一种全雌三文鱼品系诱导方法与流程

1.本发明涉及三文鱼品系诱导技术领域，具体为一种全雌三文鱼品系诱导方法。


背景技术：

2.大西洋鲑，俗称三文鱼，是世界性养殖鱼类，在全球几十个国家都有养殖，是近几十年来全球渔业和水产养殖贸易增长的主要推动利用。在几乎所有区域，大西洋鲑需求的增速都快于其他鱼类。我国已经开始利用各种冷水资源（地下冷水、冷水团、电站冷却水等）进行大西洋鲑养殖，并取得成功，目前国内深海网箱进行大西洋鲑的深远海养殖也已经成功，随着国内养殖体量的提升，苗种需要量也大幅增加，业内有关大西洋鲑苗种自给自足的呼声越来越高，苗种国产化势在必行。
3.大西洋鲑（三文鱼）是我国主要海水消费品种之一，目前国内已经有多个深海网箱和陆基工厂化养殖大西洋鲑项目开展，因此需要一种全雌三文鱼品系诱导方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种全雌三文鱼品系诱导方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种全雌三文鱼品系诱导方法，包括如下步骤：步骤一：伪雄鱼亲鱼培育和催产，购买xx型全雌发眼卵，孵化成仔鱼开口后投喂雄激素，诱导获得xx型伪雄鱼，接着将伪雄鱼个体银化成为降海鲑后，在海水中培育至2龄，利用分子标记筛选性早熟个体，通过环境调控诱导伪雄鱼成熟，人工催产获得精子用于授精或超低温冷冻保存，不能性早熟的伪雌鱼培育至自然性成熟；步骤二：雌性亲鱼培育和催产，购买2龄以上的生理雌鱼，营养强化6-8个月后，同样通过环境调控诱导性成熟，人工催产获得卵子，利用鲜精或冷冻精子人工授精，获得受精卵；步骤三：全雌苗种制备，将步骤二中的受精卵孵化仔鱼，培育6个月后，检查性腺发育，确定雌性比例，即得全雌苗种。
6.优选的，所述伪雄鱼亲鱼培育和催产的具体步骤为：（1）购买全雌二倍体发眼卵，孵化得到xx型仔鱼；（2）仔鱼开口摄食人工配合饲料后，投喂17α-甲基睾丸酮诱导性反转，获得xx型伪雄鱼；鱼苗长至20 g时进行银化，100g时幼鱼转入海水养成；（3）检查性腺形态，确定诱导效果，对精巢发育正常的伪雄鱼、精巢发育不良的伪雄鱼和间性个体进行简化基因组测序或基因组重测序，开发诱导成功性状相关的分子标记，挑选可用于生产的伪雌鱼；（4）挑选的伪雌鱼在海水中养殖12-14个月后，养殖期间定期检查性腺发育，当gsi＞0.3且组织切片观察有大量精细胞时，利用已经开发的分子标记筛选可提前性成熟个体，
将伪雄鱼转淡水培育，并控光控温促进性成熟，剩余的伪雄鱼继续在海水养殖；（5）淡水中培育的伪雄鱼出现第二性征后7-14天，利用lhrha进行人工催产，催产前先用ms-222麻醉，注射计量为500μl/kg，lhrha用量为5μg/kg，背部肌肉注射；（6）催产4-7天后，杀雄取精，精巢剪碎后用纱布过滤，取少量精液活化镜检后，精液用于人工授精或用精子保存液保存于液氮罐中备用；（7）剩余未淡化培育的伪雄鱼继续在海水中养殖，养殖过程中定期检查性腺发育情况，养殖6-12个月后，将伪雄鱼淡化培育，并控光控温促进性成熟，重复（5）与（6）的操作。
