一种牛胆汁病毒去除灭活的方法及其应用与流程

1.本发明涉及一种牛胆汁病毒去除灭活的方法及其应用，涉及a61k，具体涉及医用的配置品领域。


背景技术：

2.牛胆汁是牛胆内的一种液体，具有健脾化痰，定惊平喘的功效，因此是多种处方药的制备原料，但是牛胆汁由于收集的原料批次不同，牛胆汁中很可能带有牛本体的病毒，对药物的制备安全造成影响。为了确保药物生产的原料符合生产质量规范，确保药品安全，质量可控，需要对牛胆汁原料进行病毒去除灭活，但是牛胆汁中含有的有效组分部分是热敏性物质，在高温环境下容易失活变质，造成牛胆汁的药物功效下降，因此开发一种可以去除灭活牛胆汁中病毒，同时不会影响牛胆汁药效的加工方法至关重要。
3.中国发明专利cn202010065492.8公开了一种特异性人免疫球蛋白病毒灭活工艺，在特异性免疫球蛋白原生产工艺的基础上添加一步病毒灭活工艺，即在原来的巴氏灭活基础上添加一步低ph孵放，提高了产品的安全性，但是只针对免疫球蛋白，对于牛胆汁中的病毒灭活效果不佳。中国发明专利cn200510122291.2公开了一种高纯度血红蛋白的分离纯化与病毒灭活工艺，通过加热处理，使非血红蛋白类蛋白质变性沉淀而被除去，然后加入适量抗氧化剂调节溶液ph，再经物理脱氧与化学脱氧，充分脱除存在于血红蛋白中的氧后，然后加入过量抗氧化剂和糖类化合物作为保护剂的条件下，加热处理10～12小时，加热过程中持续通入惰性气体，达到病毒灭活的效果，但是工艺会损伤其中的蛋白质，加工牛胆汁时影响牛胆汁的药物功效。


