兼具美白、抗氧、抗炎功效的组合物及制备方法和应用与流程

1.本发明属于化妆品技术领域，特别涉及兼具美白、抗氧、抗炎功效的组合物及制备方法和应用。


背景技术：

2.目前美白功效类化妆品在国内市场深受消费者欢迎，该类化妆品一般能够有助于改善皮肤色素沉积，达到皮肤的美白、增白、亮肤、均匀肤色的效果。
3.在美白领域中，具有美白功效成分的开发已较为全面，市面上存在多种美白成分，大多美白成分的美白机制都是针对引起皮肤色素沉着和暗沉的黑色素，通过抑制酪氨酸酶的活性来减少黑色素的生成，或是通过将已经生成的黑色素进行分解代谢、还原以及阻断其向皮肤表层迁移，从而达到一定的美白亮肤效果，因其只在美白单一路径起效而很难达到高效美白；部分美白成分如烟酰胺、熊果苷、曲酸等，以化学类成分居多，在添加量上需要适当，过量易引起皮肤刺激、过敏。现阶段对于各类美白成分的功效机理研究尚未透彻，且对于多种成分之间的协同或拮抗作用的研究与开发仍较为欠缺。
4.因此，开发更高效、温和、安全的美白功效物质是本领域技术人员亟需解决的技术难题。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供一种组合物，该组合物中的光甘草定、鞣花酸和白藜芦醇发挥协同增效作用，从抑制酪氨酸酶活性、抑制小眼畸形相关转录因子(mitf)信号通路、抑制氧化应激、抑制炎症多种美白相关机制路径进行调控，从而具有优异的美白效果。进一步的，该组合物在较低浓度下表现出优异的美白效果，降低了使用单一高浓度化学成分所带来的刺激等副作用，安全性更高，同时兼具优异的抗炎和抗氧化效果。
6.本发明的第一方面提供一种组合物，所述组合物包括组分：光甘草定、鞣花酸和白藜芦醇。
7.根据本发明的一些实施方式，所述光甘草定在所述组合物中的添加量为5wt％-50wt％。
8.根据本发明的一些实施方式，所述鞣花酸在所述组合物中的添加量为35wt％-80wt％。
9.根据本发明的一些实施方式，所述白藜芦醇在所述组合物中的添加量为5wt％-60wt％。
10.本发明的第二方面提供所述组合物的制备方法，包括以下步骤：
11.将所述光甘草定、鞣花酸和白藜芦醇混合，得到所述组合物。
12.本发明的第三方面提供一种化妆品，包括本发明所述的组合物。
13.根据本发明的一些实施方式，所述化妆品的剂型选自霜剂、乳液、精华液、水剂、油
剂、凝胶或面膜。
14.根据本发明的一些实施方式，所述化妆品还包括化妆品中可接受的辅料。
15.根据本发明的一些实施方式，所述辅料包括润肤剂、乳化剂、增稠剂、保湿剂、ph调节剂和防腐剂中的至少一种。
16.根据本发明的一些实施方式，所述组合物在所述化妆品中的添加量≤20wt％。进一步的，所述组合物在所述化妆品中的添加量为0.01wt％-20wt％。再进一步的，所述组合物在所述化妆品中的添加量为0.1wt％-20wt％。更进一步的，所述组合物在所述化妆品中的添加量为0.3wt％-10wt％。
17.本发明的第四方面提供一种乳液，包括本发明所述的组合物。
18.根据本发明的一些实施方式，所述乳液包括组分：甜菜碱、黄原胶、聚丙烯酰基二甲基牛磺酸钠、c14-22醇、c12-20烷基葡糖苷、聚二甲基硅氧烷、异壬酸异壬酯、鲸蜡硬脂醇、环五聚二甲基硅氧烷、对羟基苯乙酮、1,2-己二醇、丙二醇、丁二醇、光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇和水。
19.本发明的第五方面提供一种膏霜，包括本发明所述的组合物。
20.根据本发明的一些实施方式，所述膏霜包括组分：丁二醇、edta二钠、黄原胶、透明质酸钠、甜菜碱、尿囊素、甘油、甘油聚丙烯酸酯、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡硬脂基葡糖苷、甘油硬脂酸酯、peg-100硬脂酸酯、氢化聚(c6-14烯烃)、生育酚(维生素e)、对羟基苯乙酮、1,2-己二醇、聚丙烯酸酯-13、聚异丁烯、聚山梨醇酯-20、山梨坦异硬脂酸酯、光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇和水。
21.相对于现有技术，本发明的有益效果以下：
22.1)本发明组合物通过光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇三者组合，在抑制黑色素含量及酪氨酸酶活性上具有明显的协同增效性，三者组合的效果明显优于单一组分或其他组合。
23.2)本发明组合物通过光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇三者组合，在美白关键信号通路mitf上，对相关基因、蛋白表达具备协同抑制效果，三者组合的效果明显优于单一组分或其他组合；该组合物不仅可抑制酪氨酸酶活性，同时可抑制酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白的表达量，在酪氨酸酶活性以及酪氨酸酶数量上达到双重抑制效果。
