包含冠状病毒刺突蛋白的受体结合结构域的嵌合蛋白以及包含其的组合物的制作方法

1.本发明涉及生物制药工业和生物医学，和特别地涉及疫苗领域。尤其是，本发明涉及针对冠状病毒(引起多种多样疾病的感染因子，其中包括冠状病毒2019(covid-19))的疫苗。本发明揭示了嵌合抗原的设计和获得以及包含其的疫苗组合物，其通过经由不同的施用途径来供给而生成强力的免疫应答。
现有技术
2.冠状病毒科(coronaviridae)的成员对于动物和人中的广泛的疾病负有责任。直至2003年还很少引人感兴趣，但是这种情况随着人兽互传的sars-cov(引起严重急性呼吸综合征的冠状病毒)和十年后mers-cov(引起中东呼吸综合征的冠状病毒)的出现而急剧发生了变化。这些冠状病毒已被确认为严重呼吸系统疾病的重要原因，并且引起了累计近10000个病例的两次疾病流行。最近，报道了一种新的冠状病毒，sars-cov-2，其引起后来被世界卫生组织宣布为大流行病的covid-19疾病的爆发。该大流行病已在全世界快速传播，其中直至2020年10月已确证了数百万的sars-cov-2阳性病例，和数十万人死亡。
3.已知在covid-19的恢复期病人中，大部分的针对sars-cov-2的中和抗体应答，以及相当部分的针对其的细胞应答，都是指向刺突蛋白(s)(cao y等人,2020may；brouwer pjm等人,science(80-)2020,369(6504):643-50)。因此，该蛋白是适合于将其包括在针对所述实体的疫苗制备物中的候选物，这不仅得到了以前的关于其他冠状病毒例如sars和mers的文献的支持(zhou y,jiang s,du l.expert rev vaccines.2018,17(8):677-86；wang n,shang j,jiang s,du l.front microbiol.2020,11；jiang s,he y,liu s.emerg infect dis.2005,11(7):1016-20)。
4.然而，以前的用其他致病冠状病毒的研究已显示在免疫扩增的病理学现象中牵涉s蛋白，无论在动物模型中还是在临床情境中(lambert p等人,vaccine.2020jun,38(31):4783-91)，因此在实验性疫苗中使用s蛋白不是没有风险。此外，s蛋白对于其在异源系统中的表达来说是巨大的挑战，如果希望在亚单位疫苗中使用它。它是一种具有相当大小(141kda)的分子，其活性形式为处于具有17至22个n-糖基化位点和可变数目的o-糖基化位点的预融合构象的三聚体(zhang y等人,biorxiv.2020；shajahan a,supekar nt,gleinich as,azadi p.glycobiology,2020,1-8)，其构象通过13个二硫桥来维持(kumar s,maurya vk,prasad ak,bhatt mlb,saxena sk.virus disease.2020；wrapp d等人,science(80-)2020feb 19,2011(2865))。事实上，不存在关于使用微生物系统(酵母、真菌或细菌)来异源表达以三聚体构象的刺突的报道。
5.s蛋白负责sars-cov-2与ace2(在人细胞中的其受体)的相互作用(wrapp d等人,science(80-).2020feb 19,2011(2865)；wang q等人,cell.2020,894-904)。该相互作用通过在所述蛋白质中的分开的结构结构域(称为rbd，即受体结合结构域)来产生，所述结构域大约从半胱氨酸336行至半胱氨酸525，具有大约25kd的分子量。虽然rbd相对于该蛋白质的
其余部分而言具有一定程度的可动性(处于两种位置，“打开的或向上的”和“关闭的或向下的”，这对于与受体的相互作用来说是重要的)(ke z等人,biorxiv 2020)，但是其结构通过具有复杂拓扑结构的4个二硫桥的存在而受到严格限制，并且其n-末端在天冬氨酰331和343处被n-糖基化(lan j等人,nature.2020,581(7807):215-20)。
6.许多针对rbd的抗体阻断其与ace2的相互作用，因此中和sars-cov-2；事实上，被大量针对s蛋白的中和抗体所识别的表位正是在rbd中(premkumar l等人,sci immunol.2020,5(48):1-15)。因此，rbd已被认为是有希望的疫苗候选物，不仅针对sars-cov-2而且也针对其他冠状病毒例如sars和mers(zhou y,jiang s,du l.expert rev vaccines 2018,17(8):677-86；wang n,shang j,jiang s,du l.s front microbiol.2020,11)。事实上，rbd是在biontech/pfizer的疫苗开发计划期间在临床上令人满意地得到评价的首个抗原(mulligan mj等人,medrxiv 2020jan 1)。根据以前的用sars-cov-1进行的研究，用rbd进行的免疫接种诱导免疫致病现象的概率是低的(jiang s,he y,liu s.emerg infect dis.2005,11(7):1016-20；jaume m等人,hong kong med j.2012,18(supp2):31-6)，并且已在从哺乳动物细胞(hek293、cho)到酵母例如巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)的各种各样的系统中成功地表达了该分子(arbeitman cr等人,biorxiv 2020jan 1)。最后，通过四个二硫桥来稳定化的rbd的相对刚性的结构赋予该抗原以高的热耐受性，这可以在其中有理由预期到冷链失败的情境中对基于所述分子的疫苗给予优势(malladi sk等人,biorxiv 2020jan 1)。
7.虽然在文献中最多研究的rbd变体是从精氨酸319行至苯丙氨酸541的变体，但是它在n-末端处留下一条链，所述链在s蛋白的天然结构的情景下实际上构成β-片层的一部分，并且在c-末端处留下一个游离的半胱氨酸，其可以潜在地与另一个rbd分子形成二聚体或者催化二硫桥的互换，从而影响所述分子的结构并且有助于分子间聚集体的形成(rabdano so等人,sci rep 2017,7(1):1-20)。此外，扩大的变体，例如包括氨基酸319-541和其他相关变化(氨基酸318-510，氨基酸319-591)的变体具有比更短的rbd变体(例如，分别包括氨基酸331-528和331-532的那些)潜在地更不耐热并且对于蛋白酶的作用更敏感的缺点，这是由于它们向该蛋白质的末端所提供的额外的柔韧性(karshikoff a,nilsson l,ladenstein r.febs j.2015,282(20):3899-917)。
8.s蛋白的rbd通过介导病毒与细胞受体ace2的相互作用而在病毒复制循环中发挥必不可少的作用。rbd还是强有力的中和抗体的靶标，因此被认为是用于开发亚单位疫苗候选物的基础，其中的几个已处在临床试验中。
9.rbd是大约200个氨基酸的结构域，其折叠的特征在于：a)存在有在其两侧包装在小的环和螺旋区段上的具有五条链的中心反平行β片层，b)在与受体的相互作用中所牵涉的突出的β发夹环，c)具有三条链的外周的混合型小β片层，d)两个糖基化位点，和e)四个二硫桥。
10.所述结构域位于s蛋白的顶部位置(突出的上面部分)中，显示出“呼吸”的动态行为，这导致s蛋白的不同构象的交替。在一个称为“全向下”的构象中，所述三个rbd结构域显示出c3(假)对称，其中所述结构域与s三聚体的相邻链的相应的rbd结构域进行蛋白质-蛋白质和蛋白质-聚糖接触。在该构象中，蛋白质表面残基的接近是最小的，该表面的很大一部分被掩蔽在与其他蛋白质的相互作用中，大部分被聚糖球形屏蔽。处于这种构象的s蛋白
不能够与受体ace2相互作用，与ace2的接触表面是不可接近的并且因此是无活性的。备选地，刺突的一个、两个或三个rbd可以处于“向上”抬起构象，其分别命名为“一个向上”、“两个向上”和“三个向上”。构象变化主要在于在位于残基lys529附近的柔性区域周围的铰链型运动，并且牵涉rbd相对于s蛋白的其余部分而言的方向变化、rbd与相邻结构域(亚结构域1，sd1)的分开以及在rbd和sd1的残基之间与亚基s2的接触的丧失。
11.采取“向上”类型构象的rbd暴露了与受体相互作用的表面，因此这是相关于进入细胞的过程的起始而言在生物学上有活性的构象。通过冷冻电镜术的研究已显示，s蛋白以某个比例采取所描述的类型的构象：“全向下”、“一个向上”、“两个向上”和“全向上”。rbd的该呼吸现象允许病毒“节省”可得的受体结合位点的数量/刺突(s三聚体)，并且以这种方式使诱导阻断与受体结合的强有力的中和抗体的可能性最小化。这种保护rbd结构域的ace2结合位点的策略是可行的，这首先是由于10nm的该相互作用的高亲和力。另一方面，ace2的二聚体结构具有这样的独特性，即在该链中的rbd结合位点与其对应物相隔大约10nm(与在sars-cov-2病毒粒子表面上的相邻刺突之间存在的距离相当)。因此，在sars-cov-2病毒的结合过程期间受体ace2的完全占据仅需要在两个相邻的s三聚体中的以“向上”构象的rbd，从而导致具有非常高的表观亲和力的二价相互作用。
12.s蛋白和rbd的结构-功能关系的表征在疫苗候选物(尤其是基于重组rbd蛋白的亚单位疫苗候选物)的设计中具有重要意义。这些候选物应当能够诱导强力的抗体应答(高免疫原性)。同时，应答的质量具有很大的重要性；所生成的抗体应当具有高亲和力，能够与rbd-ace2相互作用竞争，甚至在上面所描述的二价相互作用的情况下。
13.s蛋白的三聚体构象(其包括亚基s1和s2)实际上是该蛋白质的亚稳态的预融合构象：在与受体ace2相结合的过程之后，这介导结构去稳定化、蛋白质剥离或亚基s1丧失(这是其中牵涉由弗林蛋白酶和蛋白酶tmprss2进行的s1/s2和s2*蛋白水解切割的过程，其导致采取融合结构)、融合肽暴露和膜融合过程。因此，rbd-ace2相互作用的抑制阻断病毒复制循环的所有后来的过程，并且构成基于rbd的针对冠状病毒的疫苗策略的基本机制基础。
14.在专业文献中存在有一些保证通过鼻内途径的免疫接种对于预防sars-cov-2感染的适切性的要素。例如，已知在具有covid-19的有症状和无症状的患者中，鼻拭子生成了比咽拭子更高的病毒载量，这证明鼻上皮是初始感染和传播的门户(zhou p等人,nature.2020mar,579(7798):270-3)。此外，在特定的呼吸道、角膜和肠上皮细胞中检测到与sars-cov-2的病毒进入相关联的基因。在鼻上皮细胞中，这些基因与在先天免疫中所牵涉的基因共表达，这强调了这些细胞在初始病毒感染、其繁殖和其消除中的潜在作用。这些发现也暗示，鼻上皮细胞是对于个体内和个体间传播的可能储库(sungnak w等人,nature medicine.2020may,26(5):681-7)。
15.现有数据暗示，在病毒复制循环的初始阶段期间，ace2可能是对于sars-cov-2病毒进入的一个限制因素。尽管通常是低的表达水平，但是ace2通过呼吸道在多种类型的上皮细胞中以及在ii型肺泡上皮细胞中以与以前的研究相一致的方式进行表达。特别地，鼻上皮细胞在呼吸系统中的所有所调查的细胞之中显示出最高的表达(sungnak w等人,nature medicine.2020may,26(5):681-7)。在鼻样品中相对高的ace2表达和平行的来自鼻表面的上皮培养物的高感染性暗示，鼻腔对于sars-cov-2的早期感染来说是一个盛产位点。可能的是，鼻感染由表面上皮中的纤毛细胞占支配地位。病毒的感染/复制功效从近端
气道至肺泡呼吸区域明显地变化(hou yj等人,cell.2020may 27)。总之，鉴于鼻运输可能是sars-cov-2传播的关键特征，通过鼻内途径施用的药物和疫苗对于限制繁殖来说可能是非常有效的。
16.另一方面，在大肠杆菌(escherichia coli)中产生的乙型肝炎病毒核衣壳抗原(hbcag)(具有183个氨基酸的完全抗原)的病毒样颗粒(vlp)是一种大约30nm的纳米颗粒(aguilar jc,lobaina y,muzio v等人,immunol cell biol 2004,82:539-546)。以前已描述了这种颗粒的佐剂或免疫增强效应(riedl p等人,j immunol 2002,168(10):4951-4959；vanlandschoot p,cao t,leroux-roels g.antiviral res 2003,60(2):67-74)。当与其他抗原共施用时，表现出该免疫增强效应，无论通过鼻途径(aguilar jc等人,immunol cell biol 2004,82(5):539-546；lobaina y等人,mol immunol 2005,42(3):289-294)还是通过肠胃外途径(riedl p等人,j immunol 2002,168(10):4951-4959)。此外，已知该vlp在小鼠中是非常具有免疫原性的，其中生成与在人中所观察的那种相似的免疫应答(milich dr,semin liver dis 1991,11(2):93-112)。最后，在小鼠中所获得的结果在很大程度上预测了其可以在人中成功。
17.在为预防由冠状病毒引起的感染而采用的策略之中包括了开发亚单位疫苗，其在于使用通过重组dna技术而获得的病毒蛋白质作为免疫原。在这些之中，几种基于rbd结构域的疫苗候选物已被提出和/或处于临床阶段。大部分疫苗候选物基于单体rbd结构域，它们不再现病毒的刺突蛋白的四级结构并且稍微具有免疫原性。相反，这些候选物中的一些基于多聚体构建物，例如rbd与三聚体“卷曲螺旋”区段的融合蛋白。然而，这些构建物未以最佳方式模拟在天然s蛋白的rbd结构域之间的空间关系，也未模拟病毒颗粒所固有的超分子结构。还采用了与载体蛋白和/或基于聚合物(其具有免疫刺激特性)的纳米颗粒进行化学缀合的策略。具有广泛的辅助t表位清单的载体蛋白增加了所负载的蛋白质的免疫原性，并且其与所负载的蛋白质的缀合构成了现有技术中现有的疫苗候选物的设计策略。化学缀合导致在rbd蛋白和载体蛋白或聚合物的官能团之间的共价键的形成，通过基本上随机性质的化学反应，这可以影响在rbd结构域或载体蛋白的表面上的潜在地重要的表位，通常导致高度异质的制备物，其需要额外的纯化步骤以消除不希望的试剂和副产物。
