一种快速获得荷兰鸢尾后代幼苗及优异种球的方法

1.本发明属于生物技术育种领域，更具体地说，涉及一种快速获得荷兰鸢尾后代幼苗及优异种球的方法。


背景技术：

2.荷兰鸢尾(iris
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hollandica)为鸢尾科鸢尾属球根花卉，是球根鸢尾中栽培与应用最为广泛的一类，自然花期4月，群体花期约30天，可用于盆切花、花海、花田、花境、林下等多种应用形式。在荷兰生产的球根花卉商品种球中，荷兰鸢尾的栽培面积位居前列，并大多用于切花生产。我国于20世纪90年代末首次引进栽培荷兰鸢尾，但关于荷兰鸢尾应用与育种研究较少，市场上销售的鲜切花几乎全部依赖于进口或种球进口种植生产。随着社会经济的不断发展，花卉产业已成为我国国民经济的重要组成部分，在国家生态文明战略和乡村振兴战略中发挥着重要作用，荷兰鸢尾作为高档切花近年来在国内需求逐年增加，且与其他进口球根花卉相比，荷兰鸢尾种球退化较轻，一次引进可连续种植多年，无需年年购买种球，因此具有广阔的市场前景。
3.然而，目前国内具有自主知识产权的荷兰鸢尾品种很少且商业化种植基本没有，究其原因主要是因为多数荷兰鸢尾品种具有雌性或雄性不育的特性导致杂交育种困难。
4.然而，在大量引种国外优良品种并进行适应性栽培的基础上，通过大量杂交配组我们发现某些特定的杂交组合可以结实。但由于外界不确定的环境因素，例如结种期间雨水过多或者虫害等会导致收获不到成熟的杂交种子。另外，即使收获的种子进行普通播种后移栽，到翌年收获地下种球时种球周径也很小，育种周期时间长将会阻碍国内荷兰鸢尾种质创新的步伐。
5.胚培养具体指通过人为改善幼胚发育条件，提供幼胚发育必需营养进而促使幼胚长成植株。但目前该项技术在荷兰鸢尾中尚无相关研究报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种快速获得荷兰鸢尾后代幼苗及优异种球的方法。
7.需要说明的是，本发明利用胚培养技术成功缩短了荷兰鸢尾从种子到幼苗的时间，另外胚培养的幼苗在翌年收取到的种球周径显著大于普通播种幼苗产生的种球，因此该项技术的使用将大大缩短荷兰鸢尾育种周期，提高育种效率和品质，推动国内荷兰鸢尾种质创新进程。
8.进一步地，荷兰鸢尾杂交后在四月中下旬开始结果，而在结实期间发现荷兰鸢尾幼嫩的果实会受虫啃食，另外如果雨水过多也会使果实发霉，最终导致收获不到成熟的种子，胚培养方法的使用将大大降低这些因外界不确定环境因素导致种子收获不到的风险，并且通过胚培养技术获得的杂交后代种球周径显著大于普通播种幼苗产生的种球，该项技术的使用将大大加速国内荷兰鸢尾种质创新进程。
9.为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
10.一种快速获得荷兰鸢尾后代幼苗及优异种球的方法，包括以下步骤：
11.(1)亲本材料准备：选择已明确的可以获得种子的杂交组合亲本品种，商品球秋植，保证肥水充足；
12.(2)人工授粉杂交：当母本开花，雄蕊花药未成熟散粉时，剪掉母本全部雄蕊、旗瓣和垂瓣，只剩下三枚羽化柱头并用硫酸纸套袋隔离；当母本雌蕊成熟时授以父本花粉，授粉后继续套袋隔离，为提高授粉成功率，待第一次授粉结束后2-3天再重复授粉一次，待第二次授粉结束后一周左右时间，当柱头呈失水萎蔫状态时可将硫酸纸取下；且授粉宜在天气晴朗的上午进行；
13.(3)幼胚剥取：距第一次杂交授粉40-45天后，剪下膨大的蒴果，用清水冲洗表面后，在蒴果表面喷上75％酒精，然后放置在超净工作台中用紫外线灭菌30min；待紫外灭菌结束后在超净工作台无菌条件下剥开蒴果，取出膨大的种子，用解剖针划破种皮，挤出幼胚；
14.(4)幼胚离体培养：在无菌条件下，将步骤(3)中得到的幼胚接种到ms培养基上进行培养，组培室培养条件为：温度22-24℃、光周期14h光照/10h黑暗、光照强度4000-6000lux，培养直至幼苗生根；
