一种CHO细胞无血清培养基及其应用的制作方法

一种cho细胞无血清培养基及其应用
技术领域
1.本发明涉及细胞培养基领域，具体为一种cho细胞培养基及其应用。


背景技术：

2.中国仓鼠卵巢（chinese hamster ovary，cho）细胞广泛应用于重组蛋白药物及抗体药物的生产，
①
不易受人类病毒感染具有高安全性；
②
翻译后修饰与人类细胞相似的rtp；
③
高密度cho细胞可以适应化学定义的无血清培养基（cd-sfm）的悬浮培养，并产生分泌到培养基中的蛋白质，所以cho细胞是目前少数fda及各国药监部门认可的合法合规的产业化工程细胞株。最早成功开发并用于培养动物细胞的培养基通常由血浆、血清或组织提取物组成，这些生物成分复杂的、未定义的性质导致了可变性，增加了污染的风险，并阻止了对支持培养基中细胞生长所需的最低限度的、特定的营养成分的阐明。
3.补料分批和灌注细胞培养是大规模工业生产单克隆抗体和重组生物制药蛋白的两种当前方法。通常，补料分批过程的规模需要更大和更刚性的布局，这限制了它的应用，基于膜的交替切向流过滤（atf）技术是灌注培养中最常用的细胞保留方法，以增加细胞密度和mabs生产率；对于不稳定的治疗性蛋白质如重组酶和凝血因子的生产，灌注方法具有更多优点，细胞截流系统可使细胞或酶保留在反应器内，维持较高的细胞密度，从而较大的提高了产品的产量。在灌注模式中，含有产物和废物的培养液在灌注控制器的控制下灌注通过生物反应器，而细胞/产物被保留或循环回生物反应器。国内很多企业已经启动或者准备启动灌流培养方式生产单克隆抗体和重组蛋白制品，但目前市场可供cho细胞灌流培养专用的培养基基本没有。由于灌流培养基开发难度大，开发周期长，培养基用量大，设备复杂，影响了国内灌流培养工艺发展。
4.因此，cho细胞灌流培养基及其应用，是本行业目前研究的热点和痛点。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明开发了一种无任何动物性来源成分的、无蛋白的、化学成分明确的cho细胞灌流培养基，能够满足多种cho细胞的长时间高密度灌流培养需求，价格低廉，并且弥补了高性能国产灌流培养基的市场空白。
6.本发明的目的在于一种cho细胞培养基及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
7.为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种cho细胞无血清培养基，由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成；氨基酸是以下终浓度的各成分：l-丙氨酸12.8~306.9mg/l、盐酸l-精氨酸357.8~4152.8mg/l、l-天冬酰胺一水合物412.9~2976.4mg/l、l-天门冬氨酸102.4~1879.4mg/l、l-谷氨酸298.8~2852.1mg/l、l-甘氨酸56.4~492mg/l、盐酸l-组氨酸一水合物200.6~952.6mg/l、l-异亮氨酸319.6~2095.6mg/l、l-亮氨酸389.5~2159mg/l、盐酸l-赖氨酸514.9
~3998.2mg/l、l-甲硫氨酸108.5~369.4mg/l、l-苯丙氨酸108.8~1025.9mg/l、l-脯氨酸315.6~1048.9mg/l、l-丝氨酸402.5~1498.5mg/l、l-苏氨酸290.8~1359.1mg/l、l-色氨酸82.9~520.6mg/l、l-酪氨酸334.3~1230.8mg/l、l-缬氨酸328.6~2069.1mg/l、盐酸l-半胱氨酸一水合物101.4~1128.4mg/l；维生素是以下终浓度的各成分：氯化胆碱91.05~182.1mg/l、叶酸66.7~133.4mg/l、肌醇119~238mg/l、烟酰胺10.7~21.4mg/l、泛酸钙8.6~17.2mg/l、核黄素0.7975~1.595mg/l、盐酸吡哆醇3.225~6.45mg/l、盐酸硫胺素7.925~15.85mg/l、生物素1.265~2.53mg/l、维生素b12 