一种南极磷虾主要过敏原的制备方法与流程

1.本发明属于过敏原蛋白提取技术领域，具体涉及到一种南极磷虾原肌球蛋白提取、纯化及制备方法。


背景技术：

2.南极磷虾属于磷虾目磷虾科磷虾属，是生活在南冰洋的一种类虾的海洋甲壳类动物。南极磷虾具有丰富的生物资源和较高的营养价值，是未来优质动物蛋白的主要来源。由于南极磷虾被广泛用作食品原料，其潜在的致敏性（过敏原蛋白引发）和其他食品安全问题受到了特别关注。
3.原肌球蛋白已经被证实是甲壳类水产品的主要过敏原，是一个分子量为34-38 kda的热稳定性蛋白，其蛋白质的氨基酸序列高度保守，在许多无脊椎动物中被认为是一种交叉反应的过敏原。基于此免疫交叉反应，研究人员利用甲壳类动物过敏患者的血清结合免疫印迹方法证实了原肌球蛋白是南极磷虾的主要过敏原。在研究过敏原的致敏特性、生物体内的化学变化、多种抗体的制备及过敏原检测时，往往需要纯度更高的过敏原。获得纯化、单一过敏原组分在研究加工方式对过敏原活性的影响、开发低致敏性海产品的食品加工技术中具有重要的意义。
4.甲壳类水产品中主要过敏原的制备方法主要包括传统的分离纯化方法，如盐溶液提取、盐析和层析柱纯化；另外，使用基因克隆及重组蛋白表达手段得到重组过敏蛋白，也是过敏原制备的一种方法。利用基因工程技术得到的重组过敏蛋白的结构特征及致敏性，在一定程度上并不能与天然过敏原相比较，其构建的动物致敏模型也并不能完全模拟实际情况下的食物过敏，也就无法准确地探索其致敏机理。鉴于此，仍然需要大量天然提纯且具有高纯度及具有生物活性的过敏蛋白。传统的分离纯化方法制备过敏原，针对不同的甲壳类水产品，其提取和纯化制备方法也有较大的区别。目前，关于极地海洋生物过敏原的研究较少，关于极地甲壳类水产动物过敏原的研究则更少，随着我国极地海洋权益的增加和极地渔业的发展，亟需开展这方面的研究。因此，针对南极磷虾主要过敏原，我们对其制备技术进行了研究。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题：提供一种南极磷虾主要过敏原的制备方法，所制备的过敏原纯度较高，且与虾/蟹过敏患者的血清具有很高的ige结合反应性。本发明提供的主要过敏原制备及方法可以供后续磷虾过敏原致敏性及致敏机理研究提供样本及基础信息，也为后续研究加工方式对过敏原活性的影响、开发低致敏性海产品的食品加工技术具有重要的意义。
6.为了实现上述目的，本发明提出了如下技术方案：一种南极磷虾主要过敏原的制备方法，包括，对tris-nacl缓冲液提取的南极磷虾肌原纤维蛋白溶液依次进行加热煮沸、等电点沉淀；对沉淀后的蛋白进行硫酸铵分级盐析，sds-page分析确定最佳盐析条件；对最
佳盐析条件下获得的沉淀物进行缓冲盐透析，然后将透析液上样于阴离子交换柱进行洗脱分离；对洗脱液进行透析、冻干，得到南极磷虾主要过敏原；sds-page分析主要过敏原的蛋白成分及纯度；对主要过敏原的血清ige反应性进行考察；对过敏原的一级结构进行鉴定，最终确定了制备的主要过敏原为南极磷虾原肌球蛋白（tm）。
[0007] 优选的，所述南极磷虾肌肉组织与tris-hcl缓冲液的料液比为1:5～1:8（w/v），于冰浴下均质机均质2～3 min。
[0008] 优选的，所述均质并离心后的沉淀重新悬浮于8～10倍体积的1
×
pbs缓冲液中，并于4
ꢀ°
c、离心力10000～12000 r/min下离心20～25 min，重复这一步骤2～4次。
[0009] 优选的，所述pbs缓冲液清洗后的沉淀复溶于含0.1～0.2 m nacl的tris-hcl（50～100 mm，ph 7.5）中，使用均质机于冰浴下低速搅拌10～40 s，并置于4
ꢀ°
c中过夜浸提；次日，于4
ꢀ°
c、离心力12000～14000 r/min下离心20～25 min，离心后得到的沉淀重复此提取步骤2～3次；最后合并几次提取得到的过敏原粗提物。
