一种多肽用于抑制NR2B与βCaMKII及抗抑郁治疗应用

methyl-d-aspartic acid receptor,nmdar)阻断神经元burst放电，发挥快速抗抑郁作用。
17.nmdar在脑内具有重要作用，大量阻断nmdar具有强烈的神经毒性，因而开发直接安全的nmdar拮抗剂具有非常大的难度。氯胺酮是非选择性轻度nmdar抑制剂，阻断大脑中广泛存在的nmdar，导致了氯胺酮的成瘾、精神异常等副作用。特异性敲除皮层神经元中nmdar的2b亚基(nmdar 2b subunit,nr2b)后，氯胺酮并不能进一步减少小鼠抑郁样行为和兴奋性突触传递。这表明氯胺酮可能通过特异性抑制nr2b亚基起作用。
18.本发明全脑筛查结果表明lhb区钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶ii的β亚型(ca2+/calmodulin-dependent protein kinases iiβ,camkiiβ)在抑郁患者特异性升高，且与抑郁症状相关。且nr2b亚基和camkiiβ有偶联作用。通过高通量蛋白筛选，研究者发现抑郁小鼠的lhb中只有camkiiβ是明显升高的。同时，我们也发现抑郁模型小鼠lhb nr2b亚基和camkiiβ偶联增加。因此lhb nr2b和camkiiβ偶联可能是抑郁症形成的重要原因。
19.因而，可以通过解开nr2b-βcamkii偶联，特异性下调lhb区谷氨酸能神经元突触后膜nr2b膜表达，发挥安全有效快速抗抑郁作用。而本技术提供的多肽能够解决现有技术无法安全快速抗抑郁的缺点，通过特异性阻断lhb区的nmdar通道，降低谷氨酸能神经元burst放电，发挥抗抑郁疗效，巧妙避免了氯胺酮全脑非选择性阻断nmdar带来的缺陷，能够避免成瘾、诱发精神症状等副作用。
20.本发明所述tat-βcamkii多肽(seq id no.1所示)，能够解开nr2b与βcamkii偶联，特异性阻断lhb区的nmdar通道，降低谷氨酸能神经元burst放电，发挥快速抗抑郁作用。在小鼠强迫性游泳模型、小鼠悬尾模型、小鼠糖水偏爱率检测上均发现有快速抗抑郁作用。且不同于氯胺酮非选择性阻断全脑nmdar。该多肽的快速抗抑郁作用更有效，副作用更少。
21.在可选实施例中，所述抗抑郁为通过抑制lhb区内nr2b与βcamkii的偶联，以特异性阻断lhb区的nmdar通道，降低谷氨酸能神经元burst放电，发挥快速抗抑郁作用。
22.本技术实施例提供的多肽能够特异性地干扰lhb区内nr2b与βcamkii的相互作用，从而减少lhb脑区nr2b膜表达增加，从而降低lhb区细胞膜对ca2+的通透性，减少ca2+大量内流，减少lhb过度兴奋产生的簇状放电，发挥抗抑郁作用。
23.因此，本技术提供的能够通过解开nr2b与βcamkii偶联特异性地减少lhb过度兴奋产生的簇状放电，不依赖于氯胺酮的非选择性阻断全脑nmdar机制。该多肽用于治疗抑郁症具有快速起效、有效率高、复发性低、严重患者有效、无致自杀风险等诸多优势。
24.本发明具有以下有益效果：
25.本发明实施例提供了一种多肽，该多肽与seq id no.1具有至少90％的一致性。而本技术提供的多肽能够解决现有技术无法安全快速抗抑郁的缺点，通过特异性阻断lhb区的nmdar通道，降低谷氨酸能神经元burst放电，发挥抗抑郁疗效，巧妙避免了氯胺酮全脑非选择性阻断nmdar带来的缺陷，能够避免成瘾、诱发精神症状等副作用。
26.此外，本发明实施例还提供了一种用于抑制nr2b与βcamkii偶联的抑制剂在制备抗抑郁药物中的应用、编码该多肽的核酸分子、多肽在制备用于抗抑郁药物中的应用、多肽的制备方法、抗抑郁药物以及用于抑制nr2b与βcamkii偶联的抑制剂。
附图说明
27.图1为本发明验证例1提供的多肽对于nr2b与βcamkii偶联的影响图；
