PLEC在上皮性卵巢癌早期诊断及治疗中的应用

plec在上皮性卵巢癌早期诊断及治疗中的应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及plec在上皮性卵巢癌早期诊断及治疗中的应用。


背景技术：

2.卵巢肿瘤由几种组织病理学实体组成，其中上皮性卵巢癌占恶性卵巢肿瘤的大多数(约90%)。上皮性卵巢癌是妇科癌症病人死亡的主要原因，也是女性癌症死亡的第五大常见原因。来自美国和英国登记的研究估计，六分之一的女性在诊断后的90天内死亡，这反映了确诊时间晚和缺少有效治疗方法所导致的潜在高发病率和死亡率。尽管早期卵巢癌是高度可治愈的，但由于缺乏有效的早期筛查方法及具体的警告信号或症状导致诊断延迟从而难以及时在早期发现卵巢癌。因此，探究调控卵巢癌发生发展中关键基因，阐明其调节机制，对有效控制卵巢癌的发生发展，提高患者生存率具有重要意义。
3.plectin（plec）是一种500 kda的巨大多功能细胞骨架蛋白，在稳定和协调细胞的中间丝网络中起着至关重要的作用。同时，不同亚型的plec在不同器官中的表达情况多样，也可作为信号支架在细胞生物力学如机械力感知方面发挥作用。
4.卵巢由3种主要的细胞组成，即覆盖外表面的上皮细胞、产生卵子的细胞以及结缔组织细胞，每种类型的细胞都可以发展成不同类型的肿瘤：上皮肿瘤开始于覆盖卵巢外表面的细胞；生殖细胞肿瘤开始于产生卵子的细胞；间质瘤开始于结缔组织细胞。卵巢癌主要的治疗难点就在于其常发生体内转移，在远端产生转移灶，如常见的晚期腹膜转移。为了及时掌控肿瘤发生发展的情况，需要选择合适的药物靶标。选择药物作用靶标要考虑两个方面：1. 靶标的有效性，即靶标与疾病确实相关，并且通过调节靶标的生理活性能有效地改善疾病症状。2. 靶标的副作用，如果对靶标的生理活性的调节不可避免地产生严重的副作用，那么将其选作药物作用靶标是不合适的。因此，并不是所有在相关部位具有高表达的基因都可以选为靶标，一种疾病可能会和多个靶标有关，一个靶标也可能与多种疾病关联；即使是选为靶标，其作用可能只是监测，并不一定具有治疗的效果。plec具有作为高价值生物标志物及药物靶标的潜力，可能在结肠癌（doi:1007-7847(2017)03-0239-05）或者胃癌（cn 116064556 a）筛选中发挥作用，但目前还未有关于plec作为上皮性卵巢癌早期诊断及治疗的靶标分子的报道。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术，本发明的目的是提供plec在上皮性卵巢癌早期诊断及治疗中的应用。本发明是基于临床治疗上皮性卵巢癌早期诊断治疗难点及plec与上皮性卵巢癌之间的密切相关性，通过慢病毒感染构建plec-kd的上皮性卵巢癌细胞系，为开发卵巢癌早期诊断治疗新的靶标分子药物、试剂盒提供新的思路。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面，提供plec基因作为靶标在制备用于诊断或监测上皮性卵巢癌
进展的试剂盒中的应用，所述plec基因为如下i）或ii）所示的核酸分子：i）核苷酸序列是seq id no.1所示的核酸分子；ii）除i）以外的编码seq id no.2所示氨基酸序列的核酸分子。
7.进一步的，其中所述诊断或监测是检测上皮性卵巢癌的发作、进展、稳定、改善和/或缓和。
8.进一步的，其中所述上皮性卵巢癌包括浆液性癌、子宫内膜样癌、透明细胞癌和黏液性癌。
9.本发明的第二方面，提供plec基因或plec基因编码的蛋白作为靶标的在制备用于治疗上皮性卵巢癌的药物中的应用，所述plec基因为如下i）或ii）所示的核酸分子：i）核苷酸序列是seq id no.1所示的核酸分子；ii）除i）以外的编码seq id no.2所示氨基酸序列的核酸分子；所述plec基因编码的蛋白为如下（a1）或（a2）所示的蛋白质：（a1）由序列表中seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（a2）在（a1）中所限定的蛋白质的n端和/或c端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
