]
(5)将上清液(胞浆蛋白)置于预冷的ep管中，-80℃保存。
[0156]
(6)向剩下的沉淀中加入500μl ner和5μl 100xpi，混匀。
[0157]
(7)震荡15s，冰浴10min，如此重复4次。
[0158]
(8)4℃，16000g，10min，离心，将上清液(核蛋白)转移至预冷的ep管中，30ul/管，-80℃保存。
[0159]
1.2.8emsa
[0160]
(1)探针及寡核苷酸链设计
[0161][0162][0163]
*表示该寡核苷酸链5’端标记了alexa fluor 700。
[0164]
(2)探针和寡核苷酸链退火、杂交
[0165]
a.将探针及寡核苷酸链的冻干粉以2000g，5min，离心；然后用1
×
te buffer调节浓度到100pmol/μl；在混匀器上放置30min。
[0166]
b.然后55℃金属浴，3min；剧烈涡旋使其完全溶解，静置待平衡至室温
[0167]
c.在1.5ml ep管中各加入10μl正向和反向寡核苷酸链，95℃金属浴，5min
[0168]
关闭金属浴后，不取出，使其自然冷切至室温(过夜)，此过程需避光。最后得到的杂交双链浓度为50pmol/μl，于-20℃避光保存。
[0169]
(3)4％emsa聚丙烯酰胺凝胶配制(1块1.5mm玻板的量)
[0170]
[0171]
将上述试剂一起加入杯中，最后加入temed，混匀后倒入组装好的两块玻璃板中间，静置30min待其凝固。
[0172]
(4)电泳及显影
[0173]
a.配置反应体系(10μl)(反向凝胶迁移实验)
[0174][0175][0176]
a.配制mix(10
×
binding buffer、dtt、poly(di-dc)、klf9 consensus*)，可多配一个管的。
[0177]
b.配制7号管：将除了nuclear extract以外的所有试剂加入管内(最后加anti-myc)，室温避光放置20min。
[0178]
c.1-6号管按照上述体系加入各试剂后，向1-7号管加入nuclear extract，室温避光孵育30min。
[0179]
competitor probe浓度为1pmol/μl，klf9 consensus*浓度为10fmol/μl。
[0180]
b.电泳
[0181]
1)预电泳：电泳槽中加入1
×
tge buffer，80v，30min；
[0182]
2)上样：步骤1)完成后，用空枪头吹打每个待上样的孔。在所有样管中加入1μl 10
×
orange loading dye，混匀后加入孔中。全程避光。
[0183]
3)电泳：80v，60min。全程避光。
[0184]
c.显影
[0185]
电泳完成后，取下玻板擦干，放入li-cor odyssey红外成像仪中，700nm通道显影。全程避光。
[0186]
1.2.9rna提取，逆转录cdna和rt-pcr
[0187]
(1)收细胞：将pcdna4和转录因子klf9、klf5、gata3、znf263转染6孔板内的mcf-7、u251细胞，24h后从孵箱取出，pbs清洗一遍，然后每个孔加入1ml的rl裂解液(bio-teke)，吹下细胞置于预冷的无酶的1.5ml ep管中。
[0188]
(2)提取rna(具体步骤参照bio teke的rna提取试剂盒的说明)
[0189]
(3)rna逆转录cdna(试剂盒：takara，prime scripttm rt reagent kit)
[0190]
a.去基因组dna
[0191][0192][0193]
将混合物置于pcr仪，42℃，2min。
[0194]
b.逆转录cdna
[0195][0196]
将除了a中的反应液外的试剂配制mix，然后再向各管中加入a中的反应液。将混合物置于pcr仪，设置如下程序：
[0197]
37℃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15min
[0198]
85℃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5s
[0199]
4℃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