[0010] 优选的，所述对提取的过敏原粗提物进行热处理，即将粗提物于100
ꢀ°
c下煮沸10～20 min，冷却后离心取上清液。
[0011] 优选的，所述对煮沸后得到的粗提物上清液进行等电点沉淀，调节溶液的ph值至4.4～4.6，4
ꢀ°
c下静置1～2 h；离心后得到的沉淀复溶于20 mm、ph 7.5的tris-hcl缓冲液中，并调节溶液的ph至7.5。
[0012]
优选的，所述等电点沉淀后所得蛋白溶液的浓度，采用bca蛋白质定量检测试剂盒进行测定。
[0013] 优选的，所述对煮沸、等电点沉淀后所得蛋白溶液进行硫酸铵分级盐析，最终，最佳盐析条件为：蛋白溶液浓度为1～3 mg/ml；向1倍体积的蛋白溶液中逐滴加入4倍体积60%饱和度的硫酸铵溶液（ph，7.4～7.6），充分混匀后，冰浴放置30～60 min；再次加入2倍体积此蛋白溶液，混匀后继续冰浴放置30～60 min；然后加入1倍体积饱和硫酸铵溶液（ph，7.4～7.6），混匀后继续冰浴放置30～60 min；再加入1倍体积饱和硫酸铵溶液，充分混匀后，置于4
ꢀ°
c下过夜静置；次日，离心分离上清和沉淀。
[0014]
优选的，所述对硫酸铵分级盐析得到的沉淀进行sds-page分析，以根据目标蛋白的电泳条带得出硫酸铵盐析的最佳条件。
[0015] 优选的，所述阴离子交换柱分离主要过敏原，层析填料为二乙胺基乙基键合琼脂糖凝胶；填料装柱长度40～50 cm，内径3～4 cm，柱流速1～2 ml/min；蛋白洗脱梯度：含0.2～0.25 m nacl、0.4～0.45 m nacl、0.8～1m nacl的tris-hcl（20 mm，ph7.5）洗脱溶液。
[0016]
优选的，所述对阴离子交换柱分离后的洗脱液进行蛋白含量测定，采用考马斯亮蓝g-250染色法测定蛋白质含量。
[0017]
优选的，所述对阴离子交换柱分离后的蛋白洗脱液进行透析除盐、真空冷冻干燥，得到南极磷虾主要过敏原。
[0018]
本发明还提供了上述制备方法得到的南极磷虾主要过敏原，其中，所述南极磷虾主要过敏原与虾/蟹过敏患者血清具有很强的ige反应性，说明所制备的过敏原具有免疫反应性。
[0019]
本发明还提供了上述制备方法得到的南极磷虾主要过敏原，其中，对制备的南极磷虾主要过敏原进行一级结构鉴定，鉴定结果表明此主要过敏原为南极磷虾原肌球蛋白
（tropomyosin，tm）。
[0020]
具体的：所述的对过敏原的血清ige反应性，即对制备的南极磷虾主要过敏原进行血清ige反应性检测，即采用蛋白斑点免疫印迹法验证过敏原的ige结合能力，所述方法主要步骤包括，取nc膜，在超纯水中浸泡10～15 min后，取出并放置至膜半干；制备的过敏原溶于cbs溶液后点样于nc膜，过敏原的点样量2～5mg/点，点样体积1～5 ml/点，点样后的nc膜室温静置晾干10～15 min；随后将膜浸泡于5%的脱脂奶粉中封闭1～2 h；封闭后用1
×
tbst洗膜3～5次，每次3～5min；加入用1
×
tbst稀释的虾/蟹过敏患者血清（稀释比例1:4～1:6，v/v），于4
°
c下孵育过夜；一抗孵育结束后，洗膜，加入用1
×
tbst稀释的hrp标记的羊抗人ige（稀释比例1:4000～1:8000，v/v），摇床上室温孵育1～1.5 h；二抗孵育结束后，洗膜，将膜置于ecl发光试剂中反应1～2min后显色，用凝胶成像仪拍照，曝光时间10～50 s。
[0021]
所述对制备的南极磷虾主要过敏原的一级结构进行鉴定，其鉴定步骤包括，200～500 μg冻干的过敏原粉末溶解于50 mm nh4hco3中，经过还原（100～500 mm dtt，50～60
ꢀ°
c下还原30～60 min）和烷基化（100～500 mmiaa于室温下避光烷基化反应15～30 min）处理后，加入trypsin（1:40～1:50，w/w），于37
