结肠癌特异性环状RNA标记物及其检测引物与应用

结肠癌特异性环状rna标记物及其检测引物与应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及结肠癌特异性环状rna标记物及其检测引物与应用。


背景技术：

2.结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年大约新增一百万的结肠癌患者有五十万左右的结肠癌患者死亡。随着分子生物学技术的不断进步，结肠癌检测分子标记物均有一定的进展，但临床上尚缺乏在核酸水平的快速有效和精准的分子标记物，因此应该拓宽该领域的研究，积极寻找一种新型标记物。筛选有效预测结肠癌的分子标记物，可作为普查筛选手段，或可提供结肠癌的早期诊断线索。
3.环状rna（circrna）与传统的线性rna（linear rna，含5'和3'末端）不同，circrna分子呈封闭环状结构，不受rna外切酶影响，表达更稳定，不易降解。在功能上，近年的研究表明，circrna分子富含microrna（mirna）结合位点，在细胞中起到mirna海绵（mirna sponge）的作用，进而消除mirna对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平，这一作用机制被称为竞争性内源rna（competing endogenous rnas，cerna）机制。通过与疾病关联的mirna相互作用，circrna在疾病中发挥着重要的调控作用。circrna在结肠癌的发生及发展中的作用及其机制已经成为研究新热点。功能性circrna能够直接或间接调控癌基因或抑癌基因的表达，提示其可作为肿瘤诊断的标记物有非常广阔的前景。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种用于结肠癌诊断、筛查或预后评估的结肠癌特异性环状rna标记物及其检测方法与应用。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
5.为了实现上述目的，本发明首先提供了分子标记物的下述任一种应用：a1）在制备用于结肠癌诊断或辅助诊断的产品中的应用；a2）在制备用于结肠癌筛查或辅助筛查的产品中的应用；a3）在制备用于结肠癌预后评估的产品中的应用；a4）作为靶点在制备用于抑制结肠癌细胞迁移或转移的药物中的应用；a5）作为靶点在制备治疗或预防结肠癌的药物中的应用；所述分子标记物为circrna，所述circrna的核苷酸序列可如seq id no.1所示。
6.所述分子标记物名称可为has-circ_0000419，其为环状rna（circrna）。所述has-circ_0000419在结肠癌患者中的表达水平显著低于在健康人中的表达水平。has-circ_0000419低表达患者的生存时间短，与较差的结肠癌预后显著相关。
7.所述has-circ_0000419可以作为分子标记物用于结肠癌的诊断、辅助诊断、筛查、辅助筛查或预后评估等分子诊断领域。
8.本发明还提供了检测所述分子标记物的物质的下述任一种应用：
b1）在制备用于结肠癌诊断或辅助诊断的产品中的应用；b2）在制备用于结肠癌筛查或辅助筛查的产品中的应用；b3）在制备用于结肠癌预后评估的产品中的应用。
9.上述应用中，所述物质可包括特异性扩增所述分子标记物的引物、特异性识别所述分子标记物的探针和/或特异性结合所述分子标记物的结合剂。
10.上述应用中，所述引物可为引物对，所述引物对可由上游引物和下游引物组成，所述上游引物可为核苷酸序列是seq id no.2的单链dna，所述下游引物可为核苷酸序列是seq id no.3的单链dna。
11.所述上游引物名称可为has-circ_0000419-forward，所述下游引物名称可为has-circ_0000419-reserve。所述has-circ_0000419-forward（seq id no.2）和has-circ_0000419-reserve（seq id no.3）为根据has-circ_0000419的序列结构特征（seq id no.1），在has-circ_0000419反向拼接区域设计的特异性引物，用于检测has-circ_0000419。
12.所述分子标记物或所述引物对也在本发明的保护范围内。
13.本发明还提供了所述引物对在制备检测所述分子标记物的产品中的应用。
14.本发明还提供了试剂盒，所述试剂盒可包括本文中任一所述检测所述分子标记物的物质，所述试剂盒可用于检测所述分子标记物或用于结肠癌的诊断、辅助诊断、筛查、辅助筛查或预后评估。
15.进一步地，所述试剂盒的检测样本可为血液样本（如全血、血浆、血清）、组织样本等但不限于此。
