鸡RLN3基因启动子区SNP标记及其在鸡育种中的应用

鸡rln3基因启动子区snp标记及其在鸡育种中的应用
技术领域
1.本发明涉及分子遗传学技术领域，具体涉及一种鸡rln3基因启动子区snp标记及其在鸡育种中的应用。


背景技术：

2.relaxin 3是松弛素家族成员，是一种蛋白质编码基因，简称为rln3，又称为insl7。它位于z染色体，存在1个内含子和2个外显子，cdna序列包含1009bp开放阅读框，编码192个氨基酸。研究表明rln3是松弛素家族成员中最原始的多肽，与其他的松弛素家族成员有相对较低的序列同源性，但b链上rxxxrxxi/v结构域是保守的(wilkinson et al.，2005b)。rln3与胰岛素超家族的其他成员相比，主要在中枢神经系统中，在脊椎动物中高度保守，参与广泛的神经活动，如对压力和认知的反应，以及神经系统疾病(smith et al.，2011)。
3.rln3基因在人类、猕猴、啮齿动物和鱼等几个物种中保守，这表明它起着重要的生物学作用(wilkinson et al.，2005b)。在人类中，rln3主要位于大脑内，参与压力、记忆和食欲调节，在睾丸中也存在大量表达(higgins et al.，2010；mcgowan et al.，2014；mcgowan et al.，2009；ryan et al.，2013；smith et al.，2014)；在恒河猴中，rln3在脑和精巢表达(silvertown et al.，2010)；在啮齿类动物中，rln3与食物摄入和应激反应的调节有关(mcgowan et al.，2007)；rln3基因也在包括鱼类在内的许多低等脊椎动物中复制(wilkinson et al.，2005a)。例如，在硬骨鱼中，已经鉴定出与rln3密切相关的两种肽rln3a和rln3b(yang et al.，2020)。
4.随着对rln3研究的深入，发现其生物学作用广泛。在人类中，rln3基因多态性与肥胖、高胆固醇血症和糖尿病有关(munro et al.，2012)，这表明rln3信号传导参与能量代谢的调节。亦有研究表明血浆rln3水平与ais患者的关节松弛呈正相关，利用crispr/cas3系统构建了rln3敲除小鼠的模型，rln3敲除术后脊柱侧凸发病率显著降低，rln3和rxfp3激活的抗纤维化作用可能会加重ais的发病机制，并为预防这种疾病提供了潜在的靶点治疗(zhang et al.，2022)。rln3是免疫相关基因，可能在hcc、kras突变型crc和luad的进展和预后中发挥重要作用(liu et al.，2021；wang et al.，2022；zhang et al.，2019)。
5.分子遗传标记是采用分子生物学技术来优化畜禽品种的一种方法，主要的理论依据是分子数量遗传学和分子遗传学。单核苷酸多态性(snps)、随机扩增dna多态性(rapd)和扩增片段长度多态性(aflp)均是常用的dna分子标记(刘福平，2008)。在基因组水平上由单个的核苷酸变异所引起的dna序列的多态性称为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)，包括碱基的转换、插入及缺失等形式(段芳，2011)。
6.目前还未见有鸡rln3基因启动子区snp标记与鸡产蛋性能的相关报道，因此，研究rln3基因的5
′
启动子区snps，有助于找出有意义的分子标记，为标记辅助育种提供有利的理论依据，方便快速地选育出早产、高产的品种。


技术实现要素：

7.针对上述现有技术，本发明的目的是提供鸡rln3基因启动子区snp标记及其在鸡育种中的应用。本发明研究发现鸡rln3基因5
′
调控区存在两个与鸡产蛋性状相关的snp标记，可用于鸡的分子标记辅助育种。
8.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.本发明的第一方面，提供一种鸡rln3基因启动子区与产蛋性状关联的snp标记方法，其具体标记方法是：
10.采用seq id no.1和seq id no.2所示的标记引物扩增鸡育种材料的基因组dna，pcr扩增产物的序列如seq id no.3所示，具体如下：