24.3)本发明组合物通过光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇三者组合，在抗氧活性上，对dpph自由基的清除具有明显的协同增效性，三者组合的效果明显优于单一组分或其他组合。
25.4)本发明组合物通过光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇三者组合，在抗炎活性上，表现出更优的对炎症因子tnfα、no的抑制效果，三者组合的效果明显优于单一组分或其他组合。
26.综上，本发明组合物通过光甘草定、鞣花酸和白藜芦醇三者组合，发挥协同增效作用，从抑制酪氨酸酶活性、抑制小眼畸形相关转录因子(mitf)信号通路、抑制氧化应激、抑制炎症多种美白相关机制路径进行调控，从而具有优异的美白效果。进一步的，该组合物在较低浓度下表现出优异的美白效果，降低了使用单一高浓度化学成分所带来的刺激等副作用，安全性更高，同时兼具优异的抗炎和抗氧化效果。
27.另外，本发明组合物的制备方法简单易行，原料易得，能够大规模进行生产。
附图说明
28.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。
29.图1为试验例3中tnfα含量变化的统计图；
30.图2为试验例4中mitf相关基因表达变化的统计图；
31.图3为试验例4中tyr和trp2蛋白表达情况的统计图。
具体实施方式
32.为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
33.以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
34.实施例1
35.本实施例提供一种组合物，该组合物由光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇三者粉末以摩尔比为1：1：1.4混合组成(质量占比光甘草定37.9wt％、鞣花酸35.4wt％、白藜芦醇26.7wt％)。
36.实施例2
37.本实施例提供一种组合物，该组合物由光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇三者粉末以摩尔比为1：8.6：1.4混合组成(质量占比光甘草定10wt％、鞣花酸80wt％、白藜芦醇10wt％)，其用量与实施例1的组合物的用量相同。
38.实施例3
39.本实施例提供一种组合物，该组合物由光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇三者粉末以摩尔比为7.1：6.8：1混合组成(质量占比光甘草定50wt％、鞣花酸45wt％、白藜芦醇5wt％)，其用量与实施例1的组合物的用量相同
40.实施例4
41.本实施例提供一种组合物，该组合物由光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇三者粉末以摩尔比为1：7.5：17.1混合组成(质量占比光甘草定5wt％、鞣花酸35wt％、白藜芦醇60wt％)，其用量与实施例1的组合物的用量相同。
42.对比例1
43.本对比例提供一种单一组分，仅含有光甘草定粉末，其用量与实施例1的组合物的用量相同。
44.对比例2
45.本对比例提供一种单一组分，仅含有鞣花酸粉末，其用量与实施例1的组合物的用量相同。
46.对比例3
47.本对比例提供一种单一组分，仅含有白藜芦醇粉末，其用量与实施例1的组合物的用量相同。
48.对比例4
49.本对比例提供一种单一组分，仅含有传明酸粉末，其用量与实施例1的组合物的用量相同。
50.对比例5
51.本对比例提供一种单一组分，仅含有烟酰胺粉末，其用量与实施例1的组合物的用量相同。
52.对比例6
53.本对比例提供一种单一组分，仅含有根皮素粉末，其用量与实施例1的组合物的用量相同。
54.对比例7
55.本对比例提供一种组合物，该组合物由光甘草定、鞣花酸二者粉末以摩尔比为1：1混合组成(质量占比光甘草定48.2wt％，鞣花酸51.8wt％)，其用量与实施例1的组合物的用量相同。与实施例1相比，区别仅在于：缺少白藜芦醇。
56.对比例8
57.本对比例提供一种组合物，该组合物由白藜芦醇、鞣花酸二者粉末以摩尔比为1.4：1混合组成(质量占比白藜芦醇65wt％，鞣花酸35wt％)，其用量与实施例1的组合物的用量相同。与实施例1相比，区别仅在于：缺少光甘草定。
58.对比例9
59.本对比例提供一种组合物，该组合物由白藜芦醇、光甘草定二者粉末以摩尔比为1.4：1混合组成(质量占比白藜芦醇66.6wt％，光甘草定33.4wt％)，其用量与实施例1的组合物的用量相同。与实施例1相比，区别仅在于：缺少鞣花酸。