∞
[0200]
(4)rt-pcr(试剂盒：takara，sybr premix ex tagtm ii)
[0201]
a.引物设计
[0202][0203]
b.标准曲线绘制
[0204]
为ifitm3和gapdh的引物绘制标准曲线，验证它们当前体系下的扩增效率，检验的标准有两个，扩增效率为
±
100％，r2≥0.989。
[0205]
1)梯度稀释模板，设立8个浓度梯度，取8个小ep管，分别标号1-8，第1管是原管，其余2-7管中分别加入45μl水，从第1管中取出5μl加入第2管，混匀后从第2管取出5μl加入第3管，以此类推。
[0206]
2)反应体系
[0207]
[0208][0209]
除了cdna外的试剂配制mix。反应试剂3个机械性重复，8个梯度，此外设立空白对照组(mix和2μl水，即ntc组)。先向各管中加入mix，然后加入cdna。将混合物置于pcr仪中，设置程序如下：
[0210][0211]
1.2.10western blot
[0212]
(1)蛋白提取
[0213]
a.6孔板内的mcf-7、u-251细胞转染pcdna4和转录因子klf9、klf5、gata3、znf263后24h取出，吸走原来的培养基，加入pbs清洗一遍，然后在每个孔中加入100ul ripa，轻刮下细胞，转移至ep管中，冰上裂解20min。
[0214]
b.在冰上用超声破碎仪进行破碎(20％强度)超10s，停5s，共6次，直至澄清透亮。
[0215]
c.4℃，14000g，离心15min。
[0216]
d.将上清液转移至预冷的ep管(若后面来不及做，可在此时把蛋白保存在-80℃)
[0217]
e.测蛋白浓度：
[0218]
1)配制标准品：取一个96孔板，第1个孔中加入原未被稀释的标准蛋白，向随后的2-6孔中分别加入25μl水，从第1孔中取出25μl加入第2孔，混匀后从第2孔取出25μl加入第3孔，以此类推。得到的浓度依次为2，1，0.5，0.25，0.125，0(mg/ml)。
[0219]
2)样品稀释：将前面提取的蛋白一次取5μl于96孔板中，然后向各孔中加入20μlddh2o混匀。
[0220]
3)配制bca反应液(thermo bca kit)：a液：b液＝50：1(200ul：4μl)。在上述的所有孔中加入200μl bca反应液，37℃，孵育30min。
[0221]
4)上机测浓度：打开bio-teke酶标仪，选用562nm的波长，将96孔板放入仪器，检测样品吸光度，绘制标准曲线，计算蛋白浓度。
[0222]
f.蛋白变性：根据计算结果，每管中加入相应体积的蛋白样品、5
×
sample buffer和ddh2o，98℃，金属浴8min，-20℃保存。暂时不用的蛋白，按计算结果分装后-80℃保存。
[0223]
(2)配胶(2块,1.5mm板子)
[0224][0225]
使用epizyme的page凝胶快速制备试剂盒(15％)，按照上述体系配制。当下层胶配好后，用1ml的枪将下层胶缓缓加入装好的玻板中间(注意不要有气泡)，然后加入异丙醇压胶，室温静置15min待其凝固；倒掉异丙醇，用ddh2o清洗，用吸水纸吸干多余的水，再加入配好的上层胶，插入梳子，室温静置20min待其凝固。
[0226]
(3)电泳：上层胶凝固后，将玻板装配到电泳架上，倒入新配制的1
×
running buffer若不漏液，则可拔出梳子，用枪吹打孔，然后逐一上样，然后置于电泳槽中(注意电源正负极，这里可以加旧的1
×
runing buffer)。70v，30min电泳，当上层胶跑完时，调节电压至120v；当跑至接近下层胶底部时，即可停止电泳。
[0227]
(4)转膜：在白色方盆内加入新的0.5
×
trans-buffer，将海绵、夹子、滤纸按顺序放好浸泡在方盒内；提前为好pvdf膜，放在甲醇中5min，激活备用。撬开璃板，取出胶，切去上层胶，轻轻放到滤纸上，再把膜覆盖在上面(黑胶白膜)，放入黑红槽，再放入电泳槽，加入0.5
×
trans-buffer，4℃，105v，2h。
[0228]
(5)封闭：上述步骤结束后，将膜转移至盒子里，加入1
×