28.图2为本发明验证例2中生理水平悬尾实验lhb注射多肽结果图；
29.图3为本发明验证例2中生理水平强迫性游泳实验lhb注射多肽结果图；
30.图4为本发明验证例3中抑郁模型水平悬尾实验lhb注射多肽结果图；
31.图5为本发明验证例3中抑郁模型水平强迫性游泳实验lhb注射多肽结果图；
32.图6为本发明验证例3中抑郁模型水平糖水偏爱率检测实验lhb注射多肽结果图。
具体实施方式
33.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
34.以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
35.实施例1
36.本实施例提供一种多肽，其序列如seq id no.1所示。
37.实施例2
38.固相合成是从c端开始合成，即k为第一合成的氨基酸，将k(lys)的末端的羧基以共价键的结构与一个不溶性的高分子树脂相连，然后脱去第一个氨基酸的氨基保护，将第二个氨基酸a的末端的羧基与第一个氨基酸的氨基相连，重复上述步骤，即缩合-去保护-下一轮缩合，最后得到所需要合成的肽链长度。
39.在本实施例中，合成seq id no.1的具体合成步骤的具体操作为：
40.(1)取fmoc-lys(boc)-wangresin(多肽合成用树脂)，dcm(二氯甲烷)膨胀30分钟，抽干，用20％哌啶脱fmoc 20分钟，dmf(n,n-二甲基甲酰胺)洗涤6次，抽干；
41.加fmoc-ala-oh(保护氨基酸)，tbtu，hobt，吗啡啉，dmf做溶剂反应40分钟，dmf洗涤抽干，颜色，无色反应上，然后，铜20％哌啶脱fmoc 20分钟，dmf洗涤6次，抽干，反应下面一个氨基酸，以此类推。
42.(2)在步骤1的fmoc-ala-lys(boc)-wangresin树脂中加入质量百分浓度20％哌啶反应20分钟，抽干，dmf洗涤5-6次，抽干，以dmf作为溶剂，加入fmoc-glu(otbu)-oh，nmm，用hbtu/hobt或tbtu/hobt中的一种混合物为缩合剂，反应40分钟～2小时，茚三酮法检测反应中点，抽干，用dmf洗涤5-6次，抽干获得fmoc-glu(otbu)-ala-lys(boc)-wangresin。
43.(3)在步骤2fmoc-glu(otbu)-ala-lys(boc)-wangresin中加入质量百分浓度20％哌啶反应20分钟，抽干，dmf洗涤5-6次，抽干，以dmf作为溶剂，加入质量百分浓度20％哌啶反应20分钟，抽干，dmf洗涤5-6次，抽干，以dmf作为溶剂，加入fmoc-pro-oh，nmm，用hbtu/hobt或tbtu/hobt(tbtu和hobt)中的一种混合物为缩合剂，反应40分钟～2小时，茚三酮法检测反应中点，抽干，用dmf洗涤5～6次，抽干，获得fmoc-pro-glu(otbu)-ala-lys(boc)-wangresin。
44.依次类推，直到最后一个氨基合成完后脱fmoc,切割，获得seq id no.1所示多肽。
45.验证例1
46.验证实施例1提供的多肽对于nr2b与βcamkii偶联的影响。
47.小鼠lhb区立体定位双侧注射tat-camkiiβ-r，即seq id no.1所示多肽(50nmol/l,1μl)，vehicle(溶剂组，veh)，取小鼠的lhb区，制备样本检测nr2b与βcamkii偶联情况。结果请参照附图1，附图1表明多肽可以解开lhb区nr2b与βcamkii偶联。
48.验证例2
49.验证实施例1提供的多肽在生理水平的抗抑郁样作用。
50.在生理水平小鼠lhb区注射实施例1提供的多肽(50nmol/l,1μl，con+tat)，并对照设置1组对照例，为空白对照组(con+veh)，24小时后，做悬尾实验，强迫游泳实验，小鼠糖水偏爱率检测。
