MhMYB1基因在提高喜马拉雅紫茉莉总黄酮含量中的应用

mhmyb1基因在提高喜马拉雅紫茉莉总黄酮含量中的应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及mhmyb1基因在提高喜马拉雅紫茉莉总黄酮含量中的应用。


背景技术：

2.喜马拉雅紫茉莉是藏药五根之上品，作为补益类药物在二十五味儿茶丸、三味喜马拉雅紫茉莉汤等藏药成方制剂中广泛使用，市场需求不断增加，成为藏药材中最具开发前景的特色品种之一。由于喜马拉雅紫茉莉分布的生境十分狭窄，加之仅用其根入药，意味着单凭野外采挖会对本就濒危的喜马拉雅紫茉莉造成灭绝性影响。但人工栽培的喜马拉雅紫茉莉与野生资源相比，黄酮类成分含量较低。黄酮类化合物作为喜马拉雅紫茉莉中主要的有效成分，其含量高低直接决定了喜马拉雅紫茉莉品质的优劣。因此，培育高产黄酮类成分的喜马拉雅紫茉莉一直是该行业长期追求的目标。
3.现有研究表明，myb转录因子是黄酮类化合物生物合成的主效调控因子，可以调控黄酮类化合物合成途径上的多个酶基因的表达，在培育高产黄酮类化合物的药用植物新品种中具有十分重要的研究价值。通过深入分析喜马拉雅紫茉莉的基因组和转录组信息，挖掘调控喜马拉雅紫茉莉黄酮类化合物积累的myb转录因子，利用基因工程的手段可以实现在喜马拉雅紫茉莉中大量合成黄酮类化合物。因此，鉴定能调控黄酮类化合物生物合成途径的转录因子，对于培育高产黄酮类成分的喜马拉雅紫茉莉具有重要的意义。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种过量表达mhmyb1基因在提高喜马拉雅紫茉莉总黄酮含量中的应用；本发明的目的之二在于提供一种提高喜马拉雅紫茉莉中总黄酮含量的方法。
5.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.1、过量表达mhmyb1基因在提高喜马拉雅紫茉莉总黄酮含量中的应用
7.所述mhmyb1基因来自喜马拉雅紫茉莉，所述mhmyb1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述mhmyb1基因的编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。
8.2、一种提高喜马拉雅紫茉莉中总黄酮含量的方法，包括如下步骤：通过在喜马拉雅紫茉莉中过量表达mhmyb1基因，所述mhmyb1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述mhmyb1基因的编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。
9.本发明优选的，所述过量表达mhmyb1基因的方法为：克隆mhmyb1基因，然后构建植物表达载体，获得含有mhmyb1基因的重组植物表达载体，再将获得的重组植物表达载体转化发根农杆菌获得工程菌，最后用工程菌转化喜马拉雅紫茉莉外植体，筛选喜马拉雅紫茉莉毛状发根，经pcr鉴定阳性发根，获得总黄酮含量提高的喜马拉雅紫茉莉毛状发根。
10.本发明优选，所述克隆mhmyb1基因的方法为：以喜马拉雅紫茉莉cdna为模板，以seq id no.3和seq id no.4所示序列为引物进行pcr扩增，电泳检测，回收，获得带有同源
no.4)。
27.然后以高保真dna聚合酶通过pcr从总cdna中扩增mhmyb1基因，扩增片段用1％琼脂糖凝胶电泳检测并进行回收纯化，备用。
28.使用bamh i和sac i双酶切pbi121载体，经1％琼脂糖凝胶电泳后，使用dna纯化回收试剂盒回收线性化载体骨架。
29.将回收后得到的mhmyb1扩增片段和线性化的pbi121载体按照3:1的摩尔比使用bm无缝克隆试剂盒进行拼接克隆，经测序后，获得表达载体pbi121-mhmyb1(图1)。
30.本实施例将喜马拉雅紫茉莉mhmyb1基因可操作性地连接于植物表达载体pbi121，获得表达载体pbi121-mhmyb1可用于通过转录调控策略来调控喜马拉雅紫茉莉中黄酮类化合物的含量。
31.二、转化发根农杆菌
32.将连接成功的载体质粒pbi121-mhmyb1转化发根农杆菌c58c1菌株，得到重组农杆菌c58c1/pbi121-mhmyb1，经pcr验证存在预期条带(大小为1122bp的条带)后，将菌液与50％甘油等比例混合，放于-80℃冰箱保存备用。
33.三、发根农杆菌介导的mhmyb1过表达载体遗传转化喜马拉雅紫茉莉获得转基因喜马拉雅紫茉莉毛状根
34.(1)喜马拉雅紫茉莉外植体准备
35.选取成熟饱满的喜马拉雅紫茉莉种子流水冲洗过夜，然后用75％乙醇浸泡1min，再用2％的naclo浸泡10min，使用灭菌水冲洗3次后，吸干水分，接种于ms固体培养基上，在20℃光照培养箱中培养，获得喜马拉雅紫茉莉无菌苗。待苗长出5-6片真叶后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。
36.(2)农杆菌与外植体的共培养
37.将上步获取的外植体，加入活化好的含pbi121-mhmyb1表达载体的发根农杆菌工程菌的重悬液(1/2ms+as100μmol/l)中，将外植体与菌液共培养15分钟后，转到共培养培养基上，28℃暗培养2天。
38.(3)抗性毛状根的筛选与检测
39.共培养2天的喜马拉雅紫茉莉外植体转移到添加有200mg/l头孢菌素和100mg/l的卡那霉素筛选培养基上继续暗培养直到出现抗性毛状根。将生长良好的毛状根培养至完全无菌后，使用ctab的方法提取毛状根基因组dna。以提取的基因组dna为模板使用引物对(35s promoter-f和pbi121-mhmyb1-r)进行pcr鉴定，得到过表达mhmyb1基因的转基因毛状根。
40.35s promoter-f：5
’‑
gacgcacaatcccactatcc-3’(seq id no.5)；
41.pbi121-mhmyb1-r：5
’‑
ctaggatagaagccaagctaccatag-3’(seq id no.6)。
42.(4)利用qrt-pcr检测转基因毛状根中mhmyb1基因表达量
43.取适量长势一致的转基因毛状根，提取rna后反转录成cdna，使用mhmyb12-eq-f和mhmyb12-eq-r引物进行qrt-pcr检测所取样毛状根中mhmyb1基因的表达量。对照内参基因采用18s rrna，引物为18sq-f和18sq-r。
44.mhmyb12-eq-f：5
’‑
gaatggcaatccaagcgga-3’(seq id no.7)；
45.mhmyb12-eq-r：5
’‑
tgcattgcagctcggctag-3’(seq id no.8)。
46.18sq-f：5
’‑
atgataactcgacggatcgc-3’(seq id no.9)；
47.18sq-r：5
’‑
cttggatgtggtagccgttt-3’(seq id no.10)。
48.结果如图2所示，转基因喜马拉雅紫茉莉毛状根mhmyb1表达量显著高于普通毛状根，表明mhmyb1基因成功转入喜马拉雅紫茉莉并获得超量表达mhmyb1基因的喜马拉雅紫茉莉毛状根。
49.(5)转基因喜马拉雅紫茉莉毛状根中总黄酮含量的测定
50.a.植物材料前处理：将植物材料，60℃烘干后进行充分研磨，过4号筛，精确称取0.1g。
51.b.黄酮类化合物的提取：每份样品加入60％乙醇2ml作为提取剂，超声提取30min，12000g离心15min，取上清于离心管中并用60％乙醇定容至2ml；显色过程中，在提取液中加入10％的亚硝酸钠0.4ml，摇匀后静置6min，加入10％的硝酸铝0.4ml，摇匀后再次静置6min，加入1mmol/l的氢氧化钠4ml，使用30％乙醇定容至10ml，彻底混匀后静置15min。
52.c.黄酮类化合物的检测：使用紫外分光光度法，在510nm处对所有样品的od值进行测定，每个实验重复3遍。根据标准溶液回归曲线计算黄酮类化合物总含量。
53.结果如图3所示，本发明中，在喜马拉雅紫茉莉中过量表达mhmyb1基因，显著提高了总黄酮的含量。在mhmyb1过量表达的喜马拉雅紫茉莉毛状根中，总黄酮的相对含量为同时期普通毛状根中总黄酮的相对含量的1.41-2.11倍。
54.以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

