一种补骨脂生物酶法加工方法与流程

1.本发明为中药加工领域，具体涉及一种补骨脂生物酶法加工方法。


背景技术：

2.补骨脂为豆科植物补骨脂(psoralea corylifolia l)的干燥成熟果实，性温，味辛、苦，主归脾、肾两经，具有温肾壮阳、固精缩尿、温脾止泻之功效。广泛用于肾阳不足、腰膝冷痛、阳痿遗精、遗尿尿频、五更泄泻、肾虚作喘、白癜风、出血热等病症。补骨脂已有千余年药用历史，自南北朝至清末的医疗文献中，至少有88部记载有它的炮制方法。现代研究表明，补骨脂具有扩张血管，增加心肌收缩力，抑菌、抗病毒，雌性激素样作用等生理活性。
3.中国药典规定补骨脂中(异)补骨脂素的含量不得低于0.7％。但在补骨脂药材的现代栽培中，每年新产补骨脂药材的补骨脂素和异补骨脂素总含量常常达不到《中国药典》规定的最低要求0.70％。经常出现不合格的情况，使得补骨脂中药资源造成极大浪费，打击药农的栽培信心。如何提高补骨脂药材中补骨脂素和异补骨脂素的含量值我们去探索。经过本发明人反复实验研究，发现在补骨脂药材加工炮制过程中，使用生物酶发酵法能促进补骨脂中有效成分转化，能够大幅提高补骨脂药材中补骨脂素和异补骨脂素的含量，为此完成本发明。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提高补骨脂中有效成分转化，进而提供一种补骨脂生物酶法加工方法。该方法不但能大幅提高补骨脂药材中补骨脂素和异补骨脂素的含量，而且方法可靠、稳定。
5.为实现本发明的目的提供如下实施技术方案。
6.在一技术方案中，本发明的一种补骨脂生物酶法加工方法，包括以下步骤：
7.1)酶液提取和培养
8.将补骨脂药材打碎成粉，加水制成补骨脂浆,再加入磷酸盐缓冲液提取1.5-2.5小时，过滤分离，取提取液加入到改良马丁培养基中，在23～28℃培养4-6天；
9.2)酶液分离
10.收集上步培养好的菌液，离心分离，取上清液，调节ph值至6-7，即得酶液；
11.3)生物酶反应培养
12.将上步分离得到的酶液按酶液与水1：(40-60)的体积比加水稀释，调整稀释酶液的ph为6-7，均匀喷洒在补骨脂药材上，加水使药材水分达到85-95％，在温度34-36℃、湿度85-95％环境下放置4-6天，中间间断翻搅，完成酶促反应干燥，即得加工后的补骨脂药材。
13.优选的，上述本发明的加工方法，步骤1)中，所述磷酸盐缓冲液为0.3％磷酸盐缓冲液，其与所述补骨脂药材的体积质量为(1.8-2.2)：1ml/g，更优选为2：1，提取时间为2小时。
14.优选的，上述本发明的加工方法，步骤1)中，所述改良马丁培养基，由以下方法制
得：取胨5.0g、磷酸氢二钾1.0g、酵母浸出粉2.0g和硫酸镁0.5g混合，加入水1000ml溶解，调节ph值为6.4-6.7，优选为6.5，煮沸，加入葡萄糖20.0g溶解后，摇匀，纱布滤清，调节ph值，使灭菌后的ph值为6.5
±
0.2，灭菌即得。
15.优选的，上述本发明的加工方法，步骤1)中所述培养，培养基的温度为25℃培养时间为5天。
16.优选的，上述本发明的加工方法，步骤2)所述的离心分离，具体为：将收集到的菌液加入离心管内，5000r/min冷冻离心20min，收集上清液，弃去沉淀，调ph值到6.5，即得。
17.优选的，上述本发明的加工方法，步骤3)中，酶液与水的体积比为1：50，稀释酶液的ph为6.5。
18.优选的，上述本发明的加工方法，步骤3)中，所述药材水分为90％，所述温度为35℃、所述湿度为90％，放置时间为5天。
19.优选的，上述本发明的加工方法，步骤3)中，所述干燥为烘干处理法，具体为将药材沥干后放置至表面微干，置于烘箱中，在60℃下烘干处理，待药材水分达到10％左右即可。
