针对白介素-22的抗体的制作方法

1.本发明涉及抗il22抗体。本文提供的此类抗体可用于治疗皮肤炎症，特别是特应性皮炎。


背景技术：

2.特应性皮炎(ad)，也被称为异位性湿疹，是一种炎性病状，其引起表皮功能障碍和增厚、湿疹病变和瘙痒症。该病状在所有年龄和种族的人群中流行并且具有经伤残调整生命年(disability-adjusted life years)测量的所有皮肤病中的最大疾病负担(laughter等人,br.j.dermatol.2020；刊载之前的电子版)。ad是一种复杂的病状并且其病理生理学受许多因素影响，例如遗传、环境和免疫因素。尽管2型免疫机制在特应性皮炎的病理学中具有重要地位，但越来越多的证据支持若干免疫通路的作用。
3.用于ad的治疗包括全身性免疫抑制剂，例如环孢素、甲氨蝶呤、霉酚酸吗啉乙酯(mycophenolate mofetil)和硫唑嘌呤(azathioprine)。抗抑郁剂和纳曲酮可用于控制瘙痒症。在2016年，克立硼罗(crisaborole)，一种局部磷酸二酯酶-4抑制剂，被批准用于轻度至中度湿疹，并且在2017年，度匹鲁单抗(dupilumab)，一种il-4rα的单克隆抗体拮抗剂，被批准用于治疗中度至重度湿疹。然而，当前的治疗选择仅提供暂时的、不完全的症状缓解。
4.il22是il10细胞因子家族的成员，其取决于环境情况而在各种炎性和组织反应中具有多种功能。il22主要由淋巴细胞(例如t辅助1(th1)细胞、th17细胞和th22细胞、γδt细胞、自然杀伤(nk)细胞和先天性淋巴细胞(ilc)3以及非淋巴细胞(例如纤维母细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和肥大细胞)产生(关于概述，参见：lanfranca mp等人,j.mol.med.(berl)(2016)94(5):523-534)。il22通过由il22受体1(il22r1，也被称为il22ra1或白介素-22受体亚基α-1)和il10受体2(il10r2)构成的异二聚跨膜受体复合物进行信号传导，而il10通过il10r1和il10r2进行信号传导。与il-10家族的其他成员类似，il22经由il22r1/il10r2复合物和随后的jak信号转导蛋白和转录活化因子(stat)信号传导通路(包括jak1、tyk2和stat3)介导其作用。与il10不同，还报道il22经由多种mapk通路(例如erk1/2、jnk和p38)进行信号传导。在皮肤中，il22通过与表达在角质形成细胞上的il22r1结合来作用于这些细胞。
5.与il10细胞因子家族中的其他成员不同，il22具有可溶性分泌受体，称为il22结合蛋白(il22bp，也被称为il22ra2或白介素-22受体亚基α2)。尽管il22bp与il22r1链共有最高的结构同源性，但il22bp与il22r1相比呈现高得多的针对il22的亲和力并且因此阻止il22与il22r1的结合。
6.已证实，对il22具有特异性的il22bp阻断il22的活性。所有il22的抑制已在严重特应性皮炎患者或高基线il22表达患者中显示有效信号(guttman-yassky e等人,j am acad dermatol.2018；78(5):872-881和brunner pm等人,j allergy cin immunol.2019；143(1):142-154)。还提出将il22r1的抑制作为用于抑制il22的潜在治疗选择，其还将部分阻断il-20和il-24的作用。迄今为止，不存在经设计以特异性靶向生物活性il22的治疗选
择，所述il22未与il22bp结合因此对il22bp的正常生物功能无影响。
7.th22细胞因子il22的增加的表达是特应性皮炎(ad)中的特征性发现结果。然而，尚未完全理解在体内il22在ad的发病机制中的特定作用。尚未具体地研究il22在ad的发展和维持中的作用，但已假设il22通过损害皮肤屏障功能、免疫失调和瘙痒症而在ad的发展中发挥重要作用。
8.us8906375和us7901684公开了结合il22的抗体和此类抗体在治疗ad中的有效性。us7737259公开了可用于治疗银屑病的特异性抗il22抗体。


技术实现要素：

9.本发明通过提供具有本文所述的功能和结构特性的抗il22抗体解决了对特应性皮炎的新治疗的需要。
10.本发明提供了结合人白介素22(il22)的分离的抗体，其中该抗体能够抑制或减弱il22与il22受体1(il22r1)和il22结合蛋白(il22ra2)的结合。
11.本发明还提供了结合人il22的分离的抗体，其由一组特定的cdr序列和/或可变区序列限定。
12.附图简要说明
13.下面参考以下附图对本发明进行描述，其中：
14.图1显示了抗体11041轻链的人源化。还显示了针对该链生成的变体。cdr序列带下划线。
15.图2显示了抗体11041重链的人源化。还显示了针对该链生成的变体。cdr序列带下划线。
16.图3a显示了抗体11070轻链的人源化。还显示了针对该链的变体。cdr序列带下划线。图3b显示了抗体11070重链的人源化。还显示了针对该链生成的变体。cdr序列带下划线。
17.图4显示了hdx-ms实验的il22肽覆盖图。
18.图5显示了11041gl13gh14 fab的hdx-ms分析的结果。(a)列举了在抗体结合后显示显著降低的氘并入的肽。在存在和不存在抗体的情况下显示相似交换模式的肽不具有显著的氘并入并且以浅灰色显示。(b)将所测定的11041gl13gh14 fab表位投影至il22 3d结构上并且以黑色突出显示。显示与il22结合的相关11041gl13gh14 fab的x射线数据用于参考。
19.图6显示了11070gl7gh16 fab的hdx-ms分析的结果。(a)列举了在抗体结合后显示显著降低的氘并入的肽。在存在和不存在抗体的情况下显示相似交换模式的肽具有不显著的氘并入并且以浅灰色显示。(b)将所测定的11070gl7gh16 fab表位投影至il22 3d结构上并且以黑色突出显示。
20.图7显示了与il22结合的11041gl13gh14 fab的x射线分析的结果。(a)与il-22结合的11041gl13gh14 fab的卡通图示。(b)il-22与11041gl13gh14 fab之间的相互作用界面的详细视图。
21.图8显示了11041gl13gh14 fab分子阻止il22与il22r1受体的相互作用。(a)il22(表面图示)与其受体il22r1(pdb：3dlq)的复合。(b)11041gl13gh14 fab轻链的轻链阻断
il22与il22r1之间的相互作用位点。
22.图9显示了(a)il22与呈fab形式的非扎奴单抗(fezakinumab)和11070gl7gh16 fab(vr11070)复合的冷冻电镜(cryo-em)结构；和(b)il22与非扎奴单抗和11041fab(vr11041)复合的模型。通过在图(a)中的冷冻电镜结构上叠加il-22/11041gl13gh14 fab晶体结构来产生该模型。这揭示11070gl7gh16 fab和11041gl13gh14 fab在il22上具有相似的表位。
23.图10显示了(a)在il-22与11070gl7gh16 fab和非扎奴单抗fab复合的冷冻电镜结构上，叠加结合il-22的il-22r1的晶体结构；和(b)已知促进与il-10r2的相互作用的il-22残基的侧链以棒状物形式显示。此位点由非扎奴单抗fab分子占据。
24.图11显示了体外人原代角质形成细胞测定中的11041gl13gh14fab(vr11041)活性。(a)测定中s100a7反应的实例。供体批号#438z014，几何平均值n＝3/6，刺激：100ng/ml的il-22、50nm的非扎奴单抗fab和11041gl13gh14 fab；(b)测定中11041gl13gh14 fab对s100a7的抑制百分比。平均值
±
sd，n＝2个供体，刺激：100ng/ml的il-22，统计数据：log(抑制剂)相对于反应(三个参数)。
25.发明详述
26.缩写
27.表1.整个说明书中使用的缩写