16.进一步地，所述试剂盒还可包括pcr扩增所需要的taq dna聚合酶、dntp、pcr缓冲液、mg
2+
中的一种或多种。
17.进一步地，所述试剂盒还可包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂用于提取来自受试者的生物样品（待测样本）中的核酸。
18.进一步地，所述试剂盒还可包括内参基因检测试剂，所述内参基因可为gapdh基因和/或β-actin基因但不限于此。
19.所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。
20.本发明还提供了检测所述分子标记物的方法，所述方法可包括利用所述引物对或所述试剂盒对待测样品进行检测。
21.进一步地，所述检测所述分子标记物的方法可包括如下步骤：c1）提取待测样本rna；c2）将所述rna反转录为cdna；c3）以所述cdna为模板，以has-circ_0000419-forward（seq id no.2）和has-circ_0000419-reserve（seq id no.3）为引物进行pcr反应。
22.进一步地，所述pcr反应可为rt-pcr反应或数字微滴pcr反应。
23.本发明还提供了过表达本文中所述circrna（has-circ_0000419）的试剂或药物的下述任一种应用：d1）在制备用于抑制结肠癌细胞迁移或转移的药物中的应用；
d2）在制备治疗或预防结肠癌的药物中的应用。
24.本文中，所述产品包括但不限于试剂、试剂盒、芯片、试纸、检测卡、高通量测序平台或生物传感器。
25.本文所述产品可包括本文中任一所述检测所述分子标记物的物质。
26.上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。
27.本发明所提供的检测所述分子标记物（has-circ_0000419）的方法既可为非疾病诊断治疗方法，也可为疾病诊断治疗方法。其中，所述非疾病诊断治疗方法可如在人群中进行结肠癌的筛查时检测has-circ_0000419的表达水平，或进行结肠癌的易感性检测。
28.另外，本技术的检测所述分子标记物（has-circ_0000419）的方法还可以有许多其他用途，例如细胞水平检测所示分子标记物（has-circ_0000419）的表达量。
29.本发明人经过广泛而深入的研究，通过tcga数据库结合二代测序筛选到与结肠癌进展相关的新型circrna（has-circ_0000419），进一步针对has-circ_0000419这一新型分子标记物的反向拼接序列特点设计特异性引物，建立了has-circ_0000419的rt-pcr检测方法以及数字微滴pcr检测方法。本发明设计的引物和建立的检测方法具有良好的扩增效率和特异性。对34例中国结肠癌患者癌灶组织中表达量的检测，结果显示，has-circ_0000419在34例中国结肠癌患者癌灶组织中低表达，提示具有抑制结肠癌进展作用，且has-circ_0000419低表达与患者不良预后相关，能够更加精准的对结肠癌患者的生存预后进行评估。通过对过表达has-circ_0000419的lovo细胞的细胞迁移实验和肿瘤转移模型实验，结果表明过表达has-circ_0000419的试剂或药物能够抑制结肠癌细胞迁移转移。
30.综上，has-circ_0000419作为全新的circrna分子标记物在结肠癌的诊断、辅助诊断、筛查、辅助筛查或预后评估等方面具有良好的、潜在的临床应用价值，并且可作为靶点用于抑制结肠癌细胞迁移转移，在结肠癌研究和药物开发中具有广泛的应用价值。
附图说明
31.图1为二代测序has-circ_0000419表达量散点图。
32.图2为has-circ_0000419高表达患者的生存曲线。
33.图3为结肠癌患者has-circ_0000419表达与临床病理学指标的关系。
34.图4为实施例2中的细胞迁移实验结果。
35.图5为实施例2中肿瘤转移模型实验的体外活体成像结果。
36.图6为has-circ_0000419的exon6和exon7反向拼接区域特征序列为aagc的示意图。
37.图7为实施例3中的反转录反应体系。
38.图8为实施例3中的rt-pcr反应体系。
39.图9为lovo、sw480、sw620三个细胞系对照组及过表达has-circ_0000419组分别检测has-circ_0000419表达量的结果。
40.图10为has-circ_0000419扩增曲线。
41.图11为has-circ_0000419溶解曲线。
42.图12为实施例4中的数字微滴pcr反应体系。
43.图13为实施例5中has-circ_0000419相对表达量的检测结果。
具体实施方式
44.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
