一株高产叶黄素的诱变小球藻及其制备方法与应用与流程

1.本技术属于小球藻技术领域，尤其涉及一株高产叶黄素的诱变小球藻及其制备方法与应用。


背景技术：

2.叶黄素（lutein）是一种是一种含氧类胡萝卜素，化学式为c
40h56
o2，含有两个酮环，是存在于人眼视网膜黄斑区的主要色素。叶黄素在视力保护、抗氧化、抗癌、延缓早起动脉硬化等方面有较好的活性，也常被用作食品着色剂，在食品工业有着广泛应用。
3.目前，市场上的叶黄素产品主要来源于万寿菊。万寿菊生产叶黄素的高等植物，然而存在产率低、季节性强且占用耕地等问题，使得叶黄素的售价极高。而生长快速的小球藻是叶黄素生产的良好来源。小球藻是绿藻的一种，且能利用葡萄糖异养生长，可以实现叶黄素的稳定连续工业化生产，是非常有潜力的生产来源。
4.但是目前小球藻工业化生产模式主要为光合自养培养，存在生长速度慢、细胞密度低、易被微型生物（细菌、有毒藻类和原生动物等）污染等问题。小球藻可以无光异养培养，但作为捕光色素叶黄素的含量极低，限制了异养发酵小球藻生产叶黄素的工业应用。


技术实现要素：

5.本技术的目的在于提供一株高产叶黄素的诱变小球藻及其制备方法与应用，旨在解决现有技术中异养培养条件下小球藻叶黄素低的问题。
6.为实现上述申请目的，本技术采用的技术方案如下：第一方面，本技术提供一株高产叶黄素的诱变小球藻，诱变小球藻为chlorellapyrenoidos( auxenochlorellapyrenoidosa)的诱变藻株zc-1003，保藏编号为gdmcc no .63502，保藏中心为广东省微生物菌种保藏中心（ 广州市先烈中路100号大院59号楼5楼），保藏日期为2023年5月30日。
7.进一步，在无光异养条件下，诱变小球藻的叶黄素含量为7.0~7.5 mg/g。
8.进一步，在无光异养条件下，诱变小球藻的叶黄素含量为7.1 mg/g。
9.进一步，诱变小球藻的比生长速率为1.3~1.4 d-1
。
10.进一步，在发酵罐发酵培养72小时的条件下，诱变小球藻的生物量为84~85 g/l；且叶黄素产率为7.1~7.2 mg/(l.h)。
11.进一步，每升发酵罐发酵培养的培养基含1.01 g kno3、9.3 mg edtana2、0.62 g nah2po4.h2o、0.089 g na2hpo4.2h2o、0.247 g mgso4.7h2o、14.7 mg cacl2.2h2o、6.95 mg feso4.7h2o、0.061 mg h3bo3、0.169 mg mnso4.h2o、0.287 mg znso4.7h2o、0.0025 mg cuso4.5h2o、0.01235 mg (nh4)6mo7o
24
.4h2o、40 g葡萄糖、5 g尿素；并调整ph为6.0~6.5。
12.进一步，发酵罐发酵培养的条件如下：初始接种量为2~2.5 g/l，在培养温度为27~28℃、初始转速200~220 转/分钟、通气量为0.5~0.7 vvm的条件下培养72小时后进行补料，培养至90~100小时。
13.第二方面，本技术提供一种高产叶黄素的诱变小球藻的制备方法，包括如下步骤：s1.提供野生型小球藻chlorella pyrenoidosa；s2.将野生型小球藻chlorella pyrenoidosa依次进行化学诱变处理和等离子体诱变处理，然后进行无光平板培养；s3.挑取白色、生长迅速的单藻进行纯化处理、传代培养后，进行筛选，得到高产叶黄素的诱变小球藻。
14.进一步，在s2中，化学诱变处理包括采用浓度为0.1~0.15 mol/l的甲基磺酸乙酯进行处理4~6小时。
15.进一步，在s2中，等离子体诱变处理包括在常温常压下采用等离子体进行处理60~80秒。
16.第三方面，本技术提供上述高产叶黄素的诱变小球藻在生产叶黄素的应用。
17.本技术第一方面提供的一株高产叶黄素的诱变小球藻，该诱变小球藻为chlorella pyrenoidos (auxenochlorella pyrenoidosa)的诱变藻株zc-1003，保藏编号为no .63502，保藏中心为广东省微生物菌种保藏中心；该诱变小球藻在无光异养条件下生物量密度高，生长速度快，且能够得到高含量的叶黄素，有利于异养发酵小球藻生产叶黄素在工业上进行广泛应用。
18.本技术第二方面提供的高产叶黄素的诱变小球藻的制备方法，该制备方法利用了化学诱变和等离子体诱变组合诱变方式，筛选得到了异养条件下叶黄素含量高且生长快速的诱变小球藻zc-1003，有利于广泛在工业上进行应用。
19.本技术第三方面提供的高产叶黄素的诱变小球藻或由上述高产叶黄素的诱变小球藻的制备方法制备得到的诱变小球藻在生产叶黄素中的应用，由于提供的小球藻诱变藻株zc-1003在无光异养的培养条件下生长速度快、叶黄素产量高，因此有利于广泛应用于藻类叶黄素的大面积生产。