28.adcc抗体依赖性细胞毒性cdc补体依赖性细胞毒性cdr互补决定区ch1,ch2,ch3恒定重链结构域cl恒定轻链dsscfv二硫键稳定的scfvfab抗原结合片段fc可结晶片段fr1,fr2,fr3,fr4框架区fv可变结构域hvr高变区kd解离常数mab单克隆抗体scfv单链可变片段vh重链可变区vhh单结构域抗体vl轻链可变区vnarignar的可变结构域
29.表2.氨基酸缩写
[0030][0031][0032]
定义
[0033]
在整个本说明书中使用以下术语。
[0034]
本文中所使用的术语“受体人框架”是来源于人免疫球蛋白框架或人共有框架的包含轻链可变结构域(vl)框架或重链可变结构域(vh)框架的氨基酸序列的框架。来源于人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与人免疫球蛋白框架或人共有框架相同的氨基酸序列，或其可含有氨基酸序列变化。
[0035]
术语“亲和力”是指抗体与其靶蛋白质之间的所有非共价相互作用的强度。除非另外指明，否则如本文中所使用的术语“结合亲和力”是指固有结合亲和力，其反映结合对中的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子针对其结合伴侣的亲和力通常可通过
解离常数(kd)表示。可通过本领域中已知的常用方法(包括本文中所描述的方法)来测量亲和力。
[0036]
在抗体的上下文中，术语“亲和力成熟”是指与不具有高变区中的一种或多种变化的亲本抗体相比，在高变区中具有一种或多种此类变化的抗体，其中此类变化引起抗体针对抗原的亲和力的改善。
[0037]
在本文中，术语“抗体”以最广泛含义使用并且涵盖各种抗体结构，包括(但不限于)单克隆抗体、多克隆抗体和多特异性抗体，只要其呈现所需抗原结合活性即可。如本文所用，术语抗体是指完全(全长)抗体(即，包含两条重链和两条轻链的元件)和其功能活性片段(即，含有特异性结合抗原的抗原结合结构域的分子，也被称为抗体片段或抗原结合片段)。除非上下文另外规定，否则本文中关于抗体所描述的特征也适用于抗体片段。抗体可包含连接至两个scfv或dsscfv的fab，每个scfv或dsscfv结合相同或不同的靶标(例如，一个scfv或dsscfv结合治疗靶标并且一个scfv或dsscfv通过结合例如白蛋白来延长半衰期)。此类抗体描述于wo2015/197772中。术语“抗体”涵盖单价抗体，即，仅包含一个抗原结合结构域的抗体(例如，包含相互连接的全长重链和全长轻链的单臂抗体，也被称为“半抗体”)，和多价抗体，即，包含超过一个抗原结合结构域的抗体，例如，二价抗体。
[0038]
术语“与参考抗体结合相同表位的抗体”是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断参考抗体与其抗原的结合达50％或更多，并且相反，在竞争测定中参考抗体阻断该抗体与其抗原的结合达50％或更多。
[0039]
术语“抗体依赖性细胞毒性”或“adcc”是诱导细胞死亡的机制，其依赖于被抗体涂布的靶标细胞与具有裂解活性的效应细胞(例如自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)经由表达在效应细胞上的fcγ受体(fcγr)进行的相互作用。
[0040]
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指功能活性抗体结合片段，包括(但不限于)fab、经修饰的fab、fab'、经修饰的fab'、f(ab')2、fv、单结构域抗体、scfv、fv、二价抗体、三价抗体或四价抗体、双scfv、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)和以上中的任一种的表位结合片段(参见例如holliger和hudson,2005,nature biotech.23(9):1126-1136；adair和lawson,2005,drug design reviews-online 2(3),209-217)。如本文所用，“结合片段”是指能够以足以将该片段表征为对肽或抗原具有特异性的亲和力结合靶肽或抗原的片段。
[0041]
术语“抗体变体”指多肽，例如，具有本文所述的所需特征并包含与参考抗体的vh和/或vl具有至少约80％氨基酸序列同一性的vh和/或vl的抗体。此类抗体变体包括例如其中在vh和/或vl结构域中添加或删除一个或多个氨基酸残基的抗体。通常，抗体变体与本文所述的抗体具有至少约80％氨基酸序列同一性，或者至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性。任选地，与本文提供的抗体序列相比，变体抗体将具有不超过一个保守氨基酸取代，或者与本文提供的抗体序列相比，具有不超过约2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代中的任一种。在实施方案中，“抗体变体”是指包含vh和/或vl的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段的非cdr区与本文所述的抗体具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性。
[0042]
本文所用的术语“抗原结合结构域”是指抗体的一部分，其包含与靶抗原特异性相互作用的一个或多个可变结构域的部分或全部，例如一对可变结构域vh和vl的部分或全
部。在本发明的上下文中，该术语与三种不同的抗原相关地使用：il13、il22和白蛋白。因此，这样的抗原结合结构域被称为“il13结合结构域”、“il22结合结构域”和“白蛋白结合结构域”。结合结构域可以包含单结构域抗体。每个结合结构域可以是单价的。每个结合结构域可包含不超过一个vh和一个vl。
[0043]
如本文所用，术语“双特异性”或“双特异性抗体”是指具有两种抗原特异性的抗体。
[0044]
术语“互补决定区”或“cdr”通常是指包含六个cdr的抗体：三个在vh中(h1、h2、h3)并且三个在vl中(l1、l2、l3)。根据kabat编号系统，重链可变结构域的cdr位于残基31-35(cdr-h1)、残基50-65(cdr-h2)和残基95-102(cdr-h3)。然而，根据chothia(chothia,c.和lesk,a.m.j.mol.biol.,196,901-917(1987))，等效于cdr-h1的环从残基26延伸至残基32。因此，除非另外指明，否则如kabat编号系统和chothia拓朴环定义的组合所描述的，如本文中所使用的“cdr-h1”意欲指残基26至35。根据kabat编号系统，轻链可变结构域的cdr位于残基24-34(cdr-l1)、残基50-56(cdr-l2)和残基89-97(cdr-l3)。除非另外指明，否则本文中的可变结构域中的cdr残基和其他残基(例如，fr残基)是根据kabat编号。
[0045]
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的可变结构域(或其至少一部分)来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分(即，恒定结构域)来源于不同来源或物种(morrison；pnas 81,6851(1984))。例如，嵌合抗体可包含非人可变结构域和人恒定结构域。通常使用重组dna方法制备嵌合抗体。“嵌合抗体”的子类别为“人源化抗体”。
[0046]
抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要类别的抗体：iga、igd、ige、igg和igm，并且这些抗体中的几种可进一步分成子类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。
[0047]
术语“补体依赖性细胞毒性”或“cdc”是指诱导细胞死亡的机制，其中与靶标结合的抗体的fc效应结构域结合并且活化补体组分c1q，其进而活化补体级联，引起靶细胞死亡。
[0048]
如本文所用，术语“恒定结构域”或“恒定区”可互换地用于指抗体的位于可变区外部的结构域。恒定结构域在相同同种型的所有抗体中相同，但在同种型之间是不同的。通常，重链恒定区从n端至c端由包含三个或四个恒定结构域的ch1-铰链-ch2-ch3-任选ch4形成。