20.上述步骤2)中所说的培养好的菌液，实质是步骤1)的补骨脂药材的磷酸缓冲液提取物经改良马丁培养基培养发酵得到的发酵液，其中含有生物酶。
21.在一具体实施技术方案中，本发明的本发明的一种补骨脂生物酶法加工方法，包括以下步骤：
22.1)酶液提取和培养：
23.将补骨脂药材打碎成粉，加水制成补骨脂浆，再加入0.3％磷酸盐缓冲液提取2小时，过滤分离，取提取液加入到改良马丁培养基中，在23～28℃培养5天，其中，补骨脂与磷酸盐缓冲液的质量体积比为1：2g/ml；
24.2)酶液分离：
25.收集上步培养好的菌液，离心分离，5000r/min冷冻离心20min，取上清液，调ph值到6.5，即得酶液；
26.3)生物酶反应培养
27.将上步分离得到的酶液按酶液与水1：50的体积比加水稀释，调整稀释酶液的ph为6.5，均匀喷洒在补骨脂药材上，加水使药材水分达到90％，在温度35℃、湿度90％环境下放置5天，中间间断翻搅，完成发酵后，将药材沥干，放置至表面微干，置于烘箱中，在60℃下烘干处理，待药材水分达到10％左右，即得加工后的补骨脂药材。
28.在上述具体实施技术方案中，步骤1)中，所述改良马丁培养基，由以下方法制得：取胨5.0g、磷酸氢二钾1.0g、酵母浸出粉2.0g和硫酸镁0.5g混合，加入水1000ml，微热溶解，调节ph值为6.5，煮沸，加入葡萄糖20.0g溶解后，摇匀，纱布滤清，调节ph值，使灭菌后的ph值为6.5
±
0.2，分装，灭菌，即得改良马丁培养基。
29.技术效果：本发明的补骨脂药材生物酶法加工方法，通过自制生物酶培养、发酵补骨脂药材，有效促进了补骨脂素和异补骨脂素的转化，大大提高了补骨脂有效成分的转化率，显著提升了补骨脂素和异补骨脂素的含量，显著超过中国药典规定的0.70％的低限；使补骨脂药材中的补骨脂素和异补骨脂素的总量提高94.09％～134.02％，而且该加工方法可靠、稳定。
附图说明
30.图1为补骨脂几种加工炮制方式(异)补骨脂素总含量及总转化率对比图。
具体实施方式
31.以下实施例为典型的，用于进一步理解和阐明本发明的实质，但不以任何方式限制本发明的范围。
32.以下实施例中，涉及(异)补骨脂素含量检测，所用仪器：岛津lc-20a hplc，vwd，电子天平mettler toledo xp205。中国食品药品检定研究院对照品：补骨脂素110739-201918；异补骨脂素：110738-202016；补骨脂中药材样品采购于成都国际商贸城。
33.色谱条件：waters柱(c18，250mm
×
4.6mm，5μm)，流动相甲醇-水(55:45)，流速1.0ml/min，检测波长246nm，vwd，35℃；进样量：10μl。
34.同时对本发明的生物酶法加工方法中，对生物酶促反应过程中的多因素进行考察研究，包括时长，温度，湿度，提取溶剂ph等，见下表1。对3批药材进行条件筛选实验，优选出最佳的反应条件。
35.表1生物酶促反应因素考察表
[0036][0037]
实施例1生物酶促时长考察
[0038]
制备生物酶促反应补骨脂药材样品
[0039]
生物酶液的制备：将100g补骨脂药材于破壁机中进行粉碎，加水100ml制成补骨脂浆，加0.3％磷酸盐缓冲液提取2小时。分离出提取液，加入到改良马丁培养基罗氏瓶中，培养约5天(23～28℃培养)。
[0040]
改良马丁培养基成分(胨5.0g，磷酸氢二钾1.0g，酵母浸出粉2.0g，硫酸镁0.5g，葡萄糖20.0g，水1000ml)。培养基的配制：除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节ph值约为6.5，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，纱布滤清，调节ph值使灭菌后为6.5
±
0.2，分装，灭菌。
