蚕体肽的应用、蚕体肽脂质体和美白霜剂及其制备方法与流程

1.本发明涉及护肤产品技术领域，具体的说是含有蚕体肽的护肤产品技术领域，更具体地说，本发明涉及一种蚕体肽的应用、蚕体肽脂质体和美白霜剂及其制备方法。


背景技术：

[0002]“面如凝脂，眼若点漆”一句诗阐述了古往今来亚洲女性对相貌的憧憬：皮肤光滑、嫩白无暇，这也是各种护肤产品主打的功效。而现代科学证实了皮肤的变黑、暗黄，色斑、黄褐斑等形成皆和皮肤黑色素沉淀有关，而美白作用机理主要是在黑色素形成的通路上抑制或阻碍生成。黑色素的生成主要是因在紫外线或者炎症刺激下，表皮基底层的黑色素细胞受到激发，胞内酪氨酸在酪氨酸酶的作用下生成多巴，进而在不同通路下转为真黑素、褐黑素，这些黑色素逐渐上浮至角质层，最终聚集可见。
[0003]
家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物，拥有许多色素型突变体，非常适合作为研究色素代谢和斑纹机制的材料。oka-type4蚕体肽是在实验中无意获得并修饰了的肽片段，经实验证实注射入鹌鹑样突变体蚕的体液后，能有效祛除黑色斑纹，使突变体看起来和正常蚕无异。
[0004]
当今越来越多消费者青睐具有功效性的天然活性成分，如植物中花青素、黄酮、多酚提取物，动物中生物活性肽、虾青素、壳聚糖等，这类物质具有不可比拟的美白性、抗氧化性能，相对化学合成的美白剂，更安全、低敏性、无毒副作用。
[0005]
本研究将oka-type4蚕体肽应用于美白护肤品中，开发出了对人体皮肤具有美白功效的霜剂产品，对促进蚕体肽的开发应用有着重要的意义。


技术实现要素：

[0006]
本发明的一个目的将oka-type4蚕体肽应用于护肤品中，提供一种能够蚕体肽进行包裹的蚕体肽脂质体，以及具有美白效果的蚕体肽美白霜剂护肤品。
[0007]
本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0008]
一种蚕体肽在制备美白护肤品的应用，所述蚕体肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。
[0009]
优选的，所述的应用中，蚕体肽在美白护肤品中的浓度为8～40mg/ml。
[0010]
优选的，所述的应用中，蚕体肽在美白护肤品中的浓度为20mg/ml。
[0011]
优选的，所述的应用中，所述美白护肤品为霜剂、精华露或面膜。
[0012]
一种蚕体肽脂质体的制备方法，包括：
[0013]
将权利要求1的蚕体肽溶于pbs缓冲液中，制备得到水相；
[0014]
将大豆卵磷脂、胆固醇、胆酸钠加入无水乙醇中，制备得到有机相；
[0015]
将水相加入有机相中得到混合物，体积比水相：有机相＝1:1～2；
[0016]
混合物经超声处理，旋蒸得到薄膜，薄膜再经吐温-80和pbs缓冲液溶解，二次旋蒸和超声处理得到乳液并过滤，冷冻干燥得到粉末为蚕体肽脂质体。
[0017]
一种蚕体肽脂质体，由所述的制备方法制得。
[0018]
一种美白霜剂，包括以下原料组分：
[0019]
油相基料：天然油脂3-4、柔润剂2-3、乳化剂3、所述的蚕体肽脂质体3-4；
[0020]
水相基料：去离子水18-22、舒缓抗敏剂2-3、植物提取物0.5-2、抗氧化剂0.2-1。
[0021]
优选的，所述的美白霜剂，包括调节剂0.1-0.2、防腐剂2-3、香精0.2-1。
[0022]
优选的，所述的美白霜剂，包括以下原料组分：
[0023]
油相基料：天然油脂4、柔润剂3、乳化剂6、权利要求6所述的蚕体肽脂质体4；
[0024]
水相基料：去离子水18、舒缓抗敏剂3、植物提取物2、抗氧化剂1；
[0025]
调节剂0.2；防腐剂3；香精1。
[0026]
一种所述的美白霜剂的制备方法，包括：
[0027]
配制水相基料：水相基料加热至40-50℃于高速搅拌中加入0.5份黄原胶增稠，得到水相；
[0028]
配制油相基料，油相基料加热至70-80℃使熔化均匀，得到油相；
[0029]
油相再混合水相，搅拌中乳化，静置冷却；冷却至40℃后加入香精、防腐剂、调节剂，3000-4000rpm/min高速均质40min，即得。
[0030]
本发明至少包括以下优点及有益效果：