[0011][0012][0013]
注：序列中的加粗阴影处的核苷酸为snp位点。
[0014]
结果在鸡rln3基因启动子区检测到两个与鸡开产日龄、产蛋数和最大连产数相关的snp位点，即seq id no.3中第637位碱基是g或c(g.-655g》c)，第700位碱基是g或a(g.-592g》a)。
[0015]
g.-655g》c和g.-592g》a的位置，是以转录起始位点(tss)为+1，往上游为负，往下游为正。
[0016]
本发明的第二方面，提供snp标记在鸡遗传育种中的应用；所述snp标记来自鸡rln3基因，所述snp标记为对应于如seq id no.3所示序列自5
′
端起第637位碱基是g或c，第700位碱基是g或a。
[0017]
进一步的，上述应用中，所述鸡遗传育种包括：开产日龄早、产蛋数多和/或最大连产数高的蛋鸡品种选育。
[0018]
进一步的，上述应用中，所述snp标记的cc-655
aa-592
基因型个体表现出开产日龄早、产蛋数高、最大连产数高的产蛋性状。
[0019]
所述cc-655
aa-592
基因型个体是指该个体的rln3基因5'调控区在g.-655位点的基因型为cc，在g.-592位点的基因型为aa。
[0020]
本发明的第三方面，提供用于检测上述snp标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。
[0021]
本发明的第四方面，提供一种用于检测上述snp标记的试剂盒，所述试剂盒中包含seq id no.1和seq id no.2所示的引物对。
[0022]
本发明的第五方面，提供上述引物对和/或试剂盒在辅助选育开蛋鸡品种中的应用；所述蛋鸡品种具有开产日龄早、产蛋数高和/或最大连产数高的产蛋性状。
[0023]
本发明的第六方面，提供一种利用上述snp标记辅助选育开产日龄早、产蛋数高和/或最大连产数高蛋鸡品种的方法，包括以下步骤：
[0024]
在鸡群体中，选择基因型为cc-655
aa-592
的公鸡和基因型为cc-655
aa-592
的母鸡，纯繁得到，得到cc-655
aa-592
基因型的后代；cc-655
aa-592
基因型的后代母鸡的开产日龄早于其他基因型，产蛋数和最大连产数高于其他基因型。
[0025]
本发明的有益效果：
[0026]
本发明通过品种间snps的筛选，发现鸡rln3基因启动子区存在多个snp位点；并首次将枣庄孙枝鸡群体的snps基因型与产蛋性状进行关联分析，发现cc-655
基因型个体对应着更早的开产日龄；aa-592
基因型个体对应着更高的最大连产数，因此，通过检测这两个与产蛋性状相关联的分子标记，不仅方法简便快捷，并且有助于选育高产蛋鸡品种，为育种工作提供有利的帮助。
附图说明
[0027]
图1为rln3基因启动子关键调控区的多态性。
[0028]
图2为p-rln3-f/r引物pcr扩增的片段电泳图。
[0029]
图3为鸡rln3 5
′
调控区-655和-592位点的多态性图。
[0030]
图4为突变载体pgl3-(-655c)和pgl3-(-592g)与pgl3-rln3的序列比对。
[0031]
图5为snps对rln3启动子转录活性的影响。
具体实施方式
[0032]
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0033]
如前所述，rln3基因是一个多功能的基因。为深入研究rln3基因与蛋鸡品种选育之间的关联性，发明人利用dnaman 6.0软件分析不同蛋鸡品种rln3基因的序列，进行品种间多态位点的筛选，筛选到的多态性位点信息如图1所示，通过与ncbi上的rln3基因序列比对发现不同品种间可能存在g.-2,854g》a、g.-2,768c》a、g.-2,764c》g、g.-2,680a》t、g.-2,
655g》t、g.-1186c》a、g.-1,128c》t、g.-1046a》g、g.-1,021g》c、g.-916c》t、g.-885c》t、g.-860c》t、g.-655g》c、g.-592g》a、g.-372t》a和g.-282g》c等16个候选snps。