7.55~15.1mg/l、抗坏血酸磷酸酯镁倍半镁盐水合物6.5mg/l、对氨基苯甲酸3.5mg/l；微量元素是以下终浓度的各成分：二水合氯化铜0.0435mg/l、亚硒酸钠0.0035mg/l、六水氯化铝0.003865mg/l、硫酸锰0.0010285mg/l、偏钒酸铵0.0001365mg/l、氯化亚锡0.0002mg/l、氯化铷0.000035mg/l、二氯氧化锆0.02854mg/l、六水合氯化钴0.268255mg/l；无机盐是以下终浓度的各成分：氯化钾523.3~771.5mg/l、氯化钠125.7~862.3mg/l、无水硫酸镁46.5~68.3mg/l、七水合硫酸亚铁124.3mg/l、七水合硫酸锌12mg/l、无水氯化钙64.3~128.6mg/l、碳酸氢钠2200mg/l、柠檬酸铁铵1.5mg/l、磷酸氢二钠215mg/l；碳水化合物是以下终浓度的各成分：无水葡萄糖12000~13000mg/l、丙酮酸钠盐500~600mg/l；其他分子化合物是以下终浓度的各成分：亚油酸钠0.432mg/l、腐胺二盐酸5.05~10.1mg/l、乙醇胺盐酸盐7.613795mg/l、硫酸葡聚糖钠盐28.125mg/l、泊洛沙姆188 1100mg/l、丙酸钠1.5mg/l、盐酸甜菜碱100mg/l。
8.优选的，氨基酸是以下终浓度的各成分：l-丙氨酸142.3mg/l、盐酸l-精氨酸2463.9mg/l、l-天冬酰胺一水合物1521.5mg/l、l-天门冬氨酸945.5mg/l、l-谷氨酸1458.625mg/l、l-甘氨酸140.625mg/l、盐酸l-组氨酸一水合物439.8mg/l、l-异亮氨酸1137.225mg/l、l-亮氨酸1253.75mg/l、盐酸l-赖氨酸1786.875mg/l、l-甲硫氨酸289mg/l、l-苯丙氨酸585.3mg/l、l-脯氨酸683.375mg/l、l-丝氨酸949mg/l、l-苏氨酸793mg/l、l-色氨酸259.95mg/l、l-酪氨酸756.125mg/l、l-缬氨酸1120.8mg/l、盐酸l-半胱氨酸一水合物597.675mg/l；维生素是以下终浓度的各成分：氯化胆碱182.1mg/l、叶酸133.4mg/l、肌醇238mg/l、烟酰胺21.4mg/l、泛酸钙17.2mg/l、核黄素1.595mg/l、盐酸吡哆醇6.45mg/l、盐酸硫胺素15.85mg/l、生物素2.53mg/l、维生素b12 15.1mg/l、抗坏血酸磷酸酯镁倍半镁盐水合物6.5mg/l、对氨基苯甲酸3.5mg/l；微量元素是以下终浓度的各成分：二水合氯化铜0.0435mg/l、亚硒酸钠0.0035mg/l、六水氯化铝0.003865mg/l、硫酸锰0.0010285mg/l、偏钒酸铵0.0001365mg/l、氯化亚锡0.0002mg/l、氯化铷0.000035mg/l、二氯氧化锆0.02854mg/l、六水合氯化钴0.268255mg/l；无机盐是以下终浓度的各成分：氯化钾523.3mg/l、氯化钠436.9mg/l、无水硫酸镁68.3mg/l、七水合硫酸亚铁124.3mg/l、七水合硫酸锌12mg/l、无水氯化钙128.6mg/l、碳酸氢钠2200mg/l、柠檬酸铁铵1.5mg/l、磷酸氢二钠215mg/l；碳水化合物是以下终浓度的各成分：无水葡萄糖13000mg/l、丙酮酸钠盐600mg/l；其他分子化合物是以下终浓度的各成分：亚油酸钠0.432mg/l、腐胺二盐酸
10.1mg/l、乙醇胺盐酸盐7.613795mg/l、硫酸葡聚糖钠盐28.125mg/l、泊洛沙姆188 1100mg/l、丙酸钠1.5mg/l、盐酸甜菜碱100mg/l。
9.优选的，所述的cho细胞为cho-s或cho-k1中的任意一种。
10.优选的，该cho细胞无血清培养基用于cho细胞的灌流培养。