18.由于这个原因以及冠状病毒感染的潜在影响，设计和获得在预防由该病毒类型引起的感染中有效的新型疫苗抗原仍然是令人感兴趣的。
19.发明详述
20.本发明通过设计新型嵌合蛋白而提供了对于上面所提及的问题的解决办法，所述嵌合蛋白具有模块化结构，并且包含：a)冠状病毒s蛋白的rbd，其包含s蛋白的所述结构域的区段；b)具有与hbcag相结合的能力的区段，其包含氨基酸序列wsffsni；c)包含氨基酸序列hhhhhh的区段；d)由氨基酸gly和ser形成的具有5-12个氨基酸的柔性间隔子区段；和e)选自包含ssssssssss的区段和区段stnlaaa的具有7-20个氨基酸的间隔子区段。在本发明的嵌合蛋白中，a)至e)的区段以(b)-(d)-(a)-(e)-(c)或(c)-(e)-(a)-(d)-(b)的顺序进行布置。在本发明的一个实施方案中，在所述嵌合蛋白中的rbd区段为在sars-cov-2的s蛋白的氨基酸q320和c590之间的区段。在一个实施方案中，(d)的具有5-12个氨基酸的柔性间隔子区段具有从由下列各项组成的组中选择的氨基酸序列：ggsgg、ggssggs、gggssggg、gggssggssggg和ggsggsggs。在本发明的一个实施方案中，(e)的具有7-20个氨基酸的间隔
子区段具有从由下列各项组成的组中选择的氨基酸序列：ggsggssssssssssie、ssgssssssssss和ggsggssssssssssgggie。在一个特别的实施方案中，所述嵌合蛋白具有标识为seq id no:4或seq id no:5的氨基酸序列。
21.本发明提供了疫苗组合物，其包含：i)嵌合蛋白，其具有模块化结构，并且包含：a)冠状病毒s蛋白的rbd，其包含s蛋白的所述结构域的区段；b)具有与hbcag相结合的能力的区段，其包含氨基酸序列wsffsni；c)包含氨基酸序列hhhhhh的区段；d)由氨基酸gly和ser形成的具有5-12个氨基酸的柔性间隔子区段；和e)选自包含ssssssssss的区段和区段stnlaaa的具有7-20个氨基酸的间隔子区段(在本发明的嵌合蛋白中，a)至e)的区段以(b)-(d)-(a)-(e)-(c)或(c)-(e)-(a)-(d)-(b)的顺序进行布置)；和ii)在药学上可接受的赋形剂或稀释剂。在本发明的一个实施方案中，所述疫苗组合物还包含疫苗佐剂。在一个特别的实施方案中，所述疫苗佐剂为铝盐。
22.在一个方面，包含上面所描述的嵌合蛋白的疫苗组合物还包含hbcag。在一个优选的实施方案中，在所述疫苗组合物中，所述嵌合蛋白和所述hbcag形成杂合纳米颗粒。
23.在另一个方面，本发明的疫苗组合物还包含第二种冠状病毒抗原。不是对本发明的范围的限制，本发明的疫苗组合物通过肠胃外途径、粘膜途径或这两种途径的组合来进行施用。
24.上面所描述的具有模块化结构的嵌合蛋白在制备用于预防由冠状病毒引起的感染的疫苗组合物中的用途也是本发明的目标。在本发明的一个实施方案中，用所述疫苗组合物所预防的感染由sars-cov-2引起。在免疫方案的过程中，在免疫接种方案的过程中同时地或顺次地通过肠胃外途径、粘膜途径或这两种途径的组合来施用所述用于预防冠状病毒的疫苗组合物。
25.在另一个方面，本发明揭示了预防由冠状病毒引起的感染的方法，其特征在于，向有此需要的个体施用药学有效量的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含上面所描述的具有模块化结构的嵌合蛋白和在药学上可接受的赋形剂或稀释剂。在本发明的预防方法的一个实施方案中，所述疫苗组合物包含hbcag。在本发明的一个实施方案中，在所述预防冠状病毒感染的方法中，所述疫苗组合物通过肠胃外途径、粘膜途径或这两种途径的组合来进行施用。
26.在本发明的实施例中着手处理了包含sars-cov-2病毒的rbd的嵌合蛋白的设计，所述嵌合蛋白能够形成稳定的冠状物，通过在自装配的hbcag纳米颗粒上建立特异性的非共价相互作用，从而在结构上和在功能上模拟sars-cov-2病毒的表面并且通过不同的接种途径(肠胃外和鼻)生成强力的免疫应答。
27.在本发明中所揭示的包含rbd的嵌合蛋白超越了当前疫苗候选物所具有的限制。与后者不同，本发明的嵌合蛋白能够同时模拟一大组的在该病毒的刺突中存在的rbd的结构特性，例如：a)rbd三聚体的立体化学特质，如在s蛋白中所出现的；b)适应于超分子结构的能力，所述超分子结构允许相应于冠状病毒的特征性的六面体对称结构的稍微超过10nm的间距；和c)赋予rbd以类似于s蛋白的“呼吸”现象的构象变化动力学的结构柔韧性。包含rbd结构域的本发明的嵌合蛋白通过其经由非共价特异性相互作用与抗原hbcag的刺突(一种高度免疫原性的并且充当载体蛋白的20-30nm的纳米颗粒)相缔合而得以采取纳米超分子结构，从而导致以杂合纳米颗粒形式的自装配复合物，其能够生成强力的免疫应答，无论
通过肠胃外途径还是通过粘膜途径。本发明还包括所述嵌合蛋白通过建立与过渡金属的配位键来稳定以二聚体/三聚体的形成为特征的四级结构以及杂合纳米颗粒的超分子结构的能力。由本发明的蛋白质所模拟的rbd的结构特性在s蛋白的结构-功能关系中是中心的，特别是在与受体的结合中，从而促进与ace2的二聚体的二价缔合。类似地，这些蛋白质具有这样的能力：生成中和抗体，所述中和抗体能够以二价方式与冠状病毒表面的相邻刺突相结合，从而模拟与二聚体的受体ace2的结合，显示出更大的亲和性和中和效力。
28.涉及在杂合纳米颗粒的内核中hbcag的存在的本发明的一个另外的新要素是这样的事实，即除了是高度免疫原性的并且作为载体蛋白是有效的之外，该抗原还能够诱导先天免疫应答。以这种方式，除了基于特异性的抗-rbd应答而生成中和抗体之外，在本发明中所获得的杂合纳米颗粒还能够刺激先天免疫应答，其尤其在老年人(具有最高的covid-19严重度和死亡率风险的年龄组)中是降低的。
29.如在实施例1中所描述的，本发明的包含rbd的嵌合蛋白具有模块化结构，其由五个具有经明确定义的结构特性和功能的结构域或模块构成。冠状病毒的rbd结构域的模块(a)是负责生成针对sars-cov-2病毒的中和抗体的特异性免疫应答的要素。其余的模块提供这样的能力：rbd结构域与hbcag刺突高度有效地结合，从而实现稳定的冠状物的形成，其模拟了与在冠状病毒表面上所出现的那样相似的rbd的结构和功能特性。
30.合理设计允许所述嵌合多肽特别地位于hbcag刺突上，这是该蛋白质的免疫优势表位和最突出的区域。先前已检定了用于利用hbcag的其他技术解决办法，但是本发明在所有方面都超过了它们。例如，设计出了融合蛋白，其中恰好在衔接使hbcag刺突成形的螺旋的环中插入了肽和蛋白质。然而，当所插入的蛋白质包含二硫桥、是以其天然形式分泌的蛋白质并且包含糖基化位点时，该解决办法是不足的。因为hbcag是胞质蛋白质并且在细胞质中自装配，因而这些融合蛋白不是切实可行的，这是由于所插入的蛋白质的正确折叠受到妨碍。
31.本发明的技术解决办法以简单得多的方式即由模块(b)介导的非共价特异性相互作用将宿主蛋白质定位在hbcag刺突上。以这种方式，宿主蛋白质可以独立地进行表达，如在其中所设计的蛋白质在hek293、cho细胞中和在巴斯德毕赤酵母中的这种情况下。
32.本发明还超越了通过共价键的传统缀合方法。在这些情况下，实现位点特异性缀合是非常困难的，并且最终的缀合物是随机过程的结果，其中蛋白质以不同的方式进行连接。在许多情形下，这些反应需要在非生理性的溶剂和温度的条件下进行，这可能损害折叠和/或在蛋白质的氨基酸中引入不希望的化学修饰。此类变化可以影响特定的表位，这会危及免疫应答的质量。
33.在嵌合蛋白中插入模块(b)不是关于实现使用所述蛋白质作为与hbcag相结合的有效免疫原的充分条件。首要的问题是结合基序(序列wsffsni)的差的亲和力，其为12um。以如此低的亲和力，在低的蛋白质浓度下所预期的解离水平是非常高的，这危及了免疫原性。非常可能的是，这个特征是不存在有在本发明中所采用的该序列基序的实际使用的已知先例的原因。仅包括模块(b)本身并不能保证所述嵌合蛋白具有与hbcag有效地缔合的能力。如在实施例3中所证明的，为了是有功能的，模块(b)需要存在有模块(d)
–
在本发明中所设计的将模块(b)与rbd结构域相衔接的间隔子环(具有高的柔韧性和可溶性)，以及存在有关于产生所述缔合的确定的实验条件(例如，温度)，这是现有技术未预见到的事实。
34.为了增加所述相互作用的亲和力和所述复合物的稳定性，本发明包括了模块(c)、(d)和(e)的设计，它们为所述杂合纳米颗粒的内在和外在稳定化提供了立体化学要素(实施例1)。本发明的第一中心要素为认识到hbcag的三个相邻刺突的顶端的空间布置在很大程度上与rbd三聚体的n-和c-末端的空间布置相一致，如在冠状病毒的s蛋白的3d结构中所出现的(实施例1、图1a和图3)。模块(d)被设计成是非常柔韧的并且提供对于将rbd区段抬升到hbcag刺突之上来说必需的距离(图1a、图3)。模块(d)的柔韧性赋予rbd区段以通过与相邻的rbd区段的相互作用的结构适应能力(以与s蛋白的“全向下”结构相似的方式)以及允许采取“向上”构象的动态特性。rbd区段间的相互作用是本发明的内在稳定化的第一要素。该稳定化类型是在实施例3中所观察到的杂合纳米颗粒的体积亚微摩尔浓度稳定性的原因，其中记录了以相对于作为合成肽的模块(b)的亲和力而言大于50倍的估计的亲和力增加。
35.在本发明中所设计的冠状物的稳定性的另一个实验证明为抑制被抗-hbcag多克隆抗体识别的能力。这是一个非常严苛的测试，鉴于这些抗体的高亲和性。此外，这是定位与hbcag刺突相互作用的嵌合蛋白的测试，因为它是所述抗原的免疫优势表位。
36.在本发明中还开发了外在稳定化的策略，为此设计了模块(c)和(e)。模块(c)包含六组氨酸序列，其能够与过渡金属形成配位键，并且进行二聚化/三聚化(图2)。相反，模块(e)为在(c)和rbd结构域之间的衔接子环，这是柔韧的并且延长的-包含多丝氨酸的区段-其被设计为允许在刺突间空间中本发明的嵌合蛋白的二聚化/三聚化(图2)。本发明的外在稳定化的功效的证据在实施例3中观察到，ni的添加造成将与抗-hbcag抗体的结合的抑制能力增加至体积亚微摩尔浓度水平(图9)。
37.所设计的包含rbd结构域的嵌合蛋白以高亲和力与受体ace2相结合(实施例4)，这证明了本发明的模块化设计没有不利地影响其生物学功能。该观察结果与下述事实相一致：以n-和c-末端延伸方式掺入的模块在经折叠的嵌合蛋白中出现在远离受体结合位点的部分处。还证明，其掺入不影响折叠，并且所述蛋白质显示出相当的热稳定性，从实施例3的结果来判断，其中将蛋白质在50℃下温育2小时，并且之后保留了其色谱特性谱并且与hbcag的结合能力增加。
38.实施例4还显示，本发明的杂合纳米颗粒有效地与受体ace2相结合，这表明其正确地模拟了病毒表面，并且本发明的包含rbd的嵌合蛋白的新型模块化设计有效地再现了sars-cov-2病毒的s蛋白的rbd的结构-功能关系的基本特征。
39.在本发明中，还使用了模块(b)和/或(c)和相应的衔接子环(d)和(c)作为在溶液中rbd嵌合蛋白的内在相互作用的稳定化要素，甚至在hbcag纳米颗粒不存在下。具有三个芳香族氨基酸、三个极性氨基酸和一个疏水氨基酸的模块(b)的氨基酸性质是对于蛋白质-蛋白质和蛋白质-聚糖相互作用区域来说典型的。因此，可以建立额外的相互作用(分子内和分子间)，其对于包含rbd的嵌合蛋白的二聚体、三聚体或寡聚体的形成提供稳定化。衔接子的性质对这种类型的相互作用做出贡献，因其柔韧性和在模块(e)的情况下多丝氨酸区段的存在，丝氨酸具有通过氢桥形成键的能力并且还经常与蛋白质-聚糖相互作用相关联。
40.这些额外稳定化的证据在实施例3中观察到：i)蛋白crbdh6-p在处于体积亚微摩尔浓度下的溶液中主要是单体，但是观察到相应于三聚体或更高级的聚集体的较少级分(图6a)；ii)在蛋白crbdh6-cho(在cho细胞中表达的嵌合蛋白crbdh6-h)中，虽然单体最常
见的，但是也观察到二聚体和三聚体(图5)；和iii)蛋白crbdh6-h呈现为二聚体和三聚体，其一起超过了单体级分(图7b)。而不同的种类的相对丰度可以通过由模块(c)即六组氨酸(其能够与过渡金属形成配位键并因此提供二聚体和/或三聚体的额外稳定化)的存在所介导的外在相互作用来调节。蛋白crbdh6-cho是与蛋白crbdh6-h相同的多肽，其区别在于获得它时所处的细胞系，它是在cho细胞系中获得的。
41.因此，本发明的一个新要素为形成多种多样四级结构的可能性。这些是在基于rbd结构域的疫苗制备物中所希望的要素。向免疫系统呈递与在冠状病毒刺突的三聚体蛋白质中存在的不同的“向上”和“向下”状态相一致的所述结构域的结构多样性。在实施例5中证明，用rbd区段(没有其余区段)进行免疫接种诱导了低于包含所提及的五个区段的本发明的嵌合蛋白的应答。
42.另一方面，在本发明中，作为实施例5的一部分，评价了sars-cov-2病毒的s蛋白的片段的两个变体，其被描述为在巴斯德毕赤酵母中表达的rbd。所评价的变体之一在其c-末端处包含六his尾，并且通过使用金属离子可能诱导其二聚化/三聚化。所获得的结果表明，在rbd结构域的二聚化/三聚化的情况下，生成在中和应答方面具有比用以单体形式的相同重组蛋白更高的质量的抗体应答。这与下述事实相一致：二聚体/三聚体模拟在病毒粒子表面上暴露的s蛋白的四级结构(其介导与受体ace2的结合)(wrapp等人,science 367,1260-1263(2020))。