[0034]
然后再通过分析候选snps在不同品种群体内的等位基因频率、等位基因型频率，再以具有生产记录的枣庄孙枝鸡群体(208只)的基因型统计结果为基础，运用ibm spss statistics 27软件中单因素方差分析方法将每个个体的基因型与产蛋性状(afe：开产日龄；
[0035]
e38：38周产蛋数及lcs：最大连产)进行关联分析，最终发现：多态位点g.-655(g》c)的基因型与产蛋性状的关联分析显示其与开产日龄显著相关(p《0.05)，且cc基因型个体对应着更早的开产日龄(afe：129.333天)；g.-592位点的aa基因型个体对应着更多的产蛋数(e38：87.583个)，该基因型个体的最大连产数也更高(lcs：8.167个)，且差异显著(p《0.05)。说明这两个多态位点的纯合基因型分别与开产日龄和最大连产数的性状相关联。基于这两个多态位点可用于优良蛋鸡品种的选育，由此提出了本发明。
[0036]
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
[0037]
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
[0038]
实施例1：鸡rln3基因5
′
调控区序列的克隆测序、序列比对及突变位点分析
[0039]
1.试验材料
[0040]
日照琅琊鸡基因组(山东纪华家禽育种有限公司)。
[0041]
2.试验方法
[0042]
2.1引物设计
[0043]
根据已发表红色原鸡序列(genbank accession nc_052572.1)设计引物p-rln3-f和p-rln3-r(其序列如seq id no.1和seq id no.2所示)。
[0044]
2.2pcr扩增
[0045]
随机选取日照琅琊鸡30个个体的基因组混池作为模版，用引物p-rln3-f和p-rln3-r进行pcr扩增。引物见表1，反应体系25μl，其中包括1μl基因组dna(50-100ng)，12.5μl 2
×
phanta max master mix(诺唯赞)，上下游引物各1μl(10μm)，ddh2o补足至25μl。扩增程序：95℃预变性3min；95℃变性15sec，退火15sec(退火温度如表1)，72℃延伸1min 35sec，进行34个循环；循环结束后彻底延伸72℃孵育5min。
[0046]
2.3克隆测序
[0047]
pcr扩增产物经1.0％琼脂糖电泳分离后切取目的带，用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(康为世纪)纯化pcr产物，将纯化产物连接到pgl3-baic载体(promega)，并转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，包含目的片段的重组质粒纯化后测序(华大基因，青岛)。
[0048]
表1:引物的序列、退火温度和产物长度
[0049]
[0050]
3.结果与分析
[0051]
pcr产物电泳见图2，目的片段长度1512bp。
[0052]
使用dnaman比对序列同源性和完成突变核苷酸的检索。对测序结果分析，发现扩增的日照琅琊鸡rln3基因5
′
调控区-655位点存在g》c突变，而-592位点存在g》a突变(见图3)。
[0053]
实施例2：鸡rln3 5
′
调控区-655bp和-592bp突变与开产日龄、产蛋数和最大连产数的关联分析
[0054]
1、试验材料
[0055]
京红1号蛋鸡44只(血液样本来自华中农业大学李世军课题组)，日照琅琊鸡45只(山东纪华家禽育种股份有限公司)，济宁百日鸡37只(济宁大唐百日鸡保种场)以及枣庄孙枝鸡414只(其中有产蛋记录的208只，枣庄市佛脚崖禽业养殖专业合作社)，以上均为随机采样，翅静脉三角区采血，提取基因组后，-20℃保存。
[0056]
2、试验方法
[0057]
2.1pcr扩增
[0058]