附图说明
20.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1是本技术实施例提供的野生型小球藻和诱变小球藻100l发酵罐生物量分析图。
22.图2是本技术实施例提供的野生型小球藻和诱变小球藻叶黄素含量和产率分析图。
具体实施方式
23.为了使本技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
24.本技术中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例
如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b的情况。其中a，b可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
25.本技术中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项（个）或复数项（个）的任意组合。例如，
“ꢀ
a,b,或c中的至少一项（个）”，或，“a,b,和c中的至少一项（个）”，均可以表示：a, b, c, a-b（即a和b）, a-c, b-c, 或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
26.应理解，在本技术的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本技术实施例的实施过程构成任何限定。
27.在本技术实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本技术。在本技术实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
28.本技术实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本技术实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本技术实施例说明书公开的范围之内。具体地，本技术实施例说明书中的质量可以是
µ
g、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
29.术语“第一“、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本技术实施例范围的情况下，第一xx也可以被称为第二xx，类似地，第二xx也可以被称为第一xx 。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
30.本技术实施例第一方面提供一株高产叶黄素的诱变小球藻，诱变小球藻为chlorella pyrenoidos (auxenochlorella pyrenoidosa)的诱变藻株zc-1003，保藏编号为no .63502，保藏中心为广东省微生物菌种保藏中心。
31.本技术实施例第一方面提供的一株高产叶黄素的诱变小球藻，该诱变小球藻为chlorella pyrenoidos (auxenochlorella pyrenoidosa)的诱变藻株zc-1003，保藏编号为no .63502，保藏中心为广东省微生物菌种保藏中心；该诱变小球藻在无光异养条件下生物量密度高，生长速度快，且能够得到高含量的叶黄素，有利于异养发酵小球藻生产叶黄素在工业上进行广泛应用。
32.由于目前小球藻工业化生产模式主要为光合自养培养，若进行无光异养培养，一方面会影响小球藻的生长速度，另一方面会导致捕光色素叶黄素的含量很低，因此不利于采用无光异养培养方式发酵小球藻生产叶黄素。
33.本技术通过组合诱变的方法，筛选得到的保藏编号为no .63502的诱变小球藻zc-1003，其在无光异养条件下的生长速度可以接近野生型小球藻的生长速度，同时能够高产叶黄素，有利于工业化应用。
34.在一些实施例中，在无光异养条件下，诱变小球藻的叶黄素含量为7.0~7.5 mg/g；野生型小球藻的叶黄素含量3.8 mg/g；可以看出诱变小球藻的叶黄素含量为野生型小球藻叶黄素含量的1.8~1.9倍，叶黄素含量较高。
35.在一些具体实施例中，诱变小球藻的叶黄素含量包括但不限于7.0 mg/g、7.1 mg/
g、7.2 mg/g、7.3 mg/g、7.4 mg/g、7.5 mg/g。
36.在一实施例中，在无光异养条件下，诱变小球藻的叶黄素含量为7.1 mg/g。
37.在一些实施例中，诱变小球藻的比生长速率为1.3~1.4 d-1