[0031]
1、本发明采用脂质体包裹蚕体肽，配以天然油脂基料，使得蚕体肽能够在护肤品体系中稳定存放，不受有机溶剂及金属离子的影响；脂质体具有特殊的双分子层结构，同时有亲水性和疏水性，且与皮肤的主要构成一致，将蚕体肽镶嵌在脂质体中能够促进成分的透皮吸收，也提升了生物利用率。
[0032]
2、本发明的蚕体肽在稀释50倍后对酪氨酸酶抑制率可达到19.69％，可以制成相应蚕体肽浓度的美白护肤品而发挥效用。
[0033]
3、本发明使用蚕体肽脂质体制得的美白霜剂经手部涂抹试验，相比不涂抹，可改善皮肤的水分，减少了出油情况；改善皮肤细纹，提亮皮肤光泽；涂抹后一小时即可较好的改善色素深度，对毛孔收缩也有较好效果。
[0034]
4、本发明的蚕体肽经豚鼠表皮涂抹试验，未给药组黑色素细胞及黑色素颗粒增多，表皮有增生的情况，角质层，颗粒层组织较厚，真皮内见炎症细胞存在，组织排列松散，有大量拉伸的黑色素颗粒；而蚕体肽给药组的炎症因子明显减少，且表皮增生情况有所改善，细胞排列较紧密，且黑色素细胞有所降低。
[0035]
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
[0036]
图1为本发明的蚕体肽对酪氨酸酶抑制率；
[0037]
图2为本发明造模的给药周期结束后的豚鼠皮肤图片；
[0038]
图3为本发明的he染色实验中未给药组的染色图片；
[0039]
图4为本发明的he染色实验中给药组的染色图片；
[0040]
图5为本发明的masson实验中未给药组的染色图片；
[0041]
图6为本发明的masson实验中给药组的染色图片。
具体实施方式
[0042]
下面结合实例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0043]
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0044]
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0045]
本发明所用的天然油脂为植物淄醇、异16烷、角鲨烷、c16-c18硬脂酸甘油酯、聚二甲基硅氧烷等中一种或多种。
[0046]
柔润剂为丁三醇、丙二醇、甘油等中一种或多种。
[0047]
乳化剂为鲸蜡硬脂醇、甘油硬脂酸酯、山梨坦酸酯、赛比克305等中一种或多种。
[0048]
舒缓抗敏剂为尿囊素等。
[0049]
植物提取物为洋甘菊提取物等。
[0050]
抗氧化剂为维生素c等。
[0051]
调节剂为edta-2na、三乙醇胺等。
[0052]
防腐剂为对羟基苯乙酮、苯氧乙醇、戊二醇等。
[0053]
香精为玫瑰香精等。
[0054]
实施例1
[0055]
合成oka-type4蚕体肽
[0056]
根据蚕体肽的氨基酸序列合成oka-type4蚕体肽，氨基酸序列如seq id no.1所示，具体为：earhsgylpyqmf，氨基酸数量13个，合成的纯度95％。
[0057]
实施例2
[0058]
蚕体肽脂质体1的制备
[0059]
用薄膜分散法制备蚕体肽脂质体。
[0060]
配制水相：取实施例1的蚕体肽溶于ph 4.7的pbs缓冲液中，制备得到蚕体肽浓度0.2g/ml的水相。
[0061]
配制有机相：20mg大豆卵磷脂、1mg胆固醇、1mg胆酸钠加入10毫升无水乙醇中，制备得到有机相。
[0062]
在300-400rpm/min搅拌下，用1.5ml针头分批将水相滴入有机相中得到混合物，体积比水相：有机相＝1:2。
[0063]
将混合物第一次500w超声处理2-8min，进行37℃减压旋蒸，蒸发至形成乳白薄膜后加入少许吐温-80、pbs缓冲液震荡溶解薄膜。
[0064]
第二次37℃减压旋蒸去除多余水分后，500w超声处理2-4min，将形成的乳液经过0.45μm微孔过滤。
[0065]
将过滤的乳液经冷冻干燥成粉末即得蚕体肽脂质体粉末，其中，蚕体肽含量约为4.5％。
[0066]
实施例3
[0067]
蚕体肽脂质体2的制备
[0068]
用薄膜分散法制备蚕体肽脂质体。
[0069]
配制水相：取实施例1的蚕体肽溶于ph4.7的pbs缓冲液中，制备得到蚕体肽浓度0.4g/ml的水相。
[0070]