[0041]
生物酶促反应：将提取液经发酵得到的菌液立即分装在的离心管内,5000r/min冷冻离心20min，取上清液作为酶液。将酶液与水按1：50体积比混合成稀释酶液，调整ph为6.5，均匀喷洒在补骨脂药材上，将药材置于温度35℃、湿度90％的环境中，每批准备五份样品，放置，中间间断翻搅，分别在第1，2，3，5，7天取样，将药材60℃烘干处理，得到供试品，制备3批供试品。取各批次供试品，粉碎成粉末(过三号筛)，精密称取约0.5g，置索氏提取器中，加甲醇适量，加热回流提取2小时，放冷，转移至100ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得进高效液相色谱含量测定。进行数据处理与分析，各批次检测结果取平均值如下见表2-4的数据1-3。
[0042]
表2生物酶促时长考察数据1
[0043][0044]
表3生物酶促时长考察数据2
[0045][0046]
表4生物酶促时长考察数据3
[0047][0048]
生物酶促时长考察，由上表2-4的结果可知，三个批次供试品补骨脂素含量在第5天为0.55％，0.49％，0.65％；在第7天为0.57％，0.49％，0.64％；异补骨脂素含量在第5天为0.56％，0.54％，0.74％；在第7天为0.57％，0.53％，0.76％；补骨脂素与异补骨脂素总含量在第5天含量值为1.11％，1.03％，1.39％，第7天含量值为1.14％，1.02％，1.39％，到第7天已经无再增长，第5天与第7天已无明显差异，从能源、环保与成本考虑，选择生物酶促反应时长为5天。
[0049]
实施例2生物酶促温度考察
[0050]
制备生物酶促反应补骨脂药材样品
[0051]
制备方法参照实施例1，酶促反应时长为5天，分别考察药材置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃酶促温度环境中酶促反应，其它条件不变，制备样品检测结果如下表5-7。
[0052]
表5生物酶促温度考察数据1
[0053][0054]
表6生物酶促温度考察数据2
[0055][0056]
表7生物酶促温度考察数据3
[0057][0058]
生物酶促温度考察，由上表5-7数据可知，三个批次供试品骨脂素含量35℃达到峰值0.52％，0.48％，0.61％；异补骨脂素含量在35℃达到峰值0.54％，0.51％，68％；补骨脂素与异补骨脂素总含量在35℃达到峰值1.06％，0.99％，1.29％，选择生物酶促反应温度为35℃。
[0059]
实施例3生物酶促湿度考察
[0060]
制备生物酶促反应补骨脂药材样品
[0061]
制备方法参照实施例1，酶促反应时长为5天，酶促反应温度为35℃，分别考察药材置于50％、60％、70％、80％、90％环境中酶促湿度环境中酶促反应，其它条件不变，制备样品进行检测，进行数据处理与分析，结果如下表8-10：
[0062]
表8生物酶促湿度考察数据1
[0063][0064]
表9生物酶促湿度考察数据2
[0065][0066]
表10生物酶促湿度考察数据3
[0067][0068]
生物酶促湿度考察，由上分析图可知，三个批次供试品补骨脂素含量在90％达到峰值0.51％,0.58％,0.62％；异补骨脂素含量在90％达到峰值0.48％，0.52％，0.62％，补骨脂素与异补骨脂素总含量在90％达到峰值0.99％，1.10％，1.24％，选择生物酶促反应湿度为90％。
[0069]
实施例4生物酶促ph值考察
[0070]
制备生物酶促反应补骨脂药材样品
[0071]
制备方法参照实施例1，酶促反应时长为5天，酶促反应温度为35℃和湿度90％，分别考察酶稀释液的ph5.5、ph6.0、ph6.5、ph7.0、ph7.5因素对药材的酶促反应，其它条件不变，制备样品进行检测，进行数据处理与分析，结果如下表11-13。