15.(5)幼苗移栽：将步骤(4)中根长》3cm，高度》4cm的幼苗从培养基中取出，洗净根部后移栽到育苗盘中，移栽培养基质为灭菌蛭石，浇透水后盖上穴盘盖以保湿，置于人工气候箱中培养，一周左右揭开穴盘盖，待幼苗成活后再移栽换盆；且移栽换盆后的幼苗前期继续放于人工气候箱中培养，待11月下旬移至室外，正常浇水管理；
16.(6)种球收获：待翌年荷兰鸢尾地上部叶片枯萎时可收获种球。
17.可选地，步骤(5)中，所述的待幼苗成活后再移栽换盆，具体操作如下：
18.待幼苗根系长出穴盘底部后，连同培养的蛭石基质一起移栽到大盆里；其中，盆里的基质为体积比为1：1：1的草炭、营养土与蛭石的混合基质。
19.进一步地，步骤(5)中人工气候箱培养条件为：光照时间16h/d，光照期间温度23℃
±
1℃，黑暗期间温度18℃
±
1℃，光照强度20000-25000lux。
20.可选地，步骤(6)中所述的荷兰鸢尾地上部叶片枯萎即为枯萎变黄叶片占总叶片量的90-95％时收获种球。
21.值得说明的是，收获过早，绿色叶片还可以进行光合作用，影响种球生长；若收获过迟，遇到雨水过多天气会导致叶片腐烂进而引起下部种球腐烂。而当绿色叶片只占5-10％时，其光合作用对于种球营养物质的积累效果比较小且可以避免种球腐烂，因此是种球收获较适宜的时间。
22.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
23.本发明采用人工辅助授粉进行杂交并套袋隔离；剥取授粉后40-45天的幼胚；剥取的幼胚放于ms培养基上培养成幼苗；组培幼苗移栽及移栽成活后换盆；翌年幼苗叶片枯萎达90-95％时收获种球。本发明利用胚培养手段不仅可以大大降低不确定环境因素导致荷兰鸢尾种子不能获得的风险，而且相比于普通播种技术，该方法显著缩短了荷兰鸢尾从种子到可移栽幼苗的生长时间，同时收获到的后代种球周径更大。因此该方法大大缩短了荷兰鸢尾育种时间，加速了新品种的选育进程，对推动我国荷兰鸢尾产业发展具有重要的意义。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
25.图1为荷兰鸢尾果实受虫害。
26.图2为荷兰鸢尾胚培养(a-c)及移栽(d-e)。
27.图3为荷兰鸢尾胚培养苗产生的种球(左)和普通播种苗产生的种球(右)。
具体实施方式
28.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.在这里专用的词“实施例”，作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。本技术实施例中性能指标测试，除非特别说明，采用本领域常规试验方法。应理解，本技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本技术公开的内容。
30.除非另有说明，否则本文使用的技术和科学术语具有本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义；作为本技术中其它未特别注明的试验方法和技术手段均指本领域内普通技术人员通常采用的实验方法和技术手段。
31.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中”、“上”、“下”、“升”、“降”、“竖直”、“面”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
32.为了更好的说明本技术内容，在下文的具体实施例中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本技术同样可以实施。在实施例中，对于本领域技术人员熟知的一些方法、手段、仪器、设备等未作详细描述，以便凸显本技术的主旨。
33.在不冲突的前提下，本技术实施例公开的技术特征可以任意组合，得到的技术方案属于本技术实施例公开的内容。
34.需要说明的是，以下实施例中的荷兰鸢尾果实采自于江苏省中国科学院植物研究所鸢尾资源圃，试验用具均采自市面上能够购买得到或者实验室常用的常规产品。
35.实施例1：