配制有机相：20mg大豆卵磷脂、1mg胆固醇、1mg胆酸钠加入10毫升无水乙醇中，制备得到有机相。
[0071]
在300-400rpm/min搅拌下，用1.5ml针头分批将水相滴入有机相中得到混合物，体积比水相：有机相＝1:1.5。
[0072]
将混合物第一次500w超声处理2-8min，进行37℃减压旋蒸，蒸发至形成乳白薄膜后加入少许吐温-80、pbs缓冲液震荡溶解薄膜。
[0073]
第二次37℃减压旋蒸去除多余水分后，500w超声处理2-4min，将形成的乳液经过0.45μm微孔过滤。
[0074]
将过滤的乳液经冷冻干燥成粉末即得蚕体肽脂质体粉末，其中，蚕体肽含量约为12％。
[0075]
实施例4
[0076]
蚕体肽脂质体3的制备
[0077]
用薄膜分散法制备蚕体肽脂质体。
[0078]
配制水相：取实施例1的蚕体肽溶于ph4.7的pbs缓冲液中，制备得到蚕体肽浓度0.6g/ml的水相。
[0079]
配制有机相：20mg大豆卵磷脂、1mg胆固醇、1mg胆酸钠加入10毫升无水乙醇中，制备得到有机相。
[0080]
在300-400rpm/min搅拌下，用1.5ml针头分批将水相滴入有机相中得到混合物，体积比水相：有机相＝1:1。
[0081]
将混合物第一次500w超声处理2-8min，进行37℃减压旋蒸，蒸发至形成乳白薄膜后加入少许吐温-80、pbs缓冲液震荡溶解薄膜。
[0082]
第二次37℃减压旋蒸去除多余水分后，500w超声处理2-4min，将形成的乳液经过0.45μm微孔过滤。
[0083]
将过滤的乳液经冷冻干燥成粉末即得蚕体肽脂质体粉末，其中，蚕体肽的含量约为21％。
[0084]
实施例5
[0085]
蚕体肽美白霜剂1的制备
[0086]
蚕体肽美白霜剂的配方如下，以重量份为计，包括：
[0087]
油相基料：天然油脂3、柔润剂2、乳化剂3、实施例4的蚕体肽脂质体粉末3；
[0088]
水相基料：去离子水21、舒缓抗敏剂2、植物提取物0.5、抗氧化剂0.2；
[0089]
调节剂0.1；防腐剂2；香精0.2。
[0090]
制备时：
[0091]
配制水相基料，水相基料加热至40-50℃于高速搅拌中加入黄原胶0.5份增稠，得到水相。
[0092]
配制油相基料，油相基料加热至70-80℃使熔化均匀，得到油相。
[0093]
油相再混合水相，于高速搅拌中乳化30min，静置冷却；冷却至40℃后加入香精、防腐剂、调节剂，3000-4000rpm/min高速均质40min，冷却至室温后可装瓶。
[0094]
实施例6
[0095]
蚕体肽美白霜剂2的制备
[0096]
蚕体肽美白霜剂的配方如下，以重量份为计，包括：
[0097]
油相基料：天然油脂3.5、柔润剂2.5、乳化剂4.5、实施例4的蚕体肽脂质体粉末3.5；
[0098]
水相基料：去离子水22、舒缓抗敏剂2.5、植物提取物1.5、抗氧化剂0.6；
[0099]
调节剂0.15；防腐剂2.5；香精0.6。
[0100]
制备时：
[0101]
配制水相基料，水相基料加热至40-50℃于高速搅拌中加入0.5份黄原胶增稠，得到水相。
[0102]
配制油相基料，油相基料加热至70-80℃使熔化均匀，得到油相。
[0103]
油相再混合水相，于高速搅拌中乳化30min，静置冷却；冷却至40℃后加入香精、防腐剂、调节剂，3000-4000rpm/min高速均质40min，冷却至室温后可装瓶。
[0104]
实施例7
[0105]
蚕体肽美白霜剂3的制备
[0106]
蚕体肽美白霜剂的配方如下，以重量份为计，包括：
[0107]
油相基料：天然油脂4、柔润剂3、乳化剂6、实施例4的蚕体肽脂质体粉末4；
[0108]
水相基料：去离子水21、舒缓抗敏剂3、植物提取物2、抗氧化剂1；
[0109]
调节剂0.2；防腐剂3；香精1。
[0110]
制备时：
[0111]
配制水相基料，水相基料加热至40-50℃于高速搅拌中加入0.5份黄原胶增稠，得到水相。
[0112]
配制油相基料，油相基料加热至70-80℃使熔化均匀，得到油相。
[0113]
油相再混合水相，于高速搅拌中乳化30min，静置冷却；冷却至40℃后加入香精、防腐剂、调节剂，3000-4000rpm/min高速均质40min，冷却至室温后可装瓶。