11.优选的，所述灌流培养的设备为摇管或3l反应器中的任意一种。
12.与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：1、实验结果表明本发明的无血清灌流培养基不仅可以支持长时间高活细胞密度的灌流培养，还可以维持高活率保持较好的细胞状态，从而能够提高生产效率，降低生产成本，具有广泛的应用前景和价值；2、本发明的无血清灌流培养基能够在3l玻璃反应器的灌流培养体系实现超高的活细胞密度（120
×
106细胞/ml），从而可以提高体积产率；综上，本发明的无血清灌流培养基填补了国内灌流培养专用培养基的空白，能够为国内灌流培养工艺生产抗体药提供了高性能的培养基，促进国内以灌流培养方式生产抗体药的发展。
附图说明
13.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：图1是本发明摇管体系模拟灌流培养cho-s细胞的活细胞密度变化曲线图；图2是本发明摇管体系模拟灌流培养cho-s细胞的细胞活率变化曲线图；图3是本发明摇管体系模拟灌流培养cho-k1细胞的活细胞密度变化曲线图；图4是本发明摇管体系模拟灌流培养cho-k1细胞的细胞活率变化曲线图；图5是本发明3l反应器体系模拟灌流培养cho-k1细胞的活细胞密度变化曲线图；图6是本发明3l反应器体系模拟灌流培养cho-k1细胞的细胞活率变化曲线图。
具体实施方式
14.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
15.以下实施例中所述的cho细胞培养基组成（包括氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物各成分）均采购自西格玛（sigma）；细胞株cho-k1购自金斯瑞、cho-s购自智享生物。
16.一、培养基的配置：实施例1~4的cho细胞无血清培养基制备方法如下：将1l用量对应的氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组分加入800ml的注射用水中，室温搅拌30分钟后，加入一定量的氢氧化钠助溶，用盐酸调节ph到6.7~7.0，定容至1l后，用0.22
µ
m无菌膜过滤，4℃长期保存备用，即可。
17.实施例1：由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组
成，其中，氨基酸是以下终浓度的各成分：l-丙氨酸142.3mg/l、盐酸l-精氨酸2463.9mg/l、l-天冬酰胺一水合物1521.5mg/l、l-天门冬氨酸945.5mg/l、l-谷氨酸1458.625mg/l、l-甘氨酸140.625mg/l、盐酸l-组氨酸一水合物439.8mg/l、l-异亮氨酸1137.225mg/l、l-亮氨酸1253.75mg/l、盐酸l-赖氨酸1786.875mg/l、l-甲硫氨酸289mg/l、l-苯丙氨酸585.3mg/l、l-脯氨酸683.375mg/l、l-丝氨酸949mg/l、l-苏氨酸793mg/l、l-色氨酸259.95mg/l、l-酪氨酸756.125mg/l、l-缬氨酸1120.8mg/l、盐酸l-半胱氨酸一水合物597.675mg/l；维生素是以下终浓度的各成分：氯化胆碱182.1mg/l、叶酸133.4mg/l、肌醇238mg/l、烟酰胺21.4mg/l、泛酸钙17.2mg/l、核黄素1.595mg/l、盐酸吡哆醇6.45mg/l、盐酸硫胺素15.85mg/l、生物素2.53mg/l、维生素b1215.1mg/l、抗坏血酸磷酸酯镁倍半镁盐水合物6.5mg/l、对氨基苯甲酸3.5mg/l；微量元素是以下终浓度的各成分：二水合氯化铜0.0435mg/l、亚硒酸钠0.0035mg/l、六水氯化铝0.003865mg/l、硫酸锰0.0010285mg/l、偏钒酸铵0.0001365mg/l、氯化亚锡0.0002mg/l、氯化铷0.000035mg/l、二氯氧化锆0.02854