ꢀ°
c下酶解15～20 h；酶解产物脱盐后冻干，复溶于0.1%～0.15%甲酸水溶液中。液相色谱-串联质谱分析条件：流动相分别为0.1%～0.15%甲酸水溶液（a液）和0.1%～0.15%甲酸的乙腈水溶液（乙腈体积比80%，b液）；色谱柱以95%的a液平衡后，样品上样至分析柱acclaim pepmap rslc，c18（75 μm
×
25 cm，2 μm）；30 min内5%到35～40%流动相b；质谱离子源为纳升喷雾nano flex离子源；喷雾电压1.7～2.2 kv；离子传输管加热温度265～280
ꢀ°
c；质谱扫描方式为dda，一级质谱扫描范围m/z 300-2000，分辨率70000；多肽及其二级碎片的质荷比按照每次全扫描后采集20～25个碎片图谱；hcd设置为28～35 ev；质谱测试原始文件用mascot 2.2软件检索相应的数据库，最后得到鉴定的蛋白质结果，搜库参数为：酶，trypsin；数据库，ncbi和uniprot下载的euphausia superba蛋白数据库；固定修饰，carbamidomethyl（c）；可变修饰，oxidation（m）；最大漏切位点，2；肽一级质谱质量容差，10～20 ppm；二级碎片质量容差，0.05～0.1 da。
[0022]
本发明所具有的有益效果：本发明以南极磷虾肌肉组织为原料，采用tris-nacl缓冲液、加热煮沸、等电点沉淀、硫酸铵分级盐析、阴离子交换柱分离、透析、冻干等技术，制备得到南极磷虾主要过敏原，其中煮沸后再提取纯化过敏原更能真实地反映人们对虾蟹等甲壳类水产品的食用烹饪方法。本发明制备工艺操作简单，所制备的过敏原纯度较高，耐受高温处理，与虾/蟹过敏患者血清具有很强的ige反应性。
[0023]
南极磷虾因其优良的营养价值和较高的经济价值，已经成为我国重要的远洋捕捞对象，其潜在的食品安全问题有可能会对我国远洋渔业，特别是对南极磷虾捕捞和加工产生巨大的影响。如何防控南极磷虾可能引发的食物过敏问题已经成为一项迫切而紧急的工作。因此本发明以南极磷虾为研究对象，分离纯化制备其主要过敏原，并对过敏原的致敏性进行考察、一级结构进行鉴定，这对于阐明南极磷虾潜在致敏问题的预警和防控具有现实意义。
[0024]
在研究过敏原的致敏特性，生物体内的化学变化，致敏反应机理，致敏性消减技术，以及多种抗体的制备、免疫技术检测食品中的过敏原时，往往需要纯度更高的过敏原，
因此如何制备高纯度的过敏原成为研究食物过敏的一个重要课题。与现有的过敏原提取纯化技术相比，本发明采用温和的蛋白提取缓冲液、高温加热煮沸、等电点沉淀、特定饱和度的硫酸铵分级盐析及特定摩尔浓度的nacl洗脱液对南极磷虾主要过敏原进行了有效地分离和纯化，去除了南极磷虾中含量最丰富的精氨酸激酶（蛋白）的干扰，得到了纯度较高且保持过敏原活性的南极鳞虾主要过敏原tm。本发明提供的主要过敏原制备及其方法可以供后续磷虾过敏原致敏性及致敏机制研究提供样本及基础信息，也为后续研究加工方式对过敏原活性的影响、开发低致敏性海产品的食品加工技术具有重要的意义。
附图说明
[0025]
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0026]
图1为实施例1～5中tris-hcl-nacl缓冲液提取南极磷虾过敏原的sds-page图；泳道1到5的tris-nacl浓度分别为：1，0.1 m tris，0.5 m nacl；2，0.1 m tris，0.1 m nacl；3，0.1 m tris，0.05 m nacl；4，0.05 m tris，0.1 m nacl；5，0.05 m tris，0.05 m