技术实现要素：

4.为了去除灭活牛胆汁中的病毒，同时不会影响牛胆汁药效，本发明的第一个方面提供了一种牛胆汁病毒去除灭活的方法，包括以下步骤：
5.(1)一次真空浓缩；
6.(2)煮沸浓缩；
7.(3)二次真空浓缩。
8.作为一种优选的实施方式，所述步骤1中真空浓缩的的真空度为0.02～0.08mpa，温度为50-60℃。
9.作为一种优选的实施方式，所述步骤1中真空浓缩的的真空度为0.05mpa，温度为50℃。
10.作为一种优选的实施方式，所述步骤2中煮沸为常压煮沸，压力为0.1mpa，浓缩时间为20-60min。
11.作为一种优选的实施方式，所述步骤2中煮沸为常压煮沸，压力为0.1mpa，浓缩时间为30min。
12.作为一种优选的实施方式，所述步骤3中真空浓缩的的真空度为0.02～0.08mpa，
温度为50-60℃。
13.作为一种优选的实施方式，所述步骤3中真空浓缩的的真空度为0.05mpa，温度为50℃。
14.作为一种优选的实施方式，所述一次真空浓缩的时间为1-3h，二次真空浓缩的时间为2-5h。
15.作为一种优选的实施方式，所述一次真空浓缩的时间为2h，二次真空浓缩的时间为3h。
16.申请人在实验过程中发现，通过先进行真空浓缩，然后进行煮沸浓缩，可以充分将牛胆汁中的病毒进行灭活，同时不会影响牛胆汁中有效组分的发挥，猜测可能的原因是：牛胆汁中含有胆酸，脱氧胆酸等物质，导致牛胆汁含有一定酸性，当牛胆汁中含有一定病毒时，病毒容易不稳定，发生结构变异，容易造成药品原料不纯净，因此需要将牛胆汁中的病毒灭活后使用。申请人进一步发现，牛胆汁中含有一定粘蛋白体，在高温环境下粘蛋白体容易变质，申请人通过在真空环境下浓缩可以对病毒进行初步灭活，同时降低牛胆汁体系中的水含量，然后进行常压煮沸，降低体系的沸点温度，避免牛胆汁中粘蛋白体的失活，从而对病毒进一步灭活，彻底避免病毒对牛胆汁原料的毒性影响，提高药物原料安全。
17.作为一种优选的实施方式，所述牛胆汁中病毒的感染量≤106tcid
50
/0.1ml。
18.作为一种优选的实施方式，所述牛胆汁中的病毒包括牛病毒性腹泻病毒、牛鼻气管炎病毒、猪瘟病毒、蓝耳病毒中的一种或几种的组合。
19.作为一种优选的实施方式，经过去除灭活病毒后的牛胆汁需要进行检测验证，所述检测验证的方法选自荧光定量pcr(聚合酶链反应)、elisa(酶联免疫吸附测试)、电镜、rt检测(射线检测)中的一种或几种的组合。
20.作为一种优选的实施方式，所述检测验证选在步骤1、2、3结束后取样，当其中某一步骤所取样品经过检测判定病毒已灭活，则后续工艺不再取样检测。
21.本发明的第二个方面提供了一种所述牛胆汁病毒去除灭活的方法的应用，应用于牛胆汁的灭活中，去除灭活病毒后的牛胆汁应用于处方药的制备中。
22.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
23.(1)本发明所述牛胆汁病毒去除灭活的方法，通过采用一次真空浓缩，减少牛胆汁中溶剂量，降低沸点，防止煮沸过程中温度过高，影响牛胆汁中热敏药物活性，同时实现病毒的一次灭菌，为进一步操作提供条件。
24.(2)本发明所述牛胆汁病毒去除灭活的方法，在经过一次真空浓缩后，进行常压煮沸浓缩，可以进一步达到病毒灭活的作用，彻底避免病毒对牛胆汁用于药物原料时的影响。
25.(3)本发明所述牛胆汁病毒去除灭活的方法，制备的经过病毒去除灭活的牛胆汁可以排除其他病毒物质的干扰，并且充分保留牛胆汁的药物活性，广泛应用于药物中，使用便利，无干扰性。
附图说明
26.图1为实施例1步骤1后验证的猪瘟病毒的琼脂糖凝胶电泳图；
27.图2为实施例1步骤2后验证的猪瘟病毒的琼脂糖凝胶电泳图；
28.图3为实施例2步骤1后验证的蓝耳病毒的琼脂糖凝胶电泳图；
29.图4为实施例2步骤2后验证的蓝耳病毒的琼脂糖凝胶电泳图。
30.图中：1.阴性对照组；2.阳性对照组；3.实施例1；4.实施例1的平行试验；m.dna markeres。
31.注：dna markeres为琼脂糖凝胶中不同分子量的dna片段。
具体实施方式
32.实施例1
33.一种牛胆汁病毒去除灭活的方法及其应用，包括以下步骤：
34.(1)一次真空浓缩；
35.(2)煮沸浓缩；
36.(3)二次真空浓缩。
37.所述步骤1中真空浓缩的的真空度为0.05mpa，温度为50℃。
38.所述步骤2中煮沸为常压煮沸，压力为0.1mpa，浓缩时间为30min。
39.所述步骤3中真空浓缩的的真空度为0.05mpa，温度为50℃。
40.所述一次真空浓缩的时间为2h，二次真空浓缩的时间为3h。
41.所述牛胆汁中病毒的感染量为106tcid
50
/0.1ml，牛胆汁的测试量为50ml。
42.所述牛胆汁中的病毒为猪瘟病毒，采用的检测验证方法为荧光定量pcr检测。
43.所述检测验证在步骤1、2结束后取样，步骤1结束后检测验证凝胶电泳图为图1；步骤2结束后检测验证凝胶电泳图为图2。
44.实施例2
45.一种牛胆汁病毒去除灭活的方法及其应用，具体步骤同实施例1，不同点在于所述牛胆汁中的病毒为蓝耳病毒。
46.步骤1结束后检测验证凝胶电泳图为图3。
47.性能测试
48.参考gb/t27549-2011《猪瘟病毒实时荧光rt-pcr检测方法》，分别制备样品：图1，2中：(1)阴性对照组：未添加猪瘟病毒的牛胆汁；(2)阳性对照组：添加猪瘟病毒未经过灭活工艺处理的牛胆汁；(3)和(4)实验组：添加猪瘟病毒经过实施例1的灭活方法处理。
49.图3中：(1)阴性对照组：未添加蓝耳病毒的牛胆汁；(2)阳性对照组：添加蓝耳病毒未经过灭活工艺处理的牛胆汁；(3)和(4)实验组：添加蓝耳病毒经过实施例2的灭活方法处理。
50.通过pcr扩增技术，琼脂糖凝胶电泳后电泳图出现条带，实施例1经过步骤1处理后还有部分条带，病毒灭活不完全，实施例1猪瘟病毒经过步骤2处理后和实施例2蓝耳病毒经过步骤1处理后说明：阳性对照组：牛胆汁本身不能将病毒灭活；阴性对照组：牛胆汁本身不存在测试病毒；实验组经过灭活处理后可以将病毒完全杀灭。实施例1步骤2后琼脂糖凝胶电泳图见图2，(猪瘟病毒)；实施例2步骤1后琼脂糖凝胶电泳图见图2，(蓝耳病毒)。
51.实施例1步骤2后和实施例2步骤1后同时采用荧光定量pcr对病毒进行检测，阴性对照组，实验组无法达到阈值，检测不出病毒，阳性对照组的检测值见表1(猪瘟病毒)和表2(蓝耳病毒)。
52.表1
[0053] 阴性对照阳性对照实施例1实施例1平行样步骤1/27.27//步骤2/28.48//
[0054]“/”代表未检出。
[0055]
表2
[0056] 阴性对照阳性对照实施例2实施例2平行样步骤1/34.17//步骤2/35.43//
[0057]“/”代表未检出。