[0049]
术语“竞争抗体”或“交叉竞争抗体”应解释为意指所要求保护的抗体结合(i)抗原上的与由参考抗体所结合的位置相同的位置，或(ii)抗原上的抗体在空间上阻碍参考抗体与抗原结合的位置。
[0050]
如本文所用，术语“衍生物”意欲包括反应性衍生物，例如硫醇选择性反应性基团，例如马来酰亚胺及其类似物。反应性基团可直接或经由接头区段连接至聚合物。应理解，此类基团的残基在一些情况下将作为抗体片段与聚合物之间的连接基团而形成产物的一部分。
[0051]
在产生可变序列的上下文中，术语“来源于”是指以下事实：所使用的序列或与所使用的序列高度相似的序列是从原始遗传物质(例如抗体的轻链或重链)获得的。
[0052]
如本文所用，术语“双抗体”是指两个fv对，第一vh/vl对和另一个vh/vl对，其具有
两个fv间接头，使得第一fv的vh连接至第二fv的vl并且第一fv的vl连接至第二fv的vh。
[0053]
如本文所用，术语“difab”是指经由重链的c端连接的两个fab分子。
[0054]
如本文所用，术语“difab'”是指经由铰链区中的一个或多个二硫键连接的两个fab'分子。
[0055]
如本文所用，术语“dsscfv”或“二硫键稳定的单链可变片段”是指通过vh与vl可变结构域之间的肽接头而稳定化并且还包括vh与vl之间的结构域间二硫键的单链可变片段(参见例如weatherill等人,protein engineering,design&selection,25(321-329),2012,wo2007109254)。
[0056]
术语“dvd-ig”(也被称为双重v结构域igg)是指具有4个额外可变结构域(每条重链和每条轻链的n端上具有一个)的全长抗体。
[0057]
术语“效应功能”是指可归因于抗体的fc区的生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应功能的实例包括：clq结合和补体依赖性细胞毒性(cdc)、fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、吞噬作用、细胞表面受体(例如，b细胞受体)的下调和b细胞活化。
[0058]
如本文所用，术语“效应分子”包括例如抗肿瘤剂、药物、毒素、生物活性蛋白质(例如，酶)、其他抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸及其片段(例如，dna、rna及其片段)、放射性核素(尤其是放射性碘)、放射性同位素、螯合金属、纳米粒子和报道基团，例如荧光化合物或可通过nmr或esr光谱法检测的化合物。
[0059]
在抗体的上下文中，术语“表位”或“结合位点”是指抗原上的由抗体的互补位结合或识别的位点(或部分)。表位可由连续氨基酸形成(还通常称为“线性表位”)或由蛋白质的三级折叠形成的非连续氨基酸形成(通常称为“构象表位”)。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后保留，而通过折叠形成的表位通常在变性溶剂处理后消失。表位通常在独特空间构象中包括至少3个，并且更通常至少5-10个氨基酸。表位通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸、糖侧链)组成并且通常具有特定3d结构和电荷特征。
[0060]“eu索引”或“如kabat中的eu索引”或“eu编号方案”是指eu抗体的编号(edelman等人,1969,proc natl acad sci usa 63:78-85)。此类编号通常在涉及抗体重链恒定区中的残基时使用(例如，kabat等人中所报道)。除非另外陈述，否则eu编号方案是用于指本文中所描述的抗体重链恒定区中的残基。
[0061]
如本文所用，术语“fab”是指包含含有vl(可变轻链)结构域和轻链的恒定结构域(cl)的轻链片段以及vh(可变重链)结构域和重链的第一恒定结构域(ch1)的抗体片段。根据本公开内容的fab'的二聚体产生f(ab')2，其中例如二聚化可经由铰链进行。
[0062]
如本文所用，术语“fab'-fv”与fabfv相似，其中fab部分被fab'置换。该形式可以以其聚乙二醇化版本形式提供。
[0063]
如本文所用，术语“fab'-scfv”是具有在轻链或重链的c端上附接的scfv的fab'分子。
[0064]
如本文所用，术语“fab-dsfv”是指其中fv内二硫键使附接的c端可变区稳定的fabfv。该形式可以以其聚乙二醇化版本形式提供。
[0065]
如本文所用，术语“fab-fv”是指具有附接至以下中的每一种的c端的可变区的fab片段：重链的ch1和轻链的cl。该形式可以以其聚乙二醇化版本形式提供。
[0066]
如本文所用，术语“fab-scfv”是具有在轻链或重链的c端上附接的scfv的fab分子。
[0067]
术语“fc”、“fc片段”和“fc区”可互换地用于指抗体的包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域以外的抗体的恒定区的c端区域。因此，fc是指iga、igd和igg的最后两个恒定结构域ch2和ch3，或ige和igm的最后三个恒定结构域，和这些结构域的n端的柔性铰链。人igg1重链fc区在本文中定义为包含残基c226至其羧基端，其中编号是根据eu索引。在人igg1的上下文中，根据eu索引，下部铰链是指位置226-236，ch2结构域是指位置237-340并且ch3结构域是指位置341-447。其他免疫球蛋白的相应fc区可通过序列比对来鉴定。
[0068]
术语“框架”或“fr”是指除高变区残基以外的可变结构域残基。可变结构域的fr通常由四个fr结构域组成：fr1、fr2、fr3和fr4。因此，在vh(或vl)中，hvr和fr序列通常按以下顺序呈现：fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。
[0069]
术语“全长抗体”在本文中用于指具有与原生抗体结构实质上相似的结构或具有含有如本文中所定义的fc区的重链的抗体。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为vl)和轻链恒定区(cl)。取决于ig类别，每条重链包含重链可变区(本文中缩写为vh)和由三个恒定结构域ch1、ch2和ch3或四个恒定结构域ch1、ch2、ch3和ch4构成的重链恒定区(ch)。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q))的结合。
[0070]
术语“fv”是指全长抗体的两个可变结构域，例如共同操作性可变结构域，例如同源对或亲和力成熟可变结构域，即，vh和vl对。
[0071]
如在氨基酸序列的上下文中所使用，术语“高度相似”意指在全长范围内达到95％相似或更高，例如96％、97％、98％或99％相似的氨基酸序列。
[0072]
术语“人抗体”是指这样的抗体，其具有对应于由人或人细胞产生或来源于利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列。人抗体的此定义尤其排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
[0073]
术语“人共有框架”是指代表一系列人免疫球蛋白vl或vh框架序列中最常出现的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白vl或vh序列选自可变结构域序列的亚组。通常，序列的亚组为如kabat等人,sequences of proteins of immunological interest,第5版,nih publication 91-3242,bethesda md(1991),第1-3卷中的亚组。在一些实施方案中，对于vl，亚组为如kabat等人(同上)中的亚组κi。在一些实施方案中，对于vh，亚组为如kabat等人中的亚组iii。在一些实施方案中，对于vh，亚组为如kabat等人中的亚组iv。