nacl；图2为实施例1和实施例8中硫酸铵分级盐析南极磷虾过敏原后得到的沉淀的sds-page图；m，蛋白预染marker；硫酸铵饱和度20～80%；mf，硫酸铵盐析前的肌原纤维蛋白；图3为实施例1中阴离子交换柱分离南极磷虾主要过敏原；峰i，未知；峰ii，南极磷虾原肌球蛋白（tm）；图4为分离纯化后南极磷虾主要过敏原的sds-page图；m，蛋白预染marker；1，硫酸铵盐析前的肌原纤维蛋白（mf）；2，60%饱和度硫酸铵盐析mf后得到的沉淀；3，阴离子交换柱分离盐析后的mf沉淀得到的洗脱峰ii（见图3）；图5为实施例1中斑点免疫印迹法（dot blotting）检测制备的南极磷虾主要过敏原（tm）的血清ige反应性；虾/蟹过敏患者的血清编号：1，pl21224；2，pl27140；3，pl25723；4，pl24819；5，混合阳性血清；6，混合阴性血清。tm，南极磷虾原肌球蛋白；bsa，牛血清白蛋白；图6为实施例1中制备的南极磷虾主要过敏原（tm）的一级结构鉴定结果；鉴定结果表明此过敏原为南极磷虾原肌球蛋白（a7vke0_eupsu tropomyosin）。
实施方式
[0027]
为了使本发明的目的、特征和功能以及用于实现这些目的、特征和功能的方法得以阐明，下面将结合具体参考示范性实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1
[0028]
南极磷虾主要过敏原粗提物的提取取去壳后的南极磷虾肌肉组织100 g，按照料液比为1:5（w/v）加入预冷的tris-hcl缓冲液（0.1 m，ph 8.0），用均质搅拌器于冰浴下均质2 min；均质后于4
ꢀ°
c、10000rpm下离心 20 min，离心后得到的沉淀复溶于8倍体积的1
×
pbs溶液中，然后于4
ꢀ°
c、12000rpm下离心20 min，重复这一步骤2次后，得到的沉淀溶于100 ml含0.1 m nacl的tris-hcl（50 mm，ph 7.5）中，并用均质机于冰浴下低速搅拌20 s，置于4
ꢀ°
c中过夜浸提；次日，离心后得
到的上清液即为南极磷虾过敏原粗提物。上述离心后得到的沉淀再次复溶于100 ml含0.1 m nacl的tris-hcl（50 mm，ph 7.5）中，重复上述提取步骤两次；最后合并三次提取得到的过敏原粗提物。
[0029]
南极磷虾主要过敏原粗提物的热处理将粗提物于100
ꢀ°
c下煮沸20 min，冷却后于4
ꢀ°
c、12000rpm下离心25 min，取上清液。
[0030]
南极磷虾主要过敏原粗提物的等电点沉淀向加热煮沸后的粗提物上清液中加入1 m盐酸调节溶液的ph值至4.5，4
ꢀ°
c下静置2 h，然后于4
ꢀ°
c、10000rpm下离心20 min，离心后得到的沉淀溶于30 ml的tris-hcl（20 mm，ph 7.5）中，并用1 m氢氧化钠调节溶液的ph值至7.5。
[0031]
过敏原粗提物等电点沉淀后蛋白浓度的测定使用bca蛋白质定量检测试剂盒测定蛋白浓度。
[0032]
硫酸铵分级盐析纯化过敏原粗提物配制饱和度分别为60%和100%的硫酸铵溶液，用氨水调节各溶液的ph值至7.5。取10 ml上述蛋白溶液（调整蛋白溶液浓度为1mg/ml），逐滴加入40 ml60%饱和度的硫酸铵溶液，充分混匀后，冰浴放置30 min；再次加入20 ml此蛋白溶液，混匀后继续冰浴放置30 min；随后加入10 ml饱和硫酸铵溶液，混匀后再次加入10 ml饱和硫酸铵溶液，充分混匀后，置于4
ꢀ°
c下过夜静置；次日，于4
ꢀ°
c、12000rpm下离心30 min，分离上清和沉淀，取部分沉淀复溶于20μl的1
×
pbs，待做sds-page分析，用于验证硫酸铵分级盐析对过敏原粗提物的纯化效果。
[0033] sds-page分析硫酸铵分级盐析后的过敏原粗提物sds-page分析电泳条件：12%的分离胶，5%的浓缩胶，过敏原粗提物和4
×