10.本发明的第三方面，提供下调plec基因表达或抑制plec蛋白活性的物质在制备治疗上皮性卵巢癌药物中的应用。
11.进一步的，所述下调plec基因表达的物质包括：shrna或sirna。
12.进一步的，所述shrna的序列为seq id no.3。
13.本发明的有益效果：在本发明中，我们通过大量卵巢组织正常及恶性病理组织样本，发现plec在卵巢恶性病理组织中的显著高表达；随后成功构建plec-kd（knock down）慢病毒感染上皮性卵巢癌细胞系（skov3、a2780），通过puromycin筛选出能够显著抑制其蛋白表达水平并稳定表达的plec-kd细胞系，发现与正常细胞系相比，两种plec-kd的卵巢癌细胞系的增殖和克隆形成能力都受到显著抑制，为开发卵巢癌早期诊断治疗新的靶标分子药物、试剂盒提供新的思路。
附图说明
14.图1为未处理时plec表达情况，其中a为plec在正常组织不同病理分期中的表达情况（正常、ti、tii、tiii）；b为对正常组织和病理组织中plec表达的h-score进行统计学分析后的柱状图。
15.图2为处理后plec表达情况，其中a为plec-kd shrna敲减后plec及β-actin蛋白表达情况的wb条带代表图，b为以β-actin为内参进行统计学分析后的柱状图，c为plec-kd shrna敲减后，利用qrt-pcr检测，对数据进行统计学分析得到的柱状图。
16.图3为细胞增殖效率实验，其中a为对cck-8细胞增殖实验酶标仪检测数据进行统计学分析后的柱状图，b为细胞克隆形成实验结晶紫染色情况代表图，c为对细胞克隆形成实验结晶紫染色情况使用imagej进行数据分析后得到的数据统计学分析后的柱状图。
17.图4为细胞划痕实验图，其中a为细胞划痕实验的结果代表图；b为对细胞划痕实验的结果情况使用imagej进行数据分析后得到的数据统计学分析后的柱状图。
具体实施方式
18.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
19.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
20.本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。卵巢正常及病理组织芯片购买自陕西爱维拉生物科技有限公司（芯片编号：ova-809）。
21.plec基因序列如seq id no.1所示，plec基因编码的蛋白序列如seq id no.2所示，具体参见序列表。
22.在实施例的实验中，含有15%胎牛血清、1%青霉素链霉素的mccoy’s5a培养基（solarbio）构成skov3完全培养基，含有10%胎牛血清、1%青霉素链霉素的1640培养基（gibico）构成a2780完全培养基。
23.实施例1：不同临床组织样本中plec表达情况对获取的临床不同病理分期的上皮性卵巢癌组织样本，以正常卵巢组织为对照组，不同病理分期组织为实验组，进行免疫组化实验以检测不同组织中plec的表达水平。
24.通过图1中a和图1中b，可以看出plec在病理组织中呈现出高表达的特性。
25.实施例2：通过细胞实验对plec在上皮性卵巢癌中的功能进行进一步鉴定1.细胞培养将skov3和a2780细胞株复苏后分别置于skov3完全培养基和a2780完全培养基内，于培养箱37℃、5%co2条件下培养。
26.2.plec-kd稳定表达细胞株的构建从通过济南科研云生物公司构建了plec-kd的和空载的shrna，设置kd组和对照组，每组三个复孔，将skov3、a2780两种上皮性卵巢癌细胞以4
×