7.优选的，所述雌性亲鱼培育和催产的具体方法步骤为：（1）购买不同批次的2龄以上的生理雌鱼，利用鱼油或虾青素对其进行营养强化培育，饲料粗蛋白含量≥42%，日投喂量为体重的1%；（2）雌鱼经营养强化6-8个月后，检查性腺发育，当gsi＞0.6 %且卵径＞5 mm时，将雌鱼转淡水培育，并控光控温促进性成熟；（3）雌性亲鱼出现第二性征后7-14天，利用lhrha进行人工催产，催产前先用ms-222麻醉；（4）催产4-7天后，检查雌性亲鱼产卵情况，及时挑出可产卵亲鱼进行人工授精，之后每7天检查1次挑选可产卵亲鱼，催产群体可在1个月内全部产卵完成；（5）剩余未淡化培育的雌鱼继续在海水中养殖，养殖过程中定期检查性腺发育情况，养殖6-12个月后，将雌鱼淡化培育，并控光控温促进性成熟，重复（3）与（4）的操作。
8.优选的，所述全雌苗种制备的具体方法步骤为：（1）干法授精，雌雄比为2:1，授精、清洗、消毒后，孵化箱中孵化；（2）受精卵孵化，仔鱼培育，幼鱼银化；（3）统计6月龄以上的幼鲑性别比例，确定雌性比例。
9.优选的，所述17α-甲基睾丸酮的诱导计量为5mg/kg，诱导时间为900度日；所述幼鱼转入海水养殖的水温不超过18℃，以14-16℃为宜，光照1000lux、24l:0d。
10.优选的，所述伪雄鱼转淡的淡化方法为：盐度每3天降低3
‰‑5‰
，淡化前，水温按每天下降1℃调整至10℃以下，以5-8℃为宜，光照200-500lux、12l：12d。
11.优选的，所述精子保存液中加维生素e和抗坏血酸，提高精子活力。
12.优选的，所述雌性亲鱼出现第二性征进行催产时，采用背部肌肉注射，催产注射计量为500μl/kg，lhrha用量为10μg/kg。
13.与现有技术相比，本发明的有益效果是：该全雌三文鱼品系诱导方法通过利用性反转技术、分子标记、环境调控和精子超低温冷冻保存等方法制备大西洋鲑全雌苗种，制种效率高，制种周期短；筛选诱导成功性状（性反转且精巢正常发育）相关分子标记，建立伪雄鱼快速检测方法，筛选符合生产要求的伪雄鱼进行培育，节约了养殖成本；而且针对大西洋鲑伪雄鱼不能排精，雌雄性成熟时间不同步，雌鱼产卵时间长的现象，利用超低温冷冻技术保存伪雄鱼精子，长期保存精子的活性，提高了伪雄鱼的利用率；本发明涉及的亲鱼培育、受精卵孵化、苗种培育等过程全部在循环水系统中进行，温度、光照、盐度等环境因子可精准控制，确保最佳条件；本发明建立的大西洋鲑全雌苗种制种技术可实现全年生产，没有季节的限制，满足国内不同地区不同时间的苗种需求。
附图说明
14.图1为本发明的流程图。
具体实施方式
15.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
16.本发明提供的一种全雌三文鱼品系诱导方法的结构如图1所示，包括如下步骤：步骤一：伪雄鱼亲鱼培育和催产，购买xx型全雌发眼卵，孵化成仔鱼开口后投喂雄激素，诱导获得xx型伪雄鱼，接着将伪雄鱼个体银化成为降海鲑后，在海水中培育至2龄，利用分子标记筛选性早熟个体，通过环境调控（降低盐度、控光、控温）诱导伪雄鱼成熟，人工催产获得精子用于授精或超低温冷冻保存，不能性早熟的伪雌鱼培育至自然性成熟；进一步地，伪雄鱼亲鱼培育和催产的具体步骤为：（1）购买全雌二倍体（xx型）发眼卵，孵化得到xx型仔鱼；（2）仔鱼开口摄食人工配合饲料后，投喂17α-甲基睾丸酮（17-αmt）诱导性反转，获得xx型伪雄鱼，诱导计量为5mg/kg，诱导时间为900度日；鱼苗长至20 