43.在本发明的实施例6和7中所获得的结果代表了对于在现有技术中盛行的问题的新型解决办法，以满足关于新型制剂的需求，所述新型制剂使得能够增强针对目的疫苗抗原的免疫应答以实现用于控制疾病和感染的有效疫苗。以在两种不同的宿主(即，巴斯德毕赤酵母和hek-293细胞系)中表达的重组rbd蛋白为例，在其中接种了杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6的组中获得了较高免疫原性的应答，无论通过肌内(i.m.)途径还是鼻内(i.n.)途径。此外，在rbd与病毒受体ace2的相互作用的抑制测定法中验证了在动物的血清中发展出的抗体的功能性，这也在对于通过i.m.途径的免疫接种的中和测定法中得到了确证。结果表明，在hbcag纳米颗粒表面上以复合物暴露的高密度的rbd有助于提高免疫原性，高于其余的所评价的组。这些抗原的共施用(无联合)无法解释这一点，因为用所述两种抗原(无联合)通过i.m.途径进行接种的组，虽然相对于其中未共施用hbcag的那些组而言提高了体液应答，但是生成了显著更低的滴度水平。即hbcag纳米颗粒的佐剂效应无法解释用杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6所获得的结果。在这样的意义上，杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6的设计牵涉嵌合蛋白crbdh6在hbcag纳米颗粒的针突上的有序锚固，并且已经将所述针突的分布与抗-hbcag的b淋巴细胞克隆的t非依赖性刺激相关联(milich dr,mclachlan a.science 1986,234:1398-1401)。另一方面，仅杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6使得能够在100％的所评价的动物中在鼻咽粘膜中以可察觉到的水平发展出iga型抗体应答这一事实证明，所述杂合纳米颗粒(纳米大小的)和其余的上面所阐明的特征对于刺激粘膜免疫系统的细胞来说是高度有效的。这些结果是新颖的。
44.附图简述
45.图1.与hbcag刺突形成复合物并且建立内在和外在稳定化网络的rbd嵌合蛋白的3d结构的示意性图画。a)在上面部分中观察到蛋白crbdh6-p的三聚体，其采取sars-cov-2病毒的s蛋白的“全向下”构象，每条链以不同的灰色调表示。下面部分的暗灰色调的螺旋相
应于hbcag纳米颗粒表面的三个相邻刺突，每个刺突与rbd嵌合蛋白的一条链非共价地结合。在位于刺突之间和rbd结构域(模块(a))下面的中央空间中，可以观察到三个六组氨酸区段即模块(c)，其配位了两个ni原子(其由两个球状物来表示)。b)模块(b)的结合(与hbcag相结合)的3d模型，其中与纳米颗粒的刺突相互作用。模块(b)以球状物表示，并且螺旋相应于hbcag的二聚体刺突。c)六组氨酸三聚体(模块(c))的3d模型，其中配位了两个ni原子(球状物)。
46.图2.相应于模块(c)和(e)的设计的结构分析。a)蛋白cg2496(pdb标识号：2kpt)的n-末端结构域的20个3d模型的ser
170-his
188
区段的叠加，该蛋白在溶液中的结构通过nmr来进行解析。该区段具有类似于本发明的模块(e)-(c)的序列：sssssssgssslehhhhhh。对于所述叠加，仅考虑六组氨酸区段的坐标。观察到多丝氨酸区段相对于六组氨酸尾而言的相对定向的多样性。b)ser
170-ser
180
区段的20个模型的叠加，在十肽ser
170-ser
179
和ser
171-ser
180
的3d模型的n-末端和c-末端之间的平均距离为多丝氨酸区段是柔韧的但延长的，具有经明确定义的单向推进。c)观察到由蛋白na k-atp酶(pdb标识号：1q3i)的n-末端结构域的肽链的tyr
481-his
592
区段形成的三聚体。该三聚体在c3晶体学对称性中心处形成，所述三聚化通过该蛋白质的c-末端六组氨酸区段和两个ni原子(球状物)的配位来介导。在该图中还显示了叠加(用箭头标出)，图2a的ser
170-his
188
区段的3d模型(其不与ni原子相缔合)之一，并且如所观察到的，该区段的构象是非常相似的。d)两个ni原子与三个图2c的六组氨酸区段的配位复合物的结构。
47.图3.包围hbcag纳米颗粒并且通过蛋白crbdh6-p的非共价缔合而形成的冠状物的示意图。a)裸露的hbcag纳米颗粒。在圆圈中显示了hbcag的三个相邻刺突，每个刺突由该蛋白质的二聚体形成。b)图3a的三个刺突的示意图，观察到六条链(三个hbcag二聚体)的螺旋结构。c)杂合纳米颗粒的3d模型，由蛋白crbdh6-p的三聚体形成的冠状物呈暗灰色，在圆圈内显示了一个实例。浅灰色为在冠状物层下面的hbcag纳米颗粒的表面。d)在三个hbcag刺突上形成复合物的crbdh6-p三聚体的模型。在该情况下，rbd结构域采取“全向下”构象，这与sars-cov-2病毒的刺突蛋白的相应构象相似。
48.图4.由于将编码rbd的变体的片段连接至ppiczalfaa(图版a，变体rbd、rbdh、rbdcmych、crbdh6-p和crbd)或连接至pcdna3(图版b，变体crbdh6-h)而产生的质粒。
49.图5.蛋白crbdh6-cho与hbcag纳米颗粒的缔合的凝胶过滤色谱法研究。插图相应于使用general electric
tm
的低分子量试剂盒的柱子的校准。显示了下列物质的图谱：hbcag对照、蛋白crbdh6-cho和两者之间的复合物。横轴为运行时间，和纵轴为吸光度。所有样品都在37℃下预温育2小时。
50.图6.蛋白crbdh6-p与hbcag纳米颗粒的缔合的凝胶过滤色谱法研究。显示了下列物质的图谱：hbcag对照、蛋白crbdh6-p和复合物。横轴为运行时间，和纵轴为吸光度。a)在37℃下预温育2小时的样品。在插图中显示了色谱图的放大，用于更好地评估蛋白crbdh6-p的图谱。b)在50℃下预温育2小时的样品。在插图中显示了具有不同尺度的相应于蛋白crbdh6-p的色谱图的部分的放大，用于更好地评估蛋白crbdh6-p的峰。c)在18℃下预温育2显示的样品。
51.图7.a)蛋白crbd与hbcag纳米颗粒的缔合的凝胶过滤色谱法研究。显示了下列物质的图谱：hbcag对照、蛋白crbd和复合物。横轴为运行时间，和纵轴为吸光度。所有样品都
在37℃下预温育2小时。b)蛋白crbdh6-h的四级结构的凝胶过滤色谱法研究。上部显示了色谱图，而下部显示了相应于单体、二聚体和三聚体的所观察到的三个峰的去卷积。
52.图8.嵌合蛋白crbdh6-h和crbdh6-p的sds-page电泳分析。显示了重组蛋白crbdh6-p(在巴斯德毕赤酵母中表达的)和crbdh6-h(在hek293细胞系中表达的)的两种制备物在还原条件下在聚丙烯酰胺凝胶(12.5％)中的分开。mws：分子量标准。pngase f(-)为天然糖蛋白，和pngase f(+)表明所述样品是通过该酶的作用而n-去糖基化的。
53.图9.抗-hbcag多克隆抗体与由本发明的rbd嵌合蛋白和hbcag所形成的杂合纳米颗粒的结合的抑制测定法。
54.图10.在biacore x传感器上进行的嵌合蛋白crbdh6-p和crbdh6-h的测定的传感图(sensorgram)，其中使用在高等生物细胞(hek293)中通过重组途径获得的嵌合蛋白ace2-mfc作为固定化在cm5芯片的表面上的配体。上图版：溶解在ph 6.2的柠檬酸盐(17mm)/磷酸盐(66mm)缓冲液中的crbdh6-p和crbdh6-h；下图版：用作该实验的阴性对照的蛋白质：表皮生长因子(egfhr，左)和病毒的包膜蛋白的结构域iii的重组蛋白diii(dv)-h6(右)。
55.图11.在柠檬酸盐/磷酸盐(cp ph 6.2)中研究的杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6-h与受体ace2-fc的结合的传感图。所估计的平衡常数的值为kd＝2.94
×
10-11
m(χ2＝9.75)。固定化在cm5芯片上的配体和固定化条件与图10的那些是相同的。
56.图12.在血清中抗-rbd igg的体液应答。用在x轴上所描述的免疫原通过i.m.途径在第0和14天对balb/c小鼠免疫接种两次。在第二个剂量后十天收集血清，并且通过elisa计算滴度。描绘了几何平均值和95％置信区间。
57.图13.在血清中抗-rbd igg的体液应答。用在x轴上所描述的免疫原通过i.m.途径在第0和14天对balb/c小鼠免疫接种两次。在第二个剂量后十天收集血清，并且通过elisa计算滴度。不同的字母指明了在统计学上显著的差异(p《0.05)。描绘了几何平均值和95％置信区间。
58.图14.rbd-ace2相互作用的抑制测定法。用在x轴上所描述的免疫原通过i.m.途径在第0和14天对balb/c小鼠免疫接种两次。在第二个剂量后十天收集血清并且进行1:200稀释以用于该测定法。不同的字母指明了在统计学上显著的差异(p《0.05)。描绘了平均值和95％置信区间。
59.图15.在血清中抗-rbd igg的体液应答。用在x轴上所描述的免疫原通过i.n.途径在第0和14天对balb/c小鼠免疫接种两次。在第二个剂量后十天收集血清，并且通过elisa计算滴度。不同的字母指明了在统计学上显著的差异(p《0.05)。描绘了几何平均值和95％置信区间。
60.图16.在鼻咽冲洗物中抗-rbd iga的体液应答。用在x轴上所描述的免疫原通过i.n.途径在第0和14天对balb/c小鼠免疫接种两次。在第二个剂量后十天收集冲洗物，并且通过elisa来获得吸光度值。柱状物的顶部反映了应答者动物的频率。虚线表示用于检测阳性应答的截止值。描绘了平均值和95％置信区间。
61.图17.rbd-ace2相互作用的抑制测定法。用在x轴上所描述的免疫原通过i.n.途径在第0和14天对balb/c小鼠免疫接种两次。在第二个剂量后十天收集血清并且进行1:200稀释以用于该测定法。不同的字母指明了在统计学上显著的差异(p《0.05)。描绘了平均值和
95％置信区间。
62.图18.蛋白crbdh6-h(a、b和d)和crbdh6-p(a、b和c)的四级和超分子结构以及杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6-p(c)和hbcag-crbdh6-h(d)的形成的动态光散射(dls)光谱学分析。图a和c显示了按强度的大小分布，和图b和d显示了按体积的大小分布。在图a、b和c中，首字母缩写crbdh6-h和crbdh6-p分别是指溶解在1x pbs ph 7.4和0.3x pbs ph 7.4中的所述蛋白质。首字母缩写crbdh6-p-ptfni是指溶解在缓冲溶液pbs/0.03％tween-20,12％果糖,1mm niso4(ph 7.4)中的蛋白crbdh6-p；hbcag是指溶解在pbs/0.03％ tween-20(ph 7.4)中的抗原；和hbcag-crbdh6-p为相应于hbcag和crbdh6-p-ptfni的混合物的光谱。在图d中，所有样品都溶解在缓冲溶液20mm tris ph 7.4,12％果糖,1mm niso4中。图e显示了图d的样品的ζ电位分布。
63.图19.杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6-h、hbcag纳米颗粒和蛋白crbdh6-h的透射电子显微术分析(a-e)。a-c：分别为hbcag-crbdh6-h、crbdh6-h和hbcag的显微照片。d：所观察到的杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6-h和hbcag的颗粒直径值的直方图的比较。e：在所述两种情况下所观察到的颗粒直径值的图。f-j：糖基化蛋白crbdh6的3d结构的图画。显示了单体(f)、二聚体(g)、三聚体(h)、六聚体(i)和十二聚体(j)。多肽链以表面图画来显示，和聚糖以球状物原子图画来显示。
64.图20.用交联剂egs(乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯))对蛋白crbdh6-h、crbdh6-p和杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6-p进行处理的sds-page分析。箭头指出了每种蛋白质的二聚体(*)、三聚体(**)和多聚体(n*)种类：h(crbdh6-h)、p(crbdh6-p)和c(hbcag)。用圆端箭头指出了复合物hbcag-crbdh6-p的形成。
65.图21.杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6-h的形成和稳定性的分析。a)在竞争性elisa中的抑制曲线，其中杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6的形成抑制hbcag与固定化在elisa平板的固体表面上的抗体的相互作用。b)使用金属离子zn
2+
的杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6-h的天然琼脂糖凝胶电泳分析。泳道1：嵌合蛋白crbdh6-h与hbcag的缔合反应，其中使用2:1的c-rbd-h6:hbcag摩尔比；泳道2：嵌合蛋白crbdh6-h与hbcag的缔合反应，其中使用1:1的crbdh6-h:hbcag摩尔比；泳道3：嵌合蛋白crbdh6-h与hbcag的缔合反应，其中使用0.5:1的crbdh6:hbcag摩尔比；泳道4：处于与当使用2:1的crbdh6-h:hbcag摩尔比时相同的浓度的嵌合蛋白crbdh6-h对照；泳道5：处于与当使用1:1的crbdh6-h:hbcag摩尔比时相同的浓度的crbdh6-h对照；泳道6：处于与当使用0.5:1的crbdh6-h:hbcag摩尔比时相同的浓度的crbdh6-h对照；和泳道7：处于相同的在所有缔合中所使用的恒定浓度的hbcag对照。c)在硬脂酸存在下获得的嵌合蛋白crbdh6-h的纳米颗粒的天然琼脂糖凝胶电泳分析。泳道1：用硬脂酸获得的杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6；泳道2：与硬脂酸相缔合的嵌合蛋白crbdh6的纳米颗粒；泳道3：游离蛋白crbdh6-h对照；和泳道4：hbcag对照。
66.图22.杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6-h在小鼠中的体液应答的研究。a)抗-rbd igg应答的滴度(血清稀释度的倒数)；b)rbd结构域与受体ace2的结合的抑制测定法(ic50值用血清稀释度的倒数值来表示)，在插图中比较了抗-crbdh6-h血清(g3)和一组恢复期血清(pc)的抑制能力；c)体外病毒感染中和测定法。
