一种高尔基体重组和堆叠蛋白65真核表达载体及其构建方法和应用

1.本发明涉及一种高尔基体重组和堆叠蛋白65的真核表达载体及其构建方法和应用，属于分子生物学、细胞生物学和病毒学领域。


背景技术：

2.猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，prrsv)是一种具有囊膜的单股正链rna病毒，属于套式病毒目(nidovirales)、动脉炎病毒科(arteriviridae)、β-动脉炎病毒属(betaarterivirus)。prrsv感染后引起妊娠母猪流产、死胎、弱胎和木乃伊胎等繁殖障碍以及各年龄段猪呼吸系统疾病，对全球养猪业造成巨大的经济损失。然而由于prrsv易变异特点，目前对其包括疫苗免疫、抗病毒药物治疗等在内的防控措施效果不佳，因此亟需研发新的抑制prrsv感染的方法。
3.高尔基体重组和堆叠蛋白65(golgi reassembly and stacking protein 65，grasp65)在哺乳动物细胞中对高尔基体扁平囊泡堆叠结构维持和行使功能保障方面至关重要，参与细胞增殖、凋亡、迁移等过程。但是该蛋白的相关应用还需要进一步研究。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种grasp65真核表达载体及其构建方法；
5.本发明的另一项目的是提供一种grasp65抑制prrsv体外感染的方法；
6.还提供一种grasp65在抑制prrsv体外感染中的应用。
7.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案：
8.一种grasp65真核表达载体的构建方法，
9.通过snapgene软件进行引物设计，以grasp65基因序列(genbank accession no.aj409349.1)为模板，以pcdna3.1-myc/his_a为真核表达载体，进行pcr，构建grasp65真核表达载体，其中
10.grasp65正向引物
11.agacccaagctggctagcgccaccatgggcctg(seq id no.1)，
12.grasp65反向引物
13.tgcagaattcttacagatcctcttcagagatgagtttctgctcttctgtg(seq id no.2)。
14.其中的pcr反应体系：共20μl，2
×
primer star mix、用量为10μl，grasp65正向引物浓度10μm、用量1μl，grasp65反向引物浓度10μm、用量1μl，grasp65模板50ng、1μl，其余为ddh2o；
15.反应程序：98℃预变性10s；98℃变性10s、55℃退火15s、68℃延伸15s，29个循环；68℃延伸3min；16℃保存。
16.一种grasp65抑制prrsv体外感染的方法，具体步骤为：
17.(1)将marc-145细胞按5
×
104个/ml铺于24孔细胞培养板中，每孔加入500μl含10％(v/v)热灭活胎牛血清(fbs)dmem培养基，于37℃co2培养箱中培养12h；
18.(2)将处于对数生长期的marc-145细胞使用转染试剂进行转染：首先取两个1.5ml无菌离心管，分别加入50μl无血清培养基opti-mem，然后分别加入0.5μg的grasp65真核表达载体和1.5μl转染试剂，轻轻混匀短暂离心后将两管合为一管；再次混匀短暂离心后室温放置10-15min，然后均匀滴加到24孔细胞培养板中；
19.(3)在37℃co2培养箱中培养6h后，更换新的含2％(v/v)热灭活fbs dmem培养基，继续培养18h。
20.所述含热灭活fbsdmem培养基中含100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素。本发明的grasp65在抑制prrsv体外感染中的应用。
21.所述grasp65在抑制prrsv体外感染病毒rna含量中的应用。
22.所述grasp65在抑制prrsv体外感染病毒蛋白表达中的应用。
23.所述grasp65在抑制prrsv体外感染病毒滴度中的应用。
24.所述grasp65在培育抗prrsv猪方面的应用。
25.本发明的积极有益效果：
26.1、本发明通过构建grasp65真核表达载体，在非洲绿猴肾上皮细胞系marc-145中转染grasp65真核表达载体；以高致病性prrsv(hp-prrsv)毒株hn07-1感染grasp65真核表达载体转染细胞；通过实时荧光定量pcr、免疫印迹法、病毒滴度测定实验鉴定，grasp65对hp-prrsv感染marc-145细胞具有显著的抑制作用。
27.2、本发明综合利用分子生物学、细胞生物学和病毒学等技术，提供一种grasp65抑制prrsv体外感染的方法，利用本发明的方法能够显著抑制prrsv感染宿主细胞。
28.3、本发明通过marc-145细胞实验表明，grasp65能够降低prrsv感染marc-145细胞病毒rna含量，能够抑制prrsv感染marc-145细胞病毒蛋白表达，降低prrsv感染marc-145细胞病毒滴度，这些实验充分证实了grasp65能够抑制prrsv体外感染marc-145细胞。
29.4、本发明提供的一种grasp65抑制prrsv体外感染的方法有助于揭示prrsv致病机制及抗病毒分子机制。
30.5、本发明提供的一种grasp65抑制prrsv体外感染的方法可应用于抗prrsv猪的培育工作。
