一种RNA保存液及其用途的制作方法

一种rna保存液及其用途
技术领域
1.本发明属于医学生物检测领域，具体涉及一种rna保存液及其用途。


背景技术：

2.核糖核苷酸（ rna) ，普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内，是遗传信息的载体。尽管高质量的 rna 可通过立即从新鲜外周血或其他组织样本中抽提得到，但在实际检查中，外周血样本多不具备立即抽提的条件。因此，如何保存样本从而获得高质量的 rna 至关重要。目前常用的rna 抽提前血样保存的方法主要有低温冻存、pax-gene全血rna管保存、样本中添加rna保存液。
3.低温冻存是目前较为普遍的一种血样处理方法 ，使 用 乙 二 胺 四 乙 酸（ethylenediamine tetraacetic acid，edta）抗凝管采集并储存外周血，过程简便、无须额外处理且可避免外源性因素的影响，但外周血中rna 容易受内源性因素，如大量存在的核糖核酸酶（ribonuclease，rnase）的影响，在收集和储存过程中rna易发生降解。
4.使用 paxgene全血rna管保存能够显著提高从血样中分离出的rna 质量，但paxgene全血rna管过于昂贵，样本的收集成本过高。
5.样本采集后如果无法立即进行提取，可以保存在rna保存液中，rna保存液中主要成分是蛋白变性剂，通过抑制rnase的活性防止rna降解。但现有的保存液效果不稳定，当样本需要运输，反复冻融，保存时间较长，温度的变化可能会影响样本中rna的检测。