60.对比例10
61.本对比例提供一种组合物，该组合物由光甘草定、烟酰胺、白藜芦醇三者粉末以摩尔比为1：1：1.4混合组成(质量占比光甘草定17.7wt％，烟酰胺47.1wt％，白藜芦醇35.2wt％)，其用量与实施例1的组合物的用量相同。与实施例1相比，区别仅在于：将鞣花酸替换为烟酰胺。
62.对比例11
63.本对比例提供一种组合物，该组合物由光甘草定、传明酸、鞣花酸三者粉末以摩尔比为1：1.4：1混合组成(质量占比光甘草定20.2wt％，传明酸58.2wt％，鞣花酸21.6wt％)，其用量与实施例1的组合物的用量相同。与实施例1相比，区别仅在于：将白藜芦醇替换为传明酸。
64.对比例12
65.本对比例提供一种组合物，该组合物由根皮素、鞣花酸、白藜芦醇三者粉末以摩尔比为1：1：1.4混合组成(质量占比根皮素27.9wt％，鞣花酸25.3wt％，白藜芦醇46.8wt％)，其用量与实施例1的组合物的用量相同。与实施例1相比，区别仅在于：将光甘草定替换为根皮素。
66.试验例1黑色素合成及酪氨酸酶活性抑制实验
67.1.1样品溶液的配制
68.以二甲基亚砜(dmso)作为溶剂，将对比例1(光甘草定粉末)配制成摩尔浓度为0.1μm的样品溶液，进行试验。
69.以dmso作为溶剂，将对比例2(鞣花酸粉末)配制成摩尔浓度为0.1μm的样品溶液，进行试验。
msh(1μm)的培养基，并设置对照组(只含1μm的α-msh)，每孔2ml，每一个浓度做3个平行。37℃、5％co2孵育48h后，弃去上清液，每孔加入0.25％胰蛋白酶消化液0.5ml于室温下消化1min。加入1ml培养基中止消化，并吹打成单细胞悬液。取20μl作细胞计数，取0.7ml细胞悬液于2000r/min离心5min，弃上清液，加入1ml 1mol/l的naoh溶液(含质量分数10％的dmso)，并在80℃水浴中孵育30min后，在酶标仪490nm处测其吸光值。
89.(3)细胞内酪氨酸酶活性的测定
90.将上述药物处理后的细胞，胰蛋白酶消化计数后(具体步骤同1.3-(2))，取0.7ml细胞悬液于2000r/min离心5min，弃上清液，加入1ml质量分数0.5％的脱氧胆酸钠溶液，冰浴15min，裂解细胞以制备含酪氨酸酶的提取液。于37℃预温后加入质量分数0.3％的多巴溶液0.5ml，37℃反应10min后，在酶标仪475nm处测其吸光值。
91.(4)结果统计
92.测试od值以细胞数进行标定。
93.黑色素合成抑制率(％)＝[1-(as/ds)/(ac/dc)]
×
100；
[0094]
酪氨酸酶活性抑制率(％)＝[1-(as/ds)/(ac/dc)]
×
100；
[0095]
式中：as为样品组的吸光值，ac为对照组的吸光值，ds为样品组的细胞浓度，dc为对照组的细胞浓度。
[0096]
1.4实验结果
[0097]
结果如表1所示。
[0098]
表1细胞内黑色素含量及酪氨酸酶活性检测结果
[0099]
[0100][0101]
黑色素主要由肌肤基底层的黑色素细胞产生分泌，黑色素含量的高低直接影响了我们的肤色，皮肤的暗沉、色斑、色素沉着等均与黑色素的异常产生、代谢等相关，而酪氨酸酶作为调控黑色素生成的限速酶，其活性的高低会直接影响到黑色素的合成。因此，目前常用细胞法检测化妆品原料对黑色素含量及酪氨酸酶活性的影响从而评估其美白功效。
[0102]
由表1结果可知，光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇、传明酸、烟酰胺、根皮素作为美白活性成分均具备一定抑制黑色素生成和抑制酪氨酸酶活性的效果，其中光甘草定效果较好。光甘草定、白藜芦醇、鞣花酸三者组合后，其抑制黑色素生成及抑制酪氨酸酶活性效果显著增强。将其中任何一种成分剔除，形成二者组合，均不具备明显协同性，且将光甘草定、白藜芦醇、鞣花酸三者组合中的任何一种成分替换成其它美白活性物，也均未形成明显协同美白效果。
[0103]
以上结果表明，光甘草定、白藜芦醇、鞣花酸三种成分组合具有明显的协同抑制黑色素合成及协同抑制酪氨酸酶活性的效果，且具备独特性，这使得本发明组合物具有更强的美白功效，并且能够降低单一成分的添加量，减少刺激，降低成本。
[0104]
试验例2dpph自由基清除实验
[0105]
1.1样品溶液的配制
[0106]
以dmso作为溶剂，将对比例1(光甘草定粉末)分别配制成摩尔浓度为4.3μm、13μm、38.9μm的样品溶液，进行试验。
[0107]
以dmso作为溶剂，将对比例2(鞣花酸粉末)分别配制成摩尔浓度为4.3μm、13μm、38.9μm的样品溶液，进行试验。
[0108]
以dmso作为溶剂，将对比例3(白藜芦醇粉末)分别配制成摩尔浓度为6μm、18μm、53.7μm的样品溶液，进行试验。
[0109]