g时进行银化，100g时幼鱼转入海水养成，养殖水温14-16℃，光照1000lux、24l:0d；（3）检查性腺形态，确定诱导效果，对精巢发育正常的伪雄鱼、精巢发育不良的伪雄鱼和间性个体进行简化基因组测序或基因组重测序，开发诱导成功性状（性反转且性腺正常发育）相关的分子标记，挑选可用于生产的伪雌鱼；（4）挑选的伪雌鱼在海水中养殖12-14个月后，养殖期间定期检查性腺发育，当gsi＞0.3且组织切片观察有大量精细胞时，利用已经开发的分子标记筛选可提前性成熟个体，将伪雄鱼转淡水培育，并控光控温促进性成熟，剩余的伪雄鱼继续在海水养殖，伪雄鱼转淡的淡化方法：盐度每3天降低3
‰‑5‰
，淡化前，水温按每天下降1℃调整至10℃以下，以5-8℃为宜，光照200-500lux、12l：12d；（5）淡水中培育的伪雄鱼出现第二性征后7-14天，利用lhrha进行人工催产，催产前先用ms-222（50-100ppm）麻醉，注射计量为500μl/kg，lhrha用量为5μg/kg，背部肌肉注射；（6）催产4-7天后，杀雄取精，精巢剪碎后用纱布过滤，取少量精液活化镜检后，精液用于人工授精或用精子保存液保存于液氮罐中备用，精子保存液中加维生素e（0.1mm）和抗坏血酸（1mm），提高精子活力；（7）剩余未淡化培育的伪雄鱼继续在海水中养殖，养殖过程中定期检查性腺发育情况，养殖6-12个月后，将伪雄鱼淡化培育，并控光控温促进性成熟，重复（5）与（6）的操作；步骤二：雌性亲鱼培育和催产，购买2龄以上生理雌鱼，营养强化6-8个月后，同样通过环境调控（降低盐度、控光、控温）诱导性成熟，人工催产获得卵子，利用鲜精或冷冻精子人工授精，获得受精卵。
17.进一步地，雌性亲鱼培育和催产的具体方法步骤为：（1）购买不同批次的2龄以上的生理雌鱼，利用鱼油或虾青素对其进行营养强化培
育，饲料粗蛋白含量≥42%，日投喂量为体重的1%；水温14-16℃，光照1000lx、24l: 0d；（2）雌鱼经营养强化6-8个月后，检查性腺发育，当gsi＞0.6 %且卵径＞5 mm时，将雌鱼转淡水促熟，雌鱼的淡化方法：盐度每3天降低3
‰‑5‰
，淡化前，水温按每天下降1℃调整至10℃以下，以5-8℃为宜，光照200-500lux、12l：12d；（3）雌性亲鱼出现第二性征后7-14天，利用lhrha进行人工催产，催产前先用ms-222（50-100 ppm）麻醉，催产注射计量为500μl/kg，lhrha用量为10μg/kg，背部肌肉注射；（4）催产4-7天后，检查雌性亲鱼产卵情况，及时挑出可产卵亲鱼进行人工授精，之后每7天检查1次挑选可产卵亲鱼，催产群体可在1个月内全部产卵完成；（5）剩余未淡化培育的雌鱼继续在海水中养殖，养殖过程中定期检查性腺发育情况，养殖6-12个月后，将雌鱼淡化培育，并控光控温促进性成熟，重复（3）与（4）的操作；步骤三：全雌苗种制备，将步骤二中的受精卵孵化仔鱼，培育6个月后，检查性腺发育，确定雌性比例，即得全雌苗种。
18.进一步地，全雌苗种制备的具体方法步骤为：（1）干法授精，雌雄比为2:1，授精、清洗、消毒后，孵化箱中孵化；（2）受精卵孵化，仔鱼培育，幼鱼银化；（3）统计6月龄以上的幼鲑性别比例，确定雌性比例。