mg/l、六水合氯化钴0.268255mg/l；无机盐是以下终浓度的各成分：氯化钾523.3mg/l、氯化钠436.9mg/l、无水硫酸镁68.3mg/l、七水合硫酸亚铁124.3mg/l、七水合硫酸锌12mg/l、无水氯化钙128.6mg/l、碳酸氢钠2200mg/l、柠檬酸铁铵1.5mg/l、磷酸氢二钠215mg/l；碳水化合物是以下终浓度的各成分：无水葡萄糖13000mg/l、丙酮酸钠盐600mg/l；其他分子化合物是以下终浓度的各成分：亚油酸钠0.432mg/l、腐胺二盐酸10.1mg/l、盐酸乙醇胺7.613795mg/l、硫酸葡聚糖钠盐28.125mg/l、泊洛沙姆1881100mg/l、丙酸钠1.5mg/l、盐酸甜菜碱100mg/l。
18.实施例2：由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成，其中，氨基酸是以下终浓度的各成分：l-丙氨酸306.9mg/l、盐酸l-精氨酸4152.8mg/l、l-天冬酰胺一水合物2976.4mg/l、l-天门冬氨酸1859.4mg/l、l-谷氨酸2852.1mg/l、l-甘氨酸492mg/l、盐酸l-组氨酸一水合物952.6mg/l、l-异亮氨酸2095.6mg/l、l-亮氨酸2159mg/l、盐酸l-赖氨酸3998.2mg/l、l-甲硫氨酸369.4mg/l、l-苯丙氨酸1025.9mg/l、l-脯氨酸1048.9mg/l、l-丝氨酸1498.5mg/l、l-苏氨酸1359.1mg/l、l-色氨酸520.6mg/l、l-酪氨酸1230.8mg/l、l-缬氨酸2069.1mg/l、盐酸l-半胱氨酸一水合物1128.4mg/l；维生素是以下终浓度的各成分：氯化胆碱145.68mg/l、叶酸106.72mg/l、肌醇190.4mg/l、烟酰胺17.12mg/l、泛酸钙13.76mg/l、核黄素1.276mg/l、盐酸吡哆醇5.16mg/l、盐酸硫胺素12.68mg/l、生物素2.024mg/l、维生素b1212.08mg/l、抗坏血酸磷酸酯镁倍半镁盐水合物6.5mg/l、对氨基苯甲酸3.5mg/l；微量元素是以下终浓度的各成分：二水合氯化铜0.0435mg/l、亚硒酸钠0.0035mg/l、六水氯化铝0.003865mg/l、硫酸锰0.0010285mg/l、偏钒酸铵0.0001365mg/l、氯化亚锡0.0002mg/l、氯化铷0.000035mg/l、二氯氧化锆0.02854mg/l、六水合氯化钴0.268255mg/l；
无机盐是以下终浓度的各成分：氯化钾771.5mg/l、氯化钠125.7mg/l、无水硫酸镁46.5mg/l、七水合硫酸亚铁124.3mg/l、七水合硫酸锌12mg/l、无水氯化钙102.88mg/l、碳酸氢钠2200mg/l、柠檬酸铁铵1.5mg/l、磷酸氢二钠215mg/l；碳水化合物是以下终浓度的各成分：无水葡萄糖12000mg/l、丙酮酸钠盐500mg/l；其他分子化合物是以下终浓度的各成分：亚油酸钠0.432mg/l、腐胺二盐酸8.08mg/l、乙醇胺盐酸盐7.613795mg/l、硫酸葡聚糖钠盐28.125mg/l、泊洛沙姆1881100mg/l、丙酸钠1.5mg/l、盐酸甜菜碱100mg/l。
19.实施例3：由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成，其中，氨基酸是以下终浓度的各成分：l-丙氨酸72.3mg/l、盐酸l-精氨酸1253.6mg/l、l-天冬酰胺一水合物815.6mg/l、l-天门冬氨酸381.9mg/l、l-谷氨酸772.5mg/l、l-甘氨酸91.8mg/l、盐酸l-组氨酸一水合物291.7mg/l、l-异亮氨酸665.3mg/l、l-亮氨酸746.2mg/l、盐酸l-赖氨酸667.5mg/l、l-甲硫氨酸108.5mg/l、l-苯丙氨酸320.6mg/l、l-脯氨酸457.1mg/l、l-丝氨酸610.3mg/l、l-苏氨酸