以去离子水作为溶剂，将对比例4(传明酸粉末)分别配制成摩尔浓度为6μm、18μm、53.7μm的样品溶液，进行试验。
[0110]
以去离子水作为溶剂，将对比例5(烟酰胺粉末)分别配制成摩尔浓度为4.3μm、13μm、38.9μm的样品溶液，进行试验。
[0111]
以dmso作为溶剂，将对比例6(根皮素粉末)分别配制成摩尔浓度为4.3μm、13μm、38.9μm的样品溶液，进行试验。
[0112]
以dmso作为溶剂，将对比例7(由光甘草定、鞣花酸二者粉末等摩尔比混合)分别配制成样品溶液1(含有4.3μm光甘草定和4.3μm鞣花酸)、样品溶液2(含有13μm光甘草定和13μm鞣花酸)和样品溶液3(含有38.9μm光甘草定和38.9μm鞣花酸)，进行试验。
[0113]
以dmso作为溶剂，将对比例8(由鞣花酸、白藜芦醇二者粉末按摩尔比1:1.4混合)分别配制成样品溶液1(含有6μm白藜芦醇和4.3μm鞣花酸)、样品溶液2(含有18μm白藜芦醇和13μm鞣花酸)和样品溶液3(含有53.7μm白藜芦醇和38.9μm鞣花酸)，进行试验。
[0114]
以dmso作为溶剂，将对比例9(由光甘草定、白藜芦醇二者粉末按摩尔比1:1.4混合)分别配制成样品溶液1(含有6μm白藜芦醇和4.3μm光甘草定)、样品溶液2(含有18μm白藜芦醇和13μm光甘草定)和样品溶液3(含有53.7μm白藜芦醇和38.9μm光甘草定)，进行试验。
[0115]
以dmso作为溶剂，将对比例10(由光甘草定、烟酰胺、白藜芦醇三者粉末按摩尔比1:1:1.4混合)分别配制成样品溶液1(含有4.3μm光甘草定、4.3μm烟酰胺和6μm白藜芦醇)、样品溶液2(含有13μm光甘草定、13μm烟酰胺和18μm白藜芦醇)和样品溶液3(含有38.9μm光甘草定、38.9μm烟酰胺和53.7μm白藜芦醇)，进行试验。
[0116]
以dmso和去离子水作为溶剂，将对比例11(由光甘草定、鞣花酸、传明酸三者粉末按摩尔比1:1:1.4混合)分别配制成样品溶液1(含有4.3μm光甘草定、4.3μm鞣花酸和6μm传明酸)、样品溶液2(含有13μm光甘草定、13μm鞣花酸和18μm传明酸)和样品溶液3(含有38.9μm光甘草定、38.9μm鞣花酸和53.7μm传明酸)，进行试验。
[0117]
以dmso作为溶剂，将对比例12(由根皮素、鞣花酸、白藜芦醇三者粉末按摩尔比1:1:1.4混合)分别配制成样品溶液1(含有4.3μm根皮素、4.3μm鞣花酸和6μm白藜芦醇)、样品溶液2(含有13μm根皮素、13μm鞣花酸和18μm白藜芦醇)和样品溶液3(含有38.9μm根皮素、38.9μm鞣花酸和53.7μm白藜芦醇)，进行试验。
[0118]
以dmso作为溶剂，将实施例1(由光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇三者粉末按摩尔比1:1:1.4混合)分别配制成样品溶液1(含有4.3μm光甘草定、4.3μm鞣花酸和6μm白藜芦醇)、样品溶液2(含有13μm光甘草定、13μm鞣花酸和18μm白藜芦醇)和样品溶液3(含有38.9μm光甘草定、38.9μm鞣花酸和53.7μm白藜芦醇)，进行试验。
[0119]
以dmso作为溶剂，将实施例2(由光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇三者粉末按摩尔比1:8.6:1.4混合)分别配制成与实施例1同等浓度的样品溶液，进行试验。
[0120]
以dmso作为溶剂，将实施例3(由光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇三者粉末按摩尔比7.1:6.8:1混合)分别配制成与实施例1同等浓度的样品溶液，进行试验。
[0121]
以dmso作为溶剂，将实施例4(由光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇三者粉末按摩尔比1:7.5:17.1混合)分别配制成与实施例1同等浓度的样品溶液，进行试验。
[0122]
1.2实验原理
[0123]
dpph是一种稳定的以氮为中心的自由基，其在519nm波长处有最大吸收值。dpph的乙醇/甲醇溶液呈深紫色，当自由基清除剂加入到dpph溶液中时，dpph的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光值随之减小。因此，可通过吸光值减弱的程度来判断物质清除dpph自由基的能力。
[0124]
1.3实验方法
[0125]
(1)dpph溶液的配制
[0126]
称取dpph 0.05g，溶于适量无水乙醇中，超声30min后定容至100ml。该dpph溶液避
光保存，现配现用，3.5小时内用完。
[0127]
(2)正式实验
[0128]