技术实现要素：

6.为了克服上述缺陷，提供一种低成本，并能在不同保存时长、不同温度变化时保持样本中rna稳定的rna保存液，具体的，本发明第一方面，提供一种rna保存液，所述保存液包括蛋白变性剂、螯合剂、还原剂和ph缓冲液，所述保存液的ph为3.5-5.0，所述蛋白变性剂用于抑制ｒna 酶活性，所述蛋白变性剂包括异硫氰酸胍和氯化锂（licl）。
7.优选的，所述ph为3.8-5.0，可以是上述范围的任一值，例如4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8。
8.优选的，所述异硫氰酸胍：licl的摩尔质量比为1：（1-2），具体比例可以是1:1.5。
9.更进一步优选的，所述蛋白变性剂还包括氧钒核糖核苷复合物。
10.优选的，所述蛋白变性剂的终浓度为1-10m。可以是上述范围的任一值，或者任一范围，例如1.0、1.5、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.2、5.5、5.8、6.0、6.3、6.6、6.8、7.0、7.2、7.5、7.8、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0m。
11.更优选的，所述蛋白变性剂包括1.5-3.0m的异硫氰酸胍和1.5-6.0m的licl。进一步优选的，所述蛋白变性剂包括1.5-3.0m的异硫氰酸胍、1.5-6.0m的licl和5-20mm的氧钒核糖核苷复合物。
12.在一个具体的实施方式中，所述蛋白变性剂包括2m的异硫氰酸胍和3m的licl。
13.在一个具体的实施方式中，所述蛋白变性剂包括2m的异硫氰酸胍、3m的licl和10mm的氧钒核糖核苷复合物。
14.优选的，所述螯合剂包括edta、乙二胺四乙酸二钾和/或乙二胺四乙酸三钾。更优选的，所述螯合剂包括edta。
15.优选的，所述螯合剂的终浓度为0.3-2.0mm，可以是上述范围的任一值，或者任一范围，例如0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0mm。
16.更优选的，所述螯合剂包括终浓度为0.7-1.5mm的edta，进一步优选的，所述螯合剂包括终浓度为1.0mm的edta。
17.优选的，所述还原剂包括三（2－羧乙基）膦、β－巯基乙醇和二硫苏糖醇中的一种或多种。
18.更优选的，所述还原剂包括β－巯基乙醇。
19.优选的，所述还原剂的终浓度为质量百分比0.5%-3%，更优选的，可以是上述范围的任一值，或者任一范围，例如0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0、2.5、3.0%。
20.进一步优选的，所述还原剂包括0.5%-2%的β－巯基乙醇，优选为0.8%-1.5%。
21.在一个具体的实施方式中，所述还原剂包括1%的β－巯基乙醇。
22.优选的，所述rna保存液还包括表面活性剂。
23.更优选的，所述表面活性剂包括阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂或两性表面活性剂中的一种或多种，例如tween20、sds、triton x-100、十二烷基硫酸锂等等。
24.优选的，所述表面活性剂的终浓度为质量百分比0.2%-5.0%，更优选的，可以是上述范围的任一值，或者任一范围，例如0.2、0.3、0.4、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0%。
25.优选的，所述rna保存液还包括盐离子，例如硫酸铵、焦磷酸钠等等。
26.更优选的，所述盐离子的终浓度为5-30mm，例如，2.5-15mm硫酸铵和2.5-15mm的焦磷酸钠。可以是上述范围的任一值，或者任一范围，例如2.5、3.0、3.5、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.2、5.5、5.8、6.0、6.3、6.6、6.8、7.0、7.2、7.5、7.8、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0mm。
27.优选的，所述rna保存液还包括甘氨酸，所述甘氨酸终浓度为30-70mm，可以是上述范围的任一值，或者任一范围，例如30、35、40、45、50、55、60、65、70mm。
28.优选的，所述rna保存液的ph缓冲液包括浓盐酸、tris缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液和hepes等，维持保存液的ph为3.5-5.0。
29.在一个具体的实施方式中，所述rna保存液包括2m异硫氰酸胍，3m licl，1mm edta，10mm 硫酸铵，1%tween20，10mm 焦磷酸钠，1% β－巯基乙醇，50mm 甘氨酸，缓冲液为浓盐酸，ph为4.8。或者，所述rna保存液包括2m异硫氰酸胍，3m licl，1mm edta，10mm 氧钒核糖核苷复合物，10mm 硫酸铵，1%tween20，10mm 焦磷酸钠，1% β－巯基乙醇，50mm 甘氨酸，缓冲液为浓盐酸，ph为4.8。
30.上述百分浓度为质量百分比。
31.本发明第二方面，提供一种上述rna保存液的制备方法，所述制备方法包括将rna保存液的各种组分混合配置，其中用ph缓冲液调节ph，过滤获得rna保存液。
32.rna保存液的各种组分如上所定义。
33.本发明第三方面，提供一种包含rna的样本的保存方法，所述保存方法包括利用上述任一的rna保存液对样本进行保存。
34.优选的，所述样本来源于任一的样本，包括但不仅限于组织、细胞、体液、空气、土壤和/或物体表面等等。更优选的，所述体液来自唾液、血液、血清、组织液、尿液、精液、羊水、脊髓液、结膜液、阴道液、粪便或汗液等等。
35.进一步优选的，所述样本来自咽拭子采集样本、痰液样本、肺泡灌洗液样本、外周血样本、血浆样本、血清样本、淋巴结样本、胃肠组织样本、粪便样本或尿液样本等等。
36.优选的，所述的保存方法并不属于疾病的诊断和/或治疗方法。
37.本发明的有益效果：1、采用本发明的rna保存液可适用于不同的保存温度，例如4℃，室温，37℃，可以避免反复冻融导致的rna损伤，有利于温度条件变化时的储存以及长途转运。