[0114]
效果实验
[0115]
一、蚕体肽的体外美白实验
[0116]
将实施例1的蚕体肽使用pbs溶液稀释后，测试蚕体肽对酪氨酸酶的抑制率，得出蚕体肽能够有效抑制酪氨酸酶催化黑色素的生成，具有一定美白效果。如图1所示，当蚕体肽稀释50倍后对酪氨酸酶抑制率可达到19.69％，此时制备霜剂等美白护肤品的美白效果最好，实施例5～7制备的霜剂中蚕体肽比例均接近该范围。
[0117]
二、蚕体肽美白霜剂手部使用
[0118]
检测方法：手背涂抹1滴2*2cm大小的实施例7的蚕体肽美白霜剂，对比不涂抹。
[0119]
检测仪器：魔镜智能皮肤分析仪，广州魔奇美容仪器设备有限公司。
[0120]
表1手部使用蚕体肽美白霜剂涂抹效果
[0121][0122]
从表1可以看到：
[0123]
1、霜剂涂抹后改善皮肤的水分，减少了出油情况；
[0124]
2、霜剂涂抹后明显改善皮肤细纹，提亮皮肤光泽；
[0125]
3、霜剂涂抹后一小时即可较好的改善色素深度，对毛孔收缩也有较好效果。
[0126]
三、蚕体肽涂抹于豚鼠表皮试验
[0127]
1、实验材料
[0128]
豚鼠、实施例1的oka-type4蚕体肽。
[0129]
2、实验仪器
[0130]
脱水机(diapath，donatello)，包埋机(武汉俊杰电子有限公司，jb-p5)，病理切片机(上海徕卡仪器有限公司，rm2016)，冻台(武汉俊杰电子有限公司，jb-l5)，组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，kd-p)，染色机(diapath，giotto)，烤箱(天津市莱玻瑞仪器设备有限公司，gfl-230)，载玻片(servicebio，g6004)，正置光学显微镜(日本尼康，nikon eclipse e100)，成像系统(日本尼康，nikon ds-u3)。
[0131]
3、实验材料
[0132]
无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，100092683)，二甲苯(国药集团化学试剂有限公司，10023418)，he染液套装(servicebio，g1003)，中性树胶(国药集团化学试剂有限公司，10004160)masson染液套装(servicebio，g1006)。
[0133]
4、造模方法
[0134]
光源氙灯，功率400w，含长波紫外uva和中波紫外(uvb)，金属卤素灯，功率1000w，最强光谱为360nm，其中uva占70％，uvb占4％。将豚鼠背部两侧剃毛，暴露3*3cm左右范围，然后在距离皮肤10cm处进行照射，每天照射1次，连续7天，累计照射总量为5000mj/cm2。蚕体肽溶解于pbs溶液中，稀释得到蚕体肽浓度为20mg/ml的待测样品，造模后将待测样品涂布于该区域，左侧不处理，右侧涂药，每天涂抹一次，以一周为给药周期，结束给药周期后取皮肤组织检测。给药周期结束后的豚鼠皮肤图片如图2所示。
[0135]
5、he染色实验方法
[0136]
依次将表皮组织制成切片放入二甲苯ⅰ20min-二甲苯ⅱ20min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-75％酒精5min，自来水洗。切片入苏木素染液染3-5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min。切片依次放入无水乙醇i 5min-无水乙醇ii 5min-无水乙醇ⅲ5min-二甲ⅰ5min-二甲苯ⅱ5min透明，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。未给药组的结果如图3所示，给药组的结果如图4所示。
[0137]
6、masson实验方法
[0138]