451.6mg/l、l-色氨酸162.5mg/l、l-酪氨酸512.2mg/l、l-缬氨酸524.4mg/l、盐酸l-半胱氨酸一水合物306.7mg/l；维生素是以下终浓度的各成分：氯化胆碱182.1mg/l、叶酸133.4mg/l、肌醇238mg/l、烟酰胺21.4mg/l、泛酸钙17.2mg/l、核黄素1.595mg/l、盐酸吡哆醇6.45mg/l、盐酸硫胺素15.85mg/l、生物素2.53mg/l、维生素b1215.1mg/l、抗坏血酸磷酸酯镁倍半镁盐水合物6.5mg/l、对氨基苯甲酸3.5mg/l；微量元素是以下终浓度的各成分：二水合氯化铜0.0435mg/l、亚硒酸钠0.0035mg/l、六水氯化铝0.003865mg/l、硫酸锰0.0010285mg/l、偏钒酸铵0.0001365mg/l、氯化亚锡0.0002mg/l、氯化铷0.000035mg/l、二氯氧化锆0.02854mg/l、六水合氯化钴0.268255mg/l；无机盐是以下终浓度的各成分：氯化钾523.3mg/l、氯化钠754.1mg/l、无水硫酸镁68.3mg/l、七水合硫酸亚铁124.3mg/l、七水合硫酸锌12mg/l、无水氯化钙128.6mg/l、碳酸氢钠2200mg/l、柠檬酸铁铵1.5mg/l、磷酸氢二钠215mg/l；碳水化合物是以下终浓度的各成分：无水葡萄糖13000mg/l、丙酮酸钠盐600mg/l；其他分子化合物是以下终浓度的各成分：亚油酸钠0.432mg/l、腐胺二盐酸10.1mg/l、乙醇胺盐酸盐7.613795mg/l、硫酸葡聚糖钠盐28.125mg/l、泊洛沙姆1881100mg/l、丙酸钠1.5mg/l、盐酸甜菜碱100mg/l。
20.实施例4：由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成，其中，氨基酸是以下终浓度的各成分：l-丙氨酸12.8mg/l、盐酸l-精氨酸357.8mg/l、l-天冬酰胺一水合物412.9mg/l、l-天门冬氨酸102.4mg/l、l-谷氨酸298.8mg/l、l-甘氨酸56.4mg/l、盐酸l-组氨酸一水合物200.6mg/l、l-异亮氨酸319.6mg/l、l-亮氨酸389.5mg/l、盐酸l-赖氨酸514.9mg/l、l-甲硫氨酸112.9mg/l、l-苯丙氨酸108.8mg/l、l-脯氨酸315.6mg/l、l-丝氨酸402.5mg/l、l-苏氨酸290.8mg/l、l-色氨酸82.9mg/l、l-酪氨酸334.3mg/l、l-缬氨酸328.6mg/l、盐酸l-半胱氨酸一水合物101.4mg/l；维生素是以下终浓度的各成分：氯化胆碱91.05mg/l、叶酸66.7mg/l、肌醇119mg/
l、烟酰胺10.7mg/l、泛酸钙8.6mg/l、核黄素0.7975mg/l、盐酸吡哆醇3.225mg/l、盐酸硫胺素7.925mg/l、生物素1.265mg/l、维生素b127.55mg/l抗坏血酸磷酸酯镁倍半镁盐水合物6.5mg/l、对氨基苯甲酸3.5mg/l；微量元素是以下终浓度的各成分：二水合氯化铜0.0435mg/l、亚硒酸钠0.0035mg/l、六水氯化铝0.003865mg/l、硫酸锰0.0010285mg/l、偏钒酸铵0.0001365mg/l、氯化亚锡0.0002mg/l、氯化铷0.000035mg/l、二氯氧化锆0.02854mg/l、六水合氯化钴0.268255mg/l；无机盐是以下终浓度的各成分：氯化钾771.5mg/l、氯化钠862.3mg/l、无水硫酸镁68.3mg/l、七水合硫酸亚铁124.3mg/l、七水合硫酸锌12mg/l、无水氯化钙64.3mg/l、碳酸氢钠2200mg/l、柠檬酸铁铵1.5mg/l、磷酸氢二钠215mg/l；碳水化合物是以下终浓度的各成分：无水葡萄糖12000mg/l、丙酮酸钠盐500mg/l；其他分子化合物是以下终浓度的各成分：亚油酸钠0.432mg/l、腐胺二盐酸5.05mg/l、乙醇胺盐酸盐7.613795mg/l、硫酸葡聚糖钠盐28.125mg/l、泊洛沙姆1881100mg/l、丙酸钠1.5mg/l、盐酸甜菜碱100mg/l。