36.(1)亲本材料准备：选择red ember和tiger eye为亲本，商品球秋植，保证肥水充足；
37.(2)人工授粉杂交：当母本red ember开花，雄蕊花药未成熟散粉时，剪掉母本全部雄蕊、旗瓣和垂瓣，只剩下三枚羽化柱头并用硫酸纸套袋隔离；当母本雌蕊成熟时授以父本tiger eye花粉，授粉后继续套袋隔离，第一次授粉结束后的2-3天再重复授粉一次，待第二次授粉结束后一周左右时间，当柱头呈失水萎蔫状态时可将硫酸纸取下；授粉时间为上午
9-10点，授粉日天气晴朗；
38.(3)幼胚剥取：距第一次杂交授粉40天后，剪下膨大的蒴果，用清水冲洗表面后，在蒴果表面喷上75％酒精，然后放置在超净工作台中用紫外线灭菌30min；待紫外灭菌结束后在超净工作台无菌条件下剥开蒴果，取出膨大的种子，用解剖针划破种皮，挤出幼胚；
39.(4)幼胚离体培养：在无菌条件下，将步骤(3)得到的幼胚接种到ms培养基上进行培养，组培室培养条件为：温度22-24℃、光周期14h光照/10h黑暗、光照强度4000-6000lux，培养直至幼苗生根；
40.(5)幼苗移栽：当幼苗生长到根长》3cm，高度》4cm时从培养基中取出，洗净根部后移栽到育苗盘中，移栽培养基质为灭菌蛭石，浇透水后盖上穴盘盖以保湿，置于人工气候箱中培养，培养条件为：光照时间16h/d，光照期间温度23℃
±
1℃，黑暗期间温度18℃
±
1℃，光照强度20000-25000lux。7天后揭开穴盘盖，待幼苗根系长出穴盘底部后，连同培养的蛭石基质一起移栽在大盆里。盆里基质为草炭：营养土：蛭石＝1：1：1(v：v：v)。移栽换盆后的幼苗前期继续放于人工气候箱中培养，11月20日移至室外，正常浇水管理；
41.(6)种球收获：待第二年荷兰鸢尾幼苗地上部枯萎叶片达90-95％时收获种球。
42.经计算red ember
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tiger eye胚培养杂交后代幼苗长至高度》4cm需要50天左右时间，其移栽后在翌年结的种球如附图3(左)，周径约为4.2cm。
43.实施例2：
44.与实施例1步骤相似，不同在于：步骤(2)和(3)，具体操作如下：
45.(2)人工授粉杂交：以tiger eye作为母本，red ember作父本，杂交过程与实施例1相同；
46.(3)幼胚剥取：距第一次杂交授粉45天后，剪下膨大的蒴果，其余操作与实施例1相同。
47.经计算tiger eye
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red ember胚培养杂交后代幼苗长至高度》4cm需要55天左右时间，其移栽后在翌年结的种球周径约为5.4cm。对比例1：
48.步骤(1)、(2)、(6)与实施例1相同，其余操作步骤如下：
49.(3)收种：当杂交结实产生的蒴果变成黄色成熟后采收回实验室，放于尼龙网袋中并挂于通风处干燥，干燥后小心拨开果荚取出种子，挑选饱满的种子装在细密的尼龙袋中并挂于干燥处备用；
50.(4)播种：利用千分之一的多菌灵水溶液浸泡荷兰鸢尾杂交种子30min,然后用清水冲洗掉种子表面的多菌灵粉剂，冲洗2-3次。然后放在湿润的滤纸上于室温培养2天左右时间。吸饱水的荷兰鸢尾种子播种在塑料盆中，塑料盆底部需垫一层塑料编织袋而后放入厚度约为5cm的黄沙，最后将荷兰鸢尾杂交种子分散平铺在黄沙上再覆盖黄沙2cm左右。播种好的荷兰鸢尾种子浇透水然后放入光照时间16h/d，光照期间温度23℃
±
1℃，黑暗期间温度18℃
±
1℃，光照强度20000-25000lux的人工气候箱中培养，直至出苗。
51.(5)幼苗移栽：待幼苗高度》4cm时，可将幼苗小心取出移栽到草炭：营养土：蛭石＝1：1：1(v：v：v)的混合基质中，前期继续放于人工气候箱中培养。11月20日移至室外，正常浇水管理。
52.经计算该对比例red ember
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tiger eye收种后普通播种的杂交后代幼苗长至高度》4cm需要70天左右时间，其移栽后在翌年结的种球如附图3(右)，周径约为2.8cm。