石蜡切片脱蜡至水：依次将表皮组织切片放入二甲苯ⅰ20min-二甲苯ⅱ20min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-75％酒精5min，自来水洗。切片浸入masson a液中浸泡过夜，自来水洗。切片入masson b液及masson c液等比混合的染液，浸染1min，自来水洗，1％盐酸酒精分化，自来水洗。切片入masson d液浸染6min，自来水漂洗。masson e液浸染1min。不水洗，稍沥干直接入masson f液染2-30s。切片用1％冰醋酸漂洗分化，两缸无水乙醇脱水。切片放入第三缸无水乙醇5min，二甲苯5min透明，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。未给药组的图片如图5所示，给药组的图片如图6所示。
[0139]
图2为豚鼠表皮肉眼观察结果：其中图片左侧剃毛区域为未给药组，右侧剃毛区域为给药组，未给药组和给药组没有明显差别，照射位置粗糙变硬，失去弹性，有皮肤老化症状。
[0140]
图3和图4、图5和图6为表皮组织染色结果：
[0141]
未给药组黑色素细胞及黑色素颗粒增多，表皮有增生的情况，角质层，颗粒层组织较厚，真皮内见炎症细胞存在，组织排列松散，有大量拉伸的黑色素颗粒。
[0142]
而蚕体肽给药组的炎症因子明显减少，且表皮增生情况有所改善，细胞排列较紧密，且黑色素细胞有所降低。
[0143]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。

技术特征：
1.一种蚕体肽在制备美白护肤品的应用，其特征在于，所述蚕体肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，蚕体肽在美白护肤品中的浓度为8～40mg/ml。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，蚕体肽在美白护肤品中的浓度为20mg/ml。4.如权利要求1或3所述的应用，其特征在于，所述美白护肤品为霜剂、精华露或面膜。5.一种蚕体肽脂质体的制备方法，其特征在于，包括：将权利要求1的蚕体肽溶于pbs缓冲液中，制备得到水相；将大豆卵磷脂、胆固醇、胆酸钠加入无水乙醇中，制备得到有机相；将水相加入有机相中得到混合物，体积比水相：有机相＝1:1～2；混合物经超声处理，旋蒸得到薄膜，薄膜再经吐温-80和pbs缓冲液溶解，二次旋蒸和超声处理得到乳液并过滤，冷冻干燥得到粉末为蚕体肽脂质体。6.一种蚕体肽脂质体，其特征在于，由权利要求5所述的制备方法制得。7.一种美白霜剂，其特征在于，包括以下原料组分：油相基料：天然油脂3-4、柔润剂2-3、乳化剂3、权利要求6所述的蚕体肽脂质体3-4；水相基料：去离子水18-22、舒缓抗敏剂2-3、植物提取物0.5-2、抗氧化剂0.2-1。8.如权利要求7所述的美白霜剂，其特征在于，包括调节剂0.1-0.2、防腐剂2-3、香精0.2-1。9.如权利要求8所述的美白霜剂，其特征在于，包括以下原料组分：油相基料：天然油脂4、柔润剂3、乳化剂6、权利要求6所述的蚕体肽脂质体4；水相基料：去离子水18、舒缓抗敏剂3、植物提取物2、抗氧化剂1；调节剂0.2；防腐剂3；香精1。10.一种权利要求8所述的美白霜剂的制备方法，其特征在于，包括：配制水相基料：水相基料加热至40-50℃于高速搅拌中加入黄原胶增稠，得到水相；配制油相基料，油相基料加热至70-80℃使熔化均匀，得到油相；油相再混合水相，搅拌中乳化，静置冷却；冷却至40℃后加入香精、防腐剂、调节剂，3000-4000rpm/min高速均质40min，即得。

技术总结
本发明公开了一种蚕体肽在制备美白护肤品的应用，所述蚕体肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明采用脂质体包裹蚕体肽，配以天然油脂基料，使得蚕体肽能够在护肤品体系中稳定存放，不受有机溶剂及金属离子的影响；脂质体具有特殊的双分子层结构，同时有亲水性和疏水性，且与皮肤的主要构成一致，将蚕体肽镶嵌在脂质体中能够促进成分的透皮吸收，也提升了生物利用率。本发明的蚕体肽在稀释50倍后对酪氨酸酶抑制率可达到19.69％，可以制成相应蚕体肽浓度的美白护肤品而发挥效用。蚕体肽浓度的美白护肤品而发挥效用。蚕体肽浓度的美白护肤品而发挥效用。


技术研发人员：肖潇 王平阳 梁贵秋 陆春霞 刘开莉 徐雯雯 莫炳巧 李安华 赖艳梅 陈菁 李小群
受保护的技术使用者：广西壮族自治区蚕业技术推广站
技术研发日：2023.07.27
技术公布日：2023/9/23