[0074]
术语“人源化”抗体是指包含来自非人hvr的氨基酸残基和来自人fr的氨基酸残基的抗体。通常，重链和/或轻链含有来自供体抗体(例如，非人抗体，例如小鼠或兔单克隆抗体)的一个或多个cdr(如果需要，包括一个或多个经修饰的cdr)并且移植至受体抗体(人抗体)的重链和/或轻链可变区框架中(参见例如vaughan等人,nature biotechnology,16,535-539,1998)。此类人源化抗体的优点是降低针对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。可仅将来自上文所描述的任一cdr的一个或多个特异性决定残基转移至人抗体框架中，而非转移整个cdr(参见例如kashmiri等人,2005,methods,36,25-34)。“人源化”抗体是指包含来自非人hvr的氨基酸残基和来自人fr的氨基酸残基的嵌合抗体。抗体例如非人抗体的“人源化形式”是指已经历人源化的抗体。
[0075]
如本文所用，术语“高变区”或“hvr”是指抗体可变结构域中的满足以下条件的各区域：在序列上具有高变性(“互补决定区”或“cdr”)，和/或形成结构上定义的环(“高变环”)，和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)。
[0076]
如本文所用，术语“ic50”是指半最大抑制浓度，其为物质(例如抗体)抑制特定生物或生物化学功能的有效性的量度。ic50是定量量度，其指示抑制给定生物过程达50％所需的特定物质的量。
[0077]
序列中的氨基酸之间的“同一性”指示在所比对的序列中的任何特定位置，氨基酸残基在序列之间是相同的。
[0078]
如本文所用，术语“igg-scfv”为具有在每条重链或每条轻链的c端上的scfv的全长抗体。
[0079]
如本文所用，术语“igg-v”为具有在每条重链或每条轻链的c端上的可变结构域的全长抗体。
[0080]
在整个本说明书中，术语“分离的”意指视具体情况而定，抗体或多核苷酸存在于与其在自然界中所存在于的物理环境不同的物理环境中。术语“分离的”核酸是指已从其天然环境分离或以合成方式产生的核酸分子。分离的核酸可包含合成dna(例如，通过化学处理产生)、cdna、基因组dna或其任何组合。
[0081]
术语“kabat残基名称”或“kabat”是指通常用于抗体的残基编号方案。此类编号并非始终与氨基酸残基的线性编号直接对应。与严格kabat编号相比，实际线性氨基酸序列可含有对应于基本可变结构域结构的结构组分的缩短或插入(无论框架或互补决定区(cdr))的较少或额外的氨基酸。对于给定抗体，可通过将抗体序列中的具有同源性的残基与“标准”kabat编号序列进行比对来确定残基的正确kabat编号。关于详细说明，参见kabat等人,sequences of proteins of immunological interest,第5版,public health service,national institutes of health,bethesda,md(1991)。除非另外指明，否则在整个本说明书中使用kabat编号。
[0082]
如本文所用，术语“kd”是指解离常数，其由kd与ka的比率(即，kd/ka)获得并且以摩尔浓度(m)表示。kd和ka分别是指特定抗原-抗体相互作用的解离速率和缔合速率。可使用本领域中公认的方法测定抗体的kd值。
[0083]
术语“单克隆抗体”(或“mab”)是指从实质上均质的抗体群体获得的抗体，即，除可能少量存在的可能的突变(例如，天然存在的突变)以外，各个单克隆抗体制剂是相同的。然而，存在于组合物中的各种不同的抗体分子之间可存在与翻译后修饰(例如，重链c端赖氨酸的裂解、天冬酰胺残基的脱酰胺化和/或天冬氨酸残基的异构化)有关的蛋白质序列的某些差异。与多克隆抗体制剂不同，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体是针对抗原上的单一决定子。
[0084]
如本文所用，术语“多互补位抗体”是指包含两个或更多个不同互补位的如本文中所描述的抗体，所述互补位与来自相同抗原或两种不同抗原的不同表位相互作用。本文中所描述的多互补位抗体可以是双互补位、三互补位、四互补位。
[0085]
如本文中所使用的术语“多特异性”或“多特异性抗体”是指具有至少两个结合结构域(即，两个或更多个结合结构域，例如两个或三个结合结构域)的如本文中所描述的抗体，其中该至少两个结合结构域独立地结合两种不同抗原或相同抗原上的两种不同表位。
多特异性抗体对于每种特异性(抗原)而言通常为单价的。本文中所描述的多特异性抗体涵盖单价和多价，例如二价、三价、四价多特异性抗体。
[0086]
在抗体的上下文中，术语“中和(neutralizing/neutralize)”描述能够抑制或减弱其靶标(靶蛋白质)的生物信号传导活性的抗体。
[0087]
术语“互补位”是指抗体中的识别并且结合抗原的区域。
[0088]
相对于多肽和抗体序列的术语“序列同一性(或相似性)百分比(％)”定义为在比对序列并且如果需要引入空位以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分之后，候选序列中的与所比较的多肽中的氨基酸残基相同(或相似)的氨基酸残基的百分比。
[0089]“药学上可接受的载体”是指药物制剂中的除活性成分以外的成分，其对受试者无毒性。药学上可接受的载体包括(但不限于)缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0090]
术语“多克隆抗体”是指与抗原的超过一种表位结合(或以其他方式相互作用)的不同抗体分子的混合物。
[0091]
在抗体的上下文中，术语“预防”在本文中可与术语“抑制”互换地使用并且指示根据本发明的抗体对特定生物过程或分子相互作用的作用。
[0092]
术语“scdiabody”是指包含fv内接头的双抗体，使得分子包含三个接头并且形成其vh和vl末端各自连接至另一对fv的一个可变区的正常scfv。
[0093]
如本文所用，术语“scdiabody-ch3”是指各自例如经由铰链连接至ch3结构域的两个scdiabody分子。
[0094]
如本文所用，术语“scdiabody-fc”是两个scdiabody，其中每个scdiabody例如经由铰链附接至恒定区片段-ch2ch3的ch2结构域的n端。
[0095]
如本文所用，术语“单链可变片段”或“scfv”是指由vh与vl可变结构域之间的肽接头稳定化的单链可变片段。
[0096]
如本文所用，术语“scfv-fc-scfv”是指四个scfv，其中每个scfv附接至ch2ch3片段的两条重链的n端和c端。
[0097]
如本文所用，术语“scfv-igg”是具有在每条重链或每条轻链的n端上的scfv的全长抗体。
[0098]
如本文所用，术语“相似性”指示在所比对的序列中的任何特定位置，序列之间的氨基酸残基具有相似的类型。例如，亮氨酸可取代异亮氨酸或缬氨酸。其他通常可彼此取代的氨基酸包括(但不限于)：
[0099]-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳族侧链的氨基酸)；
[0100]-赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；
[0101]-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；
[0102]-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；以及
[0103]-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。
[0104]
如本文所用，术语“单结构域抗体”是指由单一单体可变结构域组成的抗体片段。单结构域抗体的实例包括vh或vl或vhh或v-nar。
[0105]
在抗体的上下文中，如本文所使用的术语“特异性”意指仅识别其特异于的抗原的抗体，或相比于与其非特异于的抗原的结合，对其特异于的抗原具有明显更高的结合亲和
力(例如，至少5、6、7、8、9、10倍更高的结合亲和力)的抗体。