38.2、采用本发明的rna保存液能稳定的保证样本中的rna总量，保存时间长，至少可以达到7天，即便是在37℃下，保存7天后，扩增ct值依然与4℃即时检测的ct值相同。本保存液具有良好的稳定性。
附图说明
39.图1所示为使用全血rna对pbgd进行浓度梯度的扩增曲线。
40.图2所示为qiagen病毒试剂盒纯化后rt-qpcr的扩增曲线。
41.图3所示为三个温度（1 是4℃, 2是室温，3是37℃）保存24h后a液和b液的rt-qpcr扩增曲线。
42.图4所示为三个温度（1 是4℃, 2是室温，3 是37℃）保存3天后a液和b液的rt-qpcr扩增曲线。
43.图5所示为三个温度（1 是4℃, 2是室温， 3是37℃）保存7天后a液和b液的rt-qpcr扩增曲线。
具体实施方式
44.下面结合具体实施例对本发明所述技术方案做进一步的说明。可以理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，其并不作为对本发明的限制。若非特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。在不偏离于本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。本领域的技术人员将会意识到或能够确认，仅仅使用常规实验，许多等同物都能应用于本文所描述的特定步骤中。这些等同物被认为处在本发明的范围之内，并且被权利要求所覆盖。
45.实施例中所涉及的仪器、试剂与耗材如下：1．实验仪器：abi 7500荧光定量pcr仪2．实验试剂与耗材：表1：实验试剂与耗材
46.表2：rna保存液b液
47.配制后用浓盐酸调ph值至4.8，然后用0.22 μm滤膜进行过滤。
实施例1 rna保存液在不同温度下的保存效果
48.使用takara rnaiso blood提取全血rna，进行下列实验：
49.实验1：rna浓度梯度确定
50.1-1：检测步骤将全血rna分三个10ng，1ng和0.1ng浓度梯度做rt-qpcr，选择人内参基因，按表3配制反应扩增体系，设计合成引物序列，引物见表4，反应条件见表5。
51.表3：扩增体系
52.表4：引物探针序列
53.表5：rt-qpcr反应条件
54.1-2 检测结果因ct值小于35即可判断为阳性，因此，观察哪个浓度的ct值更接近30，结果表明：总量在10ng时，ct值在28左右，1ng的全血rna的ct值在30左右，0.1ng的全血rna的ct值在32左右；可见0.1ng-10ng之间的ct值在28-32之间，上述终浓度范围检测是可行的（参见图1，其中曲线从左至右分别为10ng、1ng、0.1ng（其中0.1ng重复两个批次），而nort-10ng组处于水平状态）。
55.实验2：rna保存液保存即时检测
56.2-1 检测步骤：将60ng的全血rna分别混到140 μl a液（a组）, b液（b组）和10mm tris（ph8.0）（c组）中。pos-ctr作为阳性对照（pos-ctr）。用qiagen viral rna mini kit按照说明提取rna，最后溶于50 μl depc水中，取5 μl（rna大约1ng）做rt-qpcr，具体操作步骤同实验1的步骤。
57.2-2检测结果：结果见图2，结果显示，经保存液（a，b，c）处理后即时进行检测，ct值在30左右，三种保存液对于rna的提取效率影响相同，ct值较阳性对照（pos-ctr）稍有延后，但整体在可接受范围内（参见图2，其中曲线从左至右分别为保存液pos-ctr，a，b，c处理组，重复两个批次）。
58.实验3：rna保存液保存不同温度和时长后检测
59.3-1 检测步骤：将a液（a组）和b液（b组）各分为三份，每份体积约640 μl，混入320 ng的全血rna（rna浓度约为0.5 ng/μl）, 三份溶液分别保存于4℃，室温和37℃；同时做一个保存于10mm trishcl（ph8.0）（p组）并冻于-80℃的阳性对照；在1天，3天，7天和一个月的时候从每管的液体中取出140 μl 用qiagen viral rna mini kit按照说明提取rna，最后每管均溶于50 μl depc水中；rt-qpcr时取5 μl作为模板，做两个重复；使用pbgd靶标，探针为fam标记，操作条件同实验1。
60.3-2 检测结果：三种温度条件（1是4℃，2是室温，3是37℃，分别用a液和b液保存）下24h保存后的rt-qpcr结果显示，在4℃保存的a液（a1）的ct值以后出现延后，在34左右，而b液（b1)和阳性对照（p）的ct值基本相同，都在30左右（参见图3左上图，从左至右的三组曲线（两条为一组）分别为b1、p和a1）；室温和37℃条件下，24h后a液（室温和37℃不同温度分别标记为a2和a3）的扩增曲线已经没有起峰，而b液（不同温度分别标记为b2和b3）和阳性对照的ct值基本相同，在30左右（分别参见图3右上图，从左至右的两组曲线（两条为一组）分别为b2、p；图3左下图，从左至右的两组曲线（两条为一组）分别为b3、p））；阴性对照（ntc）没有起峰（参见图3右下图）；以上结果说明在不同温度下，本发明的保存液可以稳定地保存rna。
61.三天后，在4℃保存的a液还略有起峰，但ct值比较靠后（38左右）；室温和37℃没有扩增（图4中右上角和左下角图中的水平线）；而b液和阳性对照在三个温度条件下的扩增ct值依然相同，在30左右（见图4，标识同图3）；七天后，a液在三个温度条件下保存的rna提取后都没有扩增（图5的左上图、右上图和左下图中的水平线），b液和阳性对照在三个温度条件下的扩增ct值依然相同，在30左右（见图5，标识同图3）。
62.以上结果说明，即便是在室温和37℃保存一周，利用本发明的保存液（b液）rna保存效果要明显好于a液，可以防止rna降解，稳定地扩增出rna，并保持较高的ct值，可以与阳性对照相同。
63.将b液中去除氧钒核糖核苷复合物后得到的保存液也可以获得和实验3中的b液基本相同的结果。
64.以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
65.另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
66.此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