45.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
46.下述实施例中的34例结肠癌患者来源于北京大学人民医院。
47.下述实施例中的lovo、sw480和sw620细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，货号分别为tchu82，tchu172，tchu101。
48.实施例1、结肠癌特异性环状rna标记物的筛选与鉴定对34例结肠癌患者的结肠肿瘤癌灶及癌旁健康组织进行二代测序，并进一步对差异表达circrna进行筛选，筛选标准：p value《0.05，|logfc|》1。分析软件包为：circtest，共340对差异circrna，其中circrna has-circ_0000419在结肠癌患者癌灶中显著低表达（图1，p=0.001），提示其抑癌效果。进一步绘制了has-circ_0000419表达对结肠癌患者预后影响的生存曲线，has-circ_0000419低表达患者的生存时间短（图2，p=0.002），提示has-circ_0000419可作为结肠癌预后的重要指标。且has-circ_0000419低表达患者更易发生远端转移及tnm的不良分期（图3）。
49.备注：fc为fold change，即circrna在结肠癌癌灶表达量平均值与癌旁健康组织表达量平均值的除数。
50.筛选获得的结肠癌特异性环状rna标记物名称为has-circ_0000419，其染色体位置为chr12:70193988-70195501。成熟的has-circ_0000419的核苷酸长度为242 bp，序列如seq id no.1所示。
51.gcugacuuauccuuguauaaugaauuccgauuguggaaggaugagcccacaauggacaggacguguccuuucuuagacaaaaucuaccaggaagauaucuuuccauguuuaacauucucaaaaagugaguuggcuucagcuguucuggaggcuguggaaaacaauacucuaagcauugaaccagugggauuacaaccuauccgguuugugaaagcuucugcaguugaaugcggaggaccaaa（seq id no.1）。
52.所述环状rna has-circ_0000419是由seq id no.1所示核苷酸序列的起始核苷酸（seq id no.1的第1位）和末端核苷酸（seq id no.1的第242位）相连形成，呈封闭环状结构。
53.实施例2、特异性环状rna标记物促进结肠癌细胞转移的功能实验1、细胞迁移实验构建过表达has-circ_0000419的腺病毒载体及空载对照腺病毒（腺病毒可表达绿色荧光蛋白），分别转染结肠癌细胞系lovo细胞，构建稳定过表达has-circ_0000419的细胞系及对照细胞系。应用transwell实验检测细胞迁移能力，对迁移细胞计数。结果如图4所
示，过表达has-circ_0000419细胞系，迁移能力减弱，说明过表达has-circ_0000419的试剂或药物能够抑制结肠癌细胞迁移转移。
54.2、肿瘤转移模型（尾静脉注射法）实验原理：肿瘤细胞具备转移能力。将上述过表达has-circ_0000419细胞系及对照细胞系注射入裸鼠的血液系统（尾静脉注射），能够模拟肿瘤细胞脱离原发灶进入血液循环的情况，通过观察远端器官（肺、肝）转移灶形成，判断肿瘤细胞转移能力。
55.对两组小鼠进行体外活体成像（检测过表达细胞荧光情况），结果如图5所示，过表达has-circ_0000419细胞系不易在小鼠体内转移成瘤，表明过表达has-circ_0000419的试剂或药物能够抑制结肠癌细胞转移能力。
56.实施例3、结肠癌特异性环状rna标记物检测方法的建立本实施例以34个结肠癌患者手术切除的癌灶组织及癌旁健康组织为待测样本，建立has-circ_0000419的rt-pcr检测方法，具体步骤如下：1、引物设计采用rt-pcr方法检测待测样本中的has-circ_0000419的表达量，根据has-circ_0000419的序列结构特征（seq id no.1）设计特异性引物：has-circ_0000419的exon6和exon7反向拼接区域特征序列为aagc（图6）。在has-circ_0000419反向拼接区域设计特异性引物，进一步对pcr产物进行sanger测序验证，序列比对结果证实特异性引物的pcr产物为circrna has-circ_0000419。
57.用于检测has-circ_0000419的引物序列如下所示：上游引物has-circ_0000419-forward：5
’‑
gtgggattacaacctatccggt-3’（seq id no.2），下游引物has-circ_0000419-reserve：5