67.实施方案的详细描述/实施例
68.实施例1.能够模拟sars-cov-2病毒的刺突蛋白的四级和超分子结构的包含rbd结
构域的嵌合蛋白的设计。通过具有高稳定性的非共价缔合的杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6的设计。
69.本发明的嵌合rbd蛋白具有模块化结构，其具有：
70.a)rbd结构域，其包含s蛋白的残基asn
331-lys
529
并且由在限定于残基gln
320
和残基cys
590
之间的s蛋白的序列区域中所包含的区段组成。rbd结构域占据在所述嵌合蛋白的序列中的中心位置，其通过在(d)和(e)中所描述的极性和柔性间隔子区段与在(b)和(c)中所描述的模块相连接。
71.b)具有与蛋白hbcag特异性地和非共价地相结合的能力的模块。在本发明中，该模块由七残基序列wsffsni组成。该模块可以占据相对于rbd结构域而言的n-或c-末端位置，并且通过在(d)中所描述的间隔子区段与该结构域相连接。
72.c)六组氨酸区段。该模块可以占据相对于rbd结构域而言的n-或c-末端的位置，并且通过在(e)中所描述的间隔子模块与该结构域相连接。
73.d)由残基gly和ser构成的具有5-12个序列残基的柔性间隔子区段。该间隔子区段的氨基酸序列由下列序列之一组成：ggsgg、ggssggs、gggssggg、gggssggssggg、ggsggsggs。
74.e)具有7至20个残基的间隔子区段，优选地倾向于采取延伸型和柔性构象。所述间隔子模块的氨基酸序列由下列序列之一组成：ggsggssssssssssie、ssgssssssssss、stnlaaa、ggsggssssssssssgggie。
75.本发明的嵌合蛋白的序列可以以下列方式之一来进行描述，考虑到其模块化结构：(b)-(d)-(a)-(e)-(c)或(c)-(e)-(a)-(d)-(b)。
76.嵌合蛋白的模块化结构的合理性
77.模块(a)包含rbd结构域的大小较小的区段asn
331-lys
529
。该区段为独立折叠结构域。其包含：四个通过二硫桥相连接的半胱氨酸、两个n-糖基化位点(asn331和asn
343
)和位于残基asn
439
和tyr505之间的受体结合基序，其从功能观点来说是必不可少的方面。中和抗体识别该结构域，并且其基本的中和机制是阻断与受体的结合。此外，本发明还包含n-和c-末端延伸(gln
320-cys
590
)，其包括sd1结构结构域，其还包含中和抗体表位。该添加此外还包括铰链区，其在构象运动中是关键的，所述构象运动允许采取s蛋白的有活性的“向上”构象，和因此潜在地其为中和抗体的靶标。
78.模块(b)保证rbd结构域与由hbcag形成的纳米颗粒的缔合，后者是高度免疫原性的并且能够通过接种而诱导强有力的免疫应答，无论通过肠胃外途径还是通过鼻途径。然而，仅缔合并不保证载体蛋白效应-免疫刺激t-辅助应答，并且因此本身不是一个微不足道的解决办法。缔合的化学计量学是重要的，因为所述结构域的不足呈现可以导致朝向hbcag的免疫应答的失衡，这不利于抗-rbd抗体的生成。因此，原创性地将模块(b)的存在与间隔子模块(d)的设计相组合，这允许rbd结构域突出在hbcag颗粒的刺突上，从而转变成杂合纳米颗粒的免疫优势区域。模块(d)的基本特征是残基甘氨酸和丝氨酸的存在，这些是向所述区段提供柔韧性(甘氨酸)和可溶性(丝氨酸)的小残基。在(d)的情况下，甘氨酸是占优势的，从而使之是非常柔韧的，因而最小化为了将rbd结构域安置在hbcag纳米颗粒的刺突上而引入额外的约束。间隔子模块(d)的不同大小提供了通过增加(d)的大小来实现rbd的更大突出和其运动的灵活性的可能性。
79.在这种情况下，选择由建立特异性非共价相互作用的模块(b)所介导的与hbcag的
缔合，而不是基于通过形成共价键的缀合的更经常使用的策略。所选择的技术解决办法具有下列各项作为相对优势：
80.1)无需要求额外的纯化过程的化学反应；
81.2)消除了在化学反应中所使用的溶剂的存在可能影响hbcag颗粒和/或rbd的结构的可能性；
82.3)模块(b)特异性地与位于hbcag纳米颗粒的刺突中的斑片相结合，从而实现确定的化学计量学以及rbd在hbcag的免疫优势表位和纳米颗粒的最突出区域上的定位(图1和3)。相反，化学缀合不可能达到该特异性水平，其以通常随机的现象为特征，从而导致所述两种抗原的部分的不同残基被连接；
83.4)非共价结合过程在生理条件下进行并且不要求纯化。可以通过考虑所使用的浓度和缔合常数来控制所缔合的rbd的量；
84.5)化学缀合产物，在所述两种抗原中经化学修饰的残基，可以影响抗原性、免疫原性和中和表位的识别，尤其是当经修饰的残基的数目不受控制时。
85.然而，通过区段(b)与hbcag非共价结合实际应用于制备杂合纳米颗粒具有根本的困难，并且非常可能的是在生理学上重要的浓度下解离。这样的解离过程造成hbcag的载体蛋白效应的丧失，并且最终使免疫应答朝着hbcag抗原重定向，这是由于其高的免疫原性。特别地，模块(b)的序列具有低的结合亲和力(12um)，这可能是其在实际应用中以前从未被使用的根本原因，如通常用于免疫接种的非共价“缀合”方法。
86.在这种情况下，提供了用于抵消模块(b)与hbcag的相互作用的明显缺点的原创性技术解决办法。一个中心要素为在rbd嵌合蛋白的不同链之间引入额外的相互作用网络，其提供了保证非常低的解离的高度稳定性。所述网络具有两个组分：一个内在的，其由rbd结构域本身和区段(d)的适当设计来提供；和一个外在的，其通过所描述的模块(c)和(e)的设计来引入。
87.所述内在组分来自rbd结构域在s蛋白的结构中在至少两个相邻rbd的“向下”型构象中建立蛋白质-蛋白质和蛋白质-聚糖相互作用的能力。一个基本的新要素在于：hbcag纳米颗粒的选择，连同模块(b)和(d)的适当设计一起，允许rbd在模拟了s蛋白的那种的四级结构的情景下暴露(图1-3)。在hbcag刺突之间的现有距离为大约4nm，这与在相应于在s蛋白的结构中的相邻rbd结构域的n-(和c-)末端的残基之间所观察到的距离非常相似。这允许一旦与刺突相结合，rbd结构域就可以采取与在sars-cov-2病毒粒子中所观察到的非常相似的空间关系。
88.本发明的杂合纳米颗粒的这些特征使其优于以前在其他基于二聚体和三聚体rbd的疫苗候选物中所着手处理的技术解决办法。先前所描述的二聚体基于包括游离半胱氨酸(相应于cys
538
)(其形成在s蛋白的天然结构中不存在的人工分子间二硫桥)的rbd构建物。非常不可能的是，这些二聚体的每条链采取与在s蛋白的相邻rbd中所观察到的相似的相对于另一单体而言的空间定向，因为在刺突的相邻链的lys
529
残基之间所观察到的距离超过了铰链环lys
529-cys
538
的大小，即使考虑其采取完全延伸的构象。这些通过二硫桥的形成而获得的二聚体也没有满足对于与ace2二聚体结合的10nm的间隔要求。相似的情况出现在现有技术中所描述的三聚体中，它们由rbd与能够进行三聚化的螺旋状卷曲螺旋区段的融合蛋白组成。该策略的缺点是所得的三聚体显示出辐射状布置，其中rbd结构域的n-和c-末端
位于卷曲螺旋区域的末端附近，和因此也接近相邻rbd的链的n-和c-末端，不同于在s蛋白中所观察到的在这些残基之间的实质分开。在这种情况下，也没有实现对于与ace2二聚体相结合来说必需的立体化学特征。
89.如此设计的嵌合蛋白，与提供了额外相互作用网络的增加的稳定性相平行地，包括了具有很大柔韧性的间隔子(d)的设计，这些间隔子赋予与hbcag相结合的嵌合蛋白的rbd结构域以展示出与在s蛋白中所观察到的呼吸类似的动态行为的可能性。
90.本发明的嵌合蛋白还包括外在组分，其由模块(c)和(e)提供。该组分的中心要素为模块(c)的六组氨酸序列，其能够通过与过渡金属(例如ni和zn)形成配位键来介导三聚化和/或二聚化过程(图2)。对于该类型的相互作用在现有技术中所报道的亲和力在体积纳摩尔浓度范围内，因此被转变为在与hbcag的复合物中的rbd嵌合蛋白的稳定化网络的高度稳定性的节点。
91.然而，与形成与金属的配位复合物相联合的六组氨酸尾的潜力的实际应用不是明显的。所述模块应当对于可能相互作用的那些来说是充分暴露的和可接近的，但是此外，由于rbd模块与hbcag刺突相缔合，因此需要模块(c)通过间隔子序列与rbd相衔接，所述间隔子序列保证每条链的六组氨酸可以在包含于离刺突不小于2nm的距离内的空间中内部地相互作用。模块(e)执行了该功能，其是柔韧的、可溶的、富含氨基酸丝氨酸，这保证了采取该区段的更延伸的结构(图2)。在所显示的情况下，紧邻rbd结构域的末端的(e)的残基富含残基gly，从而向该部分给予更大的局部链柔韧性和最小可能程度的结构约束。该模块的必不可少的要素是具有至少10个残基的多丝氨酸区段的存在。在本发明中进行了存在于蛋白质中的多丝氨酸型序列或富含丝氨酸的区段的分析，所述蛋白质的3d结构已经通过实验方法进行了解析并且其坐标已存放于pdb中。所进行的分析表明，具有十个连续丝氨酸的区段保证了的间隔(图2)。如多丝氨酸区段的叠加所显示的，它们采取了各种各样的构象-表明了某些柔韧性-但是也表明了某些单向刚性，其对于由本发明的模块(e)所要求的特性来说是有用的。图2c和2d显示了由两个ni原子的配位所介导的六组氨酸区段的三聚化的实例。
92.在本发明中建立了在包含rbd的嵌合蛋白之间的相互作用网络，其节点是与hbcag刺突相缔合的模块(a)，和由通过与过渡金属的配位键的建立而三聚化和/或二聚化的由六组氨酸区段组成的模块(c)。
93.本发明的嵌合蛋白能够在hbcag纳米颗粒上形成冠状物(图3)，其具有独特的特性，在现有技术中没有先例。所述冠状物模拟sars-cov-2病毒的rbd结构域的结构的基本外观，其对于生成强力且高质量的中和抗体应答来说是必不可少的。该冠状物有效地模拟该病毒的rbd的结构特性，依照三聚体四级结构、由超分子结构所决定的间隔和由于使用柔性衔接子而引起的内在柔韧性。迄今为止还未报道过具有在本发明中所达到的程度的结构-功能模拟。具有这些特征的冠状物的建立通过基于非共价相互作用的在本发明中所描述的相互作用网络的新型设计来实现，这保证了很大的特异性、自装配能力和在实践中获得的容易性，因为不需要牵涉共价键形成的化学反应，也不需要纯化过程以消除试剂、不希望的副反应的存在等。
94.实施例2.包含rbd区段的嵌合蛋白的获得
95.在实施例1中所显示的设计后，决定获得不同的包含rbd区段的蛋白质，其中改变
了rbd区段的精确长度以及位于rbd区段与hbcag结合序列或六组氨酸二聚化/三聚化序列之间的衔接子或间隔子的长度和序列，甚至省略了hbcag结合序列、二聚化/三聚化序列或两者。这些变体保持了相同的通常组织：按n-末端至c-末端的方向，具有hbcag结合序列、(具有可变长度的)第一间隔子、rbd、(具有可变长度的)第二间隔子和二聚化/三聚化序列(在该情况下，六组氨酸)。
96.在表1中显示了所述变体的特征，按n-末端至c-末端的方向(rbd区段的残基的编号遵循在数据库genbank登录号qhd43416中所采取的那种)。在表1中所显示的多肽中的五个之中，缺少hbcag结合序列。同样地，在该表格中所显示的变体中的大部分之中缺少第一间隔子，和在所获得的变体中的三个之中缺少第二间隔子。
97.表1.包含rbd区段的多肽的特征
[0098][0099]
作为起始疫苗抗原，选择rbd结构域asn331-ser530(seq id no:1)，目的是使用rbd变体，其：a)尽可能地紧凑，和b)没有游离半胱氨酸。该变体从该结构域的第一个半胱氨酸开始延伸5个残基直至n-末端，以便以这种方式包括该结构域的n-末端的两个n-糖基化位点，其对于在微生物宿主中所述结构域的表达来说是重要的，根据以前对于sars-cov-1的rbd所获得的数据(chen wh等人,hum vaccines immunother.2014,10(3):648-58)，并且通过c-末端在最后的半胱氨酸之后延伸4个残基，因为在文献中存在几个例子，其中在微生物宿主中成功地表达了具有该c-末端的rbd(premkumar l等人,sci immunol.2020,5(48):1-15；malladi sk等人,biorxiv[internet].2020jan 1)。
[0100]
为了获得变体rbd、rbdh、rbdcmych、crbdh6-p、rbdh6-p和crbd，从通过亚磷酰胺方法(beaucage sl,caruthers mh,deoxynucleoside phosphoramidites-a new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis.,tetrahedron letters(1981),22,1859)固相合成的寡核苷酸开始，通过agarwal等人(agarwal kl等人,(1970),nature 227,27-34)的方法，以化学方式合成所述基因，所述寡核苷酸用于获得侧翼为sap i限制位点的dna片段，其编码所述变体并且允许其插入到载体ppiczalfaa(invitrogen corp.usa)中以便与编码酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)的α交配因子的序列相融合。在变体crbdh6-h和rbdh6-h的情况下，还通过上面所提及的方法以化学方式合成了每个片段，这些片段以与人蛋白质lrp1的信号肽(seq id no:9)的融合物来编码它们，其侧翼为
bamh i和xba i限制位点。
[0101]
在变体rbd、rbdh、rbdcmych、crbdh6-p、rbdh6-p和crbd的情况下，将载体ppiczalfaa(invitrogen corp.usa)通过聚合酶链式反应(pcr)来进行扩增(saiki,r.k.等人,(1985)
‘
enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia’,science,230(4732),第1350-1354页)，其中使用high fidelity pcr试剂盒(new england biolabs inc.,usa)和引物寡核苷酸(seq id no:7和seq id no:8)，其引入与在先前所生成的合成片段中存在的那些互补的sap i位点。在用sap i(new england biolabs inc.,usa)在由制造商所建议的条件下消化通过pcr扩增出的ppiczalfaa，以及编码变体rbd、rbdh、rbdcmych、crbdh6-p、rbdh6-p和crbd的片段后，将经消化的每个片段独个地以酶促方式连接至ppiczalfaa/sap i，为此使用t4 dna连接酶(promega corp.usa)，也是在由制造商所建议的条件下。
[0102]
在变体crbdh6-h和rbdh6-h的情况下，用酶bamh i和xba i(new england biolabs inc.,usa)消化载体pcdna3(invitrogen corp.,usa)，并且独个地用t4 dna连接酶(promega corp.usa)在由制造商所建议的条件下连接至事先同样地进行消化的关于这些变体的合成片段。
[0103]
在所有情况下，按照sambrook等人(sambrook j,fritsch ef,maniatis t.molecular cloning:a laboratory manual.new york,usa:cold spring harbor laboratory press,1989)，将所获得的反应物转化到大肠杆菌(escherichia coli)菌株dh5alfa中(匿名(1986)
‘
brl puc host:e.coli dh5αcompetent cells’,focus,8(2),第9页)，并且在分离出在几个在选择培养基上获得的菌落中存在的质粒的dna后，将样品通过限制分析进行调查。将几个得自每个转化的重组质粒(其限制模式与对于重组克隆所预期的相一致)的序列通过自动测序来进行验证，并且对于每个反应选择一个代表性克隆，其序列与所预期的相一致。所得的质粒的总体示意图显示在图4中。
[0104]
为了产生变体rbd、rbdh、rbdcmych、crbdh6-p、rbdh6-p和crbd，事先将相应的质粒用限制酶pme i(new england biolabs inc.,usa)在由制造商所指示的条件下进行消化，并且通过由wu等人(wu,s.和letchworth,g.j.(2004),biotechniques,36(1),第152-4页)所描述的程序转化到甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母x-33菌株中(higgins,d.r.等人,(1998)
‘
small vectors for expression based on dominant drug resistance with direct multicopy selection’,pichia protocols.new jersey:humana press,第41-54页)，用100μg/ml的zeocina
tm
(invitrogen corp.,usa)来选择转化体。将从每个质粒的转化中得到的菌落接种在2l锥形瓶中的200ml的bmgy培养基(pichia expression kit.a manual of methods for expression of recombinant proteins in pichia pastoris.version m 011102 25-0043,invitrogen corp.,uas,2002)之中，并且在28℃,180rpm下进行生长直至在600nm处的8的光密度(od)，之后通过在3000
×
g,4℃下离心10分钟来收获细胞并且重悬浮在200ml的bmmy培养基(pichia expression kit.a manual of methods for expression of recombinant proteins in pichia pastoris.version m 011102 25-0043,invitrogen corp.,usa,2002)中，将其转移至2l锥形瓶。将所得的经接种的培养物在28℃,180rpm下温育72小时，每24小时添加甲醇至0.5％(v/v)的最终浓度。在该
时间段后，将培养物在3000
×
g,4℃下离心20分钟。将上清液通过0.22μm的膜进行过滤，并且通过渗滤在50mm磷酸盐缓冲液(ph 8),300mm nacl,10mm咪唑中进行平衡。
[0105]
为了产生变体crbdh6-h和rbdh6-h，通过聚乙烯亚胺方法(pei)(boussif,o.等人,(1995)
‘
a versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo:polyethylenimine.’,proceedings of the national academy of sciences of the united states of america,92(16),第7297-301页)将质粒pcdna3-crbdh6-h和pcdna3-rbdh6-h转化到细胞系hek293(graham,f.l.等人,(1977),journal of general virology,36(1),第59-72页)和cho(wurm,f.,hacker,d.nat biotechnol 29,718-720(2011))中。在这两种情况下，细胞都在补充有10％胎牛血清(natocor,usa)和110mg/l丙酮酸钠的、具有4.5g/l葡萄糖的dmem培养基(thermofisher scientific,usa)中在37℃下在5％ co2中进行培养。让细胞生长72小时，并且在通过0.22μm的膜进行过滤后，将培养物上清液通过渗滤在50mm磷酸盐缓冲液(ph 8),300mm nacl,10mm咪唑中进行平衡。
[0106]
在所有情况下，按照制造商的说明书，使用ni-nta琼脂糖(qiagen benelux b.v.,the netherlands)，将在磷酸盐缓冲液中进行平衡的制备物通过金属螯合亲和色谱法(sulkowski,e.(1985)purification of proteins by imac.trends biotechnol.3,1-7)进行纯化。使所得的制备物经历反向疏水相互作用色谱法的最后一个步骤，具有c4的配体密度和15至20μm的颗粒大小，其中将基质在0.5％v/v的三氟乙酸(tfa)溶液(溶液a)中进行平衡并且用具有1％(v/v)tfa的乙腈溶液(溶液b)施加梯度40分钟。在消除乙腈和将最终样品在20mm tris-hcl(ph 7.4)缓冲液中进行调适后，rbd变体处于大于或等于0.7mg/ml的浓度和98％-99％的纯度。
[0107]
实施例3.由hbcag和包含rbd区段的嵌合蛋白crbdh6构成的杂合纳米颗粒的形成
[0108]
为了监测本发明的嵌合蛋白crbdh6与hbcag纳米颗粒的结合，使用分析柱superdex75 10/30通过凝胶过滤色谱法来进行研究。以0.9ml/分钟的流速使用pbs作为运行缓冲液，并且在214nm下进行检测。将柱子用general electric
tm
的低分子量试剂盒的几种标准蛋白质进行校准(图5的插图)，证明了在所使用的运行条件下，按照分子量很好地区分所述嵌合蛋白crbdh6的单体、二聚体和三聚体(或高于三聚体的种类)。
[0109]
在第一个实验中，分析了三个样品：蛋白crbdh6-cho(在cho细胞中表达的)、hbcag纳米颗粒和两者之间的复合物，所有样品都存在于磷酸盐缓冲液(ph 7.4)中。所分析的蛋白质的浓度为4μm(对于crbdh6-cho)和20μm(对于hbcag)，这表明在反应中后者五倍过量。在色谱法分析之前，将所述三个样品在37℃下温育2小时。如在图5中所显示的，蛋白crbdh6-cho的大多数种类为单体，虽然也观察到二聚体和三聚体(或多聚体)的存在。具有大于单体的大小的种类的出现不是在37℃下进行温育的结果，因为也在环境温度(24℃，未显示)下也观察到。凝胶过滤的一个内在特征是在运行期间产生样品的稀释效应，在该情况下，对于rbd蛋白的单体的峰所计算的稀释因子相应于15倍。这表明蛋白质的最终有效浓度小于267nm，并且蛋白质的缔合常数对于检测在体积亚微摩尔浓度范围内的二聚体和更大大小的种类的出现来说是足够高的。另一方面，hbcag在柱子的排阻体积中迁移，这与下述事实相一致：该蛋白质形成具有高于20nm的大小的纳米颗粒，其由数百单体组成(240条链，在t4二十面体对称的情况下)。复合物(hbcag纳米颗粒和crbdh6-cho)的色谱图表明，嵌合蛋白crbdh6-cho与hbcag纳米颗粒相结合，相当大的部分在最终稀释度下保持缔合(尽管由
于稀释而解离)，并且暗示了在体积亚微摩尔浓度范围内的缔合常数。还观察到，二聚体信号的相对降低比单体的更大，这与本发明的杂合纳米颗粒的设计的内在稳定化的原理相一致。
[0110]
接下来，研究了在巴斯德毕赤酵母中产生的嵌合蛋白crbdh6-p以及其在37℃的温度下与hbcag纳米颗粒的缔合。在该情况下，蛋白质浓度为3.4μm(对于crbdh6-p)和20μm(对于hbcag)。如在图6a中所观察到的，蛋白crbdh6-p的主峰相应于蛋白crbdh6-h的二聚体的大小。尽管如此，不能得出所述信号真实地相应于二聚体的结论。
[0111]
通过嵌合蛋白crbdh6-p和crbdh6-h的sds-page电泳进行的研究(图8)证明，蛋白crbdh6-p以显著地大于crbdh6-h的大小进行迁移，该差异归因于前者的较高的糖基化程度，因为这两种蛋白质的相对电泳迁移在去糖基化之后是相似的。独立于蛋白crbdh6-p的迁移的不确定性，在色谱图谱线中清楚地检测到一个较少级分，其相应于较大分子量的大小，这确证了处于在体积亚微摩尔浓度范围内的有效浓度的所述种类的存在。在色谱法中复合物hbcag-crbdh6-p的谱线清楚地表明，蛋白crbdh6-p与hbcag相结合，这是通过相应于所述蛋白质的信号的减小和hbcag信号的定量增加而发觉的。
[0112]
复合物的形成也在50℃的温度下发生，如在图6b中所观察到的。与hbcag形成复合物的嵌合蛋白crbdh6-p的级分在这种情况下更加大(大约50％)，这表明平衡常数kd在体积亚微摩尔浓度范围内(大约200nm)，如果考虑到3.4μm的所述蛋白质的起始浓度的15倍稀释。按照这个分析，相互作用的“亲和力”远大于所预期的，并且因此未被预见到，其中假定按照现有技术，与hbcag相结合的肽(本发明的模块(d))的亲和力值为12μm。这表明所述嵌合蛋白的设计的另外的稳定化(在该情况下，内在的)保证了与hbcag纳米颗粒的结合亲和力的至少50倍的增加。
[0113]
图6c显示了类似于先前的两个实验的实验的结果，但是其中样品的温育在18℃下进行2小时。然而，在这种情况下未观察到复合物的形成，这表明温度在蛋白crbdh6-p与hbcag纳米颗粒之间的相互作用中发挥了至关重要的作用。也未观察到蛋白crbd与hbcag的缔合(图7)，所述蛋白crbd在n-末端处包含与hbcag纳米颗粒的刺突相结合的模块(b)，但是不具有在本发明中所描述的柔性衔接子环(d)。这表明，仅存在序列wsffsni(其能够与hbcag纳米颗粒相结合，以合成肽的形式)在融合蛋白的情况下不是足够的。在这些情况下，需要间隔子环的适当设计和一套新要素，如在本发明中所描述的。
[0114]
如这些实验的结果所显示的，温度在杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6-p的形成中是一个关键因素，在18℃下的两小时温育未观察到蛋白crbdh6-p的缔合，而与hbcag纳米颗粒相缔合的嵌合蛋白crbdh6-p的级分在50℃下比在37℃下多。本发明的嵌合蛋白的设计包括将柔性环掺入到rbd结构域的序列的两个末端处，其具有为了有利于复合物的形成和稳定性而特别设计的立体化学特征。衔接rbd结构域与hbcag结合模块(b)的模块(d)富含甘氨酸，并且包含几个丝氨酸残基以增加可溶性。在更高的温度下，衔接子环的运动增加，从而增加其柔韧性并且推断出hbcag结合模块的更大的可接近性和其对于与纳米颗粒相互作用的可得性。在这个意义下，还指出下述事实：hbcag结合序列包含芳香族氨基酸(一个trp和两个phe)和极性氨基酸(两个ser和一个asn)，其在蛋白质-聚糖相互作用中是有利的。如果考虑到这些嵌合蛋白以高糖基化含量进行表达，那么非常可能的是，该区段与本身的糖相互作用并且被陷捕在局部能量最小值中，具有一定水平的激活屏障，这需要热能以便对于与
hbcag相互作用来说是可接近的。在50℃下所观察到的另一个差异为蛋白crbdh6-p的聚集物级分相对于37℃的温度而言减少，可能的是区段(d)和(b)有助于蛋白质的低稳定的二聚体/三聚体/寡聚体的形成，它们可以通过热运动而“溶解”。
[0115]
crbdh6-p和crbdh6-h与hbcag的杂合纳米颗粒的形成阻断后者与抗-hbcag抗体的相互作用。六组氨酸模块(c)和与金属的配位在复合物的外在稳定化中的作用(对于二聚化/三聚化)。
[0116]
为了研究蛋白crbdh6-p与hbcag的缔合，使用竞争性elisa。首先，用在兔子中获得并且经纯化的(大于95％的纯度)特异性多克隆抗体包被96-孔微量培养板。将所述多克隆抗体在包被缓冲液(0.1m碳酸盐/碳酸氢盐，ph 9.6)中稀释至0.5μg/ml的最终浓度(100μl/孔)。将微量培养板在37℃下温育2小时，并且接着用洗涤缓冲液(pbs/0.05％ tween 20)进行洗涤。接下来，添加200μl/孔的封闭缓冲液(pbs/0.05％ tween 20/0.05％脱脂乳)并且将微量培养板在25℃下温育1小时，并且再次洗涤两次。平行地，在该时刻之前，以不同浓度制备包含rbd的蛋白质(从15μm至0.12μm，在pbs/0.05％tween 20中进行稀释)以及50ng/ml的恒定浓度的hbcag，并且在37℃下温育2小时。在该时刻，施加100μl/孔的包含rbd的蛋白质与hbcag的不同混合物，接着将微量培养板在25℃下温育1小时并且洗涤五次。接下来，施加80μl/孔的与过氧化物酶相缀合的抗-hbcag多克隆抗体(在pbs/0.05％ tween 20中的1/5000稀释物)。接下来，将微量培养板在25℃下温育1小时，并且进行洗涤，添加(100μl/孔)过氧化物酶的生色底物溶液(包含tmb的h2o2)。最后，向平板添加h2so4以终止反应。用微量培养板阅读器(thermo-scientific,finland)读取在450nm处的吸光度值。