[0106]
如本文所用，术语“空间上阻断”或“空间上阻止”意指通过结合第一蛋白质的第三蛋白质来阻断第一蛋白质与第二蛋白质之间的相互作用的方法。归因于第二蛋白质与第三蛋白质之间的不适当的范德华力或静电相互作用，第一蛋白质与第三蛋白质之间的结合阻止第二蛋白质结合第一蛋白质。
[0107]
在治疗和诊断的上下文中，术语“受试者”或“个体”通常是指哺乳动物。哺乳动物包括(但不限于)家养动物(例如牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，例如猴)、兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。更具体地，个体或受试者为人。
[0108]
如本文所用，术语“串联scfv”是指经由单一接头连接，使得存在单一fv间接头的至少两个scfv。
[0109]
如本文所用，术语“串联scfv-fc”是指至少两个串联scfv，其中每个scfv例如经由铰链附接至恒定区片段-ch2ch3的ch2结构域的n端。
[0110]
如本文所用，术语“靶标”或“抗体靶标”是指抗体结合的靶抗原。
[0111]
如本文所用，术语“四抗体”是指包含四个fv和四个fv间接头的与双抗体相似的形式。
[0112]
术语“治疗有效量”是指当向受试者施用以用于治疗疾病时，足以产生此类疾病的治疗的抗体的量。治疗有效量将取决于抗体、所治疗的受试者的疾病及其严重程度以及年龄、体重等而变化。
[0113]
如本文所用，术语“三体”(也被称为fab(scfv)2)是指具有附接至轻链的c端的第一scfv和附接至重链的c端的第二scfv的fab片段。
[0114]
如本文所用，术语“三特异性或三特异性抗体”是指具有三种抗原结合特异性的抗体。例如，抗体为具有三个抗原结合结构域(三价)的抗体，该三个抗原结合结构域独立地结合三个不同抗原或相同抗原上的三个不同表位，即，每个结合结构域对于每个抗原是单价的。三特异性抗体形式的一个实例为trybe。
[0115]
术语“预防(prevent/preventing)”及其相似术语是指在完全或部分预防疾病或其症状方面获得防治性作用。因此，预防涵盖在可能易患疾病，但尚未诊断为罹患疾病的受试者中停止疾病的发生。
[0116]
术语“治疗(treatment/treating)”及其相似术语是指获得所需药理学和/或生理学作用。该作用在部分或完成治愈疾病和/或由疾病引起的不良作用方面可以是治疗性的。因此，治疗涵盖(a)抑制疾病，即，遏制其发展；和(b)缓解疾病，即，引起疾病消退。
[0117]
如本文所用，术语“trybe”是指包含两个dsscfv的三体。如本文所用，dsfab是指具有可变区内二硫键的fab。
[0118]
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中的涉及抗体与抗原的结合的结构域。全长重链(vh)和轻链(vl)的可变结构域通常具有相似结构，其中每个结构域包含四个保守性框架区(fr)和三个cdr(参见例如kindt等人,kuby immunology,6th ed.,w.h.freeman and co.,第91页(2007))。单一vh或vl结构域可足以赋予抗原结合特异性。每个vh和vl由从氨基端至羧基端按以下顺序排列的三个cdr和四个fr构成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。cdr和fr共同形成可变区。按照惯例，抗体的重链可变区中的cdr称为cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3并且轻链可变区中的cdr称为cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3。它们在从
每条链的n端至c端的方向上依序编号。常规地根据由kabat设计的系统来将cdr编号。
[0119]
如本文所用，术语“载体”是指能够传播与其连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括呈自我复制核酸结构形式的载体以及并入已引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够引导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。术语“载体”包括“表达载体”。
[0120]
术语“vh”是指重链的可变结构域(或序列)。
[0121]
如本文所用，术语“v-igg”为具有在每条重链或每条轻链的n端上的可变结构域的全长抗体。
[0122]
术语“vl”是指轻链的可变结构域(或序列)。
[0123]
白介素22(il22)
[0124]
术语“白介素-22”或“il22”是指能够结合il22r1(也被称为il22ra1、il22受体1或白介素-22受体亚基α-1)和/或il22r1与il10ra2的受体复合物(也被称为il22bp、il22结合蛋白质或白介素-22受体亚基α2)的ii类细胞因子。il22也被称为白介素-10相关t细胞衍生的可诱导因子(il-tif)。该术语是指天然存在的或内源性哺乳动物il22蛋白质，以及具有与天然存在的或内源性相应哺乳动物il22蛋白质的氨基酸序列相同的氨基酸序列的蛋白质(例如，重组蛋白质、合成蛋白质)。因此，如本文中所定义，该术语包括成熟il22蛋白质、多态或等位基因变体和il22的其他同种型(例如，由可变剪接或其他细胞过程产生)，以及前述的经修饰或未经修饰的形式(例如，脂化、糖基化)。天然存在的或内源性il22包括野生型蛋白质，例如成熟il22、多态或等位基因变体以及天然存在于哺乳动物(例如，人、非人灵长类动物)中的其他同种型和突变形式。这些蛋白质和与天然存在的或内源性相应il22具有相同氨基酸序列的蛋白质通过相应哺乳动物的名称提及。
[0125]
成熟人il22的氨基酸序列对应于seq id no：1的氨基酸34-179。重组人il22的分析揭示了许多结构域(nagem等人,(2002)structure,10:1051-62；us2002/0187512)。
[0126]
与il22结合的抗体
[0127]
本发明提供了结合il22(靶多肽)并具有如本文进一步描述的功能和结构特性的抗il22抗体。
[0128]
本公开内容提供了鉴定结合il22的抗体的方法，所述方法包括：
[0129]
a)用人il22免疫动物；
[0130]
b)从所述动物分离所产生的抗il22抗体；和
[0131]
c)选择符合以下条件的抗il22抗体：
[0132]
i.与人和食蟹猴il22两者结合；
[0133]
ii.中和il22诱导的stat3磷酸化，或il22依赖性il-10释放；和
[0134]
iii.与人il22结合并阻止il22r1的结合。
[0135]
任何合适的动物都可以用于产生抗il22抗体，包括小鼠、大鼠和兔子。与il22的结合和交叉结合测量可以使用技术人员已知的技术进行。标准测定可用于测量已鉴定的抗体的中和活性。此类测定的实例在本文的实施例中提供。
[0136]
本发明上下文中的抗体包括完整抗体和功能活性抗体片段(即，含有特异性结合抗原的抗原结合结构域的分子，也称为抗原结合片段)。除非上下文另有说明，本文描述的特征也适用于抗体片段。抗体可以是(或源自)多克隆、单克隆、多价、多特异性、双特异性、
完全人、人源化或嵌合的。
[0137]
仅出于参考和示例的目的而进一步描述抗体并且不限制本发明的范围。
[0138]
根据本发明使用的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且优选为单克隆抗体。根据本发明使用的抗体可以是嵌合抗体、cdr移植抗体(例如，考虑到cdr源自的供体抗体的类别/类型，可以使用任何合适的受体可变区框架序列，包括小鼠、灵长类动物和人框架区)、纳米抗体、人或人源化抗体。对于单克隆和多克隆抗体的产生，用于产生此类抗体的动物通常为非人哺乳动物，例如山羊、兔、大鼠或小鼠，但也可在其他物种中产生抗体。
[0139]
可通过常规方法产生多克隆抗体，例如用相关抗原对合适的动物进行免疫接种。接着，可从此类动物移出血液并且将所产生的抗体纯化。
