一种偶联透明质酸中PEG偶联率的检测方法与流程

一种偶联透明质酸中peg偶联率的检测方法
技术领域
1.本发明涉及化学分析技术领域，特别涉及一种偶联透明质酸中peg偶联率的检测方法。


背景技术：

2.透明质酸(hyalouronic acid，ha)是由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡糖双糖单位重复组成的一种直链高分子粘性多糖。透明质酸是人体内本身具有的内源性物质，具有良好的生物相容性；具有高粘弹性和非牛顿流变学特性；无毒、无免疫源性、无刺激性，具有很高的安全性，以及可通过注射透明质酸酶降解消除等特点，被广泛用作美容中的软组织填充剂，将其注射至皮肤内，以增加软组织体积，可达到除皱或塑形等目的。
3.医美产品水光针由透明质酸钠溶液与甲氧基-聚乙二醇-环氧化物(m-epox)在碱性溶液中偶联反应得到。其中，m-epox与透明质酸钠的偶联率是水光针成品的重要性质，偶联的作用为延长水光针产品在体内的降解时间，偶联率会影响成品的分子量，分子量是水光针产品的重要参数，反映终产品的性状特征。
4.专利文件cn114397399a公开了一种测定透明质酸-季铵盐聚合物中季铵盐含量的方法，所述方法包括：供试品溶液的制备：将透明质酸-季铵盐聚合物水解得到透明质酸和季铵盐的混合溶液，接着加入盐溶液和乙腈对透明质酸进行沉降，得到的上清液作为供试品溶液；使用离子色谱法测定供试品溶液中游离季铵盐的含量。上述检测方法中采用羧酸官能化阳离子交换色谱柱对样品进行分析，无法避免样品在色谱柱中被吸附所带来的检测准确度低的缺陷。
5.专利文件cn108254456b公开了一种测定透明质酸钠凝胶中填充的交联葡聚糖含量的方法，其包括采用裂解气相色谱-质谱联用法对若干组质量不同的交联葡聚糖纯品进行高温裂解分析的步骤。上述检测方法中采用极性色谱柱对样品进行分析，无法避免样品在色谱柱中被吸附所带来的检测准确度低的缺陷。
6.目前关于水光针产品上peg偶联比例的测试并没有一个明确的方法，而偶联的比例对于水光针产品的质量又是一个至关重要的因素。因此，急需建立一个快速，便捷的方法用于检测水光针产品上peg偶联的比例。