19.本发明通过利用性反转技术、分子标记、环境调控和精子超低温冷冻保存等方法制备大西洋鲑全雌苗种，制种效率高，制种周期短；筛选诱导成功性状（性反转且精巢正常发育）相关分子标记，建立伪雄鱼快速检测方法，筛选符合生产要求的伪雄鱼进行培育，节约了养殖成本；而且针对大西洋鲑伪雄鱼不能排精，雌雄性成熟时间不同步，雌鱼产卵时间长的现象，利用超低温冷冻技术保存伪雄鱼精子，长期保存精子的活性，提高了伪雄鱼的利用率；本发明涉及的亲鱼培育、受精卵孵化、苗种培育等过程全部在循环水系统中进行，温度、光照、盐度等环境因子可精准控制，确保最佳条件；本发明建立的大西洋鲑全雌苗种制种技术可实现全年生产，没有季节的限制，满足国内不同地区不同时间的苗种需求。
20.方法步骤：由于大西洋鲑遗传性别类型为xx/xy型，其全雄制种技术方法是利用雄激素诱导xx型雌鱼性反转为xx型伪雄鱼，xx型伪雄鱼与xx型雌鱼杂交得到xx型全雌苗种，伪雄鱼的诱导效果存在个体差异，开发诱导成功性状（性反转且性腺正常发育）相关的分子标记可快速筛选符合要求的伪雄鱼进行培育。
21.此外，利用性成熟相关分子标记筛选性早熟伪雄鱼，通过环境调控促进其提前1年（正常需3年）性成熟，缩短制种时间，雌鱼一般需要3以上龄性成熟，同样可通过环境调控性早熟，但小个体雌鱼（如1龄）提前性成熟会导致卵子质量差而影响孵化率和仔鱼成活率，因此选2龄以上雌鱼经营养强化培育至3龄的个体作为雌性亲本，针对雌雄性成熟时间不同步（雄性先熟）、雌鱼产卵周期长的问题，利用超低温冷冻方法保存精子。
22.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

技术特征：
1.一种全雌三文鱼品系诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：伪雄鱼亲鱼培育和催产，购买xx型全雌发眼卵，孵化成仔鱼开口后投喂雄激素，诱导获得xx型伪雄鱼，接着将伪雄鱼个体银化成为降海鲑后，在海水中培育至2龄，利用分子标记筛选性早熟个体，通过环境调控诱导伪雄鱼成熟，人工催产获得精子用于授精或超低温冷冻保存，不能性早熟的伪雌鱼培育至自然性成熟；步骤二：雌性亲鱼培育和催产，购买2龄以上的生理雌鱼，营养强化6-8个月后，同样通过环境调控诱导性成熟，人工催产获得卵子，利用鲜精或冷冻精子人工授精，获得受精卵；步骤三：全雌苗种制备，将步骤二中的受精卵孵化仔鱼，培育6个月后，检查性腺发育，确定雌性比例，即得全雌苗种。2.根据权利要求1所述的一种全雌三文鱼品系诱导方法，其特征在于：在步骤一中，所述伪雄鱼亲鱼培育和催产的具体步骤为：（1）购买全雌二倍体发眼卵，孵化得到xx型仔鱼；（2）仔鱼开口摄食人工配合饲料后，投喂17α-甲基睾丸酮诱导性反转，获得xx型伪雄鱼；鱼苗长至20 g时进行银化，100g时幼鱼转入海水养成；（3）检查性腺形态，确定诱导效果，对精巢发育正常的伪雄鱼、精巢发育不良的伪雄鱼和间性个体进行简化基因组测序或基因组重测序，开发诱导成功性状相关的分子标记，挑选可用于生产的伪雌鱼；（4）挑选的伪雌鱼在海水中养殖12-14个月后，养殖期间定期检查性腺发育，当gsi＞0.3且组织切片观察有大量精细胞时，利用已经开发的分子标记筛选可提前性成熟个体，将伪雄鱼转淡水培育，并控光控温促进性成熟，剩余的伪雄鱼继续在海水养殖；（5）淡水中培育的伪雄鱼出现第二性征后7-14天，利用lhrha进行人工催产，催产前先用ms-222麻醉，注射计量为500μl/kg，lhrha用量为5μg/kg，背部肌肉注射；（6）催产4-7天后，杀雄取精，精巢剪碎后用纱布过滤，取少量精液活化镜检后，精液用于人工授精或用精子保存液保存于液氮罐中备用；（7）剩余未淡化培育的伪雄鱼继续在海水中养殖，养殖过程中定期检查性腺发育情况，养殖6-12个月后，将伪雄鱼转淡水培育，并控光控温促进性成熟，重复（5）与（6）的操作。