53.对比例2：
54.步骤(1)、(2)与实施例2相同，步骤(3)-(6)与对比例1相同。
55.经计算该对比例tiger eye
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red ember收种后普通播种的杂交后代幼苗长至高度》4cm需要73天左右时间，其移栽后在翌年结的种球周径约为3.0cm。
56.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种快速获得荷兰鸢尾后代幼苗及优异种球的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)亲本材料准备：选择已明确获得种子的杂交组合亲本品种，商品球秋植，以保证肥水充足；(2)人工授粉杂交：当母本开花，雄蕊花药未成熟散粉时，剪掉母本全部雄蕊、旗瓣和垂瓣，只剩下三枚羽化柱头并用硫酸纸套袋隔离，当母本雌蕊成熟时授以父本花粉，授粉后继续套袋隔离。为提高授粉成功率，在第一次授粉结束后2-3天可进行二次授粉；(3)幼胚剥取：经步骤(2)杂交授粉后，待蒴果膨大后剪下，用清水冲洗表面并在蒴果表面喷上75％酒精；然后用紫外线灭菌30min；待紫外灭菌结束后在超净工作台无菌条件下剥开蒴果，取出膨大的种子，用解剖针划破种皮，挤出幼胚；(4)幼胚离体培养：在无菌条件下，将步骤(3)得到的幼胚接种到ms培养基上进行培养，组培室培养条件为：温度22-24℃、光周期14h光照/10h黑暗、光照强度4000-6000lux，培养直至幼苗生根；(5)幼苗移栽：将步骤(4)中生根良好，叶片长至组培瓶中上部的幼苗从培养基中取出，洗净根部后移栽到育苗盘中，浇透水后盖上穴盘盖以保湿，置于人工气候箱中培养，待幼苗成活后再移栽换盆；(6)种球收获：待翌年荷兰鸢尾地上部叶片枯萎时即收获种球。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述幼胚取自第一次杂交授粉后生长40-45天的蒴果。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的组培瓶中的待移栽幼苗根长>3cm，高度>4cm。4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的组培苗移栽培养基质为灭菌蛭石，人工气候箱培养条件如下：光照时间16h/d，光照期间温度23℃
±
1℃，黑暗期间温度18℃
±
1℃，光照强度20000-25000lux。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的待幼苗成活后再移栽换盆，具体操作如下：待幼苗根系长出穴盘底部后，连同培养的蛭石基质一起移栽到大盆里；其中，盆里的基质为体积比为1：1：1的草炭、营养土与蛭石的混合基质。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述的荷兰鸢尾地上部叶片枯萎即为枯萎变黄叶片占总叶片量的90-95％时收获种球。

技术总结
本发明公开了一种快速获得荷兰鸢尾后代幼苗及优异种球的方法，属于生物技术育种领域。采用人工辅助授粉进行杂交并套袋隔离；剥取授粉后40-45天的幼胚；剥取的幼胚放于MS培养基上培养成幼苗；组培幼苗移栽及移栽成活后换盆；翌年幼苗叶片枯萎达90-95％时收获种球。本发明利用胚培养手段不仅可以大大降低不确定环境因素导致荷兰鸢尾种子不能获得的风险，而且相比于普通播种技术，该方法显著缩短了荷兰鸢尾从种子到可移栽幼苗的生长时间，同时收获到的后代种球周径更大。因此该方法大大缩短了荷兰鸢尾育种时间，加速了新品种的选育进程，对推动我国荷兰鸢尾产业发展具有重要的意义。义。义。


技术研发人员：张婷 原海燕 张永侠 王银杰 杨永恒
受保护的技术使用者：江苏省中国科学院植物研究所
技术研发日：2023.08.14
技术公布日：2023/9/23