21.二、细胞培养和检测：2.1种子细胞培养方法：将cho-k1和cho-s细胞以0.6
×
106细胞/ml的密度接种至含30ml各实施例培养基的125ml三角摇瓶中，将三角摇瓶置于37℃摇床中培养，转速120rpm；当细胞密度约4.8
×
106细胞/ml时，以0.6
×
106细胞/ml的密度接种传代，直至细胞传代3次以上。
22.2.2摇管体系细胞灌流培养方法：将cho-k1和cho-s细胞以10
×
106细胞/ml的密度接种至含10ml各实施例培养基的50ml摇管中，将摇管置于37℃摇床中培养，转速320rpm，振幅50mm，湿度80%，co2含量5%；稳态密度建立在40
×
106细胞/ml，达到稳态后每天依据活细胞密度丢弃多余的细胞，再以离心弃上清后用新鲜培养基重悬的方式灌注新鲜培养基，依据残糖浓度添加30%葡萄糖母液使葡萄糖不受限制。
23.2.3反应器体系细胞灌流培养方法：将cho-k1和cho-s细胞以10
×
106细胞/ml的密度接种至含1000ml各实施例培养基的3l反应器中，反应器转速250~400rpm，ph为7.0，do为40，温度37℃；稳态密度分别建立在40
×
106细胞/ml，60
×
106细胞/ml，80
×
106细胞/ml，120
×
106细胞/ml，达到稳态后每天依据活细胞密度调整丢弃多余的细胞，依据残糖浓度添加30%葡萄糖母液使葡萄糖不受限制。
24.2.4活细胞密度检测和生化分析方法：使用countstar细胞计数仪进行活细胞密度和细胞活率等检测，使用nova生化分析仪检测乳酸、葡萄糖、nh4+、谷氨酸、na+、k+等物质浓度。
25.三、结果和分析：3.1根据方法2.1和2.2用各实施例培养基在摇管体系模拟灌流培养cho-s细胞，每隔24小时取样计数，各实验组细胞培养至第3天达到稳态活细胞密度，开始丢弃多余的细胞，培养液建立稳态40
×
106细胞/ml，实施例3培养至第12、实施例4培养至第10天无法达到稳态密度，随着培养进行，峰值密度降低，活率下降结束培养，实施例2培养至第16天峰值密度下降，活率较实施例1降低结束培养，实施例1在培养至实验结束（第21天）均维持正常的
增值，且活率维持较好（＞95%），明显优于其他实验组（如图1、2所示）。
26.3.2根据方法2.1和2.2用各实施例培养基在摇管体系模拟灌流培养cho-k1细胞，每隔24小时取样计数，各实验组细胞培养至第4天达到稳态活细胞密度，开始丢弃部分细胞，培养液建立稳态40
×
106细胞/ml，实施例2、3和4分别在培养至第13、20和19天无法达到稳态密度，随着培养进行，峰值密度降低活率下降，结束培养；实施例1在培养至实验结束（第24天）均维持正常的增值，且活率维持较好（＞95%），明显优于其他实验组（如图3、4所示）。
27.3.3根据方法2.1和2.3用各实施例培养基在3l反应器体系模拟灌流培养cho-k1细胞，每隔24小时取样计数，各实验组细胞培养至第4天达到密度峰值，开始丢弃部分细胞，培养液分别建立稳态（40、60、80、120）
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106细胞/ml，实施例2在第10天、实施例3在第12天无法建立稳态60
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106细胞/ml，且活率下降，结束培养；实施例4在培养至14天无法将稳态建立在80
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106细胞/ml，活率快速下降后结束培养；实施例1可以建立不同稳态（40、60、80、120）
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106细胞/ml，且活率维持较好（＞92%），明显优于其他实验组（如图5、6所示）。