[0117]
研究了五种蛋白质：crbdh6-cho、crbdh6-p以及对照rbd、crbd和rbdcmych，在实施例2中所描述的。变体rbd和rbdcmych不具有模块(b)和(d)，并且因此不具有hbcag结合序列；相反，crbd具有hbcag结合模块(b)，但是没有衔接子环，模块(d)。
[0118]
如在图9中所观察到的，通过形成杂合纳米颗粒，蛋白crbdh6-cho和crbdh6-p能够以剂量依赖性方式阻断多克隆抗体与hbcag的相互作用，显示出在低的体积微摩尔浓度范围内的ic50。阻断的有效性的原因归于两个因素：1)模块(b)与hbcag刺突的斑片相结合，后者是该抗原的免疫优势表位，大部分的抗-hbcag抗体都针对其；和2)蛋白crbdh6-cho和crbdh6-p被放置在hbcag纳米颗粒的刺突上，从而产生在阻断抗-hbcag抗体中有效的冠状物。
[0119]
在该测定法中，在相同的实验条件下，蛋白crbdh6-cho比crbdh6-p在抑制方面更有效。后者仅取得部分抑制，这可能归因于，该蛋白质的较高的糖基化程度通过位阻而影响了可接近的结合位点的数目。尽管如此，向蛋白crbdh6-p添加ni引起结合位点的最大占据增加至与crbdh6-cho相似的水平，和以体积亚微摩尔浓度水平实质性增加ic50。该观察结果证明，组合模块(c)和(e)的设计使得能够增加这些蛋白质与hbcag的复合物的稳定性(外在的)，通过经由六组氨酸区段的配位键而形成蛋白crbdh6的二聚体/三聚体。
[0120]
在图9中还看到，蛋白crbd在所检定的浓度下不抑制抗-hbcag抗体的结合。因此，包含hbcag结合模块(b)不足以实现与纳米颗粒的有效结合。在这方面，从证明了具有序列wsffsni的肽与hbcag相结合的能力的现有技术出发未预测到本发明的嵌合蛋白的特性。蛋白crbd包含无间隔子地与rbd结构域相结合的模块(b)，因此非常可能的是通过分子内相互作用而被立体地阻塞，因此其与hbcag刺突的结合位点相互作用是不可能的和/或结合亲和
力受到具有同样特征的不利约束影响。本发明包括了富含甘氨酸的柔性间隔子(d)的设计，所述甘氨酸赋予其最大柔韧性和突出以实现有效的结合。
[0121]
实施例4.嵌合蛋白crbdh6-h和crbdh6-p以及hbcag与这些蛋白质的杂合纳米颗粒的受体ace2结合测定法
[0122]
这些测定法的目的是表征在本发明的嵌合蛋白的一些变体与固定化在芯片表面上的受体ace2之间的相互作用。为此目的，使用下列样品：1)嵌合蛋白ace2-mfc(固定化的配体)，其通过组合途径在哺乳动物细胞系(hek293)中获得，以在磷酸盐缓冲液(ph＝7.2)中0.93mg/ml的浓度；2)嵌合蛋白crbdh6-h和crbdh6-p；3)阴性对照egfhr和diii(dv)-h6，其分别在酿酒酵母中和在大肠杆菌中通过重组途径获得。
[0123]
在biacore上的分析：所述分析在生物传感器biacore x(general electric,usa)上进行。作为运行缓冲液，使用pbs(sigma-aldrich,usa)。固定化程序在25℃下以5μl/分钟的流速来进行。通过施加35μl的在水中的0.2mol/l的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(sigma-aldrich,usa)和50mmol/l的n-羟基琥珀酰亚胺(sigma-aldrich,usa)的溶液来活化cm5芯片的表面。然后，施加在10mmol/l ch3coona(ph 5.0)中的30μg/ml ace2-mfc的溶液。最后，注射35μl的1mol/l的乙醇胺(ph 8.0)以封闭仍然活化的nh2基团。在被用作阴性对照的通道中，仅进行活化注射和用乙醇胺的封闭，其中采用相同的流速和注射体积。以10μl/分钟的流速施加每个样品120秒，然后替换为运行缓冲液，并且在另一个120秒期间记录解离。对于表面的再生，施加5μl的在水中的10mm naoh。对于动力学分析，以从2μm至0.015μm的系列稀释度施加每个样品。每个试验重复两次，结果相似。为了计算常数，考虑了每种蛋白质的至少5条不同浓度曲线。结果的分析通过程序biaevaluation v4.1(general electric
tm
,usa)来进行。从1:1朗格缪尔调整开始测定所研究的相互作用的缔合(ka)和解离(kd)速率以及亲和力常数(kd)。这依照以前对于该配体-受体对所报道的biacore研究来进行，以相似的实验样式(wang q等人,cell(2020),181:894-904；jun lan等人,structure of the sars-cov-2spike receptor-binding domain bound to the ace2 receptor.nature(2020),581:215-220)。
[0124]
呈现了对于蛋白crbdh6-h和crbdh6-p以及用作对照的蛋白质(在溶液中的分析物)的测定的结果，以使用固定化在芯片表面上的受体ace2-mfc的实验样式。对于相应于每种所分析的蛋白质的测定之一所获得的传感图以及通过调整至1:1朗格缪尔数学模型而获得的曲线(包括在该图中)显示在图10中。将蛋白质样品溶解在基于柠檬酸盐(17mm)和磷酸盐(66mm)的缓冲溶液(ph＝6.2)中来进行研究，在所评价的浓度范围内检测信号的实质变化(图10)，这使得能够计算对于该相互作用的缔合和解离速率以及解离常数(表2)。另一方面，在实验中用作阴性对照的蛋白质仅显示出接近基线的信号。
[0125]
表2.对于在biacore x上进行分析的样品中的每一个而获得的rmax、缔合和解离速率(ka和kd)以及平衡解离常数(kd)的值
[0126]
nd：未测定
[0127]
所获得的应答取决于在溶液中的和饱和的分析物的浓度，这表明这是配体-受体特异性相互作用。缔合速率在105m-1
·
s-1
的级别，达到了缔合相的在25和30秒之间的平衡。另一方面，解离具有大约10-6
s-1
的值，比在文献中对于rbd-ace2相互作用(在biacore型传感器上以实验方式估计的)所报道的慢3个量级。因此，从所进行的估计得到的kd在低体积纳摩尔浓度，几乎体积皮摩尔浓度(10-11
m)级别内。在这种情况下，计算出的亲和力常数的值更接近在计算机芯片上的预测，而不是以实验方式获得的值。该结果暗示，包含rbd结构域的嵌合蛋白对于受体ace2的亲和力是高的，无论为了获得其所使用的表达系统为何。两种嵌合蛋白crbdh6-p和crbdh6-h都显示出高的对于固定化在芯片上的受体ace2的亲和力(分别为kd＝2.57
×
10-11
和kd＝1.54
×
10-11
m)，无论为了获得其所使用的宿主系统为何。
[0128]
接下来，研究了杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6-h与受体ace2的结合。图11显示了在柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液(ph 6.2)中研究的样品的传感图。所估计的平衡常数的值为kd＝2.94
×
10-11
m(χ2＝9.75)。如可以看到的，无论以图形形式还是以所估计的kd值，嵌合蛋白crbdh6-h与hbcag的缔合都不影响在所研究的系统中的rbd-ace2结合的亲和力。
[0129]
实施例5.在用在巴斯德毕赤酵母中表达的包含rbd结构域的重组蛋白的两个变体通过肠胃外途径进行接种的小鼠中的免疫应答的评价
[0130]
预先，从在巴斯德毕赤酵母中表达其开始通过重组途径获得两个包含rbd结构域的重组蛋白变体(表1)并且纯化至》90％的纯度，从而获得了具有非常低的致热原水平的产物。这两种蛋白质为：1.rbd，其具有sars-cov-2的rbd结构域的序列；和2.crbdh6-p。嵌合蛋白crbdh6-p使得能够通过金属离子(即，ni
2+
)的螯合来获得蛋白质三聚体。
[0131]
为了研究在通过肠胃外途径进行接种后抗-rbd体液免疫应答的生成，通过肌内(i.m.)途径接种了10只6-8周龄的雌性balb/c小鼠(cenpalab,cuba)。采用0天、14天方案，100μl的体积，并且对抗原佐以1mg/ml的氢氧化铝(alooh)(superfos biosector a/s,vedbaek,denmark)。按照免疫原的组为：1.安慰剂；2.rbd-p(20μg)；和3.crbdh6-p(20μg)。括号中的量反映了剂量/动物。安慰剂组(g1组)与其余免疫原同样地进行制备，但是没有抗原。
[0132]
从眶后血管丛收集血液，以7830g离心10分钟，并且将血清保存于-20℃直至其评价。
[0133]
通过elisa来测量特异性抗-rbd igg应答。用在包被缓冲液(碳酸盐-碳酸氢盐，ph 9.6)中的3μg/ml的rbdhfc(cim,cuba)以100μl/孔包被96-孔平板(high-binding
tm
,costar,austin,tx,usa)，并且在37℃下温育1小时。在37℃下用在pbs中的2％脱脂乳封闭这些平板1小时。接下来，将所述平板与在稀释缓冲液(1％脱脂乳和1％tween-20，在pbs中)中稀释的血清样品一起在37℃下温育1小时。将与过氧化物酶相偶联的在绵羊中针对igg
总
而获得的抗体的缀合物(sigma,milwaukee,wi,usa)以1:5000稀释度在37℃下温育1小时。用底物溶液使反应显色10分钟。最后，在平板阅读器(suma pr-621型,centro de inmunoensayo,cuba)上在492nm的波长下测量孔的吸光度。在步骤之间进行至少五次洗涤。为了检测鼻咽冲洗物中的iga，使用相同的程序，但是在没有事先稀释的情况下评价样品，并且使用处于1:5000稀释度的在绵羊中获得的抗小鼠iga缀合物(sigma,milwaukee,wi,usa)。
[0134]
igg
总
的滴度通过下述方式来计算：在具有已知滴度的血清的标准曲线的稀释度的
log与在492nm处的吸光度的log进行的线性回归中，内插在固定血清稀释度下的吸光度值的log。然后，找到内插结果的逆对数并且乘以血清稀释度。对于内插，选择高于以1:100稀释度的阴性对照(未经免疫接种的动物的血清的均质混合物)的吸光度两倍的最大血清稀释度。
[0135]
中和测定法以下面的方式来进行。简而言之，在96-孔平板(costar,usa)中在补充有5％胎牛血清、25mm谷氨酰胺、80μg/ml庆大霉素和2μg/ml碳酸氢盐的dmem培养基中接种总共20000个细胞/孔。在37℃下在5％ co2和95％湿度的气氛中培养24小时后，弃去上清液并且向平板添加事先在37℃下温育1小时的血清系列稀释物(例如，从1:20开始的1:2系列稀释物)，以及先前测定的并且诱导vero细胞单层100％破裂的固定病毒载量。在第四天，添加在sstf中的0.02％的中性红。在25
±
3℃下温育一小时后，用sstf洗涤平板并且在25
±
3℃下添加裂解溶液(50％乙醇、1％冰醋酸)15分钟。最后，在540nm下进行光密度的读取。作为中和滴度，考虑具有大于截止值的光密度值的所评价的最高血清稀释度，所述截止值被计算为细胞对照的孔的光密度值的平均值除以2。
[0136]
统计学软件包graphpad prism 8.4.3版(graphpad software,san diego,usa)用于获得所述值的描述性参数并且实施组之间的比较。对于抗-rbd滴度的比较，在验证是否具有正常分布之前将所述值转换为log。对于阴性血清，分配10的任意滴度。用达戈斯蒂诺(d'agostino)和皮尔逊(pearson)检验来验证数据的正态性。然后，对于组之间的比较，使用曼-惠特尼(mann whitney)检验。为了比较中和结果，使用费希尔(fisher)精确检验。认为p《0.05是显著的。
[0137]
在第二个剂量后十天，观察到相对于用rbd进行接种的小鼠而言，在用crbdh6-p进行免疫接种的小鼠的血清中igg滴度的增加倾向，但是未达到统计学显著性(图12)。为了验证所生成的抗-rbd抗体的功能性，采用中和测定法。在表3中显示了在第二个剂量后10天获得的结果。频率分析证明，在用嵌合蛋白crbdh6-p进行免疫接种的小鼠的组中具有相比于rbd-p组而言更高比例的这样的动物，所述动物的血清报告了可检测的中和水平，直至等于或高于1:320的稀释度(p＝0.0031，费希尔精确检验)。
[0138]
表3.在第二个剂量后10天获得的独个血清的体外中和
[0139]
血清/动物安慰剂rbdcrbdh6-p1《20801602《201603203《204012804《2016012805《20806406《201601607《20406408《2020809《2016064010《20401280
[0140]
结果呈现为在其之下仍观察到中和的最终稀释度。
[0141]
基本上，所获得的结果表明，用嵌合蛋白crbdh6-p的特征性的三聚化生成了具有
h2so4。最后，在平板阅读器(clariostar,bmg labtech,usa)上在492nm的波长下测量孔的吸光度。在步骤之间进行至少五次洗涤。将抑制百分比估计为以百分比表示的在与血清一起进行温育的孔中的吸光度和其中rbd-ace2相互作用为最大的孔(无血清)中的吸光度之间的分数。体外中和测定法如在实施例5中所描述的那样来进行。
[0146]