sds蛋白上样缓冲液按照体积比3:1混匀后，加热煮沸7 min，上样体积2μl，电泳电压为浓缩胶80 v，分离胶120 v，运行时间80 min；染色液，考马斯亮蓝r250染色液，染色3 h；脱色液，水:乙醇:乙酸（800:100:100，v/v/v）混合，脱色5 h。电泳结果见图2。
[0034]
阴离子交换柱分离纯化主要过敏原柱分离前蛋白溶液的预处理：硫酸铵分级盐析后得到的蛋白沉淀复溶于50 ml的20 mm tris-hcl缓冲液（ph7.5）中，用该缓冲液于4
°
c下透析（透析袋分子截留量8000～14000 da）除盐48 h。透析液过0.45 μm的亲水ptfe滤膜，待过层析柱。
[0035] 阴离子交换柱分离纯化主要过敏原条件：层析填料为二乙胺基乙基键合琼脂糖凝胶；填料装柱长度45 cm，内径3.5 cm，柱流速1.2 ml/min；柱子经20 mm tris-hcl缓冲液平衡后，加入透析后的蛋白溶液，待样品流过柱子且冲洗柱子一段时间后，依次采用含0.25 m nacl的tris-hcl（20 mm，ph7.5）、含0.4 m nacl的tris-hcl（20 mm，ph7.5）和含1m nacl的tris-hcl（20 mm，ph7.5）进行洗脱，使用自动收集器收集洗脱液（6 ml/管）。
[0036]
柱分离后洗脱液中蛋白含量的检测采用考马斯亮蓝g-250染色法测定洗脱液中蛋白质含量，主要步骤：按照洗脱液和考马斯亮蓝g-250染色液体积比为1:5的比例加入到试管中，摇匀后放置20 min，比色测定吸光值a595nm，记录每管洗脱液的吸光值，以洗脱管数为横坐标，od
595nm
值和nacl摩尔浓度为纵坐标，绘制洗脱曲线，结果见图3。图3显示，经过阴离子交换柱nacl溶液梯度洗脱后，在
0.4 m nacl洗脱处，得到两个蛋白洗脱峰，其中峰i是较小的杂峰，峰ii是分离后得到的主要过敏原。
[0037] 对离子交换柱分离后的蛋白洗脱液进行透析除盐（4
°
c下用超纯水透析48 h，透析袋分子截留量8000～14000 da）、真空冷冻干燥，得到南极磷虾主要过敏原。
[0038] 对冻干后的南极磷虾主要过敏原进行sds-page分析，以验证离子交换柱对主要过敏原的分离纯化效果。电泳结果见图4。图4中泳道3显示，经阴离子交换柱分离后，得到一个目的蛋白条带（过敏原）。
[0039]
南极磷虾主要过敏原的血清ige反应性采用蛋白斑点免疫印迹法（dot blotting）验证南极磷虾主要过敏原的血清ige反应性。方法主要步骤：裁剪适当大小的nc膜（0.45 mm孔径），在超纯水中浸泡15 min后，取出并放置一定时间至膜半干；制备的过敏原溶于ph 9.6的碳酸盐缓冲液，配制过敏原溶液浓度为2 mg/ml，同时以bsa作为阴性对照，点样于nc膜，点样量为5 mg/点，点样体积2.5 ml/点，点样后的nc膜室温静置晾干10 min；随后将膜浸泡于5%的脱脂奶粉中封闭2 h；封闭后用1
×
tbst洗膜5次，每次5min；加入用1
×
tbst稀释的虾/蟹过敏患者血清（稀释比例1:6，v/v），于4
°
c下孵育过夜；一抗孵育结束后，洗膜，加入用1
×
tbst稀释的hrp标记的羊抗人ige（稀释比例1:6000，v/v），摇床上室温孵育1 h；二抗孵育结束后，洗膜，将膜置于ecl发光试剂中反应2min后显色，用凝胶成像仪拍照，曝光时间40 s。过敏原斑点免疫印迹结果见图5。图5显示，经分离纯化后制备的过敏原与虾/蟹过敏患者血清均具有很强的ige结合反应性，与非过敏健康者血清无明显的血清反应性，证明所制备的南极磷虾主要过敏原具有强烈的免疫反应性。
[0040]
南极磷虾主要过敏原的一级结构鉴定采用液相色谱-串联质谱法对制备的南极磷虾主要过敏原进行一级结构鉴定，鉴定步骤主要如下：取200 μg的过敏原冻干粉末溶于50 mm nh4hco3，混匀后加入10 μl 500 mm dtt于56
ꢀ°