28.四、结论上述实验结果表明：本发明公开的cho细胞无血清培养基，是完全化学成分确定的，不含有任何动物来源性成分的无血清配方，不仅能够满足cho-k1、cho-s等多种cho细胞高密度的悬浮培养，而且可以实现长时间连续性灌流培养；在培养条件控制更精准，传质效率更高的反应器培养体系下可以将稳态建立到120
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106细胞/ml的超高密度，可以达到更高的体积产率。
29.为了促进国内灌流培养基工艺的发展和应用，申请人开发了本发明的培养基，不含血清和蛋白质，所有组分化学成分确定，能够满足多种cho细胞的高密度悬浮培养，并且本发明的培养基不仅能够支持以摇管为灌流培养缩小模型的早期灌流培养工艺开发，同时也支持实验室型3l玻璃生物反应器为灌流培养缩小模型的灌流培养工艺开发。本发明的培养基为国内研发产品，可以从整体上降低生产成本，适用于大规模生产。本发明的培养基填补了国内化学成分确定的cho细胞灌流培养基的空白。
30.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
31.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种cho细胞无血清培养基，其特征在于，由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成；氨基酸是以下终浓度的各成分：l-丙氨酸12.8~306.9mg/l、盐酸l-精氨酸357.8~4152.8mg/l、l-天冬酰胺一水合物412.9~2976.4mg/l、l-天门冬氨酸102.4~1879.4mg/l、l-谷氨酸298.8~2852.1mg/l、l-甘氨酸56.4~492mg/l、盐酸l-组氨酸一水合物200.6~952.6mg/l、l-异亮氨酸319.6~2095.6mg/l、l-亮氨酸389.5~2159mg/l、盐酸l-赖氨酸514.9~3998.2mg/l、l-甲硫氨酸108.5~369.4mg/l、l-苯丙氨酸108.8~1025.9mg/l、l-脯氨酸315.6~1048.9mg/l、l-丝氨酸402.5~1498.5mg/l、l-苏氨酸290.8~1359.1mg/l、l-色氨酸82.9~520.6mg/l、l-酪氨酸334.3~1230.8mg/l、l-缬氨酸328.6~2069.1mg/l、盐酸l-半胱氨酸一水合物101.4~1128.4mg/l；维生素是以下终浓度的各成分：氯化胆碱91.05~182.1mg/l、叶酸66.7~133.4mg/l、肌醇119~238mg/l、烟酰胺10.7~21.4mg/l、泛酸钙8.6~17.2mg/l、核黄素0.7975~1.595mg/l、盐酸吡哆醇3.225~6.45mg/l、盐酸硫胺素7.925~15.85mg/l、生物素1.265~2.53mg/l、维生素b127.55~15.1mg/l、抗坏血酸磷酸酯镁倍半镁盐水合物6.5mg/l、对氨基苯甲酸3.5mg/l；微量元素是以下终浓度的各成分：二水合氯化铜0.0435mg/l、亚硒酸钠0.0035mg/l、六水氯化铝0.003865mg/l、硫酸锰0.0010285mg/l、偏钒酸铵0.0001365mg/l、氯化亚锡0.0002mg/l、氯化铷0.000035mg/l、二氯氧化锆0.02854mg/l、六水合氯化钴0.268255mg/l；无机盐是以下终浓度的各成分：氯化钾523.3~771.5mg/l、氯化钠125.7~862.3mg/l、无水硫酸镁46.5~68.3mg/l、七水合硫酸亚铁124.3mg/l、七水合硫酸锌12mg/l、无水氯化钙64.3~128.6mg/l、碳酸氢钠2200mg/l、柠檬酸铁铵1.5mg/l、磷酸氢二钠215mg/l；碳水化合物是以下终浓度的各成分：无水葡萄糖12000~13000mg/l、丙酮酸钠盐500~600mg/l；其他分子化合物是以下终浓度的各成分：亚油酸钠0.432mg/l、腐胺二盐酸5.05~10.1mg/l、乙醇胺盐酸盐7.613795mg/l、硫酸葡聚糖钠盐28.125mg/l、泊洛沙姆1881100mg/l、丙酸钠1.5mg/l、盐酸甜菜碱100mg/l。