。野生型小球藻的比生长速率为1.0 d-1
。可以看出，诱变小球藻的生长速率比野生型小球藻的生长速率快30%~40%。
38.在一些具体实施例中，小球藻诱变藻株zc-1003的比生长速率包括但不限于1.3 d-1
、1.32 d-1
、1.34 d-1
、1.36 d-1
、1.38 d-1
、1.4 d-1
。
39.在一些实施例中，在发酵罐发酵培养72小时的条件下，诱变小球藻的生物量为84~85 g/l；且叶黄素产率为7.1~7.2 mg/(l.h)。其中，野生型小球藻达到90 g/l以上，需要5天时间；并且，叶黄素产率为2.85 mg/(l.h)，可以看出，小球藻诱变藻株zc-1003的生长速度快，叶黄素产率高。
40.在一些具体实施例中，在发酵罐发酵培养72小时的条件下，诱变小球藻的生物量包括但不限于84 g/l、84.1 g/l、84.2 g/l、84.3 g/l、84.4 g/l、84.5 g/l、84.6 g/l、84.7 g/l、84.8 g/l、84.9 g/l、85 g/l。
41.在一些具体实施例中，在发酵罐发酵培养72小时的条件下，叶黄素产率包括但不限于7.1 mg/(l.h)、7.11 mg/(l.h)、7.12 mg/(l.h)、7.13 mg/(l.h)、7.14 mg/(l.h)、7.15 mg/(l.h)、7.16 mg/(l.h)、7.17 mg/(l.h)、7.18 mg/(l.h)、7.19 mg/(l.h)、7.2 mg/(l.h)。
42.在一些实施例中，每升发酵罐发酵培养的培养基含1.01 g kno3、9.3 mg edtana2、0.62 g nah2po4.h2o、0.089 g na2hpo4.2h2o、0.247 g mgso4.7h2o、14.7 mg cacl2.2h2o、6.95 mg feso4.7h2o、0.061 mg h3bo3、0.169 mg mnso4.h2o、0.287 mg znso4.7h2o、0.0025 mg cuso4.5h2o、0.01235 mg (nh4)6mo7o
24
.4h2o、40 g葡萄糖、5 g尿素；并调整ph为6.0~6.5。
43.在一些具体实施例中，培养基ph值为6.1。
44.在一些实施例中，发酵罐发酵培养的条件如下：初始接种量为2~2.5 g/l，在培养温度为27~28℃、初始转速200~220 转/分钟、通气量为0.5~0.7 vvm的条件下培养72小时后进行补料，培养至90~100小时。
45.在一些具体实施例中，发酵罐发酵培养的条件如下：初始接种量为2 g/l，在培养温度为27℃、初始转速200 转/分钟、通气量为0.5 vvm的条件下培养72小时后进行补料，培养至90小时。
46.在一些实施例中，补料包括补充葡萄糖，其中，葡萄糖指数补料按照以下公式进行补充：
47.其中v
f.s 为补料速度（ml/h）；μ为比生长速率 h-1；v0为发酵体积（l）；c0为初始细胞浓度（g/l）；t为发酵时间，fs为葡萄糖补料液中葡萄糖浓度（g/l）。
48.本技术实施例第二方面提供一种高产叶黄素的诱变小球藻的制备方法，包括如下步骤：s01. 提供野生型小球藻chlorella pyrenoidosa；s02. 将野生型小球藻chlorella pyrenoidosa依次进行化学诱变处理和等离子
体诱变处理，然后进行无光平板培养；s03. 挑取白色、生长迅速的单藻进行纯化处理、传代培养后，进行筛选，得到高产叶黄素的诱变小球藻。
49.本技术实施例第二方面提供的高产叶黄素的诱变小球藻的制备方法，该制备方法利用了化学诱变和等离子体诱变组合诱变方式，筛选得到了异养条件下叶黄素含量高且生长快速的诱变小球藻zc-1003，有利于广泛在工业上进行应用。
50.步骤s01中，提供的野生型小球藻chlorella pyrenoidosa的浓度为1.0
×
107~1.2
×
107个/ml。
51.步骤s02中，将野生型小球藻chlorella pyrenoidosa依次进行化学诱变处理和等离子体诱变处理，然后进行无光平板培养。
52.在一些实施例中，化学诱变处理包括采用浓度为0.1~0.15 mol/l的甲基磺酸乙酯进行处理4~6小时。
53.在一些具体实施例中，化学诱变处理包括采用浓度为0.1 mol/l的甲基磺酸乙酯进行处理4小时。采用低浓度的化学试剂进行处理，为了让细胞有一定损伤，但不至于损伤太严重；保证细胞再进行后续的等离子体的诱变处理。若浓度过高、处理时间多长，均会造成致死率过高，突变失败。
54.在一些实施例中，等离子体诱变处理包括在常温常压下采用等离子体进行处理60~80秒。其中，等离子体是一种电离状态电荷多，但总量是0的气体物质，利用等离子体（活性离子）处理细胞，有利于使细胞形成突变。