c下还原30 min；然后加入30 μl 500 mm iaa于室温下避光烷基化反应30 min；反应结束后，向溶液中加入trypsin（1:50，w/w），于37
ꢀ°
c下酶解15 h；酶解产物脱盐后冻干，复溶于0.1%甲酸水溶液中。液相色谱-串联质谱分析条件：流动相分别为0.1%甲酸水溶液（a液）和0.1%甲酸的乙腈水溶液（含80%乙腈，b液）；色谱柱以95%的a液平衡后，样品上样至分析柱acclaim pepmap rslc，c18（75 μm
×
25 cm，2 μm）；洗脱梯度，30 min内5-40%流动相b。质谱离子源为纳升喷雾nano flex离子源；喷雾电压2 kv；离子传输管加热温度270
ꢀ°
c；质谱扫描方式为dda，一级质谱扫描范围m/z 300-2000，分辨率70000；多肽及其二级碎片的质荷比按照每次全扫描后采集20个碎片图谱；hcd设置为30 ev；质谱测试原始文件用mascot 2.2软件检索相应的数据库，最后得到鉴定的蛋白质结果，搜库参数为：酶，trypsin；数据库，ncbi和uniprot下载的euphausia superba蛋白数据库；固定修饰，carbamidomethyl（c）；可变修饰，oxidation（m）；酶最大漏切位点，2；肽一级质谱质量容差，20 ppm；二级碎片质量容差，0.1 da。过敏原的一级结构鉴定结果见图6。图6显示，制备的南极磷虾主要过敏原经lc-ms/ms鉴定后，其一级结构为南极磷虾原肌球蛋白（a7vke0_eupsu tropomyosin），所鉴定的肽段总数为389，其中特异性肽段有65条，蛋白中肽段覆盖率为94.01%。
实施例2
[0041] 除了将1
×
pbs溶解后得到的沉淀复溶于100 ml含0.5 m nacl的tris-hcl（100 mm，ph 7.5）中，其他步骤与实施例1相同。提取得到的过敏原粗提物的电泳图见图1（泳道1）。
实施例3
[0042] 除了将1
×
pbs溶解后得到的沉淀复溶于100 ml含0.1 m nacl的tris-hcl（100 mm，ph 7.5）中，其他步骤与实施例1相同。提取得到的过敏原粗提物的电泳图见图1（泳道2）。
实施例4
[0043]
除了将1
×
pbs溶解后得到的沉淀复溶于100 ml含0.05 m nacl的tris-hcl（100 mm，ph 7.5）中，其他步骤与实施例1相同。提取得到的过敏原粗提物的电泳图见图1（泳道3）。
实施例5
[0044]
除了将1
×
pbs溶解后得到的沉淀复溶于100 ml含0.05 m nacl的tris-hcl（50 mm，ph 7.5）中，其他步骤与实施例1相同。提取得到的过敏原粗提物的电泳图见图1（泳道5）。
[0045]
由图1可知，本发明实施例1和实施例3中提取的过敏原粗提物蛋白含量更丰富。
实施例6
[0046]
除了将1
×
pbs溶解离心后得到的沉淀再次复溶于100 ml含0.1 m nacl的tris-hcl（50 mm，ph 7.5）中，重复上述提取步骤一次，最后合并两次提取得到的过敏原粗提物外，其他步骤与实施例1相同。
[0047]
结果发现，重复提取三次后所得过敏原粗提物中目的蛋白含量更高。
实施例7
[0048]
除了将粗提物于100
ꢀ°
c下煮沸10 min外，其他步骤与实施例1相同。
[0049]
结果发现，100
ꢀ°
c下分别煮沸10 min和20 min，对过敏原粗提物中的目的蛋白无明显影响。
实施例8
[0050] 除了配制饱和度分别为50%和100%的硫酸铵溶液，用氨水调节各溶液的ph值至7.5。取10 ml上述蛋白溶液（调整蛋白溶液浓度为1mg/ml），逐滴加入40 ml 50%饱和度的硫酸铵溶液外，其他步骤与实施例1相同。硫酸铵沉淀后的电泳结果见图2。
[0051]