统计学软件包graphpad prism 8.4.3版(graphpad software,san diego,ca,usa)用于获得所述值的描述性参数并且实施组之间的比较。对于抗-rbd滴度的比较，在验证是否具有正常分布之前将所述值转换为log。对于阴性血清，分配10的任意滴度。用达戈斯蒂诺和皮尔逊检验来验证数据的正态性。然后，对于组之间的比较，使用anova检验。作为事后检验，使用tukey检验。为了比较rbd-ace2相互作用的抑制百分比，使用具有welch校正的anova检验，并且作为事后检验，使用dunnett检验。认为p《0.05是显著的。
[0147]
在第二个剂量后十天，观察到相对于其中嵌合蛋白crbdh6的不同变体未与hbcag一起进行接种的其各自的对照组(g3和g4)和其中未获得杂合纳米颗粒的组(g7和g8)而言，在用包含杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6的免疫原进行免疫接种的小鼠(g5和g6)的血清中igg滴度的显著增加(p《0.0001，anova)(图13)。
[0148]
为了验证所生成的抗-rbd抗体的功能性，使用在rbd蛋白和其受体(ace2分子)之间的结合的抑制测定法。在图14中显示了在第二个剂量后10天获得的结果。如所预期的，组之间的比较给出了与所观察的igg滴度相一致的结果。在这样的意义下，再次在包含杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6的组(g5和g6)中观察到更高的抑制百分比(p《0.0001，具有welch校正的anova检验)。重要的是指出，在多克隆血清的抑制能力与中和测定法之间具有相关性(zang j等人,cell discov 2020,6:61)。因此，该抑制测定法可以被认为是血清的中和能力的“替代标志物”。
[0149]
除了rbd-ace2结合的抑制测定法之外，还进行了sars-cov2病毒感染的体外中和测定法。仅评价了其中使用在巴斯德毕赤酵母中产生的重组蛋白的变体(g3、g5和g7)和对照(g1和g2)的组(表4)。如所预期的，与在抑制测定法中所获得的相一致，观察到相比于其他组而言，在用包含杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6-p的免疫原进行接种的组(g5)中存在更大比例的具有≥640的中和滴度的血清(p＝0.0351，费希尔检验)。
[0150]
表4.在2个剂量后10天获得的独个血清的体外中和
[0151]
[0152]
结果呈现为在其之下观察到中和的最终稀释度。
[0153]
所获得的全体结果表明，包含杂合纳米颗粒crbdh6的免疫原通过肠胃外(即，肌内)途径的免疫接种诱导了在动物血清中特异性抗-rbd igg的滴度以及其病毒中和能力的显著增加。该免疫增强效应仅在杂合纳米颗粒存在的情况下取得，因为在用hbcag与重组蛋白rbdh6-h和rbdh6-p(其不与hbcag纳米颗粒相缔合)的混合物进行免疫接种的动物中，观察到明显更低的免疫应答。此外，对于这些杂合纳米颗粒所观察到的免疫增强效应不随氨基酸序列的差异也不随所使用的嵌合蛋白crbdh6的每一个变体的翻译后修饰而变化。在这个意义下，重要的是强调，一个变体(crbdh6-p)在甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母中表达，而另一个变体(crbdh6-h)在人来源的细胞系中表达，因此在两个重组蛋白中的糖基化模式是不同的。
[0154]
实施例7.在用重组嵌合蛋白crdbh6的不同变体以及杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6通过粘膜途径进行接种的小鼠中的免疫应答的评价
[0155]
在实施例6中证明，当通过肠胃外途径进行免疫接种时，杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6的形成可以更加多地增加抗-rbd免疫应答以及还有血清的中和能力。接下来，探究通过粘膜途径(鼻内)是否获得相同的结果。
[0156]
通过鼻内(i.n.)途径接种了10只6-8周龄的雌性balb/c小鼠(cenpalab,cuba)。使用0天、14天方案和50μl的体积，在柠檬酸盐缓冲液(ph 5.2)中稀释所述抗原。按照免疫原的组为：1.安慰剂；2.hbcag(阴性对照组)；3.crbdh6-p(20μg)；4.crbdh6-h(20μg)；5.hbcag(5μg)-crbdh6-p(20μg)；6.hbcag(5μg)-crbdh6-h(20μg)；7.rbdh6-p(20μg)+hbcag(5μg)；和8.rbdh6-h(20μg)+hbcag(5μg)。
[0157]
如在实施例6中所描述的那样来获得血清。鼻咽冲洗物按照cho等人在2012年所描述的来制作(cho sh,oh sy,zhu z,lee j,lane ap(2012).plos one 7(4):e35114.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0035114)并且保存于-20℃直至其评价。特异性抗-rbd igg应答和rbd-ace2相互作用的抑制如在实施例6中所描述的那样来进行评价。
[0158]
统计学软件包graphpad prism 8.4.3版(graphpad software,san diego,ca,usa)用于获得所述值的描述性参数并且实施组之间的比较。对于抗-rbd滴度的比较，在验证是否具有正常分布之前将所述值转换为log。对于阴性血清，分配10的任意滴度。用达戈斯蒂诺和皮尔逊检验来验证数据的正态性。然后，对于组之间的比较，使用kruskal-wallis检验，并且作为事后检验，使用dunn检验。作为事后检验，使用tukey检验。为了比较rbd-ace2相互作用的抑制百分比，使用具有welch校正的anova检验，并且作为事后检验，使用dunnett检验。认为p《0.05是显著的。
[0159]
关于通过i.n.途径进行接种的组，在第二个剂量后十天，也观察到相对于其中嵌合蛋白crbgh6的变体未与hbcag一起进行接种的其各自的对照组(g3和g4)和其中不包含杂合纳米颗粒的组(g7和g8)而言，在用包含杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6的样品进行免疫接种的小鼠(g5和g6)的血清中igg滴度的显著增加(p《0.0001，kruskal-wallis)(图15)。此外，由于鼻接种的目的是在鼻咽粘膜水平上发展出抗体应答，因此对于随机选择的每组六只动物用100μl的生理盐水溶液(0.9％ nacl)制作鼻咽冲洗物。然后，通过elisa来评价特异性抗-rbd iga抗体应答(图16)。仅在用包含杂合纳米颗粒的免疫原进行接种的组中观察到
100％的血清转变。此外，这些组(g5和g6)的吸光度平均值为在g7和g8组中所获得的》3.5倍，后者的血清转变水平是非常低的(33％)。
[0160]
为了验证在血清中所生成的抗-rbd抗体的功能性，在通过i.n.途径进行接种后，使用在rbd蛋白和其受体(ace2分子)之间的结合的抑制测定法。在图17中显示了在第二个剂量后10天获得的结果。如所预期的，组之间的比较给出了与所观察到的igg滴度相一致的结果。在这样的意义下，用包含杂合纳米颗粒的免疫原进行接种的组为报告更高值的组(p《0.0001，具有welch校正的anova检验)。在其余组中没有与对照g1和g2的差异，因此可以确认没有可检测的应答。
[0161]
所获得的全体结果表明，包含杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6的免疫原通过粘膜(即，鼻内)途径的免疫接种也诱导了在动物血清中特异性抗-rbd igg的滴度的显著增加。此外，在鼻内接种后，在100％的动物中在鼻咽区域中生成了iga类型的抗-rbd抗体。这些抗体可能帮助在粘膜中制止病毒感染。杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6的这种经改善的免疫增强效应是用未与hbcag纳米颗粒相缔合的rbd变体无法取得的，后者诱导明显更低的免疫应答。此外，在使用无论嵌合蛋白crbdh6-p还是嵌合蛋白crbdh6-h(其以具有不同的糖基化模式为特征)而形成的杂合纳米颗粒中也观察到该免疫增强效应。实施例8.诱导高度强有力的中和应答的杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6的形成。嵌合蛋白crbdh6和杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6的四级和超分子结构。
[0162]
本发明的一个中心要素为这些嵌合蛋白缔合为同二聚体、三聚体和/或多聚体(其模拟在该病毒的s蛋白的天然结构中所观察到的分子内相互作用)的能力。如在发明描述中和在实施例4中所陈述的，模块(b)和(c)通过外在缔合而有助于rbd结构域以与在s蛋白中所观察到的类似的方式介导其缔合的先天(内在)倾向。hbcag结合区段即模块(b)具有富含倾向于与糖类相互作用的芳香族和极性氨基酸的氨基酸组成(banno m等人,computational biology and chemistry,66,36-43,2017)，并且因此可以有助于这些缔合，因为rbd结构域包含两个糖基化位点。除了其通过与过渡金属形成配位键而形成二聚体和三聚体的能力之外，包含六组氨酸序列的模块(c)还倾向于与碳水化合物相互作用。另外，hbcag结合区段即模块(b)为七肽，其中七个残基中的四个为：一个trp、两个phe和一个ile，所有都倾向于也通常与表面活性剂和两亲化合物(例如聚山梨酯、脂肪酸、磷脂等)相互作用，尤其是当这些分子在高于其特定cmc的浓度下形成胶束时。在这个意义下，在本发明的实施例3中显示，在0.05％ tween-20这种表面活性剂存在下杂合纳米颗粒的形成对于crbdh6的存在妨碍抗-hbcag抗体的结合来说是足够稳定的。蛋白crbdh6的模块(b)可以与所述表面活性剂(例如tween-20)胶束直接缔合，后者可以充当用于rbd结构域的缔合的外部支持物。另一方面，模块(c)可以通过与金属形成配位键来介导二聚体/三聚体的形成，并且对蛋白crbdh6的四级结构和/或杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6提供额外的稳定性。
[0163]
在本实施例中我们提供了物理化学、生物物理学和生物学特征的额外证据，所述特征涉及嵌合蛋白crbdh6以及杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6的四级结构域，在本发明中所设计的嵌合蛋白crbdh6的模块的作用，和其对于导致形成杂合纳米颗粒(其诱导高度强有力的免疫应答)的这些蛋白质的结构-功能关系的影响。
[0164]
通过dls(zetasizer nano,malvern instruments,uk)的嵌合蛋白crbdh6-p和crbdh6-h的分析显示，在生理条件(pbs缓冲溶液，ph 7.4)下在hbcag不存在下这些蛋白质
缔合为二聚体，三聚体，多聚体，和以较小程度，超分子聚集体。在图18a中看到，在pbs(0.3x)中的蛋白crbdh6-p主要是单体的。主峰的平均直径为4.8
±
1.2nm，并且从单体的坐标开始估计的流体动力学直径(dh)为4.9nm。从分布的宽度，还似乎共存一定数目的其dh为6.7nm的二聚体。在图18a中还观察到分别为33
±
9nm和176
±
55nm的超分子聚集体，尽管这些是少数，如在图18b的按体积的分布中所观察到的。在cho细胞中表达的蛋白crbdh6显示出相似的行为，尽管大小有点小，如在图8的电泳中所观察到的，这归因于由哺乳动物细胞所掺入的聚糖的较小的大小。
[0165]
在缓冲溶液pbs 0.03％ tween-20和1mm niso
4 ph 7.4存在下，蛋白crbdh6-p显示出7
±
2nm的主峰。考虑到分布的宽度，这与单体(dh＝4.9nm)、二聚体(dh＝6.7nm)、三聚体(dh＝7.3nm)、六聚体(dh＝8.6nm)和直至十二聚体(dh＝11.2nm)的形成相一致。图19f-j显示了在不同的四级结构域状态(从单体直至六聚体和十二聚体)下蛋白crbdh6-p和crbdh6-h的3d模型。
[0166]
图18c显示了杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6-p的形成：hbcag纳米颗粒(12.5um的抗原)具有19.5
±
5nm的大小(在pbs 0.03％tween-20ph 7.4中)，添加在缓冲液pbs 0.03％ tween-20,1mm niso
4 ph 7.4中的蛋白crbdh6-p(6um)引起蛋白crbdh6-p的峰消失和hbcag的峰移动至30
±
10nm的大小，这与在图3中所描述的杂合纳米颗粒的形成是相一致的。
[0167]
杂合纳米颗粒的形成也通过使用蛋白crbdh6-h来获得，如在图18d中所观察到的。在该图中可看到dls光谱，其相应于蛋白crbdh6-h(4.4
±
1nm)、hbcag纳米颗粒(24
±
7.6nm)和杂合纳米颗粒(26
±
6.2nm)的按体积的分布，在所有情况下均溶解在缓冲溶液20mm tris(ph7.4),0.03％ tween-20,12％果糖和1mm niso4中。因此，杂合纳米颗粒在大小方面大于hbcag并且更均一。图18e显示了相应于图18d的相同样品的z电位分析：蛋白crbdh6-h(-8.9
±
7.2mv)、hbcag纳米颗粒(-11
±
7.4mv)和杂合纳米颗粒(-7.7
±
3.4mv)。可以看出，杂合纳米颗粒在静电方面更均一，并且不同于蛋白crbdh6-h和hbcag。还通过透射电子显微术研究了这些样品(图19a-e)。使样品经历负染色的标准程序，并且用配备有透射检测器(在30kv下)的扫描电子显微镜mira3-tescan(tescan,czech republic)拍摄显微照片。颗粒大小分布的分析通过使用图像处理软件包imagej fiji(imaged,nih,wi,usa)来进行。直径的比较用曼-惠特尼双尾检验来进行(认为p《0.05是在统计学上显著的)。