[0140]
可通过多种技术制备单克隆抗体，包括(但不限于)杂交瘤方法、重组dna方法、噬菌体展示方法和使用含有全部或一部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法。本文中描述了用于制备单克隆抗体的一些示例性方法。
[0141]
例如，可使用杂交瘤技术(kohler和milstein,1975,nature,256:495-497)、三源杂交瘤技术、人b细胞杂交瘤技术(kozbor等人,1983,immunology today,4:72)和ebv杂交瘤技术(cole等人,monoclonal antibodies and cancer therapy,第77-96页,alan r liss,inc.,1985)制备单克隆抗体。
[0142]
还可通过例如wo9202551、wo2004051268和wo2004106377中所描述的方法，使用单一淋巴细胞抗体方法，通过克隆和表达由经选择以用于制备特异性抗体的单一淋巴细胞所产生的免疫球蛋白可变区cdna来产生抗体。
[0143]
在需要对动物进行免疫接种的情况下，可使用熟知和常规的方案，通过向动物，优选非人动物施用多肽来获得针对靶多肽所产生的抗体，参见例如handbook of experimental immunology,d.m.weir(ed.)，第4卷，blackwell scientific publishers,oxford,england,1986。可对许多动物进行免疫接种，例如兔、小鼠、大鼠、羊、牛、骆驼或猪。然而，通常使用小鼠、兔、猪和大鼠。
[0144]
单克隆抗体还可使用本领域中已知的各种噬菌体展示方法产生并且包括由brinkman等人(j.immunol.methods,1995,182:41-50)、ames等人(j.immunol.methods,1995,184:177-186)、kettleborough等人(eur.j.immunol.1994,24:952-958)、persic等人(gene,1997 1879-18)、burton等人(advances in immunology,1994,57:191-280)所公开的方法。在某些噬菌体展示方法中，vh和vl基因的库分别通过聚合酶链反应(pcr)克隆并且在噬菌体库中随机重组，其随后可针对抗原结合噬菌体进行筛选，如winter等人,ann.rev.immunol.12:433-455(1994)中所描述的。噬菌体通常以单链fv(scfv)片段或fab片段形式展示抗体片段。来自经免疫接种的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体而无需构建杂交瘤。或者，可克隆(例如，从人)原生库以提供针对广泛范围的非自体抗原以及自体抗原的单一抗体来源而无需任何免疫接种，如griffiths等人,embo j,12:725-734(1993)所描述的。最终，天然文库还可以以合成方式通过从干细胞克隆未经重排的v基因区段，并且使用含有随机序列以编码高度可变cdr3区和实现体外重排的pcr引物来制得，如由hoogenboom和winter,j.mol.biol.,227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括例如：us 5,750,373和us2005/0079574、us2005/0119455、us2005/0266000、us2007/0117126、us2007/0160598、us2007/0237764、us2007/0292936和us2009/
0002360。
[0145]
可使用用于测量与靶多肽的结合的测定和/或用于测量抗体阻断特定相互作用的能力的测定进行抗体筛选。结合测定的实例为elisa，例如，使用固定在板上的靶多肽的融合蛋白质并且使用缀合的二抗以检测抗体与靶标的结合。阻断测定的实例为基于流式细胞术的测定，其测量与靶多肽结合的配体蛋白质的阻断。使用经荧光标记的二抗检测结合靶多肽的此类配体蛋白质的量。
[0146]
可通过针对具有一种或多种所需活性的抗体筛选组合文库来分离抗体。例如，本领域中已知多种用于产生噬菌体展示文库和针对具有所需结合特征的抗体筛选此类文库的方法。
[0147]
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段被视为人抗体或人抗体片段。
[0148]
抗体可以是全长抗体。更具体地，抗体可具有igg同种型。更具体地，抗体可以是igg1或igg4。
[0149]
可视所提出的抗体分子的功能并且特别地，可能需要的效应功能来选择抗体的恒定区结构域(如果存在)。例如，恒定区结构域可以是人iga、igd、ige、igg或igm结构域。特别地，当抗体分子意欲用于治疗用途并且需要抗体效应功能时，可使用人igg恒定区结构域，尤其是igg1和igg3同种型。或者，当抗体分子意欲用于治疗目的并且不需要抗体效应功能时，可使用igg2和igg4同种型。应理解，还可使用这些恒定区结构域的序列变体。本领域技术人员还已知抗体可经历各种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度通常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及细胞培养条件。此类修饰可包括糖基化变化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺化。常见修饰为由于羧基肽酶作用而损失羧基端碱性残基(例如赖氨酸或精氨酸)(如harris,rj.journal of chromatography 705:129-134,1995中所描述)。因此，可不存在抗体重链的c端赖氨酸。
[0150]
或者，抗体是抗原结合片段。
[0151]
关于某些抗原结合片段的综述，参见hudson等人,nat.med.9:129-134(2003)。关于scfv片段的综述，参见例如pl
ü
ckthun,the pharmacology of monoclonal antibodies,第113卷,rosenburg和moore编,(springer-verlag,new york),第269-315页(1994)；还参见wo 93/16185；和us 5,571,894和us 5,587,458。包含救助受体结合表位残基并且具有延长的体内半衰期的fab和f(ab')2片段公开于us 5,869,046中。
[0152]
抗原结合片段及其制备方法是本领域中熟知的，参见例如verma等人,1998,journal of immunological methods,216,165-181；adair和lawson,2005.therapeutic antibodies.drug design reviews-online 2(3):209-217。fab-fv形式首先公开于wo2009/040562中并且其二硫键稳定的版本，即fab-dsfv，首先公开于wo2010/035012中，并且trybe形式公开于wo2015/197772中。
[0153]
已开发出多种用于产生抗体片段的技术。此类片段可经由完整抗体的蛋白水解消化衍生(参见例如morimoto等人,journal of biochemical and biophysical methods 24:107-117(1992)和brennan等人,science 229:81(1985))。然而，还可通过重组宿主细胞直接产生抗体片段。例如，可从上文所讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌(e.coli)回收fab'-sh片段并且以化学方式偶联以形成f(ab')2片段(carter等人,bio/technology 10:163-167(1992))。
[0154]
可直接从重组宿主细胞培养物分离f(ab')2片段。抗体可以是单链fv片段(scfv)。此类片段描述于wo 93/16185；us 5,571,894；和us 5,587,458中。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如us 5,641,870中所描述。此类线性抗体片段可以是单特异性或双特异性的。