’‑
gacacgtcctgtccattgtg-3’（seq id no.3）。
58.2、rna提取采用trizol试剂（invitrogen）提取待测样本rna。
59.3、反转录使用反转录试剂盒primescript rt reagent kit（takara公司产品，货号：rr037a）对rna样品进行反转录，得到cdna。反转录反应体系如图7所示，反转录反应条件为：37℃ 15 min，85℃ 5 sec，4℃。
60.4、rt-pcr反应以反转录的cdna为模板，gapdh作为内参基因，以步骤1中的has-circ_0000419-forward（seq id no.2）和has-circ_0000419-reserve（seq idno.3）为引物进行rt-pcr反应，对circrna has-circ_0000419的表达量进行相对定量分析。rt-pcr试剂盒为sybr
®
green realtime pcr master mix（toyobo公司产品，货号：qpk-201）。
61.rt-pcr反应体系如图8所示，rt-pcr反应条件为：95℃ 3分钟；95℃ 10 秒，60℃ 60秒，40个循环。
62.5、扩增效率和特异性检测过表达has-circ_0000419细胞（lovo、sw480、sw620细胞）的构建：应用过表达has-circ_0000419的腺病毒载体及空载对照腺病毒（腺病毒可表达绿色荧光蛋白），分别转染结
肠癌细胞系lovo、sw480、sw620细胞，分别构建稳定过表达has-circ_0000419的lovo、sw480、sw620细胞细胞系及对照lovo、sw480、sw620细胞细胞系。
63.以lovo、sw480、sw620三个结肠癌细胞系作为对照组及过表达has-circ_0000419组分别检测has-circ_0000419相对表达量，结果如图9所示。has-circ_0000419的扩增曲线如图10所示，has-circ_0000419的溶解曲线如图11所示。结果表明，本发明设计的引物和建立的检测方法具有良好的扩增效率和特异性。
64.实施例4、结肠癌特异性环状rna标记物数字微滴pcr检测方法的建立本实施例以34个结肠癌患者手术切除的癌灶组织及癌旁健康组织为待测样本，建立has-circ_0000419的数字微滴pcr检测方法，具体步骤如下：1、引物设计同实施例3。
65.2、rna提取同实施例3。
66.3、反转录同实施例3。
67.4、数字微滴pcr反应以反转录的cdna为模板，gapdh作为内参基因，以步骤1中的has-circ_0000419-forward（seq id no.2）和has-circ_0000419-reserve（seq idno.3）为引物进行数字微滴pcr反应，对circrna has-circ_0000419的表达量进行相对定量分析。
68.数字微滴pcr使用bio—rad公司的qx100tm型微滴式数字pcr系统（包括微滴发生板、微滴发生器、pcr仪、微滴分析仪）检测。试剂盒为qx200
™ꢀ
ddpcr
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evagreen supermix（bio-rad，货号：1864033）。
69.数字微滴pcr反应体系如图12所示。
70.微滴生成体系：将微滴发生卡（bio-rad，货号：1864008）至于托架中，将上述20 ul的反应液加入中间一排的孔中，加样要小心，避免气泡；最下面一排每孔加入70 ul微滴生成油（bio-rad，货号：1863005），盖上硅胶垫（bio-rad，货号：1863009）；将此托架放入微滴发生器中，关盖生成微滴，约3 min左右。
71.数字微滴-pcr反应条件为：95℃ 3分钟；95℃ 30秒，60℃ 60秒，40个循环； 4℃ 5分钟；90℃ 5分钟；4℃ 10分钟。
72.5、结果判定微滴发生器将pcr反应混合液通过打散并制成约2
×
104个微滴后进行pcr反应，每个微滴内的pcr反应在相对独立的环境里独自反应。pcr反应结束后，使用微滴检测器对每个微滴逐个检测，含有目标分子的微滴有荧光信号为阳性微滴，不含目标分子的微滴没有荧光信号为阴性微滴。最终根据两种微滴的比例，通过泊松方程，分析软件可以计算出样品中目标dna分子的浓度（copies/μl），最终实现绝对定量。
73.检测癌灶组织及癌旁健康对照组织目的基因has-circ_0000419及内参基因gapdh，对总微滴式大于104的样本进行后续分析计算，计算公式=目的基因分子浓度/gapdh分子浓度。
74.实施例5、结肠癌特异性环状rna标记物的诊断性能