a0值的测量：于酶标板加入无水乙醇50μl(一个样品做3个复孔)，随后取dpph溶液100μl加入到各个孔后，用保鲜膜封板，于37℃静置30min，置于酶标仪中在519nm处测吸光值a0。
[0129]
a值的测量：于酶标板各孔中加入不同浓度的样品溶液50μl(一个样品做3个复孔)，随后取dpph溶液100μl加入到各个孔后，用保鲜膜封板，于37℃静置30min，置于酶标仪中在519nm处测吸光值a。
[0130]
(3)结果统计
[0131]
dpph清除率(％)＝(a
0-a)/a0×
100；
[0132]
式中：a0为对照组吸光值，a为样品组的吸光值。
[0133]
半数清除浓度：以样品受试浓度为横坐标，dpph清除率为纵坐标，绘制曲线并根据拟合公式，求得当dpph清除率为50％时的样品浓度，即半数清除浓度(ic
50
)。ic
50
越小，代表样品清除dpph自由基的能力越强。
[0134]
1.4实验结果
[0135]
结果表2所示。
[0136]
表2dpph自由基清除率统计
[0137]
[0138][0139]
当细胞收到外界刺激(如紫外诱导)会产生氧化应激，而产生大量的自由基，加之，黑色素的生成过程为需氧反应，过多自由基的存在会加速黑色素的生成，因此，原料的抗氧活性，可以间接影响黑色素的生成。对于抗氧化能力这一指标，可利用dpph自由基清除的方法进行理化检测。
[0140]
由上述结果可知，光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇、传明酸、烟酰胺、根皮素作为美白活性成分均具备一定清除dpph自由基的能力，其中鞣花酸清除dpph自由基能力较高，其次是白藜芦醇、光甘草定和根皮素，烟酰胺和传明酸相对较弱。
[0141]
光甘草定、白藜芦醇、鞣花酸三者组成的组合物对dpph自由基清除能力明显提升。在低浓度下，实施例1的效果较鞣花酸提升了108.3％；中浓度下，实施例1效果较鞣花酸提升了43.5％；高浓度下，实施例1较鞣花酸效果提升了16.8％。将该实施例其中任何一种成分剔除，形成二者组合，均不具备明显协同性，且将该实施例中任何一种成分替换成其它美白活性物，也均未形成明显协同清除dpph自由基效果。
[0142]
以上结果表明，光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇三者组合可以明显提升其抗氧效果，三者组合在dpph自由基清除率上具备协同性。
[0143]
试验例3巨噬细胞促炎因子tnfα及促炎介质no抑制实验
[0144]
1.1样品溶液的配制
[0145]
以dmso作为溶剂，将对比例1(光甘草定粉末)配制成摩尔浓度为1μm的样品溶液，进行试验。
[0146]
以dmso作为溶剂，将对比例2(鞣花酸粉末)配制成摩尔浓度为1μm的样品溶液，进行试验。
[0147]
以dmso作为溶剂，将对比例3(白藜芦醇粉末)配制成摩尔浓度为1.4μm的样品溶液，进行试验。
[0148]
以去离子水作为溶剂，将对比例4(传明酸粉末)配制成摩尔浓度为1.4μm的样品溶液，进行试验。
[0149]
以去离子水作为溶剂，将对比例5(烟酰胺粉末)配制成摩尔浓度为1μm的样品溶液，进行试验。
[0150]
以dmso作为溶剂，将对比例6(根皮素粉末)配制成摩尔浓度为1μm的样品溶液，进行试验。
[0151]
以dmso作为溶剂，将对比例7(由光甘草定、鞣花酸二者粉末等摩尔比混合)配制成样品溶液(含有1μm光甘草定和1μm鞣花酸)，进行试验。
[0152]
以dmso作为溶剂，将对比例8(由鞣花酸、白藜芦醇二者粉末按摩尔比1:1.4混合)配制成样品溶液(含有1μm鞣花酸和1.4μm白藜芦醇)，进行试验。
[0153]
以dmso作为溶剂，将对比例9(由光甘草定、白藜芦醇二者粉末等摩尔比混合)配制成样品溶液(含有1μm光甘草定和1.4μm白藜芦醇)，进行试验。
[0154]
以dmso作为溶剂，将对比例10(由光甘草定、烟酰胺、白藜芦醇三者粉末按摩尔比1:1:1.4混合)配制成样品溶液(含有1μm光甘草定、1μm烟酰胺和1.4μm白藜芦醇)，进行试验。
[0155]
以dmso和去离子水作为溶剂，将对比例11(由光甘草定、鞣花酸、传明酸三者粉末按摩尔比1:1:1.4混合)配制成样品溶液(含有1μm光甘草定、1μm鞣花酸和1.4μm传明酸)，进行试验。
[0156]
以dmso作为溶剂，将实施例1(由光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇三者粉末按摩尔比1:1:1.4混合)配制成样品溶液(含有1μm光甘草定、1μm鞣花酸和1.4μm白藜芦醇)，进行试验。
[0157]
1.2实验原理
[0158]