技术特征：
1.一种rna保存液，其特征在于，所述rna保存液包括蛋白变性剂、螯合剂、还原剂和ph缓冲液，所述保存液的ph为3.5-5.0，所述蛋白变性剂用于抑制ｒna 酶活性，所述蛋白变性剂包括异硫氰酸胍和氯化锂（licl）。2.根据权利要求1所述的rna保存液，其特征在于，所述异硫氰酸胍：licl的摩尔质量比为1：（1-2）。3.根据权利要求1-2任一所述的rna保存液，其特征在于，所述蛋白变性剂的终浓度为1-10m。4.根据权利要求1所述的rna保存液，其特征在于，所述螯合剂包括edta、乙二胺四乙酸二钾和/或乙二胺四乙酸三钾，所述螯合剂的终浓度为0.3-2.0mm。5.根据权利要求1所述的rna保存液，其特征在于，所述还原剂包括三（2－羧乙基）膦、β－巯基乙醇和二硫苏糖醇中的一种或多种，所述还原剂的终浓度为质量百分比0.5%-3%。6.根据权利要求1所述的rna保存液，其特征在于，所述rna保存液还包括表面活性剂，所述表面活性剂的终浓度为质量百分比0.2%-5.0%。7.根据权利要求1所述的rna保存液，其特征在于，所述rna保存液还包括盐离子，所述盐离子的终浓度为5-30mm。8.权利要求1-7任一所述的rna保存液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将rna保存液的各种组分混合配置，用ph缓冲液调节ph，过滤获得rna保存液。9.一种包含rna的样本的保存方法，其特征在于，所述保存方法包括利用权利要求1-7任一所述的rna保存液对样本进行保存。10.根据权利要求9所述的保存方法，其特征在于，所述样本来源于包括组织、细胞、体液、空气、土壤和/或物体表面。

技术总结
本发明涉及一种RNA保存液及其应用，所述RNA保存液包括蛋白变性剂、螯合剂、还原剂和pH缓冲液，所述保存液的pH为3.5-5.0，所述蛋白变性剂用于抑制ＲNA酶活性，所述蛋白变性剂包括异硫氰酸胍和氯化锂（LiCl）。相对于已知的RNA保存液，本发明的保存液在不同温度，保存较长时间之后均可以稳定地稳定地扩增出RNA，并保持较高的Ct值。持较高的Ct值。持较高的Ct值。


技术研发人员：杨宇 宋悦谦 赵婷婷 刘莉 郭铮蕾
受保护的技术使用者：中国海关科学技术研究中心
技术研发日：2023.08.17
技术公布日：2023/9/23