[0168]
虽然杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6-h的平均直径仅稍微大于hbcag纳米颗粒(平均直径27.6nm vs 27.5nm)，但是这些颗粒的直径分布的中位数分别为27.6nm和15.4nm，这与杂合纳米颗粒的较大大小相一致。它们在外观上也有所不同，其中展示出相比于hbcag颗粒而言更不规则的轮廓(图19a-e)。直径的差异
–
杂合纳米颗粒比hbcag纳米颗粒更大
–
也是在统计学上显著的(p＝0.0023)。反过来，杂合纳米颗粒的大小更均一，直径值的标准偏差对于hbcag纳米颗粒来说是更大的(21.1nm vs 16.7nm)。
[0169]
接下来，着手评价金属离子和两亲化合物的存在对于本发明的杂合纳米颗粒的合成过程的影响。特别地，评价了在不同条件下获得的纳米颗粒的稳定性，作为稳定性的标准，采取了纳米颗粒无法被抗-hbcag抗体识别，或者换句话说，蛋白crbdh6阻断所述抗体与hbcag相互作用的能力。在这种情况下，制备不同浓度的crbdh6-h(从3
×
10-6
摩尔/l至0.047
×
10-6
摩尔/l)，然后添加hbcag至50ng/ml的恒定的最终浓度。在缓冲液20mm tris-hcl(ph 7.4)中和在还包含0.01％v/v的tween 20的相同缓冲液中进行稀释。接下来，将样品在37℃
下在摇动下温育2小时。然后，向所制备的不同样品添加znso4至0、0.04和0.2
×
10-3
摩尔/l的最终浓度。与znso4一起的温育在37℃下在摇动下进行30分钟，接着在竞争性elisa中进行分析，如先前在实施例3中所描述的。
[0170]
在图21a中观察到，为了实现嵌合蛋白crbdh6-h与hbcag之间的有效缔合，需要在介质中包括二价金属例如zn
2+
离子。当不包括所述离子时-在tween-20存在或不存在下-未观察到hbcag被抗体识别的可察觉到的抑制。相反，包括处于0.04-0.2
×
10-3
m的浓度的zn
2+
导致抗体与hbcag的结合的80-100％的抑制。无论在0.01％的tween-20存在还是不存在下均获得了所述结果。尽管如此，其中获得较大抑制的条件包括这两个要素：金属和两亲化合物。此外，该实验还确证，与hbcag的缔合需要hbcag结合模块c)的存在，在所检定的任何条件下，蛋白rbdh6-h都不抑制抗体的结合。
[0171]
还通过以水平形式的琼脂糖凝胶天然电泳评价了杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6的形成(li,c.,&arakawa,t.(2019).agarose native gel electrophoresis of proteins.international journal of biological macromolecules,140,668-671)。在这种电泳方法中分子的相对迁移同时取决于其大小和电荷，并且具有可能同时分析本发明的蛋白质和纳米颗粒的优点。蛋白crbdh6与hbcag的缔合反应以与上面在竞争性elisa实验中所描述的相似的形式来进行，其中将zn的浓度固定在0.2mm并且改变c-rbd-h6:hbcag的摩尔比为0.5:1、1:1和2:1m。将反应混合物在37℃下在摇动下温育两小时，接着添加znso4并且在摇动下在37℃下温育另外30分钟。在相似的条件下制备处于与对于缔合(泳道1至3)所使用的浓度相等的浓度的融合蛋白crbdh6-h对照(图21b，泳道4至6)和处于6
×
10-6
m的所使用的恒定浓度的hbcag(泳道7)。图21b的泳道1至3显示了杂合纳米颗粒的形成，这通过位于hbcag的条带上方的弥散斑点的存在来证明。观察到，杂合纳米颗粒的形成在所评价的三个摩尔比下发生，虽然在2:1摩尔/l的crbdh6-h:hbcag摩尔比下是更均一的(泳道1)，其导致更紧凑和强烈的条带。
[0172]
接下来，采用相同的琼脂糖凝胶天然电泳系统，评价了杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6-p-tsazn的形成。在这种情况下，缔合在1:1的crbdh6-p:hbcag摩尔比下在下述中进行：缓冲液20mm tris-hcl(ph 7.4)，1m的zn，并且代替tween 20，采用0.1m的两亲化合物硬脂酸(sa)。还分析了通过蛋白crbdh6-p与0.1m的硬脂酸相缔合而形成的纳米颗粒(crbdh6-p-sa)，不包括hbcag。在图21c中通过在hbcag的条带上方的弥散斑点的存在而证明了杂合纳米颗粒的形成，其中杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6-p-tsazn在泳道1中和纳米颗粒crbdh6-sa在泳道2中。
[0173]
还通过使用同双官能交联化学试剂egs(pierce,usa)证明了蛋白crbdh6-p和crbdh6-h的多聚体种类以及杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6-p的形成。egs使得能够通过与处于距离处的两个赖氨酸残基的反应来稳定蛋白质的聚集形式。
[0174]
以相对于相应的蛋白质而言50:1的摩尔过量使用egs。以在缓冲液0.3x(图版a、c和d)和1x(图版b)pbs(ph 7.4)中的20μmol/l(图版a和b)和6μmol/l(图版c和d)的浓度使用crbdh6-p和crbdh6-h的制备物。在图版c中，添加物是指0.015％ tween-20、12％果糖和3mmol/l niso4。以12.5μmol/l的浓度使用蛋白hbcag。将交联反应在25℃下温育30分钟，并且通过添加缓冲液1m tris(ph8.0)至100mmol/l的最终浓度来终止。用试剂egs来结束反应，使每个样品的等份试样经历12.5％的sds-page凝胶电泳。
igg滴度。如可以在图22a中观察到的，用杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6-h-ptfni(g4)和hbcag-crbdh6-h-ptfzn(g5)进行免疫接种的小鼠发展出了相比于用crbdh6-h(没有hbcag存在)进行接种的组(g3)而言高得多的抗体水平(11.2和22.8倍更高的滴度)(p＝0.0051，g4对g3；和p《0.0001，g5对g3)。金属离子显著地增强了免疫原性，其中g4和g5的平均滴度高至g6的6.6和13.4倍(p＝0.0137，g4对g6；和p《0.0001，g5对g6)。
[0182]
结果清楚地表明，包含金属离子的杂合纳米颗粒(最稳定的)是诱导更大量的抗-rbd抗体的那些，并且在金属不存在下获得的纳米颗粒以与溶解在缓冲液ptfni中的嵌合蛋白crbdh6-h相似的方式作出行为表现。
[0183]
接下来，研究了用不同免疫原生成的抗体的质量-功能性。在这种情况下，测定了蛋白rbd与受体ace2的结合的抑制的ic50值，其相应于用嵌合蛋白crbdh6-h(g3)、掺入有ni
2+
的杂合纳米颗粒(g4)、掺入有zn
2+
的杂合纳米颗粒(g5)和没有金属离子的杂合纳米颗粒(g6)进行接种的组的独个血清(图22b)。以比较的方式包括了一组10个恢复期血清。
[0184]
对于杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6-h-ptfzn获得了最佳质量的抗体应答，其以超过两倍的程度比杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6-h-ptfni(所评价的免疫原中第二最强有力的)更强有力，虽然不具有显著差异(p＝0.1562)。
[0185]
杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6-h-ptfzn诱导了比在恢复期血清组中检测到的对于sars-cov-2病毒感染的天然应答更强有力一个数量级以上(63倍)的应答(p＝0.0049)。在杂合纳米颗粒中金属离子的存在对于抗-rbd应答的质量来说是非常重要的，其中当在纳米颗粒hbcag-crbdh6-h-ptf中省略离子时，所述应答的效力降低了3.9倍(p＝0.0287，g5对g6)。
[0186]
在所有情况下，杂合纳米颗粒都优于嵌合蛋白：hbcag-crbdh6-h-ptfzn、hbcag-crbdh6-h-ptfni和hbcag-crbdh6比crbdh6-h更强有力19.5倍、9倍和5倍(分别地，p＝0.0065，p＝0.0012，p＝0.1699)，虽然在没有金属的情况下，差异不是在统计学上显著的。该结果与作为本发明的嵌合蛋白的设计的基础的四级和超分子结构的重要性相一致。另一方面，如在图22b的插图中所观察到的，针对嵌合蛋白crbdh6-h的应答相比于在恢复期血清中所观察到的滴度而言高至三倍，虽然差异也不是在统计学上显著的(p＝0.6862)。
[0187]
以相似的方式，在细胞中的病毒感染中和测定法之中评价了血清。为此目的，分别用g2组(阴性对照，hbcag)的5和5个血清制备了两个均质混合物(以相等部分)。在g3组(crbdh6-h-ptfni)和g4组(hbcag-crbdh6-h-ptfni)的情况下，从将具有最接近的抗-rbd igg滴度的血清两两配对开始制备了5个混合物。图22c显示了这些混合物针对sars-cov-2病毒的中和测定法的结果。如所观察到的，所述结果与在受体ace2结合抑制测定法中所获得的相一致。g2、g3和g4组的中和滴度的平均值分别为0、496和1280。这确认了相对于用仅嵌合蛋白crbdh6-h的接种所生成的抗体而言由杂合纳米颗粒hbcag-crbdh6-h-ptfni所生成的抗体的功能优越性。
[0188]
总之，所述结果显示，杂合纳米颗粒(其包括金属)的免疫原性是单独的蛋白crbdh6的10-20倍，其中金属对于所述效应来说是严格必需的。关于应答的质量，杂合纳米颗粒比蛋白crbdh6更强有力至19倍，其中所述应答的直至80％取决于金属离子的存在。观察到在生物学结果和杂合纳米颗粒的稳定性之间的相关性，更稳定的纳米颗粒是更具有免疫原性的并且其对于与受体的结合的阻断应答更强力。

技术特征：
1.嵌合蛋白，其具有模块化结构，并且包含：a)冠状病毒刺突蛋白(s)的受体结合结构域(rbd)，其包含s蛋白的所述结构域的区段，b)具有与乙型肝炎病毒核衣壳抗原(hbcag)相结合的能力的区段，其包含氨基酸序列wsffsni，c)包含氨基酸序列hhhhhh的区段，d)由氨基酸g和s形成的具有5-12个氨基酸的柔性间隔子区段，e)选自包含ssssssssss的区段和区段stnlaaa的具有7-20个氨基酸的间隔子区段，其中(a)至(e)的区段以(b)-(d)-(a)-(e)-(c)或(c)-(e)-(a)-(d)-(b)的顺序进行布置。2.权利要求1的嵌合蛋白，其中(a)的rbd区段为在sars-cov-2的s蛋白的氨基酸q320和c590之间的区段。3.权利要求1的嵌合蛋白，其中(d)的具有5-12个氨基酸的柔性间隔子区段具有从由下列各项组成的组中选择的氨基酸序列：ggsgg、ggssggs、gggssggg、gggssggssggg和ggsggsggs。4.权利要求1的嵌合蛋白，其中(e)的具有7-20个氨基酸的间隔子区段具有从由下列各项组成的组中选择的氨基酸序列：ggsggssssssssssie、ssgssssssssss和ggsggssssssssssgggie。5.权利要求1的嵌合蛋白，其具有标识为seq id no:4或seq id no:5的氨基酸序列。6.疫苗组合物，其包含权利要求1的嵌合蛋白和在药学上可接受的赋形剂或稀释剂。7.权利要求6的疫苗组合物，其还包含疫苗佐剂。8.权利要求7的疫苗组合物，其中所述疫苗佐剂为铝盐。9.权利要求6的疫苗组合物，其还包含乙型肝炎病毒核衣壳抗原(hbcag)。10.权利要求9的疫苗组合物，其中所述嵌合蛋白和所述hbcag形成杂合纳米颗粒。11.权利要求6的疫苗组合物，其还包含第二种冠状病毒抗原。12.权利要求6的疫苗组合物，其通过肠胃外途径、粘膜途径或这两种途径的组合来进行施用。13.根据权利要求6至12的疫苗组合物，其中所述嵌合蛋白选自由seq id no:4和seq id no:5组成的氨基酸序列。14.权利要求1的嵌合蛋白在制备用于预防由冠状病毒引起的感染的疫苗组合物中的用途。15.权利要求14的用途，其中所述感染由sars-cov-2引起。16.权利要求14的用途，其中在免疫接种方案的过程中同时地或顺次地通过肠胃外途径、粘膜途径或这两种途径的组合来施用所述疫苗组合物。17.根据权利要求14至16的用途，其中所述嵌合蛋白包含序列seq id no:4或seq id no:5。18.预防由冠状病毒引起的感染的方法，其特征在于，向有此需要的个体施用药学有效量的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含权利要求1的嵌合蛋白和在药学上可接受的赋形剂或稀释剂。19.权利要求18的预防方法，其中所述疫苗组合物还包含乙型肝炎病毒核衣壳抗原(hbcag)。
20.权利要求18的预防方法，其中所述疫苗组合物通过肠胃外途径、粘膜途径或这两种途径的组合来进行施用。

技术总结
本发明提供了嵌合蛋白，其具有模块化结构，并且包含冠状病毒刺突蛋白(S)的受体结合结构域(RBD)、具有与乙型肝炎病毒核衣壳抗原(HBcAg)相结合的能力的区段、含有氨基酸序列HHHHHH的区段和两个间隔子区段。在所述嵌合蛋白中，所述区段以特定的顺序进行布置，并且其具有与HBcAg形成杂合纳米颗粒的能力。所述嵌合蛋白构成用于预防由冠状病毒引起的感染的疫苗组合物的一部分。因此，本发明揭示了预防由冠状病毒引起的感染的方法，其中施用包含所述嵌合蛋白的疫苗组合物。述嵌合蛋白的疫苗组合物。述嵌合蛋白的疫苗组合物。


技术研发人员：G
受保护的技术使用者：遗传工程与生物技术中心
技术研发日：2021.11.03
技术公布日：2023/9/23