技术实现要素：

7.为克服现有技术的不足，本发明旨在提供一种透明质酸偶联peg比例的直接偶联率的检测方法，其能快速便捷的测试偶联比例，从而有效控制产品质量。
8.名词解释：
9.m-peg-5k为甲氧基-聚乙二醇-5k；
10.m-epox为甲氧基-聚乙二醇-环氧化物。
11.本发明在第一方面提供了一种医美产品透明质酸偶联peg比例的直接偶联率的检测方法，所述的检测方法包括如下步骤：
12.(1)作标准曲线：取含量已知的对照品溶液，用溶剂对其进行梯度稀释，得到线性对照品溶液，吸取线性对照品溶液注入液相系统(高效液相色谱仪)，不接色谱柱，直接进入到质谱系统进行检测，记录色谱图，通过提取peg特征离子m/z:133.0859，获取对照品溶液浓度、峰高、保留时间、峰面积等参数，绘制对照品溶液与峰高线性关系的标准曲线；
13.(2)偶联率的测定：
14.将待测样品(待测偶联透明质酸)用水稀释一定倍数后，测定其峰高，利用步骤(1)所述的标准曲线，得到peg浓度c(peg)；测定透明质酸或其盐的分子量m(透明质酸或其盐分子量)；
15.通过下式
①②③
计算得到偶联率
16.①
17.②
18.③
19.其中，n(待测样品中偶联peg)为待测样品中偶联peg的物质的量，c(peg)为待测样品中偶联peg的浓度，v(待测样品体积)为待测样品的体积，n(透明质酸或其盐)为透明质酸或其盐的物质的量，m(透明质酸或其盐投入量)为透明质酸或其盐投入的质量，m(透明质酸或其盐投入量)为透明质酸或其盐的分子量。
20.进一步地，所述对照品溶液为甲氧基聚乙二醇。
21.在本发明的一个实施方式中，所述的甲氧基聚乙二醇选自：m-peg-2k、m-peg-5k、m-peg-10k、m-peg-20k和m-peg-40k中的一种。
22.在本发明的一个实施方式中，所述的甲氧基聚乙二醇为m-peg-5k。
23.进一步地，所述透明质酸或其盐的分子量m(透明质酸或其盐分子量)通过多角度激光光散射技术测定。
24.进一步地，步骤(2)所述的稀释倍数为4000～20000倍(如4000倍、4500倍、5000倍、5500倍、6000倍、6500倍、7000倍、7500倍、8000倍、8500倍、9000倍、9500倍、10000倍、15000倍、20000倍)，优选地，为4000～10000倍，更优选地，为4000～8000倍。
25.进一步地，所述的透明质酸盐选自透明质酸的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、锌盐、钴盐和四丁基铵盐中的一种或多种；优选的，所述的盐为钠盐。
26.进一步地，步骤(1)所述的溶剂为水。
27.在本发明的一个实施方式中，所述的液相系统为sciexexionlc液相系统。
28.在本发明的一个实施方式中，所述的质谱系统为sciextripletof6000检测器。
29.进一步地，所述液相系统中的流动相为甲酸水溶液或三氟乙酸水溶液。
30.在本发明的一个实施方式中，所述液相系统中的流动相为甲酸水溶液。
31.进一步地，所述液相系统中的流动相为体积浓度为0.01～0.5％的甲酸水溶液(如0.01％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％)，优选地，所述流动相为体积浓度为0.1％的甲酸水溶液。
32.进一步地，所述液相系统中的柱温为25～45℃(如25、28、30、32、35、36、37、38、39、
40、41、42、43、44、45℃)，优选为38～42℃。
33.在本发明的一个实施例中，所述液相系统中的柱温为40℃。
34.进一步地，所述液相系统中的流速为0.05～1.0ml/min(如0.05ml/min、0.1ml/min、0.15ml/min、0.16ml/min、0.17ml/min、0.18ml/min、0.19ml/min、0.2ml/min、0.21ml/min、0.22ml/min、0.23ml/min、0.24ml/min、0.25ml/min、0.3ml/min、0.4ml/min、0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min)，优选地，为0.05～0.5ml/min，更优选地，为0.05～0.3ml/min。
35.在本发明的一个实施例中，所述液相系统中的流速为0.2ml/min。
36.进一步地，所述液相系统采用等度洗脱程序。
37.进一步地，所述洗脱程序的洗脱时间为1～10min(如1min、1.5min、2min、2.5min、3min、3.5min、4min、4.5min、5min)
38.在本发明的一个实施例中，所述洗脱程序的洗脱时间为5min。
39.进一步地，所述液相系统中的进样量为1～10μl(如1、1.5、2、2.5、3、4、5、8、9、10μl)，优选地，为1～8μl。
40.在本发明的一个实施方式中，所述液相系统中的进样量为2μl。
41.进一步地，所述质谱系统的参数如下所示，
42.gas1:50,gas2:50,cur:30,tem:450,isvf:5500,dp:50,ce:40。
43.进一步地，所述偶联透明质酸的结构为：
44.其中，n为聚乙二醇残基的聚合度，m为透明质酸残基的聚合度，所述聚乙二醇残基的分子量为3000-8000da，所述透明质酸残基的分子量为600-1500kda。