由图2可知，当蛋白溶液和硫酸铵溶液按照一定体积比混合，硫酸铵溶液饱和度分别为50%和60%时，对南极磷虾过敏原粗提物的盐析纯化效果基本一致，但是60%饱和度硫酸铵纯化后的粗提物，杂蛋白含量更低，目标蛋白富集更充分。
实施例9
[0052]
配制饱和度为60%的硫酸铵溶液，用氨水调节各溶液的ph值至7.5。取10 ml上述蛋白溶液（调整蛋白溶液浓度为1mg/ml），逐滴加入40 ml60%饱和度的硫酸铵溶液，充分混匀后，冰浴放置30 min；再次加入20 ml此蛋白溶液，充分混匀后，置于4
ꢀ°
c下过夜静置；次日，于4
ꢀ°
c、12000rpm下离心30 min，分离上清和沉淀，部分沉淀复溶于20μl的1
×
pbs，待做sds-page分析。其他步骤与实施例1相同。
[0053]
当用60%饱和度的硫酸铵溶液盐析过敏原粗提物，不再分级加入饱和硫酸铵溶液时，盐析得到的蛋白中，虽然目标蛋白得到富集，但是杂蛋白的比例也有所增加，不利于后续的进一步纯化。
实施例10
[0054] 柱分离前蛋白溶液的预处理：硫酸铵分级盐析后得到的蛋白沉淀复溶于超纯水中，于4
°
c下透析（透析袋分子截留量8000～14000 da）除盐48 h。透析后的蛋白真空冷冻干燥。取干燥后的蛋白粉末，溶于20 mm tris-hcl缓冲液（ph7.5）中，并过0.45 μm的亲水ptfe滤膜，待过层析柱。
[0055]
上述冻干后的蛋白粉末，在tris-hcl缓冲液中溶解不充分，造成蛋白一定的损失；并且对透析后的蛋白溶液（柱分离前）进行真空冷冻干燥，费时费力，不经济。
[0056]
由以上实施例可知，本发明提供的方法制备的南极磷虾过敏原纯度较高，耐受高温处理，与虾/蟹过敏患者血清具有很强的ige反应性；通过液相色谱质谱联用技术对其一级结构进行鉴定，确定了制备的过敏原为南极磷虾原肌球蛋白（tm）。
[0057]
以上所述仅是本发明的一部分优选实施例，并不是全部的实施例，对于本领域的普通技术人员来说，可以对本技术方案进行优化修改或同等替换，这些修改等不应该脱离本发明的技术原理，其均应该涵盖在本发明的权利要求范围中。

技术特征：
1.一种南极磷虾主要过敏原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将tris-nacl缓冲液提取的南极磷虾肌原纤维蛋白进行加热煮沸、等电点沉淀、硫酸铵分级盐析、阴离子交换柱分离、透析、冻干，得到南极磷虾主要过敏原，并对过敏原的血清ige反应性、一级结构进行鉴定，确定了制备的主要过敏原为南极磷虾原肌球蛋白。2.根据权利要求1所述的南极磷虾主要过敏原的制备方法，其特征在于：所述的南极磷虾肌原纤维蛋白的提取方法：将解冻后的南极磷虾肌肉组织与tris-hcl缓冲液按照料液比为1:5～1:8混合，在冰浴下使用均质机进行均质2～3 min，离心，弃去上清液；离心后的沉淀重新悬浮于8～10倍体积的1
×
pbs缓冲液中，离心，重复这一步骤2～4次后，得到的沉淀溶于含0.1～0.2 m nacl的tris-hcl中，随后用均质机于冰浴下低速搅拌10～40 s，并置于4
ꢀ°
c中过夜浸提；离心，得到的上清液即为南极磷虾过敏原粗提物-南极磷虾肌原纤维蛋白。3. 根据权利要求2所述的南极磷虾主要过敏原的制备方法，其特征在于：所述的将tris-nacl缓冲液提取的南极磷虾肌原纤维蛋白进行加热煮沸，即对提取的过敏原粗提物进行热处理：将粗提物煮沸10～20 min，冷却后离心取上清液。4. 根据权利要求1或3所述的南极磷虾主要过敏原的制备方法，其特征在于：所述的等电点沉淀即对煮沸后得到的粗提物上清液进行等电点沉淀：向煮沸后的上清液中加入盐酸，调节溶液的ph值至4.4～4.6，静置1～2 h，离心得到的沉淀复溶于tris-hcl缓冲液中，并用氢氧化钠调节溶液的ph值至7.5；测定酸沉后所得蛋白溶液的浓度。5. 