炎症反应是机体针对各种外来刺激如微生物感染和组织损伤产生的一种生理性反应，主要有两种作用：(1)把效应细胞输送到病原体入侵部位，增强防御第一线巨噬细胞对病原体的杀伤；(2)提供一个生理屏障，防止感染扩散。但在过敏和痤疮引起的炎症反应中，免疫应答已经超出了正常范围，炎症反应反而会对组织造成损伤，敏感肌肤表现为红、肿、痛，痤疮肌肤则表现为红、肿、痛、流脓等。巨噬细胞能够促进和介导炎症。炎症部位的高浓度趋化因子可与巨噬细胞表面相应受体作用，诱导细胞活化并向感染部位募集。活化的巨噬细胞能释放各种促炎因子如il-1β、il-6和tnf-α，诱导和加强局部的炎症反应。lps是内毒素和重要群特异性抗原，能够和巨噬细胞上的lps受体结合，激活巨噬细胞释放促炎因子。通过lps诱导巨噬细胞释放促炎因子tnf-α，用elisa检测法检测tnf-α的含量。
[0159]
在炎症部位，no是一种具有高度活性的信号分子，对细胞功能具有重要调控作用。然而长期、过度的no会通过细胞毒性效应导致细胞和组织损伤，进而参与某些炎症性疾病的发生与发展。因此，抑制no的过量表达已经成为预防炎症反应和疾病的功效物质检测的一个重要指标。lps诱导巨噬细胞同样可促进趋化因子或炎症介质no或者pge2产生。这些炎症介质过量的产生，对人类具有不利的影响。在此可以通过化学法检测no含量变化。
[0160]
1.3实验方法
[0161]
(1)mtt法测试细胞毒性
[0162]
使用10％fbs的dmem培养基培养raw264.7细胞，接种至96孔板，24h后加入不同样品继续培养24h。弃去旧培养基，加入pbs清洗一次细胞后，再加入100μl含有0.5mg/ml的mtt溶液的完全培养基(现配现用)，放入培养箱中孵育4h吸尽培养孔中液体，每孔加入200μl dmso，490nm处测吸收值，以阴性对照为基准，计算细胞活率。当细胞活率大于90％，证明该浓度对细胞毒性较小，可用于后续实验。
[0163]
(2)no含量检测
[0164]
按照上述方法接种并处理细胞，收取细胞上清后，使用no试剂检测盒测定细胞上清中no含量变化，实验操作根据试剂盒说明书进行。
[0165]
(3)tnfα含量检测
[0166]
raw264.7细胞接种至24孔板后24h，加入1μg/ml的lps诱导细胞炎症产生，并同时设置空白组、对照组、样品处理组，24h后收取细胞上清，2000rpm离心10分钟，收集上清至新的ep管，即为待检测样品。使用elisa试剂盒检测细胞上清中tnfα含量变化，实验操作根据试剂盒说明书进行，按照标准曲线计算待测样品中tnfα的含量。
[0167]
1.4实验结果
[0168]
结果如图1、表3和表4所示。
[0169]
表3no抑制率统计结果
[0170][0171]
表4tnfα抑制率统计结果
[0172][0173]
炎症因子的大量释放可直接促进黑色素细胞的增殖，同时也可促进黑色素的生成，因此抑制炎症的能力可以一定程度上反应受试物的美白功效。而raw264.7作为巨噬细胞，具备分泌炎症因子及炎症介质的能力，在lps诱导炎症的情况下，可以根据其分泌炎症因子、炎症介质的含量判断受试物抑制炎症的效果。
[0174]
由图1、表3-4可知，光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇三者均具有一定的抗炎效果，其中鞣花酸效果较为一般，光甘草定效果居中，白藜芦醇效果较好，而实施例1抑制tnfα和no的效果有了明显提升，并且是明显优于各自单一成分。将该实施例1其中任何一种成分剔除，形成二者组合，均不具备非常明显协同性，且将该实施例1中，任何一种成分替换成其它美白活性物，其效果均劣于实施例1。
[0175]
以上结果表明，光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇三者组合可以明显提升其抗炎效果，该组合物在抑制tnfα和no的生成上具备协同性；该组合物在抗炎功效上的提升，更加有利于其美白功效的增强。
[0176]
试验例4mitf通路相关基因和蛋白表达抑制实验
[0177]
1.1样品溶液的配制
[0178]
以dmso作为溶剂，将对比例1(光甘草定粉末)配制成摩尔浓度为1μm的样品溶液，进行试验。
[0179]
以dmso作为溶剂，将对比例2(鞣花酸粉末)配制成摩尔浓度为1μm的样品溶液，进行试验。
[0180]
以dmso作为溶剂，将对比例3(白藜芦醇粉末)配制成摩尔浓度为1.4μm的样品溶液，进行试验。
[0181]
以dmso作为溶剂，将实施例1(由光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇三者粉末按摩尔比1:1:1.4混合)配制成样品溶液(含有1μm光甘草定、1μm鞣花酸和1.4μm白藜芦醇)，进行试验。
[0182]
1.2实验原理
[0183]