104每孔的细胞密度均匀铺于六孔板中于培养箱37℃、5%co2条件下培养过夜后，在病毒moi=10，polybrene浓度为6μg/ml条件下感染24小时后，换新鲜培养基（skov3完全培养基和a2780完全培养基）培养5天后，使用puromycin在一周内从1.5梯度递减至0.75，筛选出稳定低表达plec（kdplec）和空载（对照）的细胞株。
27.plec-kd的shrna序列如下:seq id no.3：5
’‑
ggatccggtctcagttcctgaagtttattcaagagataaacttcaggaactgagaccttttttgaattc-3’空载的shrna的序列如下:seq id no.4：5
’‑
atcttgtggaaaggacgaggatccggacaagcttcgaattcatcgatactagtaaggatctgcgatcgctccggtgcccgtcagtg-3’3.western blot 检测蛋白水平plec表达情况（1）细胞蛋白提取：
①
将纯化柱及收集管放在冰上预冷；
②
使用前数分钟将蛋白酶
抑制剂混合液与变性裂解液按1:100混合；
③
将培养在t25培养瓶中的细胞在冰上用2ml预冷的1
×
pbs清洗两次后，吸去上清，每瓶加入100μl
②
中的混合液，用移液器吹打几次；
④
将裂解后的细胞转移到预冷的纯化柱套管中，15000rpm离心30s后取出；
⑤
立刻将收集管置于冰上，弃去纯化柱，变性总蛋白提取完成；
⑥
留2μl测定蛋白浓度，剩余样本按5
×
上样缓冲液与样品1:4的比例混合，加盖后于100℃，10min变性，放-20℃保存。
28.（2）蛋白浓度测定：
①
将蛋白标准品稀释至终浓度0.5mg/ml，将试剂a与试剂b按50:1比例配置适量工作液，充分混匀；
②
绘制标准曲线，将蛋白标准品按照0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板中，再分别补充标准品稀释液至20μl；
③
在96孔板样品孔中加入18μl标准品稀释液，再加入2μl待测样品；
④
分别在标准品孔和样品孔中加入200工作液，加入工作液时轻轻混匀注意不要产生气泡，将96孔板放入37℃培养箱孵育30min，取出观察是否有残余气泡，使用枪头去除后，设定酶标仪在562nm波长下测定各孔吸光度，测三次取各孔平均值；
⑤
以蛋白浓度为x轴，吸光度值为y轴，获得标准曲线公式，根据测得标准曲线待测样品浓度。
29.（3）制胶：
①
将玻璃板及制胶架安装好，按照表1中比例配置6%的分离胶，依次加入各种试剂混匀后，立即取8ml加入两块玻璃板之间，接着轻轻加入1ml超纯水对分离胶进行水封，室温等待分离胶凝固；
②
凝固后倒掉纯水，用吸水纸吸取残留水分；
③
按照表2中比例配置5%的浓缩胶，依次加入各种试剂混匀后立即灌胶，加满后插入1.5mm梳子；
④
等待浓缩胶凝固后将制好的胶连同胶架一起转移至电泳槽中，并将1
×
电泳缓冲液灌满内槽，将外槽电泳缓冲液加至3/4的位置，缓慢拔出梳子。
30.表1
31.表2
32.（4）加样：根据检测的蛋白浓度，使用加样枪头将蛋白样品加入样品孔。
33.（5）电泳：设置电压为80v电泳1h，停止后继续以120v电压电泳至目的蛋白分离至合适位置时终止电泳。
34.（6）转膜：
①
电泳结束后将凝胶取出置于桌面上，按照蛋白marker指示的位置切出含有目的蛋白的凝胶，同时在凝胶右上角做标记，根据凝胶大小裁出大小合适的pvdf膜，先
将pvdf膜放到甲醇中激活30s后取出放入纯水中静置5min，将平衡后的pvdf膜转移至转膜缓冲液中；
②
按照从上到下负极-海绵-3层滤纸-凝胶-pvdf膜-3层滤纸-海绵-正极的顺序制作“三明治”转膜夹层，过程中注意不要产生气泡，将夹层放入装有转膜液的转膜槽中，向转膜槽中加入转膜液至没过夹层，按照“红正黑负”的顺序连接好转膜仪后放入装有碎冰的泡沫箱中并用碎冰覆盖转膜槽，设置转膜仪300ma转膜2h。