45.进一步地，所述聚乙二醇残基的分子量为4000-6000da(如4500da、4600da、4700da、4800da、4900da、5000da、5100da、5200da、5300da、5400da、5500da、5600da、5700da、
5800da、5900da、6000da)。
46.进一步地，所述透明质酸残基的分子量为700-1300kda(如700kda、800kda、900kda、1000kda、1100kda、1150kda、1160kda、1170kda、1180kda、1190kda、1200kda、1210kda、1220kda、1230kda、1240kda、1250kda、1260kda、1270kda、1280kda、1290kda、1300kda)，优选地，为800-1200kda。
47.在本发明的一个实施方式中，所述偶联透明质酸的结构为：
[0048][0049]
另一方面，本发明提供了上述检测方法在偶联透明质酸质量评价中的应用。
[0050]
本发明取得了如下技术效果：
[0051]
1.本发明的检测方法方便快捷，液相系统直接通过两通接头与质谱系统相连，一针运行时间仅需5分钟，不接色谱柱，同时避免了样品在色谱柱中被吸附导致样品损失的问题；
[0052]
2.本发明的检索方法准确高效，通过使用qtof进行检测，提取peg特征离子m/z:133.0859用于peg的定量，操作便捷，准确度高。
附图说明
[0053]
图1为m-peg-5k浓度与峰高的线性关系图。
具体实施方式
[0054]
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0055]
实施例1
[0056]
1、方法参数
[0057]
表1
[0058][0059][0060]
2、溶液配制
[0061]
2.1空白溶液：mili-q水，现用现取。
[0062]
2.2对照品储备液(20mg/ml)
[0063]
称取m-peg-5k样品约20mg置于离心管中，加入1ml水溶解，涡旋混均。
[0064]
2.3中间工作溶液1(约1mg/ml)
[0065]
移取50μl2.2对照品储备液置于离心管中，加入950μl水溶解，涡旋混均。
[0066]
2.4中间工作溶液2(约100μg/ml)
[0067]
移取100μl2.3中间工作溶液1置于离心管中，加入900μl水溶解，涡旋混均。
[0068]
2.5中间工作溶液3(约10μg/ml)
[0069]
移取100μl2.4中间工作溶液2置于离心管中，加入900μl水溶解，涡旋混均。
[0070]
2.6线性溶液配制
[0071]
2.6.1线性溶液1(约0.2μg/ml)
[0072]
移取20μl2.5中间工作溶液3置于离心管中，加入980μl水溶解，涡旋混均。2.6.2线性溶液2(约0.5μg/ml)
[0073]
移取50μl2.5中间工作溶液3置于离心管中，加入950μl水溶解，涡旋混均。2.6.3线性溶液3(约1μg/ml)
[0074]
移取100μl2.5中间工作溶液3置于离心管中，加入900μl水溶解，涡旋混均。
[0075]
2.6.4线性溶液4(约2μg/ml)
[0076]
移取200μl2.5中间工作溶液3置于离心管中，加入800μl水溶解，涡旋混均。
[0077]
2.6.5线性溶液5(约5μg/ml)
[0078]
移取500μl2.5中间工作溶液3置于离心管中，加入500μl水溶解，涡旋混均。
[0079]
3、线性结果
[0080]
通过提取peg特征离子m/z:133.0859，用于对线性溶液中的peg进行定量。线性结果以m-peg-5k浓度为横坐标，峰高为纵坐标，绘制标准曲线(见图1)。
[0081]
表2
[0082]
m-peg-5k浓度(μg/ml)0.210.521.032.075.16峰高496.401516.392830.005706.0612373.96
[0083]
结果表明，m-peg-5k在0.21-5.16μg/ml浓度范围内线性符合要求，可以作为定量评估使用。
[0084]
4、样品测试
[0085]
4.1样品溶液的配制：
[0086]
由于样品溶液有一定的粘稠度，为避免堵塞进样针，将样品溶液用水稀释一定倍数后，再进样。实验中发现，样品存在离子化基质效应，稀释倍数需要足够大时，浓度与峰高成正相关。本实验中，采用成品稀释4000倍及以上的结果作为最终计算数据。
[0087]
4.2偶联比例的计算公式：
[0088][0089][0090][0091]
其中，peg物质浓度，通过将待测溶液的峰高代入线性曲线，利用外标法求得。透明质酸钠的分子量由多角度光直接测得。
[0092]
4.3计算结果：
[0093][0094][0095]
通过实验可以计算得出，投入的透明质酸钠与偶联上的peg单元的mol比例，提供给生产部门的人员，用于水光针样品上peg偶联的比例的表征。
[0096]
使用本方法对透明质酸钠偶联peg实验步骤中的第一步投料溶液进行了检测。通
过测得溶液浓度值、溶液体积值以及稀释倍数计算得出peg物质实际的质量，并将其与理论值(理论投料量)对比，测试结果符合预期投料结果，此方法是准确可行的。