技术特征：
1.一种牛胆汁病毒去除灭活的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)一次真空浓缩；(2)煮沸浓缩；(3)二次真空浓缩。2.根据权利要求1所述牛胆汁病毒去除灭活的方法，其特征在于，所述步骤1中真空浓缩的的真空度为0.02～0.08mpa，温度为50-60℃。3.根据权利要求1所述牛胆汁病毒去除灭活的方法，其特征在于，所述步骤2中煮沸为常压煮沸，压力为0.1mpa，浓缩时间为20-60min。4.根据权利要求1所述牛胆汁病毒去除灭活的方法，其特征在于，所述步骤3中真空浓缩的的真空度为0.02～0.08mpa，温度为50-60℃。5.根据权利要求1所述牛胆汁病毒去除灭活的方法，其特征在于，所述一次真空浓缩的时间为1-3h，二次真空浓缩的时间为2-5h。6.根据权利要求1所述牛胆汁病毒去除灭活的方法，其特征在于，所述牛胆汁中病毒的感染量≤106tcid
50
/0.1ml。7.根据权利要求1所述牛胆汁病毒去除灭活的方法，其特征在于，所述牛胆汁中的病毒包括牛病毒性腹泻病毒、牛鼻气管炎病毒、猪瘟病毒、蓝耳病毒中的一种或几种的组合。8.根据权利要求1所述牛胆汁病毒去除灭活的方法，其特征在于，经过去除灭活病毒后的牛胆汁需要进行检测验证，所述检测验证的方法选自荧光定量pcr、elisa、电镜、rt检测中的一种或几种的组合。9.根据权利要求8所述牛胆汁病毒去除灭活的方法，其特征在于，所述检测验证选在步骤1、2、3结束后取样，当其中某一步骤所取样品经过检测判定病毒已灭活，则后续工艺不再取样检测。10.一种根据权利要求1-9任一项所述牛胆汁病毒去除灭活的方法的应用，其特征在于，应用于牛胆汁的灭活中，去除灭活病毒后的牛胆汁应用于处方药的制备中。

技术总结
本发明公开了一种牛胆汁病毒去除灭活的方法，包括以下步骤：(1)一次真空浓缩；(2)煮沸浓缩；(3)二次真空浓缩。本发明通过采用一次真空浓缩，减少牛胆汁中溶剂量，降低沸点，防止煮沸过程中温度过高，影响牛胆汁中热敏药物活性，同时实现病毒的一次灭菌，为进一步操作提供条件。并且在经过一次真空浓缩后，进行常压煮沸浓缩，可以进一步达到病毒灭活的作用，彻底避免病毒对牛胆汁用于药物原料时的影响。同时本发明制备的经过病毒去除灭活的牛胆汁可以排除其他病毒物质的干扰，并且充分保留牛胆汁的药物活性，广泛应用于药物中，使用便利，无干扰性。干扰性。


技术研发人员：张晓君
受保护的技术使用者：成都杨天万应制药有限公司
技术研发日：2023.07.31
技术公布日：2023/9/23