55.在一些具体实施例中，等离子体诱变处理包括在常温常压下采用等离子体进行处理60秒。
56.在一些实施例中，无光平板培养的条件为24~25℃下培养7天。
57.经过检测，在依次进行化学诱变处理和等离子体诱变处理后，小球藻的致死率为99.0%。
58.经过无光平板培养7天后，挑选白色、大的菌落，经纯化、传代后转到液体培养。
59.步骤s03中，挑取白色、生长迅速的单藻进行纯化处理、传代培养后，进行筛选，得到高产叶黄素的诱变小球藻。
60.本技术实施例第三方面提供上述高产叶黄素的诱变小球藻或由上述高产叶黄素的诱变小球藻的制备方法制备得到的诱变小球藻在生产叶黄素的应用。
61.本技术实施例第三方面提供的高产叶黄素的诱变小球藻或由上述高产叶黄素的诱变小球藻的制备方法制备得到的诱变小球藻在生产叶黄素中的应用，由于提供的小球藻诱变藻株zc-1003在无光异养的培养条件下生长速度快、叶黄素产量高，因此有利于广泛应用于藻类叶黄素的大面积生产。
62.下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
63.高产叶黄素的诱变小球藻及其制备方法高产叶黄素的诱变小球藻的制备方法包括如下步骤：提供浓度为1
×
107个/ml野生型小球藻chlorella pyrenoidosa；
将野生型小球藻chlorella pyrenoidosa依次进行化学诱变处理和等离子体诱变处理，然后进行无光平板培养；其中，化学诱变处理包括采用浓度为0.1 mol/l的甲基磺酸乙酯进行处理4小时，等离子体诱变处理包括在常温常压下采用等离子体进行处理60秒，无光平板培养的条件为25℃下培养7天；挑取白色、生长迅速的单藻进行纯化处理、传代培养后，进行筛选，得到高产叶黄素的诱变小球藻。
64.其中，得到的诱变小球藻为保藏编号为no .63502的小球藻诱变藻株zc-1003，是一株高产叶黄素的诱变小球藻。
实施例2
65.高产叶黄素的诱变小球藻的100l发酵罐扩大培养包括如下步骤：将实施例1得到的保藏编号为no .63502的小球藻诱变藻株zc-1003进行发酵罐扩大培养，发酵罐发酵培养的培养基组分包括：每升培养基含1.01 g kno3、9.3 mg edtana2、0.62 g nah2po4.h2o、0.089 g na2hpo4.2h2o、0.247 g mgso4.7h2o、14.7 mg cacl2.2h2o、6.95 mg feso4.7h2o、0.061 mg h3bo3、0.169 mg mnso4.h2o、0.287 mg znso4.7h2o、0.0025 mg cuso4.5h2o、0.01235 mg (nh4)6mo7o
24
.4h2o、40 g葡萄糖、5 g尿素；并调整ph为6.1。
66.发酵罐发酵培养的条件如下：初始接种量为2 g/l，在培养温度为28℃、初始转速200 转/分钟、通气量为0.5 vvm的条件下培养72小时后进行补料，培养至90小时；其中，补料包括补充葡萄糖，葡萄糖指数补料按照以下公式进行补充：
67.其中v
f.s
为补料速度（ml/h）；μ为比生长速率 h-1；v0为发酵体积（l）；c0为初始细胞浓度（g/l）；t为发酵时间，fs为葡萄糖补料液中葡萄糖浓度（g/l）。
68.对比例1野生型小球藻的100l发酵罐扩大培养初始培养基发酵罐发酵培养的培养基组分包括：每升培养基含1.01 g kno3、9.3 mg edtana2、0.62 g nah2po4.h2o、0.089 g na2hpo4.2h2o、0.247 g mgso4.7h2o、14.7 mg cacl2.2h2o、6.95 mg feso4.7h2o、0.061 mg h3bo3、0.169 mg mnso4.h2o、0.287 mg znso4.7h2o、0.0025 mg cuso4.5h2o、0.01235 mg (nh4)6mo7o
24
.4h2o、40 g葡萄糖、5 g尿素；并调整ph为6.1。
69.培养条件为：培养温度28℃，初始转速200 转/分钟，通气量0.5 vvm，初始接种量在2g/l条件下，120h流加补料进行培养。
70.性能测试与结果分析将实施例2高产叶黄素的诱变小球藻的100l发酵罐扩大培养得到的诱变小球藻和对比例1野生型小球藻的100l发酵罐扩大培养得到的野生型小球藻分别进行以下性质的测定（一）生物量经过检测，如图1所示，实施例2得到的诱变小球藻在72小时内最高生物量可达到
84.4g/l；对比例1得到的野生型小球藻在120小时的最高生物量为90g/l。