附图说明
31.图1是prrsv感染marc-145细胞病毒rna相对含量的柱状图；
32.图2是prrsv感染marc-145细胞病毒蛋白表达的柱状图；
33.图3是prrsv感染marc-145细胞病毒滴度的柱状图。
具体实施方式
34.以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
35.实施例1.grasp65真核表达载体的构建方法
36.通过snapgene软件进行引物设计，以grasp65基因序列(genbank accession no.aj409349.1)为模板，以本实验室保存的pcdna3.1-myc/his_a为真核表达载体，使用表1
中所列pcr引物，表2中pcr反应体系，构建grasp65真核表达载体，经生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证。经比对，pcr扩增出的序列和模板完全相同。
37.表1pcr引物序列
[0038][0039]
表2pcr反应体系
[0040][0041]
pcr反应程序如下：98℃预变性10s；98℃变性10s、55℃退火15s、68℃延伸15s，29个循环；68℃延伸3min；16℃保存。
[0042]
实施例2.grasp65真核表达载体转染marc-145细胞
[0043]
将marc-145细胞按5
×
104个/ml铺于24孔细胞培养板中，每孔加入500μl含10％(v/v)热灭活胎牛血清(fbs)dmem培养基(100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素)，于37℃co2培养箱中培养12h。将处于对数生长期的marc-145细胞使用lipofectamine ltx reagent with plus reagent转染试剂(美国invitrogen公司)按照操作说明进行转染：
[0044]
首先取两个1.5ml无菌离心管，分别加入50μl无血清培养基opti-mem，然后分别加入0.5μg grasp65真核表达载体和1.5μl转染试剂，轻轻混匀短暂离心后将两管合为一管；再次混匀短暂离心后室温放置10-15min，然后均匀滴加到24孔细胞培养板中；在37℃co2培养箱中培养6h后，更换新的含2％热灭活fbs的dmem培养基(100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素)，继续培养18h用于后续实施例。同时将pcdna3.1-myc/his_a载体平行转染marc-145细胞以作对照。
[0045]
实施例3.grasp65对prrsv感染marc-145细胞病毒rna含量的影响
[0046]
为了验证grasp65对prrsv感染marc-145细胞病毒rna含量的影响，将实施例2转染grasp65真核表达载体marc-145细胞更换新的含2％热灭活fbsdmem培养基(100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素)，加入病毒感染复数(moi)为1的高致病性prrsv(highly pathogenic prrsv，hp-prrsv)hn07-1毒株(由本实验室分离并保存，genbank编号kx766378.1)，置于37℃co2培养箱1h；随后弃细胞上清，用磷酸盐缓冲液(pbs)清洗细胞三次；向细胞培养板孔中加入500μl含2％热灭活fbsdmem培养基(100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素)，37℃培养10h；收集细胞，弃去原有细胞培养基，用pbs清洗细胞三次；使用rna提取试剂trizol(美国thermo fisher scientific公司)提取prrsv感染细胞的总rna，使用primescript
tm
反转录
试剂盒(大连takara公司)生成互补dna(cdna)作为实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr，rt-qpcr)模板；因prrsv orf7 rna含量通常被用于代表病毒总rna含量，因此以相对rt-qpcr对hp-prrsv orf7 rna含量进行测定。以3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)作为细胞内参，用gapdh mrna对病毒rna进行标准化，并通过2
‑△△
ct
方法进行相对定量。引物和反应体系见表3和表4，反应程序使用abi荧光定量pcr仪自带fast测序(美国applied biosystems公司)。对实施例2转染pcdna3.1-myc/his_a载体marc-145细胞进行平行实验以作对照。
[0047]
表3rt-qpcr引物序列
[0048][0049]
表4rt-qpcr反应体系
[0050][0051]
该实验独立进行三次，每次三个重复，实验数据以组平均值和均值标准误差(sem)表示；统计学分析利用graphpad软件非配对双尾student t检验进行；***p《0.001表示有非常显著统计学差异。
[0052]