本实施例选取42例结肠癌患者的癌灶组织及癌旁健康对照组织（来源于北京大学人民医院）为待测样本，验证本发明结肠癌特异性环状rna标记物has-circ_0000419的诊断性能。
75.采用trizol试剂（invitrogen）提取待测样本rna，使用反转录试剂盒primescript rt reagent kit（takara公司产品，货号：rr037a）对rna样品进行反转录，得到cdna，将该cdna作为模板，利用实施例4中的微滴数字pcr检测方法进行检测，并对扩增产物进行测序，以确认本发明引物在实验研究和临床研究中的应用价值。
76.has-circ_0000419相对表达量的检测结果如图13所示。结果表明：在42例结肠癌临床组织样本（癌灶）中，患者癌灶中has-circ_0000419相对表达量的平均值为12.06，患者癌旁健康组织中has-circ_0000419相对表达量的平均值为15.09，结肠癌患者癌灶中has-circ_0000419的相对表达量显著低于癌旁健康组织。说明has-circ_0000419作为靶点在结肠癌的预测与诊断中具有较高的应用价值。
77.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

技术特征：
1.分子标记物的下述任一种应用：a1）在制备用于结肠癌诊断或辅助诊断的产品中的应用；a2）在制备用于结肠癌筛查或辅助筛查的产品中的应用；a3）在制备用于结肠癌预后评估的产品中的应用；a4）作为靶点在制备用于抑制结肠癌细胞迁移或转移的药物中的应用；a5）作为靶点在制备治疗或预防结肠癌的药物中的应用；所述分子标记物为circrna，所述circrna的核苷酸序列如seq id no.1所示。2.检测权利要求1中所述分子标记物的物质的下述任一种应用：b1）在制备用于结肠癌诊断或辅助诊断的产品中的应用；b2）在制备用于结肠癌筛查或辅助筛查的产品中的应用；b3）在制备用于结肠癌预后评估的产品中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述物质包括特异性扩增权利要求1中所述分子标记物的引物、特异性识别权利要求1中所述分子标记物的探针和/或特异性结合权利要求1中所述分子标记物的结合剂。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述引物为引物对，所述引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物为核苷酸序列是seq id no.2的单链dna，所述下游引物为核苷酸序列是seq id no.3的单链dna。5.权利要求1中所述的分子标记物或权利要求4中所述的引物对。6.权利要求4中所述的引物对在制备检测权利要求1中所述分子标记物的产品中的应用。7.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2-4中任一所述检测权利要求1中所述分子标记物的物质，所述试剂盒用于检测权利要求1中所述的分子标记物或用于结肠癌的诊断、辅助诊断、筛查、辅助筛查或预后评估。8.检测权利要求1中所述分子标记物的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求4中所述的引物对或权利要求7所述的试剂盒对待测样品进行检测。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：c1）提取待测样本rna；c2）将所述rna反转录为cdna；c3）以所述cdna为模板，用权利要求4中所述的引物对进行pcr反应。10.过表达权利要求1中所述circrna的试剂或药物的下述任一种应用：d1）在制备用于抑制结肠癌细胞迁移或转移的药物中的应用；d2）在制备治疗或预防结肠癌的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了结肠癌特异性环状RNA标记物及其检测引物与应用，属于生物技术领域。本发明所要解决的技术问题是提供一种用于结肠癌诊断、筛查或预后评估的标记物及其检测方法。为了解决该技术问题，本发明提供了分子标记物或检测所述分子标记物的物质在制备用于结肠癌诊断或辅助诊断的产品中的应用，所述分子标记物为circRNA，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明建立了所述circRNA的检测方法，该方法及其检测引物具有良好的扩增效率和特异性。本发明开发的分子标记物及其检测方法与引物在结肠癌的诊断、辅助诊断、筛查、辅助筛查或预后评估等方面具有良好的、潜在的临床应用价值。值。


技术研发人员：武娜 郁卫东 朱宝利 钟朝辉
受保护的技术使用者：北京大学人民医院
技术研发日：2023.08.17
技术公布日：2023/9/23