以京红1号蛋鸡、日照琅琊鸡和有生产性能记录的枣庄孙枝鸡基因组为模版，进行pcr扩增。引物见表1，反应体系25μl，其中包括1μl基因组dna(50-100ng)，12.5μl 2
×
phanta max master mix(诺唯赞)，上下游引物各1μl(10μm)，ddh2o补足至25μl。扩增程序：95℃预变性3min；95℃变性15sec，退火15sec(退火温度如表1)，72℃延伸1min 35sec，进行34个循环；循环结束后彻底延伸72℃孵育6min。
[0059]
pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(康为世纪)进行回收测序(华大基因，青岛)。
[0060]
2.2单倍型构建及关联分析
[0061]
利用dnaman和chromaspro对突变位点进行统计分析。
[0062]
r软件用于统计基因型和基因型频率，phase软件用于单倍型构建。
[0063]
运用ibm spss statistics 27软件中的一般线性模型分析多态位点或者双倍型与产蛋指标(开产日龄、产蛋数和最大连产数)的相关性，数学模型为yi＝μ+gi+εi(yi为性状表型值，μ为群体均值，gi为基因型或双倍型的效应值，εi是随机误差效应)，采用lsd进行多重比较分析，使用平均值
±
标准误差表示，显著水平设定p《0.05。
[0064]
3、结果与分析
[0065]
3.1rln3基因5
′
调控区-655和-592突变位点在枣庄孙枝鸡鸡群中的基因型和等位基因频率分布
[0066]
共统计枣庄孙枝鸡414个个体。由表2可知，-655位点g等位基因的频率远远高于c，基因型gg频率远高于cc和gc，-592位点a等位基因的频率高于g等位基因，aa基因型占优势。
[0067]
表2：枣庄孙枝鸡鸡群rln3基因5
′
调控区-655和-592突变基因型和等位基因频率
[0068][0069]
3.2rln3 5
′
调控区-655、-592bp位点的多态性分析及其与生产性能的关联分析
[0070]
3.2.1rln3 5
′
调控区-655、-592bp位点多态性在不同品种中的分布
[0071]
统计了京红1号蛋鸡、济宁百日鸡和枣庄孙枝鸡等品种的基因型和等位基因频率。-655位点在京红1号蛋鸡、济宁百日鸡、枣庄孙枝鸡群体中均以g为优势等位基因，在-592位点处，等位基因a在济宁百日鸡、枣庄孙枝鸡群体中为优势等位基因，而在京红1号蛋鸡群体中等位基因g为优势等位基因。分析结果见表3，表4。
[0072]
表3：rln3基因5
′
调控区-655位点基因型和等位基因频率在不同品种中的分布
[0073][0074]
表4：rln3基因5
′
调控区-592位点基因型和等位基因频率在不同品种中的分布
[0075][0076]
3.2.2枣庄孙枝鸡中rln3 5
′
调控区-655、-592位点多态性与生产性能的关联分析
[0077]
在208只枣庄孙枝鸡群体，分析rln3 5
′
调控区-655和-592位点对开产日龄(afe)、38w产蛋数(e38)和最大连产数(lcs)的效应，结果发现，-655位点于afe显著相关，cc基因型的开产日龄显著早于gc和gg基因型；-592位点于lcs显著相关，且a基因型显著高于ag和gg基因型。表明纯合型cc-655
和aa-592
分别与afe和lcs等产蛋高的性状有关联。
[0078]
表5：枣庄孙枝鸡rln3基因5
′
调控区-655和-592位点的基因型与开产日龄(afe)、38w产蛋数和最大连产数(lcs)的关联分析
[0079][0080]
注：表中数值为开产日龄(afe)、38w产蛋数(e38)和最大连产(lcs)的最小二乘均值
±
标准误，不含相同字母最小二乘均值间差异显著(p＜0.05),*表示差异显著。
[0081]
实施例3鸡rln3基因5
′
调控区多态位点对基因表达的影响
[0082]
1.试验材料
[0083]
随机采集泰安市临溪村养殖场的高峰产蛋期的健康海兰褐鸡(3-5只)
[0084]
2.试验方法
[0085]
2.1鸡rln3基因5
′
调控区多态位点突变型荧光素酶表达载体的构建
[0086]