35.（7）封闭：用tbst配置含5%脱脂奶粉的封闭液，将转膜完成的pvdf膜放入封闭液中摇床以65rpm速度室温封闭1h。
36.（8）一抗孵育：封闭结束后，将pvdf膜放入用封闭液稀释的一抗（plec抗体稀释倍数为1：1000，β-actin为1:2000）中4℃过夜孵育。
37.（9）二抗孵育：过夜孵育后，将pvdf膜放入tbst中，室温摇床洗10min
×
5次，将洗过的pvdf膜放入tbst稀释的二抗（1:2000）中，室温摇床孵育1h。孵育结束后用tbst洗10min
×
4次。
38.（10）曝光：使用ecl化学发光试剂盒，按照a液：b液=1：1的比例配置发光液，将pvdf膜正面向上放于化学发光设备托盘上，将发光液滴加在pvdf膜上，开启系统进行曝光。
39.4.实时荧光定量pcr检测rna水平plec表达情况（1）利用基因工程技术，通过ncbi数据库查找plec启动子序列，plec启动子序列引物序列为：seq id no.5：plectin-f：5
’‑
ccgcctcttcaatgccatcatcc-3’seq id no.6：plectin-r：5
’‑
tccaggttctccaggttggtctg-3’（2）rna提取：
①
取生长状态良好的细胞，弃掉培养基，2ml1
×
pbs洗3次最后一次尽量吸净，加100μl裂解液r1，震荡混合30s，室温静置1min；
②
在处理好的样本中加入600μl裂解液r2，充分颠倒混匀，室温静置3-5min；
③
将上清液吸入套有接液管的纯化柱，12000rpm离心30s；
④
弃去接液管中液体，向纯化柱中加入600μl洗涤液，12000rpm离心30s，弃去接液管中液体，重复洗涤一次；
⑤
空柱10000rpm离心1min后将纯化柱转移到新的1.5ml离心管中；
⑥
在纯化柱中央加入30-50μl洗脱液，室温静置1min，12000rpm离心30s，获得总rna。
40.（3）rna浓度测定：使用紫外分光光度计检测rna样品浓度（ng/μl）,同时检测od260和od280的吸光度值，计算od260/od280的比值，为保证rna纯度较高，确保比值在1.9~2.0之间。
41.（4）逆转录合成cdna：
①
rna65℃5min变性后立即放入碎冰中降温；
②
根据所测的rna浓度，按表3比例计算反转录时各组所需体积（反应条件：37℃,15min;98℃,5 min,4℃循环），使反应体系中rna的终浓度为300 ng/ml。表4、表5分别为实时荧光定量pcr（qrt-pcr）反应试剂以及程序。
42.表3
43.表4实时荧光定量pcr（qrt-pcr）反应试剂
44.表5实时荧光定量pcr（qrt-pcr）反应程序
45.5.cck8实验检测细胞增殖能力（1）取对数生长期细胞，以5000个/孔的密度均匀铺在96孔板中，每组设3个副孔，培养箱37℃培养。
46.（2）分别在20h（提前4小时，24h-4h）和44h (提前4小时，48h-4h)时向每孔加入10mlcck-8溶液。
47.（3）在培养箱培养4h后用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
48.6.克隆形成实验检测细胞增殖能力（1）取对数生长期细胞，以1000个/孔的密度均匀铺在6孔板中，每组设3个副孔，培养箱37℃培养。
49.（2）显微镜下观察，出现克隆时终止培养，弃掉培养基，pbs洗2次。
50.（3）4%多聚甲醛固定20min，pbs洗2次。
51.（4）结晶紫染色15min，pbs洗2次。
52.7.细胞划痕实验检测细胞迁移能力（1）取对数生长期细胞，按合适密度均匀铺在6孔板中，每组设3个副孔，培养箱37℃培养。
53.（2）细胞密度达到90%左右时，使用20μl中号枪头沿直尺边缘垂直划痕。
54.（3）划痕结束后，用pbs洗2次，更换对应新鲜2%低血清培养基，其中，含有2%胎牛血清、1%青霉素链霉素的mccoy’s5a培养基（solarbio）构成skov3低血清培养基，含有2%胎牛血清、1%青霉素链霉素的1640培养基（gibico）构成a2780低血清培养基。