pbst，放到摇床上清洗，100转，5min，重复3遍。倒掉pbst，加入5％的脱脂牛奶(2.5g奶粉+50mlpbst)，放到摇床上，50转，60-90min，封闭。
[0229]
(6)洗膜：封闭完成后，回收牛奶，加入1
×
pbst清洗，100转，5min，重复3遍。
[0230]
(7)一抗孵育：用pbst按照1：5000稀释一抗，倒掉盒子里洗膜用的1
×
pbst，加入稀释后的一抗(单张膜，正面朝上；两张膜，背靠背放)，4℃冷库，最低转速过夜孵育。
[0231]
(8)洗膜：次日，回收一抗，加入1
×
pbst，放到摇床上清洗，100转，5min，重复3遍。
[0232]
(9)二抗孵育：用pbst按照1：5000稀释二抗，倒掉盒子里洗膜用的pbst，加入稀释后的二抗，常温，最低转速孵育1～1.5小时。
[0233]
(10)洗膜：回收二抗，用1
×
pbst洗膜，洗3次，5min/次。
[0234]
(11)显影：显影液a和b液按1:1比例混合，将混合液加到膜上充分反应，1-2min后，genesys化学发光仪显影。
[0235]
1.2.11统计学分析
[0236]
每个结果进行3次及以上独立重复实验，使用anova或t检验统计分析，p＜0.05被认为有统计学差异。
[0237]
2.结果
[0238]
2.1ifitm3基因启动子功能活性区分析
[0239]
人ifitm3基因位于11号染色体上，其有2个外显子和一个内含子。我们以exon1第一个碱基为+1，并选择该基因启动子的-1000～+47区域进行研究。利用hek293t细胞提取人基因组dna,以其为模板扩增出-1000～+47区域。其余缺失片段则以-1000～+47片段为模板进行扩增。然后我们将这些靶片段通过同源重组连接到缺失启动子的载体pgl4.10上，生成pifitm3-a～pifitm3-l缺失质粒。绘制示意图如图1所示。
[0240]
将一系列ifitm3基因启动子缺失质粒转染hek293t细胞，海肾荧光素酶报告基因质粒pcmv-rluc作为内参，pgl4.10为阴性对照，转染24h后进行荧光素酶活性检测，用rlu(fluc/rluc)值反应启动子的活性。结果显示，与阴性对照相比，pifitm3-a的荧光素酶的活性显著提高(p＜0.01)，说明-1000～+47包含该基因的转录调控功能活性区域；由5’端开始，-1000至-500的删切使荧光素酶活性明显升高，且pifitm3-b具有很高的启动子活性，说明该区域存在负性调控元件；pifitm3-d与pifitm3-c相比，启动子活性显著降低了，提示这里可能存在一些正性调控元件；pifitm3-e和pifitm3-f、pifitm3-i和pifitm3-j也是一样的情况；但与pifitm3-e和pifitm3-d相比，启动子活性明显增强，说明-300～-200之间存在负性调控元件；pifitm3-f到pifitm3-i的删切，启动子活性没有明显的变化；pifitm3-l的启动子活性下降接近阴性对照水平，说明-10～-47为ifitm3基因启动子的最小活性区(图2)。
[0241]
2.2ifitm3基因启动子区域转录因子预测及分析
[0242]
结合ncbi和genome browser网站，获取了ifitm3基因启动子-1000～+47区域的碱基序列，利用jasper、encode等数据库对该区域进行转录因子预测，结果如图3所示。
[0243]
2.3过表达klf9可上调ifitm3基因的转录
[0244]
由ifitm3基因启动子删切质粒荧光素酶结果可知，ifitm3基因启动子的-300～-200区域存在影响该启动子活性的调控元件。结合转录因子预测结果，我们将-300至-200区域的转录因子klf9、klf5、gata3、znf263分别转染mcf-7、u251细胞，24h后提取rna进行荧光定量pcr实验，检测ifitm3基因内源性mrna水平的变化情况。结果显示，在mcf-7细胞中，与对照组pcdna4相比，klf9能够明显上调ifitm3基因的mrna水平(2.4倍,p＜0.01)；在u251细胞中也是同样的情况(1.67倍,p＜0.05)其余的转录因子没有明显变化(图4)。
[0245]
2.3过表达klf9可上调ifitm3基因的启动子活性
[0246]