[0072]
表11生物酶促ph考察数据1
[0073]
[0074]
表12生物酶促ph考察数据2
[0075][0076][0077]
表13生物酶促ph考察数据3
[0078][0079]
生物酶促ph考察结果，由上表11-13的数据可知，三个批次供试品补骨脂素含量在ph6.5达到峰值0.52％，0.57％，0.66％；异补骨脂素含量在ph6.5达到峰值0.48％，0.54％，0.63％；补骨脂素与异补骨脂素总含量在ph6.5达到峰值1.00％，1.11％，1.29％，选择生物酶促ph为6.5。
[0080]
实施例5补骨脂生物酶法加工
[0081]
1、酶液提取、培养：采用溶剂浸提取方法
[0082]
将取100g补骨脂药材于破壁机中进行粉碎，加水100ml制成补骨脂浆，加0.3％磷酸盐缓冲液200ml提取2小时,过滤分离提取液。将提取液加入改良马丁培养基罗氏瓶中，培养约5天(23～28℃培养)。
[0083]
改良马丁培养基成分为：胨5.0g，磷酸氢二钾1.0g，酵母浸出粉2.0g，硫酸镁0.5g，葡萄糖20.0g，水1000ml。培养基配制方法：除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节ph值约为6.5，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，纱布滤清，调节ph值使灭菌后为6.5
±
0.2，分装，灭菌。
[0084]
2、酶液分离
[0085]
将培养好的菌液收集，采用离心的方法。收集上步提取液经酵母发酵、培养好的菌液，立即分装在的离心管内，5000r/min冷冻离心20min。收集上清液，弃去沉淀，调ph值到6.5，即得酶液。
[0086]
3、生物酶反应培养：采用生物酶反应的方法
[0087]
将提取出来的酶液进行酶液：水(1：50)混合成稀释酶液，调整ph为6.5，装在喷洒壶内。将补骨脂药材放在容器中，均匀喷洒稀释酶液在补骨脂药材上，加水使药材水分达到90％左右，将药材置于温度35℃，湿度90％的环境中，放置5天，中间间断翻搅，防止局部温度过高而产生腐烂，影响生物酶反应。
[0088]
4、干燥：采用烘干法处理。
[0089]
将上步培养后补骨脂药材沥干，放置至表面微干，将药材置于烘箱中，设置60℃烘干处理，待药材水分达到10％左右，将药材分装作为样品(即生物酶法加工后的补骨脂)。
[0090]
实施例6生物酶促法及其它方法加工对比研究
[0091]
清炒制品：净补骨脂用文火炒至有噼啪声，微鼓起。
[0092]
雷公炮制法制品：净制过的补骨脂生品用黄酒(药材与黄酒重量比1∶1.5)泡1d，沥干多余黄酒，再用水(药材与水重量比1∶1.5)泡3d，沥干多余水，蒸6h，晾干。
[0093]
生物酶法制品：按实施例5的加工方法制得到补骨脂炮制品。
[0094]
分组：生药组，清炒组，雷公炮制组，生物酶促组，各组取7批药材进行试验，进高效液相色谱含量测定。进行数据处理与分析，各批次检测结果如下见表15的数据。通过对检测组数据进行对比，发现生物酶法组补骨脂素和异补骨脂素转化率最高，总转化率也是最高的。
[0095]
由上表1、5、8结果可知，各实验组的批样品中补骨脂素和异补骨脂素含量(％)中，补骨脂素含量，清炒组、雷公炮制组、生物酶促组均高于生药组数据；补骨脂素含量大小：清炒组《雷公炮制组《生物酶促组。
[0096]
各实验组的批样品中补骨脂素和异补骨脂素的总含量和总转化率如下表15。
[0097][0098][0099]