71.（二）叶黄素含量经过检测，如图2所示，实施例2得到的诱变小球藻在72小时的叶黄素含量为6.1mg/g；叶黄素产率为7.15mg/(l.h)；对比例1得到的野生型小球藻的在120小时的叶黄素含量为3.8mg/g，叶黄素产率为2.85 mg/(l.h)。
72.（三）比生长速率经过检测，实施例2得到的诱变小球藻的比生长速率为1.30 d-1
；对比例1得到的野生型小球藻的比生长速率为1d-1
。
73.综上，本技术实施例提供的一株高产叶黄素的诱变小球藻，该诱变小球藻为chlorella pyrenoidos (auxenochlorella pyrenoidosa)的诱变藻株zc-1003，保藏编号为no .63502，保藏中心为广东省微生物菌种保藏中心；该诱变小球藻在无光异养条件下生物量密度高，生长速度快，且能够得到高含量的叶黄素，有利于异养发酵小球藻生产叶黄素在工业上进行广泛应用。
74.以上所述仅为本技术的较佳实施例而已，并不用以限制本技术，凡在本技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1. 一株高产叶黄素的诱变小球藻，其特征在于，所述诱变小球藻为chlorella pyrenoidos( auxenochlorella pyrenoidosa)的诱变藻株zc-1003，保藏编号为no. 63502，保藏中心为广东省微生物菌种保藏中心。2. 根据权利要求1所述的高产叶黄素的诱变小球藻，其特征在于，在无光异养条件下，所述诱变小球藻的叶黄素含量为7.0~7.5 mg/g。3. 根据权利要求2所述的高产叶黄素的诱变小球藻，其特征在于，在无光异养条件下，所述诱变小球藻的叶黄素含量为7.1 mg/g。4. 根据权利要求1所述的高产叶黄素的诱变小球藻，其特征在于，所述诱变小球藻的比生长速率为1.3~1.4 d-1
。5. 根据权利要求1所述的高产叶黄素的诱变小球藻，其特征在于，在发酵罐发酵培养72小时的条件下，所述诱变小球藻的生物量为84~85 g/l；且叶黄素产率为7.1~7.2 mg/(l.h)。6. 根据权利要求5所述的高产叶黄素的诱变小球藻，其特征在于，每升所述发酵罐发酵培养的培养基含1.01 g kno3、9.3 mg edtana2、0.62 g nah2po4.h2o、0.089 g na2hpo4.2h2o、0.247 g mgso4.7h2o、14.7 mg cacl2.2h2o、6.95 mg feso4.7h2o、0.061 mg h3bo3、0.169 mg mnso4.h2o、0.287 mg znso4.7h2o、0.0025 mg cuso4.5h2o、0.01235 mg (nh4)6mo7o
24
.4h2o、40 g葡萄糖、5 g尿素；并调整ph为6.0~6.5。7. 根据权利要求5所述的高产叶黄素的诱变小球藻，其特征在于，所述发酵罐发酵培养的条件如下：初始接种量为2~2.5 g/l，在培养温度为27~28℃、初始转速200~220 转/分钟、通气量为0.5~0.7 vvm的条件下培养72小时后进行补料，培养至90~100小时。8.一种如权利要求1~7任一所述的高产叶黄素的诱变小球藻的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：s1.提供野生型小球藻chlorella pyrenoidosa；s2.将所述野生型小球藻chlorella pyrenoidosa依次进行化学诱变处理和等离子体诱变处理，然后进行无光平板培养；s3.挑取白色、生长迅速的单藻进行纯化处理、传代培养后，进行筛选，得到高产叶黄素的诱变小球藻。9. 根据权利要求8所述的高产叶黄素的诱变小球藻的制备方法，其特征在于，在s2中，所述化学诱变处理包括采用浓度为0.1~0.15 mol/l的甲基磺酸乙酯进行处理4~6小时；所述等离子体诱变处理包括在常温常压下采用等离子体进行处理60~80秒。10.权利要求1~7任一所述的高产叶黄素的诱变小球藻在生产叶黄素的应用。

技术总结
本申请涉及小球藻技术领域，尤其涉及一株高产叶黄素的诱变小球藻及其制备方法与应用；提供了一株高产叶黄素的诱变小球藻，该诱变小球藻为Chlorella pyrenoidos(Auxenochlorella pyrenoidosa)的诱变藻株ZC-1003，保藏编号为No.63502，保藏中心为广东省微生物菌种保藏中心；该诱变小球藻在无光异养条件下生物量密度高，生长速度快，且能够得到高含量的叶黄素，有利于异养发酵小球藻生产叶黄素在工业上进行广泛应用。叶黄素在工业上进行广泛应用。叶黄素在工业上进行广泛应用。


技术研发人员：杨阳 刘宾 付爽 李浩东 车黎猛 吴云杰
受保护的技术使用者：藻辰（山东）生物工程有限公司
技术研发日：2023.08.17
技术公布日：2023/9/23