1)定点突变引物的设计
[0087]
以rln3基因启动子区-2,888/+221区段为模板，设计g.-655(g》c)、g.-592(a》g)这两个位点的突变引物，引物序列信息如表6所示(序列表中seq id no.4-seq id no.7)。
[0088]
表6：单位点突变的引物
[0089][0090]
2)pcr扩增
[0091]
扩增反应采用高保真酶，反应体系(50μl)包括：2
×
phanta max master mix(dye plus)25μl，上下游引物各2μl，2μl基因组dna(50-100ng)，ddh2o补足至50μl。反应程序为：预变性95℃，3min；变性95℃，15s；退火15s；延伸72℃，3min 20s；34个循环；延伸72℃，6min。pcr产物使用0.9％的琼脂糖凝胶电泳检测，220v电压下电泳15min。随后用琼脂糖凝胶回收试剂盒(axyprep dna gel extraction kit，axygen)进行回收进行琼脂糖凝胶回收，目的片段与载体连接、转化、单克隆挑菌过夜培养，并测序验证是否突变成功。
[0092]
3)去内毒素质粒的制备
[0093]
用tiangen公司的endofree maxi plasmid kit去内毒素质粒大提试剂盒，按照说明书进行操作。
[0094]
将构建好的载体质粒pgl3-rln3、pgl3-(-655c)、pgl3-(-592g)重新转化感受态细胞，挑取单克隆菌落，进行摇菌，用tiangen公司的去内毒素质粒大提试剂盒提取双荧光素
酶表达载体质粒，用于原代细胞的转染。
[0095]
2.2鸡卵泡颗粒细胞的分离
[0096]
1)等级卵泡颗粒细胞的分离及培养
[0097]
顺着龙骨突剖开海兰褐蛋鸡腹部，将所有的卵泡取出，放入pbs(含3％双抗)中，在细胞间用灭菌过的剪刀将卵泡一个个剪下，取出等级卵泡并放在有pbs的培养皿内。首先将等级卵泡的外膜细胞剥除，然后用弯头镊子从卵泡表面划开一个小口，轻轻挤压使卵黄缓慢流出，然后放入有pbs的培养皿中，沿着开口将卵泡展开铺平，用镊子夹住颗粒层轻轻拖拉，尽量将表面的卵黄去除，分离颗粒层，pbs洗涤后，376
×
g离心5min，去上清液并加入胰酶混合均匀。37℃水浴锅内消化10min，期间将离心管拿出混匀2～3次。终止消化后用200目滤网进行过滤，将收集的滤液376xg离心5min，弃上清，向沉淀中加入少量的培养基轻轻吹打混匀备用。
[0098]
2)细胞铺板及培养
[0099]
向24孔板中加入细胞培养液(含有10％胎牛血清)，在前几个孔中先加入不同浓度的重悬的细胞，静置一会后镜检找出细胞密度最合适的孔，以该密度做后续铺板。完成后在39℃细胞培养箱中放置培养板，培养24h后更换培养基，继续开展后续实验。
[0100]
2.3质粒dna转染实验
[0101]
当细胞融合度达到60％～70％时，即可进行转染；将阴性对照质粒(空载质粒)和构建好的载体按照每个孔800ng的量配制，分别稀释到适量不含抗生素的opti培养基中，轻轻混匀；加入和质粒同体积的plus，混匀，常温下静置孵育5min；加入适量ltx转染试剂，颠倒混匀，常温下静置孵育30min；颗粒细胞用pbs洗净，用无双抗m199培养基，每个孔加500μl；向清洗后的细胞孔中加入100μl上述转染混合物，轻轻摇动培养板，将其混合均匀；在4～6h后给细胞换液，换成1ml新的不含双抗的m199培养基，继续培养24～72h后收细胞进行双荧光素酶活性检测。
[0102]
2.4双荧光素酶活性测定
[0103]
配制1
×
plb(每个孔100μl)、1
×
stop终止液(每个孔100μl)和larⅱ试剂；在细胞即将要铺满培养板时收取细胞，先用pbs清洗细胞两遍，然后每孔加入100μl 1
×
plb，静置10min，刮板并吸打混匀，转移至1.5ml离心管中，16,200
×
g 2min，取60μl上清液转移至新的1.5ml离心管中；取100μl larⅱ加入装有上清液的离心管中，轻轻混匀，检测萤火虫荧光活性，记录数据；取100μl1
×
stop终止液至管中，轻轻混匀，检测海肾荧光活性，记录数据；