b16小鼠皮肤黑色素瘤细胞，其黑色素合成功能与人正常的皮肤黑色素细胞基本一致，故广泛被采用为美白化学物功效测定的受试细胞。α-msh为α-促黑色素，通过α-msh诱导b16细胞黑化模型，其不仅可促进b16细胞分泌黑色素，同时也会激活mitf相关通路基因、蛋白的表达，测定受试物对b16细胞mitf通路相关基因表达的影响。
[0184]
1.3实验方法
[0185]
(1)细胞培养与处理
[0186]
b16-f10细胞用1640完全培养基(1640培养基+体积分数10％的fbs+双抗)在37℃、5％co2的二氧化碳培养箱中培养，每2～3天传一次代。
[0187]
(2)细胞rna的提取及蛋白的制备
[0188]
rna：在六孔板内每孔加入细胞裂解溶液裂解细胞。在裂解液中加入三氯甲烷(与裂解液体积比为1：5)，充分震荡后，室温静置5min后放入4℃离心机中，以12000rpm离心15min。吸取上层无色液体至新的1.5ml离心管内，加入等体积的异丙醇，混匀后室温静置10min。在4℃离心机中，以12000rpm离心10min，去掉上清液。加入500μl75％乙醇。在4℃离心机中，7500rpm离心5min，弃去上清，室温放置晾干1～2min。加入适量depc水使rna沉淀充分溶解。
[0189]
蛋白：在六孔板内每孔加入细胞裂解溶液裂解细胞。于冰上将细胞裂解15min，以12000rpm离心15min，收集上清液，即为提取的蛋白样。收集细胞裂解液后用bca试剂盒测定蛋白质浓度后，将细胞裂解液与loadingbuffer(上样缓冲液)混合，煮沸5min使其完全变性。
[0190]
(3)cdna合成及rt-pcr
[0191]
本实验所使用的反转录试剂盒以及荧光定量pcr试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技有限公司。根据试剂盒说明按步骤进行，以相对定量的方式计算相关基因表达情况。
[0192]
(4)western blot
[0193]
电泳和转膜：根据page凝胶快速制备试剂盒的说明书配置电泳胶。将制好的蛋白样本及蛋白marker加入相应的胶孔中，分离胶(恒压)80-100v跑30min，浓缩胶(恒压)110-130v跑60-100min，关闭电压；取出胶后按需要对胶进行裁剪，并按实际大小裁剪合适的pvdf膜置于甲醇中激活，按照顺序将胶与pvdf膜置于转膜夹上，300ma横流转膜40-120min。
[0194]
封闭和孵育：转膜后适当裁剪pvdf膜，用tbst洗膜5min，随后用5％脱脂奶粉浸泡pvdf膜，于摇床上慢速摇晃封闭60min；用tbst洗去脱脂奶粉后，将稀释好的特异一抗浸泡
pvdf膜于4℃孵育过夜；tbst洗膜后将稀释好的二抗浸泡pvdf膜于室温孵育60min，随后弃去二抗用tbst洗膜。
[0195]
显影：根据试剂盒说明书配制显色液，将pvdf浸泡于显色液中反应1min，用凝胶成像显影pvdf膜，采集蛋白条带图片；用图像软件采集蛋白条带灰度值并分析处理。
[0196]
1.4实验结果
[0197]
结果如图2、图3、表5和表6所示。
[0198]
表5mitf通路相关基因表达的抑制率统计结果
[0199][0200]
表6tyr和trp2蛋白表达的抑制率统计结果
[0201][0202]
mitf是调控酪氨酸酶基因家族的重要上游靶点，其可入核调控下游多个与黑色素合成、转运、分布相关的基因/蛋白的表达，因此其在黑色素细胞的形态、生存、迁移、增殖和分化过程中有重要作用，mitf在黑色素瘤和色素沉着过度疾病中具有关键作用。黑素皮质素受体1(mc1r)作为黑色素细胞膜上的信号受体，当其与α-促黑素(α-msh)结合后，将启动下游一系列的信号转导，进一步激活mitf及其下游与黑色素合成相关蛋白的表达，从而加速黑色素的生成。另外，mitf可直接调控相关色素基因的转录，包括tyr、tyrp1、trp2、gpnmb和pmel等。其中tyr、tyrp1、trp2是酪氨酸酶基因家族中的3种酶，try是黑色素合成反应的关键酶，其参与了2种黑色素生成过程，而tyrp-1、trp-2在真黑素合成过程中发挥重要作用，tyrp-1具有5,6-二羟基吲哚-2-羧酸(dhica)氧化酶活性，trp-2可以快速地将多巴色素转化为dhica。pmel是黑素体蛋白中原纤维的结构基础，而gpnmb则对晚期黑素体的形成有
重要作用，其作用可能与黑素体的运输或转移到角化细胞有关。因此，通过降低mitf通路相关基因或蛋白水平或抑制mc1r受体可达到美白的目的。
[0203]
由图2、表5可知，α-msh的诱导可明显激活mitf相关通路基因的表达，包括mc1r、mitf、tyr、tyrp1、trp2、gpnmb、pmel的表达均出现明显上调，而光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇三种物质均可不同程度上抑制mitf通路这些相关基因的表达，但三者组合之后，其在抑制mitf通路相关基因的表达上有明显的增强，组合物的效果优于各自单一的组分。以上结果表明，经复配的组合物具有优秀的协同效果，能够显著抑制mitf信号通路上重要基因的表达，更有利于该组合物在化妆品中的应用。