技术特征：
1.过量表达mhmyb1基因在提高喜马拉雅紫茉莉总黄酮含量中的应用，其特征在于，所述mhmyb1基因来自喜马拉雅紫茉莉，所述mhmyb1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述mhmyb1基因的编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。2.一种提高喜马拉雅紫茉莉中总黄酮含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：通过在喜马拉雅紫茉莉中过量表达mhmyb1基因，所述mhmyb1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述mhmyb1基因的编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述过量表达mhmyb1基因的方法为：克隆mhmyb1基因，然后构建植物表达载体，获得含有mhmyb1基因的重组植物表达载体，再将获得的重组植物表达载体转化发根农杆菌获得工程菌，最后用工程菌转化喜马拉雅紫茉莉外植体，筛选喜马拉雅紫茉莉毛状发根，经pcr鉴定阳性发根，获得总黄酮含量提高的喜马拉雅紫茉莉毛状发根。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述克隆mhmyb1基因的方法为：以喜马拉雅紫茉莉cdna为模板，以seq id no.3和seq id no.4所示序列为引物进行pcr扩增，电泳检测，回收，获得带有同源臂的mhmyb1基因。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述重组植物表达载体为以pbi121载体为骨架，通过同源重组方式将带有同源臂的mhmyb1基因替换pbi121载体上gus基因制得。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发根农杆菌为c58c1。

技术总结
本发明公开了MhMYB1基因在提高喜马拉雅紫茉莉总黄酮含量中的应用，MhMYB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，MhMYB1基因的过表达能够提高喜马拉雅紫茉莉毛状根中黄酮类化合物的含量，因此，喜马拉雅紫茉莉MhMYB1基因的发现，为针对药用植物提高黄酮类化合物含量的分子育种提供了相关的基因资源，可应用于在喜马拉雅紫茉莉中大规模生产黄酮类化合物，具有很大的应用价值。大的应用价值。大的应用价值。


技术研发人员：赵凯辉 兰小中 李连强 权红 袁芳 赵芳玉 张芳源
受保护的技术使用者：西藏农牧学院
技术研发日：2023.07.31
技术公布日：2023/9/23