结果如图1显示，与转染pcdna3.1-myc/his_a载体marc-145细胞(图中标识myc)相比，转染grasp65真核表达载体marc-145细胞(图中标识myc-grasp65)中hp-prrsv rna含量明显降低(下降了75％)，说明grasp65能够降低prrsv感染marc-145细胞病毒rna含量，证实了grasp65能够抑制prrsv感染marc-145细胞。
[0053]
实施例4.grasp65对prrsv感染marc-145细胞病毒蛋白表达的影响
[0054]
为了验证grasp65对prrsv感染marc-145细胞病毒蛋白表达的影响，将实施例2转染grasp65真核表达载体marc-145细胞更换新的含2％热灭活fbsdmem培养基(100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素)，加入moi＝1的hp-prrsv hn07-1毒株，置于37℃co2培养箱1h；随后弃细胞上清，用pbs清洗细胞三次；向细胞培养板孔中加入500μl含2％热灭活fbsdmem培养基(100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素)，37℃培养12h、24h和36h；弃掉细胞培养液，用pbs清洗三次；弃掉pbs，加入150μl细胞强裂解液(上海碧云天生物技术有限公司，货号p0013b)，在冰上震荡15min，收集全细胞裂解液；以13000g、4℃离心15min，小心吸取上清至1.5ml离心管中并做好标记，获取全细胞裂解液上清液；以相同含量β-微管蛋白(β-actin)为标准调节
上样量；加入5
×
蛋白上样缓冲液使其终浓度为1
×
，沸水煮样10min使样品充分变性后12000g离心2min；分别配制15％分离胶、5％浓缩胶，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；以400ma(恒流)、45min条件转移蛋白样品至0.2μm聚偏二氟乙烯膜(pvdf，美国merck millipore公司)；用含5％(v/v)脱脂奶的pbs吐温-20缓冲液(pbst)于37℃封闭1h；
[0055]
分别以美国gtx公司兔抗prrsv核衣壳n蛋白多克隆抗体(货号129270)、美国cst公司鼠抗myc抗体(货号2276s)和美国cst公司鼠抗β-actin抗体(货号5125s)作为一抗，37℃孵育2h；pbst清洗5次，每次5min，以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体和鼠抗体(英国abcam公司，货号ab6721和ab6789)作为二抗，37℃孵育1h；pbst清洗5次，每次5min；使用苏州新赛美公司的超敏ecl化学发光试剂盒(苏州ncm公司，货号p0013b)，根据说明书将显色液a和b等比例混匀，用吸水纸吸干膜上残留的清洗液，将混匀后的发光液均匀滴加在pvdf膜上，分别对hp-prrsv n蛋白、myc-grasp65、β-actin蛋白水平进行免疫印迹法(immunoblotting，ib)检测。对实施例2转染pcdna3.1-myc/his_a载体marc-145细胞进行平行实验以作对照。
[0056]
结果如图2显示，在β-actin蛋白含量相同的条件下(条带粗细程度均一)，与转染pcdna3.1-myc/his_a载体marc-145细胞(图中标识myc)相比，转染grasp65真核表达载体marc-145细胞(图中标识myc-grasp65)中在hp-prrsv感染后12h(12hpi)、24h(24hpi)、36h(36hpi)，病毒n蛋白含量均明显降低(条带变细)，说明grasp65能够抑制prrsv感染marc-145细胞病毒蛋白表达，又一次证实了grasp65能够抑制prrsv感染marc-145细胞。
[0057]
实施例5.grasp65对prrsv感染marc-145细胞病毒滴度的影响
[0058]
为了验证grasp65对prrsv感染marc-145细胞病毒滴度的影响，将实施例2转染grasp65真核表达载体marc-145细胞更换新的含2％热灭活fbs dmem培养基(100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素)，加入moi＝1的hp-prrsv hn07-1毒株，置于37℃co2培养箱1h；随后弃细胞上清，用pbs清洗细胞三次；向细胞培养板孔中加入500μl含2％ fbs热灭活dmem培养基(100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素)，37℃培养12h、24h、36h和48h。对实施例2转染pcdna3.1-myc/his_a载体marc-145细胞进行平行实验以作对照。按常规步骤进行病毒滴度测定实验(即半数细胞感染剂量，50％tissue culture infective dose，tcid
50
)：
[0059]
将marc-145细胞稀释至5
×
104个/ml铺设96孔细胞培养板，每孔加入100μl含10％热灭活fbsdmem培养基(100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素)，置于37℃、5％ co2培养箱培养过夜；待细胞的汇合度达到70％-80％左右，取上述感染后培养不同时间点的marc-145细胞上清液进行10倍倍比稀释(10-1-10-10