[0155]
抗体可以是fab、fab'、f(ab')2、fv、dsfv、scfv或dsscfv。抗体可以是单结构域抗体或纳米抗体，例如vh或vl或vhh或vnar。抗体可以是wo2011/117648、wo2005/003169、wo2005/003170和wo2005/003171中所描述的fab或fab'片段。
[0156]
抗体可以是二硫键稳定的单链可变片段(dsscfv)。
[0157]
可变结构域vh与vl之间的二硫键可位于两个以下列举的残基之间：
[0158]
●vh
37+v
l
95，参见例如protein science 6,781-788zhu等人(1997)；
[0159]
●vh
44+v
l
100，参见例如weatherill等人,protein engineering,design&selection,25(321-329),2012；
[0160]
●vh
44+v
l
105，参见例如j biochem.118,825-831luo等人(1995)；
[0161]
●vh
45+v
l
87，参见例如protein science 6,781-788zhu等人(1997)；
[0162]
●vh
55+v
l
101，参见例如febs letters 377 135-139young等人(1995)；
[0163]
●vh
100+v
l
50，参见例如biochemistry 29 1362-1367glockshuber等人(1990)；
[0164]
●vh
100b+v
l
49，参见例如biochemistry 29 1362-1367glockshuber等人(1990)；
[0165]
●vh
98+v
l
46，参见例如protein science 6,781-788zhu等人(1997)；
[0166]
●vh
101+v
l
46，参见例如protein science 6,781-788zhu等人(1997)；
[0167]
●vh
105+v
l
43，参见例如proc.natl.acad.sci.usa第90卷,第7538-7542页brinkmann等人(1993)；或proteins 19,35-47jung等人(1994)，
[0168]
●vh
106+v
l
57，参见例如febs letters 377 135-139young等人(1995)
[0169]
和与其相应的在位于分子中的可变区对中的一个或多个位置。
[0170]
可在位置vh44与vl100之间形成二硫键。
[0171]
本领域技术人员应理解，本文中所描述的抗原结合片段还可表征为单克隆、嵌合、人源化、完全人、多特异性、双特异性等，并且这些术语的讨论还涉及此类片段。
[0172]
多特异性抗体
[0173]
本发明的抗体可以是多特异性抗体。
[0174]
还考虑用于本公开内容的上下文中的多特异性抗体或其抗原结合片段的实例包括二价、三价或四价抗体、bis-scfv、双抗体、三抗体、四抗体、双体和三体(参见例如holliger和hudson，2005,nature biotech 23(9):1126-1136；schoonjans等人,2001，biomolecular engineering,17(6),193-202)。
[0175]
已经产生了多种多特异性抗体形式。已经提出了不同的分类，但多特异性igg抗体形式通常包括双特异性igg、附加igg、多特异性(例如双特异性)抗体片段、多特异性(例如双特异性)融合蛋白和多特异性(例如双特异性)抗体缀合物，如例如spiess等人,alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies.mol immunol.67(2015):95-106中所描述的。
[0176]
抗体可以是双特异性抗体。在一个实施方案中，抗体包含两个抗原结合结构域，其中一个结合结构域结合il22并且另一个结合结构域结合另一种抗原，即每个结合结构域对于每种抗原是单价的。在一个实施方案中，抗体是四价双特异性抗体，即抗体包含四个抗原
结合结构域，其中例如两个结合结构域结合il22并且另外两个结合结构域结合另一抗原。在一个实施方案中，抗体是三价双特异性抗体。
[0177]
用于制备双特异性抗体的技术包括但不限于crossmab技术(klein等人,engineering therapeutic bispecific antibodies using crossmab technology,methods 154(2019)21-31)、把手入孔(knobs-in-holes)工程化(例如wo1996027011、wo1998050431)、duobody技术(例如wo2011131746)、azymetric技术(例如wo2012058768)。用于制备双特异性抗体的其他技术已在例如godar等人,2018,therapeutic bispecific antibody formats:a patent applications review(1994-2017),expert opinion on therapeutic patents,28:3,251-276中描述。双特异性抗体特别包括crossmab抗体、daf(二合一)、daf(四合一)、dutamab、dt-igg、把手入孔通用lc、把手入孔组件、电荷对、fab臂交换、seedbody、triomab、luz-y、fcab、κλ-body和正交fab。
[0178]
抗体构建体可以是三特异性抗体。
[0179]
抗体可以是多互补位抗体。
[0180]
在一个实施方案中，每个结合结构域是单价的。优选地，每个结合结构域包含不超过一个vh和一个vl。
[0181]
附加的igg通常包含通过将额外的抗原结合结构域或抗原结合片段附加到igg的重链和/或轻链的n和/或c端而工程化的全长igg。此类额外的抗原结合片段的实例包括sdab抗体(例如vh或vl)、fv、scfv、dsscfv、fab、scfab附加的igg抗体形式尤其包括dvd-igg、igg(h)-scfv、scfv-(h)igg、igg(l)-scfv、scfv-(l)igg、igg(l,h)-fv、igg(h)-v、v(h)-igg、igc(l)-v、v(l)-igg、kih igg-scfab、2scfv-igg、igg-2scfv、scfv4-ig、zybody和dvi-igg(四合一)，例如如spiess等人,alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies.mol immunol.67(2015):95-106中所述。
[0182]
多特异性抗体片段包括纳米抗体、纳米抗体-hsa、bites、双抗体、dart、tandab、scdiabody、sc-diabody-ch3、diabody-ch3、triple body、miniantibody；微型抗体、tri bi微型抗体、scfv-ch3kih、fab-scfv、scfv-ch-cl-scfv、f(ab')2、f(ab')
2-scfv2、scfv-kih、fab-scfv-fc、四价hcab、scdiabody-fc、diabody-fc、串联scfv-fc；和胞内抗体，如例如spiess等人,alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies.mol immunol.67(2015):95-106中所描述的。
[0183]
多特异性融合蛋白包括dock and lock、immtac、hsabody、scdiabody-hsa和串联scfv-toxin。
[0184]
多特异性抗体缀合物包括igg-igg；cov-x-body；和scfv1-peg-scfv2。
[0185]
额外的多特异性抗体形式已经描述于例如brinkmann等人,the making of bispecific antibodies,mabs,9:2,182-212(2017)，特别是在图2中，例如串联scfv、triplebody、fab-vhh、tafv-fc、scfv4-ig、scfv2-fcab、scfv4-igg。双体、三体及其生产方法公开于例如wo99/37791中。