技术特征：
1.一种偶联透明质酸中peg偶联率的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括如下步骤：(1)标准曲线的绘制：取含量已知的对照品溶液，用溶剂对其进行梯度稀释，得到不同梯度的线性对照品溶液；将所述不同梯度的线性对照品溶液注入液相色谱分析系统，不接色谱柱，并直接对接质谱系统进行检测，记录色谱图，通过提取peg特征离子m/z:133.0859，获取对照品溶液的浓度、峰高、保留时间、峰面积，绘制对照品溶液与峰高线性关系的标准曲线；(2)偶联率的测定：将待测样品用水稀释一定倍数后，测定其峰高，利用步骤(1)所述的标准曲线，得到peg浓度c(peg)；测定透明质酸或其盐的分子量m(透明质酸或其盐分子量)；通过下式
①②③
计算得到偶联率计算得到偶联率计算得到偶联率其中，n(待测样品中偶联peg)为待测样品中偶联peg的物质的量，c(peg)为待测样品中偶联peg的浓度，v(待测样品体积)为待测样品的体积，n(透明质酸或其盐)为透明质酸或其盐的物质的量，m(透明质酸或其盐投入量)为透明质酸或其盐投入的质量，m(透明质酸或其盐投入量)为透明质酸或其盐的分子量。2.一种如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述透明质酸或其盐的分子量m(透明质酸或其盐分子量)的测定方法为多角度激光光散射技术。3.一种如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述对照品溶液为甲氧基聚乙二醇，所述的甲氧基聚乙二醇选自：m-peg-2k、m-peg-5k、m-peg-10k、m-peg-20k和m-peg-40k中的一种。4.一种如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相系统中的流动相为甲酸水溶液或三氟乙酸水溶液，优选地，所述液相系统中的流动相为甲酸水溶液。5.一种如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述液相系统中的流动相为体积浓度为0.01～0.5％的甲酸水溶液，优选地，所述流动相为体积浓度为0.1％的甲酸水溶液。6.一种如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)的稀释倍数为4000～20000倍，优选地，为4000～10000倍，更优选地，为4000～8000倍。7.一种如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的透明质酸盐选自透明质酸的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、锌盐、钴盐和四丁基铵盐中的一种或多种；优选的，所述的盐为钠盐。8.一种如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相系统采用等度洗脱程序，所述液相系统中的流速为0.05～1.0ml/min，优选地，为0.05～0.5ml/min，更优选地，为0.05～0.3ml/min。9.一种如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述偶联透明质酸的结构为：
其中，n为聚乙二醇残基的聚合度，m为透明质酸残基的聚合度，所述聚乙二醇残基的分子量为3000-8000da，所述透明质酸残基的分子量为600-1500kda。10.一种如权利要求1-9任一项所述的检测方法在偶联透明质酸质量评价中的应用。

技术总结
本发明公开了一种偶联透明质酸中PEG偶联率的检测方法，其将待测样品通过液相系统，且液相系统中不接色谱柱，直接进入到质谱系统进行检测，使用对照品溶液，用外标曲线法定量，该检测方法一针运行时间仅需5分钟，液相系统直接通过两通接头与质谱系统相连，不接色谱柱，同时避免了样品在色谱柱中被吸附导致样品损失的问题，所述方法操作便捷，准确度高。准确度高。准确度高。


技术研发人员：李洋 何平 王辰 林美娜 赵宣
受保护的技术使用者：天津键凯科技有限公司
技术研发日：2023.07.13
技术公布日：2023/9/23