为了明确klf9能否影响ifitm3基因的启动子活性，我们进行了双荧光素酶实验。将klf9表达质粒与pifitm3-d质粒共转hke293t细胞，24小时后，检测荧光素酶活性。结果显示，与对照组相比，klf9能明显上调ifitm3基因启动子活性(2.44倍,p＜0.05)；将ifitm3基因启动子区域klf9结合位点突变后，构建pifitm3-d-mut质粒与klf9共转hek293t细胞，荧光素酶实验结果显示，与共转pifitm3-d相比，活性明显下降，到达对照组水平(1.95倍,p＜0.05)，进一步说明了klf9对ifitm3基因启动子活性的影响(图5)。
[0247]
2.4转录因子klf9可以与ifitm3基因的启动子结合
[0248]
fitm3基因启动子-300至-200区域序列分析表明存在有预测的klf9的结合位点。为了研究该位点元素是否是与ifitm3相互作用的klf9是否确实能结合该位点，我们进行了凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,emsa)。将带有myc标签的转录因子klf9转染hek293t细胞，24h收板，提取核蛋白。将此核蛋白与alexa fluor 700标记的klf9通用探针(klf9 consensus*)结合，进行反向凝胶迁移实验。以不加核蛋白的组为阴性对照组(图6；lane1)。与阴性对照相比，klf9可与通用探针klf9 concensus*相结合(图6；lane2)，且这种结合可以被未标记的通klf9 consensus探针所抑制(通常应该给出竞争探针与标记探针的比例)(图6；lane3)，将其突变为klf9 consensus mut后，这种抑制作用消失(图6；lane4)；根据klf9在ifitm3基因启动子上的结合位点合成了ifitm3-klf9探针和突变的ifitm3-klf9 mut探针。加入竞争性探针ifitm3-klf9后，迁移带的结合强度也有所减
弱(图6；lane5)，但这种减弱在换成ifitm3-klf9 mut后得到恢复(图3；lane6)；在klf9核蛋白与klf9 consensus*的复合物中加入anti-myc抗体，出现了超迁移条带(lane7)，验证了两者结合的特异性。
[0249]
2.5过表达klf9可上调ifitm3基因的翻译
[0250]
为了进一步研究klf9是否会影响ifitm3基因的翻译水平，我们在mcf-7、u251细胞中过表达了klf9，提取细胞总蛋白进行wb实验，用klf9特异性单克隆抗体检测内源性ifitm3蛋白的表达情况。结果显示，在mcf-7细胞中，相较于加pcdna4的对照组，过表达klf9使ifitm3基因蛋白表达水平明显升高(2.06倍，p＜0.05)(图7中a)。在u251细胞中液观察到了类似的变化(1.84倍，p＜0.05)(图7中b)。

技术特征：
1.转录因子klf9或其编码基因在制备调控ifitm3基因表达的产品上的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述转录因子klf9的氨基酸序列如seq id no.1所示。3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seq idno.2所示。4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述调控为过表达转录因子klf9，从而上调ifitm3基因的启动子活性或ifitm3基因转录水平或ifitm3蛋白表达水平。5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述ifitm3基因为人ifitm3基因。

技术总结
本发明公开了转录因子KLF9在IFITM3基因转录调控中的用途，通过过表达转录因子KLF9，从而上调IFITM3基因的启动子活性或IFITM3基因转录水平或IFITM3蛋白表达水平。因转录水平或IFITM3蛋白表达水平。因转录水平或IFITM3蛋白表达水平。


技术研发人员：周倩 宋伟宏 周卫辉
受保护的技术使用者：重庆医科大学附属儿童医院
技术研发日：2023.07.12
技术公布日：2023/9/23