55.（4）培养箱37℃培养，分别于划痕后0、24、48h时取出细胞显微镜下观察迁移情况并拍照记录。
56.实验结果：通过图2可以看到，在使用a2780和skov3细胞时，plec的表达以及相关mrna的表达情况较为一致，kdplec组均低于对照组。说明敲低后，呈现出低表达状态。
57.通过图3可以看到，对于图3中a细胞增殖实验，24h时，使用a2780和skov3细胞的
kdplec组活细胞数均略高于对照组；48h时，使用a2780和skov3细胞的kdplec组活细胞数均低于对照组。说明敲低后，在较长时间内，增殖能力降低。对于图3中b和图3中c细胞克隆形成实验，使用a2780和skov3细胞的kdplec组克隆效率均低于对照组。说明敲低后，增殖能力降低。
58.通过图4可以看到，对于细胞划痕实验，使用a2780和skov3细胞的kdplec组迁移效率均低于对照l组，说明敲低后，细胞迁移效率降低。
59.以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.plec基因作为靶标在制备用于诊断或监测上皮性卵巢癌进展的试剂盒中的应用，其特征在于，所述plec基因为如下i）或ii）所示的核酸分子：i）核苷酸序列是seq id no.1所示的核酸分子；ii）除i）以外的编码seq id no.2所示氨基酸序列的核酸分子。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，其中所述诊断或监测是检测上皮性卵巢癌的发作、进展、稳定、改善和/或缓和。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，其中所述上皮性卵巢癌包括浆液性癌、子宫内膜样癌、透明细胞癌和黏液性癌。4.plec基因或plec基因编码的蛋白作为靶标的在制备用于治疗上皮性卵巢癌的药物中的应用，其特征在于，所述plec基因为如下i）或ii）所示的核酸分子：i）核苷酸序列是seq id no.1所示的核酸分子；ii）除i）以外的编码seq id no.2所示氨基酸序列的核酸分子；所述plec基因编码的蛋白为如下（a1）或（a2）所示的蛋白质：（a1）由序列表中seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（a2）在（a1）中所限定的蛋白质的n端和/或c端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。5.下调plec基因表达或抑制plec蛋白活性的物质在制备治疗上皮性卵巢癌药物中的应用。6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述下调plec基因表达的物质包括：shrna或sirna。7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述shrna的序列为seq id no.3。

技术总结
本发明公开了PLEC在上皮性卵巢癌早期诊断及治疗中的应用，属于基因工程技术领域。本发明通过大量卵巢组织正常及恶性病理组织样本，发现PLEC在卵巢恶性病理组织中的显著高表达；随后成功构建PLEC-KD（Knock Down）慢病毒感染上皮性卵巢癌细胞系（SKOV3、A2780），通过puromycin筛选出能够显著抑制其蛋白表达水平并稳定表达的PLEC-KD细胞系，发现与正常细胞系相比，两种PLEC-KD的卵巢癌细胞系的增殖和克隆形成能力都受到显著抑制，为开发卵巢癌早期靶标分子药物、试剂盒提供新的思路。试剂盒提供新的思路。试剂盒提供新的思路。


技术研发人员：韩阳阳 白岚宁 张慧
受保护的技术使用者：潍坊医学院
技术研发日：2023.08.08
技术公布日：2023/9/23