由表14的数据和图1所示可知，补骨脂几种加工炮制方式的补骨脂素与异补骨脂素的总含量及总转化率，清炒组转化率在108.61％-120.18％之间；雷公炮制组转化率在108.79％-128.44％之间；生物酶促组转化率在194.09％-234.02％之间，转化率为最高组，由此可见，生物酶促法在补骨脂素和异补骨脂素总含量的提高方面，效果显著。
[0100]
综上，补骨脂药材在现代栽培中，每年新产补骨脂素和异补骨脂素的总含量达不到《中国药典》的最低规定0.70％，经常出现不合格情况，使得中药资源得到极大浪费，打击药农的栽培信心。本发明人经过对补骨脂药材的加工炮制方法的进一步研究，在加工炮制研究过程中，发现本发明使用生物酶促法能促补骨脂中有效成分转化，使补骨脂素和异补骨脂素的总量提高94.09％-134.02％。本发明的生物酶促法加工方法使补骨脂药材中的补骨脂素和异补骨脂素的总含量得到显著的提高，极大地提高补骨脂中药的疗效，增强中药材补骨脂的治疗效果。

技术特征：
1.一种补骨脂生物酶法加工方法，包括以下步骤：1)酶液提取和培养：将补骨脂药材打碎成粉，加水制成补骨脂浆,再加入磷酸盐缓冲液提取1.5-2.5小时，过滤分离，将提取液加入到改良马丁培养基中，在23～28℃培养4-6天；2)酶液分离：收集上步培养好的菌液，离心分离，收集上清液，调节ph值至6-7，即得酶液；3)生物酶反应培养：将上步分离得到的酶液按酶液与水1：(40-60)的体积比加水稀释，调整稀释酶液的ph为6-7，均匀喷洒在补骨脂药材上，加水使药材水分达到85-95％，在温度34-36℃、湿度85-95％环境下放置4-6天，中间间断翻搅，酶促反应完后，干燥，即得加工后的补骨脂药材。2.如权利要求1所述的加工方法，步骤1)中，所述磷酸盐缓冲液为0.3％磷酸盐缓冲液，其与所述补骨脂药材的体积质量比为(1.8-2.2)：1ml/g，提取时间为2小时。3.如权利要求1所述的加工方法，步骤1)中，所述改良马丁培养基，由以下方法制得：取胨5.0g、磷酸氢二钾1.0g、酵母浸出粉2.0g和硫酸镁0.5g混合，加入水1000ml溶解，调节ph值为6.4-6.7，煮沸，加入葡萄糖20.0g溶解后，摇匀，滤清，调节ph值，使灭菌后的ph值为6.5
±
0.2，灭菌即得。4.如权利要求1所述的加工方法，步骤1)中所述培养，培养液的温度为25℃，培养时间为5天。5.如权利要求1所述的加工方法，步骤2)所述的离心分离，具体为：将收集到的菌液加入离心管内，5000r/min冷冻离心20min，收集上清液，弃去沉淀，调ph值到6.5，即得。6.如权利要求1所述的加工方法，步骤3)中，酶液与水的体积比为1：50，稀释酶液的ph为6.5。7.如权利要求1所述的加工方法，步骤3)中，所述药材水分为90％，所述温度为35℃，所述湿度为90％，放置时间为5天。8.如权利要求1所述的加工方法，步骤3)中，所述干燥为烘干处理法，具体为将药材沥干后放置至表面微干，置于烘箱中，在60℃下烘干处理，待药材水分达到10％左右即可。9.如权利要求2所述的加工方法，步骤1)中，0.3％磷酸盐缓冲液与所述补骨脂药材的体积质量比为2：1ml/g。

技术总结
本发明公开了一种补骨脂生物酶法加工方法，包括将补骨脂粉加水制成补骨脂浆，加入磷酸盐缓冲液提取，提取液加入到改良马丁培养基中培养，离心分离制得酶液，按1：50体积比加入水稀释，调节pH为6.5，喷洒在补骨脂药材上，加水使药材水分达到90％，在温度35℃、湿度90％的环境下放置5天，中间间断翻搅，完成培养后干燥，即得加工后的补骨脂药材。该方法有效提高补骨脂有效成分的转化率，使补骨脂药材中的补骨脂素和异补骨脂素的总量显著提高，提高治疗效果，且该方法可靠，稳定。稳定。


技术研发人员：吕紫璇 陈亚 唐瑜 陈建
受保护的技术使用者：重庆市涪陵食品药品检验所
技术研发日：2023.07.13
技术公布日：2023/9/23