)；弃去原有培养基，将上述稀释好的病毒液接种于96孔细胞培养板的marc-145细胞中，每孔接种100μl，每个稀释度做8个重复，另以含2％热灭活fbsdmem培养基(100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素)代替培养细胞上清液作阴性对照；将96孔细胞培养板放于37℃、5％ co2培养箱培养；每24h观察一次细胞的生长状态，并从第3d开始记录细胞病变孔数，观察3-5d，直至细胞病变孔数不再增加；用reed-muench法计算病毒的tcid
50
。实验数据以组平均值和均值标准误差(sem)表示；统计学分析利用graphpad软件非配对双尾student t检验进行；****p《0.0001为有极显著差异。
[0060]
结果如图3所示，与转染pcdna3.1-myc/his_a载体marc-145细胞(图中标识myc)相比，转染grasp65真核表达载体marc-145细胞(图中标识myc-grasp65)在hp-prrsv感染后12h(12hpi)、24h(24hpi)、36h(36hpi)和48h(48hpi)上清液中病毒滴度均明显下降(下降了
至少100倍，》2log
10
tcid
50
/ml)，说明grasp65能够降低prrsv感染marc-145细胞病毒滴度，再一次证实了grasp65能够抑制prrsv感染marc-145细胞。

技术特征：
1.一种高尔基体重组和堆叠蛋白65(grasp65)真核表达载体，其特征在于，其构建方法为：通过snapgene软件进行引物设计，以grasp65基因序列(genbank accession no.aj409349.1)为模板，以pcdna3.1-myc/his_a为真核表达载体，进行pcr，构建grasp65真核表达载体，其中grasp65正向引物agacccaagctggctagcgccaccatgggcctg(seq id no.1)，grasp65反向引物tgcagaattcttacagatcctcttcagagatgagtttctgctcttctgtg(seq id no.2)。2.如权利要求1所述的grasp65真核表达载体，其特征在于，pcr过程中的反应体系：共20μl，2
×
primer star mix、用量为10μl，grasp65正向引物浓度10μm、用量1μl，grasp65反向引物浓度10μm、用量1μl，grasp65模板50ng、1μl，其余为ddh2o；pcr反应程序：98℃预变性10s；98℃变性10s、55℃退火15s、68℃延伸15s，29个循环；68℃延伸3min；16℃保存。3.一种grasp65抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外感染的方法，其特征在于，具体步骤为：(1)将marc-145细胞按5
×
104个/ml铺于24孔细胞培养板中，每孔加入500μl含10％(v/v)热灭活胎牛血清(fbs)dmem培养基，于37℃co2培养箱中培养12h；(2)将处于对数生长期的marc-145细胞使用转染试剂进行转染：首先取两个1.5ml无菌离心管，分别加入50μl无血清培养基opti-mem，然后分别加入0.5μg权利要求1的grasp65真核表达载体和1.5μl转染试剂，轻轻混匀短暂离心后将两管合为一管；再次混匀短暂离心后室温放置10-15min，然后均匀滴加到24孔细胞培养板中；(3)在37℃co2培养箱中培养6h后，更换新的含2％(v/v)热灭活fbs dmem培养基，继续培养18h。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述含热灭活fbsdmem培养基中含100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素。5.grasp65在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外感染中的应用。6.如权利要求5所述grasp65在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外感染病毒rna含量中的应用。7.如权利要求5所述grasp65在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外感染病毒蛋白表达中的应用。8.如权利要求5所述grasp65在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外感染病毒滴度中的应用。9.如权利要求5所述grasp65在培育抗猪繁殖与呼吸综合征病毒猪方面的应用。

技术总结
本发明涉及一种高尔基体重组和堆叠蛋白65(GRASP65)真核表达载体及其构建方法和应用，通过构建GRASP65真核表达载体，在非洲绿猴肾上皮细胞系MARC-145中转染GRASP65真核表达载体；以高致病性PRRSV(HP-PRRSV)毒株感染GRASP65真核表达载体转染细胞；通过实时荧光定量PCR、免疫印迹法、病毒滴度测定实验鉴定，证明了GRASP65对HP-PRRSV感染MARC-145细胞具有显著抑制作用，本发明的GRASP65可应用于抗PRRSV猪的培育工作。PRRSV猪的培育工作。PRRSV猪的培育工作。


技术研发人员：李睿 赵爽爽 乔松林 陈鑫鑫 郭军庆 邢广旭 赵东 张改平
受保护的技术使用者：河南省农业科学院
技术研发日：2023.08.12
技术公布日：2023/9/23