3.根据权利要求1所述的一种全雌三文鱼品系诱导方法，其特征在于：在步骤二中，所述雌性亲鱼培育和催产的具体方法步骤为：（1）购买不同批次的2龄以上的生理雌鱼，利用鱼油或虾青素对其进行营养强化培育，饲料粗蛋白含量≥42%，日投喂量为体重的1%；（2）雌鱼经营养强化6-8个月后，检查性腺发育，当gsi＞0.6 %且卵径＞5 mm时，将雌鱼转淡水培育，并控光控温促进性成熟；（3）雌性亲鱼出现第二性征后7-14天，利用lhrha进行人工催产，催产前先用ms-222麻醉；（4）催产4-7天后，检查雌性亲鱼产卵情况，及时挑出可产卵亲鱼进行人工授精，之后每7天检查1次挑选可产卵亲鱼，催产群体可在1个月内全部产卵完成；（5）剩余未淡化培育的雌鱼继续在海水中养殖，养殖过程中定期检查性腺发育情况，养殖6-12个月后，将雌鱼淡化控光控温促进性成熟，重复（3）与（4）的操作。4.根据权利要求1所述的一种全雌三文鱼品系诱导方法，其特征在于：在步骤三中，所
述全雌苗种制备的具体方法步骤为：（1）干法授精，雌雄比为2:1，授精、清洗、消毒后，孵化箱中孵化；（2）受精卵孵化，仔鱼培育，幼鱼银化；（3）统计6月龄以上的幼鲑性别比例，确定雌性比例。5.根据权利要求2所述的一种全雌三文鱼品系诱导方法，其特征在于：所述17α-甲基睾丸酮的诱导计量为5mg/kg，诱导时间为900度日；所述幼鱼转入海水养殖的水温不超过18℃，以14-16℃为宜，光照1000lux、24l:0d。6.根据权利要求2所述的一种全雌三文鱼品系诱导方法，其特征在于：所述伪雄鱼转淡的淡化方法为：盐度每3天降低3
‰‑5‰
，淡化前，水温按每天下降1℃调整至10℃以下，以5-8℃为宜，光照200-500lux、12l：12d。7.根据权利要求2所述的一种全雌三文鱼品系诱导方法，其特征在于：所述精子保存液中加维生素e和抗坏血酸，提高精子活力。8.根据权利要求3所述的一种全雌三文鱼品系诱导方法，其特征在于：所述雌性亲鱼出现第二性征进行催产时，采用背部肌肉注射，催产注射计量为500μl/kg，lhrha用量为10μg/kg。

技术总结
本发明涉及三文鱼品系诱导技术领域，具体为一种全雌三文鱼品系诱导方法，包括如下步骤，步骤一：伪雄鱼亲鱼培育和催产，购买XX型全雌发眼卵，孵化成仔鱼开口后投喂雄激素，诱导获得XX型伪雄鱼，通过分子标记筛选性早熟个体，经环境调控诱导性成熟，获得精子；步骤二：雌性亲鱼培育和催产，购买2龄以上生理雌鱼，营养强化6-8个月后，同样通过环境调控诱导性成熟，人工催产获得卵子，人工授精制备受精卵；步骤三：全雌苗种制备，将步骤二中的受精卵孵化，即得全雌苗种。本发明是在不影响精子质量的前提下，通过分子标记筛选和环境调控，伪雄鱼能够提前性成熟，从而缩短制种周期，提高制种效率。率。率。


技术研发人员：秦骥 胡鹏 江鑫
受保护的技术使用者：深圳精渔科技有限公司
技术研发日：2023.08.18
技术公布日：2023/9/23