51.悬尾实验：悬尾箱(25
×
25
×
25cm)顶板中心固定一塑料夹子，试验时用夹子夹住鼠尾尖约1cm处，将小鼠倒悬，使头部离箱底4～5cm。观察6min，并用电子秒表记录后4min内累计不动时间。
52.强迫游泳实验：将小鼠放入高20cm，直径10cm的圆柱型玻璃缸中，每缸一只，缸中水深10cm，水温25℃。观察6min，并用电子秒表记录后4min内累计不动时间，即小鼠在水中停止挣扎，或呈漂浮状态，仅有细小的肢体运动以保持头部浮在水面的持续时间。
53.悬尾实验请参照附图2，强迫游泳实验请参照附图3，由结果可知，在lhb注射实施例1提供的多肽在生理水平上具有明显抗抑郁作用。
54.验证例3
55.验证实施例1提供的多肽在抑郁模型水平发挥抗抑郁作用。
56.小鼠慢性温和不可预知应激造模(cms，同验证例1)6周后，在小鼠lhb区注射实施例1提供的多肽(50nmol/l,1ul，cms+tat)，并对照设置2组对照例，为空白对照组(con+veh)和(cms+veh)。24小时后，做悬尾实验，强迫游泳实验，小鼠糖水偏爱率检测。
57.悬尾实验，强迫游泳实验同验证例3。
58.小鼠糖水偏爱率检测：采用双瓶法，即一瓶糖水，一瓶正常饮用水，同时供给小鼠饮用。测试前小鼠单笼饲养，小鼠适应性喝1％糖水3天，于测试前一天晚上10：00禁水禁食，第二天晚上10：00给予糖水和无糖水，给予小鼠之前称水瓶的重量，第三上午8：00收取糖水和无糖水，称水瓶的重量。通过两次水瓶重量之差求得小鼠的糖水和非糖水摄取量。饮用糖水的绝对值就是糖水摄入量。糖水摄入量/(糖水摄入量+白水摄入量)＝糖水偏爱率。测试完毕后小鼠放回原笼饲养。
59.悬尾实验请参照附图4，强迫游泳实验请参照附图5，小鼠糖水偏爱率检测参照附图6，由结果可知，在lhb注射实施例1提供的多肽在抑郁模型水平具有明显抗抑郁作用。
60.综上，本发明实施例提供了一种多肽，该多肽与seq id no.1具有不低于90％的一致性。而本技术提供的多肽能够解决现有技术无法安全快速抗抑郁的缺点，通过特异性阻断lhb区的nmdar通道，降低谷氨酸能神经元burst放电，发挥抗抑郁疗效，巧妙避免了氯胺酮全脑非选择性阻断nmdar带来的缺陷，能够避免成瘾、诱发精神症状等副作用。
61.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.用于抑制nr2b与βcamkii偶联的抑制剂在制备抗抑郁药物中的应用。2.一种多肽，其特征在于，所述多肽选自如下中的一种：1)序列为seq id no.1的多肽；2)与seq id no.1具有至少90％的同源性且具有抑制nr2b与βcamkii偶联作用的多肽。3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求2所述的多肽。4.权利要求2所述多肽或权利要求3所述的药物组合物在制备抑制nr2b与βcamkii偶联的抑制剂中的应用。5.权利要求2所述多肽或权利要求3所述的药物组合物在制备抗抑郁药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种多肽用于抑制NR2B与βCaMKII及抗抑郁治疗应用，涉及抗抑郁药物制备及应用领域，该多肽与SEQ ID No.1具有至少90％的一致性。而本申请提供的多肽能够解决现有技术无法安全快速抗抑郁的缺点，通过特异性阻断LHb区的NMDAR通道的NR2B亚基，降低LHb区谷氨酸能神经元Burst放电，发挥快速抗抑郁疗效，巧妙避免了氯胺酮全脑非选择性阻断NMDAR带来的缺陷，能够避免成瘾、诱发精神症状等副作用。作用。作用。


技术研发人员：周其冈 夏天 陈佳丽 张晶 孟帆
受保护的技术使用者：南京医科大学
技术研发日：2023.08.09
技术公布日：2023/9/23