2.根据权利要求1所述的一种cho细胞无血清培养基，其特征在于，氨基酸是以下终浓度的各成分：l-丙氨酸142.3mg/l、盐酸l-精氨酸2463.9mg/l、l-天冬酰胺一水合物1521.5mg/l、l-天门冬氨酸945.5mg/l、l-谷氨酸1458.625mg/l、l-甘氨酸140.625mg/l、盐酸l-组氨酸一水合物439.8mg/l、l-异亮氨酸1137.225mg/l、l-亮氨酸1253.75mg/l、盐酸l-赖氨酸1786.875mg/l、l-甲硫氨酸289mg/l、l-苯丙氨酸585.3mg/l、l-脯氨酸683.375mg/l、l-丝氨酸949mg/l、l-苏氨酸793mg/l、l-色氨酸259.95mg/l、l-酪氨酸756.125mg/l、l-缬氨酸1120.8mg/l、盐酸l-半胱氨酸一水合物597.675mg/l；维生素是以下终浓度的各成分：氯化胆碱182.1mg/l、叶酸133.4mg/l、肌醇238mg/l、烟酰胺21.4mg/l、泛酸钙17.2mg/l、核黄素1.595mg/l、盐酸吡哆醇6.45mg/l、盐酸硫胺素15.85mg/l、生物素2.53mg/l、维生素b1215.1mg/l、抗坏血酸磷酸酯镁倍半镁盐水合物6.5mg/l、对氨基苯甲酸3.5mg/l；微量元素是以下终浓度的各成分：二水合氯化铜0.0435mg/l、亚硒酸钠0.0035mg/l、六水氯化铝0.003865mg/l、硫酸锰0.0010285mg/l、偏钒酸铵0.0001365mg/l、氯化亚锡
0.0002mg/l、氯化铷0.000035mg/l、二氯氧化锆0.02854mg/l、六水合氯化钴0.268255mg/l；无机盐是以下终浓度的各成分：氯化钾523.3mg/l、氯化钠436.9mg/l、无水硫酸镁68.3mg/l、七水合硫酸亚铁124.3mg/l、七水合硫酸锌12mg/l、无水氯化钙128.6mg/l、碳酸氢钠2200mg/l、柠檬酸铁铵1.5mg/l、磷酸氢二钠215mg/l；碳水化合物是以下终浓度的各成分：无水葡萄糖13000mg/l、丙酮酸钠盐600mg/l；其他分子化合物是以下终浓度的各成分：亚油酸钠0.432mg/l、腐胺二盐酸10.1mg/l、乙醇胺盐酸盐7.613795mg/l、硫酸葡聚糖钠盐28.125mg/l、泊洛沙姆188 1100mg/l、丙酸钠1.5mg/l、盐酸甜菜碱100mg/l。3.根据权利要求1所述的一种cho细胞无血清培养基，其特征在于，所述的cho细胞为cho-s或cho-k1中的任意一种。4.根据权利要求1~3中任一所述的一种cho细胞无血清培养基的应用，其特征在于，该cho细胞无血清培养基用于cho细胞的灌流培养。5.根据权利要求4所述的一种cho细胞无血清培养基的应用，其特征在于，所述灌流培养的设备为摇管或3l反应器中的任意一种。

技术总结
本发明公开了一种CHO细胞无血清培养基及其应用，该培养基由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成，该培养基无任何动物性来源成分、无蛋白、化学成分明确，能够满足多种CHO细胞的长时间高密度灌流培养需求，价格低廉，并且弥补了高性能国产灌流培养基的市场空白。为国内灌流培养工艺生产抗体药提供了高性能的培养基，促进国内以灌流培养方式生产抗体药的发展。灌流培养方式生产抗体药的发展。灌流培养方式生产抗体药的发展。


技术研发人员：徐亮亮 卢荣波 季晓刚 闫居锴 陈旭 陈刚
受保护的技术使用者：上海吉泰依科赛生物科技有限公司
技术研发日：2023.08.22
技术公布日：2023/9/23