[0204]
通过免疫印迹法对细胞中tyr蛋白和trp2蛋白的表达水平进行测定。如图3和表6所示，光甘草定、白藜芦醇、鞣花酸均能抑制黑色素细胞中tyr蛋白和trp2蛋白的表达，且在trp2蛋白的抑制上，光甘草定效果相对较鞣花酸、白藜芦醇强，而白藜芦醇的效果在三者中相对较弱。光甘草定、鞣花酸、白藜芦醇三者组合后表现出协同效应，组合物能够更好的抑制tyr和trp2蛋白的表达，在相同浓度下优于单体化合物。
[0205]
因此，q-pcr和蛋白免疫印迹实验均表明，经复配的组合物具有优秀的协同效果，能够显著抑制mitf信号通路上重要基因和蛋白的表达，表现出强大的美白功效。该组合物在低浓度下即可达到较强的美白功效，能够大大降低各成分在化妆品中的添加量，有利于避免单一成分添加量过高而导致的一系列皮肤问题。
[0206]
应用例1
[0207]
本应用例提供一种含有本发明组合物的乳液，该乳液的具体配方如表7所示，总质量分数按100％计。
[0208]
表7乳液配方
[0209][0210]
上述乳液可通过本领域常规制备方法制得。
[0211]
应用例2
[0212]
本应用例提供一种含有本发明组合物的膏霜，该膏霜的具体配方如表8所示，总质量分数按100％计。
[0213]
表8膏霜配方
[0214][0215]
[0216]
上述膏霜可通过本领域常规制备方法制得。
[0217]
不难想到的是，应用例1的乳液和应用例2的膏霜，由于均使用了本发明组合物，该组合物中的光甘草定、鞣花酸和白藜芦醇发挥协同增效作用，从抑制酪氨酸酶活性、抑制小眼畸形相关转录因子(mitf)信号通路、抑制氧化应激、抑制炎症多种美白相关机制路径进行调控，从而具有优异的美白效果。同时该组合物在较低浓度下表现出优异的美白效果，降低了使用单一高浓度化学成分所带来的刺激等副作用，安全性更高，且兼具优异的抗炎和抗氧化效果。因此，这些化妆品，由于其中添加有本发明组合物，从而也具有优异的美白、抗炎和抗氧化效果。
[0218]
以上对本发明的较佳实施方式进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。

技术特征：
1.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括组分：光甘草定、鞣花酸和白藜芦醇。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述光甘草定在所述组合物中的添加量为5wt％-50wt％。3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述鞣花酸在所述组合物中的添加量为35wt％-80wt％。4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述白藜芦醇在所述组合物中的添加量为5wt％-60wt％。5.权利要求1-4任一项所述的组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述光甘草定、鞣花酸和白藜芦醇混合，得到所述组合物。6.一种化妆品，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的组合物。7.根据权利要求6所述的化妆品，其特征在于，所述化妆品的剂型选自霜剂、乳液、精华液、水剂、油剂、凝胶或面膜。8.根据权利要求6所述的化妆品，其特征在于，所述组合物在所述化妆品中的添加量≤20wt％。9.一种乳液，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的组合物。10.一种膏霜，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的组合物。

技术总结
本发明属于化妆品技术领域，公开了兼具美白、抗氧、抗炎功效的组合物及制备方法和应用。该组合物包括组分：光甘草定、鞣花酸和白藜芦醇；通过光甘草定、鞣花酸和白藜芦醇发挥协同增效作用，从抑制酪氨酸酶活性、抑制小眼畸形相关转录因子(MITF)信号通路、抑制氧化应激、抑制炎症多种美白相关机制路径进行调控，从而具有优异的美白效果；同时该组合物在较低浓度下表现出优异的美白效果，降低了使用单一高浓度化学成分所带来的刺激等副作用，安全性更高，且兼具优异的抗炎和抗氧化效果。且兼具优异的抗炎和抗氧化效果。且兼具优异的抗炎和抗氧化效果。


技术研发人员：黄洁 谢翀 潘志 陈庆生
受保护的技术使用者：广州环亚化妆品科技股份有限公司
技术研发日：2023.07.13
技术公布日：2023/9/23