[0104]
2.5统计分析
[0105]
数据统计采用t检验，进行两两比较，数据用平均数
±
标准误表示，p《0.05为差异显著，p《0.01为差异极显著。
[0106]
3结果与分析
[0107]
以pgl3-rln3-3109载体为模板，分别构建2个snps(g-655c和a-592g)的定点突变载体pgl3-(-655c)和pgl3-(-592g)(图4)。将突变载体分别转染鸡等级颗粒细胞并于24h后检测双荧光素酶活性值，结果如图5所示。rln3的tss上游-655g突变成c，其转录活性显著升高(p《0.001)；而tss上游-592a突变成g后，其转录活性显著降低(p《0.001)。
[0108]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修
改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一种鸡rln3基因启动子区与产蛋性状关联的snp标记方法，其特征在于，具体标记方法是：采用seq id no.1和seq id no.2所示的标记引物扩增鸡育种材料的基因组dna，pcr扩增产物的序列如seq id no.3所示；结果在鸡rln3基因启动子区检测到两个与鸡开产日龄、产蛋数和最大连产数相关的snp位点，即seq id no.3中第637位碱基是g或c，第700位碱基是g或a。2.snp标记在鸡遗传育种中的应用；其特征在于，所述snp标记来自鸡rln3基因，所述snp标记为对应于如seq id no.3所示序列自5
′
端起第637位碱基是g或c，第700位碱基是g或a。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鸡遗传育种包括：开产日龄早、产蛋数多和/或最大连产数高的蛋鸡品种选育。4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述snp标记的cc-655
aa-592
基因型个体表现出开产日龄早、产蛋数高、最大连产数高的产蛋性状。5.用于检测snp分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示；所述snp标记来自鸡rln3基因，所述snp标记为对应于如seq id no.3所示序列自5
′
端起第637位碱基是g或c，第700位碱基是g或a。6.用于检测snp分子标记的试剂盒，所述试剂盒中包含seq id no.1和seq id no.2所示的引物对；所述snp标记来自鸡rln3基因，所述snp标记为对应于如seq id no.3所示序列自5
′
端起第637位碱基是g或c，第700位碱基是g或a。7.权利要求5所述的引物对或权利要求6所述的试剂盒在辅助选育开蛋鸡品种中的应用；其特征在于，所述蛋鸡品种具有开产日龄早、产蛋数高和/或最大连产数高的产蛋性状。8.一种利用snp标记辅助选育开产日龄早、产蛋数高和/或最大连产数高蛋鸡品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：在鸡群体中，选择基因型为cc-655
aa-592
的公鸡和基因型为cc-655
aa-592
的母鸡，纯繁得到，得到cc-655
aa-592
基因型的后代；cc-655
aa-592
基因型的后代母鸡的开产日龄早于其他基因型，产蛋数和最大连产数高于其他基因型；所述snp标记来自鸡rln3基因，所述snp标记为对应于如seq id no.3所示序列自5
′
端起第637位碱基是g或c，第700位碱基是g或a。

技术总结
本发明公开了一种鸡RLN3基因启动子区SNP标记及其在鸡育种中的应用，属于分子遗传学技术领域。本发明通过品种间SNPs的筛选，发现鸡RLN3基因启动子区存在多个SNP位点；并首次将枣庄孙枝鸡群体的SNPs基因型与产蛋性状进行关联分析，发现CC-655


技术研发人员：姜运良 张春峰 康丽 陈诚 李丹丹 仲从豪
受保护的技术使用者：山东农业大学
技术研发日：2023.07.20
技术公布日：2023/9/23