根据权利要求4所述的南极磷虾主要过敏原的制备方法，其特征在于：对蛋白溶液进行硫酸铵分级盐析：配制饱和度分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和100%的硫酸铵溶液，用氨水调节各溶液的ph值至7.4～7.6，取上述蛋白溶液，逐滴加入4倍体积各饱和度的硫酸铵溶液，充分混匀后，冰浴放置30～60 min；再次加入2倍体积此蛋白溶液，混匀后继续冰浴放置30～60 min；随后加入1倍体积饱和硫酸铵溶液，混匀后继续冰浴放置30～60 min；再加入1倍体积饱和硫酸铵溶液，充分混匀后，过夜静置；次日，离心，沉淀复溶于1
×
pbs，待做sds-page分析，根据目标蛋白的电泳条带得出硫酸铵盐析的最佳条件。6. 根据权利要求5所述的南极磷虾主要过敏原的制备方法，其特征在于：所述sds-page分析，其电泳条件包括10～12%的分离胶，5%的浓缩胶，蛋白样品和4
×
sds蛋白上样缓冲液按照体积比3:1混匀后，加热煮沸5～10 min，上样体积2～5μl，电泳电压为浓缩胶80 v，分离胶120 v，运行时间60～80min；染色液，考马斯亮蓝r250染色液，染色2～4h；脱色液，脱色5～8 h。7. 根据权利要求1所述的南极磷虾主要过敏原的制备方法，其特征在于：所述阴离子交换柱分离，即阴离子交换柱分离主要过敏原：离子交换柱为deae-琼脂糖凝胶ff，将二乙胺基乙基键合在快流速琼脂糖凝胶上形成的一种弱阴离子交换介质；层析柱分离条件为，填料装柱长度40～50 cm，内径3～4 cm，柱流速1～2 ml/min；柱子经20 mm tris-hcl缓冲液平衡后，加入预处理的蛋白溶液，待样品流过柱子且冲洗柱子一段时间后，依次用含0.2～0.25m nacl、0.4～0.45m nacl和0.8～1m nacl的tris-hcl溶液进行洗脱，使用自动收集器收集洗脱液，随后对收集的洗脱液进行蛋白含量测定。8. 根据权利要求7所述的南极磷虾主要过敏原的制备方法，其特征在于：所述的预处理的蛋白溶液的预处理包括，硫酸铵分级盐析后得到的沉淀复溶于20 mm tris-hcl缓冲液
中，并用该缓冲液透析36～48 h；透析液过0.45 μm的亲水滤膜即得。9. 根据权利要求7所述的南极磷虾主要过敏原的制备方法，其特征在于：对阴离子交换柱分离后的洗脱液进行蛋白含量测定，采用考马斯亮蓝g-250染色法测定蛋白质含量，主要步骤包括，按照洗脱液和考马斯亮蓝g-250染色液1:5v/v的比例加入到离心管中，摇匀后放置20～30 min，比色测定吸光值a595nm，记录每管洗脱液的吸光值，以洗脱管数为横坐标，od
595nm
值和nacl摩尔浓度为纵坐标，绘制洗脱曲线。10.根据权利要求1所述的南极磷虾主要过敏原的制备方法，其特征在于：对阴离子交换柱分离后的蛋白洗脱液进行透析、真空冷冻干燥，得到南极磷虾主要过敏原；对冻干后的过敏原进行sds-page分析，以考察其纯度及蛋白成分。

技术总结
本发明提供了一种南极磷虾主要过敏原的制备方法，对去壳后的冷冻南极磷虾肌肉组织进行缓冲液浸提，将提取后的过敏原粗提物加热煮沸，并在特定的pH值下进行等电点沉淀，然后对沉淀进行硫酸铵分级盐析；采用SDS-PAGE分析盐析后的沉淀，得出过敏原粗提物的最佳盐析条件；使用阴离子交换柱对盐析后的过敏原进行分离，对分离后得到的过敏原洗脱物进行蛋白含量分析，从而得到不同的洗脱组分；将不同的洗脱组分进行透析、真空冷冻干燥，得到纯化的过敏原；电泳分析纯化后的过敏原，验证其纯度及蛋白组分。本发明提出的过敏原制备方法简单易操作，所制备的过敏原纯度较高；过敏原经高温处理后，仍然保持很高的免疫反应性。仍然保持很高的免疫反应性。仍然保持很高的免疫反应性。


技术研发人员：林娜 刘志东 迟海 马德蓉 倪玲
受保护的技术使用者：中国水产科学研究院东海水产研究所
技术研发日：2023.08.24
技术公布日：2023/9/23