[0186]
用于本发明的抗体可以是与两个scfv或dsscfv连接的fab，每个scfv或dsscfv结合相同或不同的靶标(例如，一个scfv或dsscfv结合治疗靶标，而一个scfv或dsscfv通过结合例如白蛋白增加半衰期)。此类抗体片段描述于wo2015/197772中。用于本发明片段的另
一种优选抗体包含仅与一个scfv或dsscfv连接的fab，如例如wo2013/068571和dave等人,mabs,8(7)1319-1335(2016)中所述。
[0187]
用于本发明的另一种抗体是把手入孔抗体(“kih”)。它是一种多特异性抗体形式，其由用于异二聚化的重链同二聚体组成(例如，用于有效生产双特异性抗体、多特异性抗体或单臂抗体)。一般而言，此类技术涉及在第一多肽(例如第一抗体重链中的第一ch3结构域)的界面处引入突起(“把手”)以及在第二多肽(例如第二抗体重链中的第二ch3结构域)的界面中引入相应的空腔(“孔”)，使得突起可以定位在空腔中，从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过用较大侧链(例如精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)替换来自第一多肽(例如第一抗体重链中的第一ch3结构域)的界面的小氨基酸侧链来构建突起。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二多肽(例如第二抗体重链中的第二ch3结构域)的界面中产生与突起大小相同或相似的补偿空腔。突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸(例如通过位点特异性诱变)或通过肽合成来制备。关于“把手入孔”技术的进一步细节在例如us 5,731,168；us 7,695,936；wo 2009/089004；us2009/0182127；marvin md z u,acta pharmacologica sincia(2005)26(6):649-658；kontermann acta pharmacologica sincia(2005)26:1-9；ridgway等人,prot eng 9,617-621(1996)；和carter,j immunol meth 248,7-15(2001)中描述。
[0188]
人源化、人和嵌合抗体以及产生此类抗体的方法
[0189]
本发明的抗体可以是(但不限于)人源化、完全人或嵌合抗体。
[0190]
在一个实施方案中，抗体是人源化的。更具体地，抗体是嵌合、人或人源化抗体。
[0191]
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体是嵌合抗体。嵌合抗体的实例描述于例如us 4,816,567；和morrison等人,proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855(1984))中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(例如猴)的可变区)和人恒定区。在另一实例中，嵌合抗体为“类别转换”抗体，其中类别或子类别已从亲本抗体的类别或子类别改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
[0192]
在一个实施方案中，抗体为人源化抗体。
[0193]
人源化抗体可任选地进一步包含一个或多个来源于衍生cdr的非人物种的框架残基。应理解，可能仅需要转移cdr的特异性决定残基而非整个cdr(参见例如kashmiri等人,2005,methods,36,25-34)。
[0194]
适当地，根据本发明的人源化抗体具有可变结构域，其包含人受体框架区以及一个或多个cdr并且任选地进一步包括一个或多个供体框架残基。
[0195]
因此，在一个实施方案中提供人源化抗体，其中可变结构域包含人受体框架区和非人供体cdr。
[0196]
当移植cdr或特异性决定残基时，根据衍生cdr的供体抗体的类别/类型，可使用任何适当的受体可变区框架序列，包括小鼠、灵长类动物和人框架区。
[0197]
可用于本发明中的人框架的实例为kol、newm、rei、eu、tur、tei、lay和pom(kabat等人)。例如，kol和newm可用于重链，rei可用于轻链并且eu、lay和pom可用于重链和轻链。或者，可使用人生殖系序列；这些序列可在www.imgt.org获得。在实施方案中，受体框架为igkv1d-13人生殖系、ighv3-66人生殖系、igkv1-12人生殖系和/或ighv4-31人生殖系。在实施方案中，人框架含有1-5、1-4、1-3或1-2个供体抗体氨基酸残基。
[0198]
在本发明的人源化抗体中，受体重链和轻链无需来源于相同抗体并且可以(如果需要)包含具有来源于不同链的框架区的复合链。
[0199]
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体为人抗体。可使用本领域中已知的各种技术来产生人抗体。
[0200]
如果抗体的可变区或全长链从使用人生殖系免疫球蛋白基因的系统获得，则人抗体包含作为特定生殖系序列的“产物”或“来源于”特定生殖系序列的重链或轻链可变区或全长重链或轻链。此类系统包括用感兴趣的抗原对携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行免疫接种或用感兴趣的抗原筛选展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库。因此，作为人生殖系免疫球蛋白序列的“产物”或“来源于”人生殖系免疫球蛋白序列的人抗体或其片段可通过将人抗体的氨基酸序列与人生殖系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较并且选择在序列方面最相似于人抗体序列(即，最大同一性百分比)的人生殖系免疫球蛋白序列来鉴定。作为特定人生殖系免疫球蛋白序列的“产物”或“来源于”特定人生殖系免疫球蛋白序列的人抗体可含有与生殖系序列相比由于例如天然存在的体细胞突变或有意引入的定点突变所引起的氨基酸差异。然而，所选择的人抗体通常在氨基酸序列方面与人生殖系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90％相同，并且含有与其他物种的生殖系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠生殖系序列)相比时将人抗体鉴定为人的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体在氨基酸序列方面可与由生殖系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少60％、70％、80％、90％或至少95％，或甚至至少96％、97％、98％或99％相同。通常，来源于特定人生殖系序列的人抗体与由人生殖系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比将显示不超过10个氨基酸差异。在某些情况下，人抗体与由生殖系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比可能显示不超过5个，或甚至不超过4个、3个、2个或1个氨基酸差异。
[0201]
抗体的结构特征
[0202]
本发明的抗体包含结合结构域。结合结构域通常包含6个cdr，其中三个来自重链，三个来自轻链。在一个实施方案中，cdr位于框架内并一起形成可变区。因此，抗体具有抗原特异性的结合结构域，所述结合结构域包含轻链可变区和重链可变区。
[0203]
表3.抗il22抗体的氨基酸序列
[0204]
特征11041seq id no11070seq id nocdr-l1565cdr-l2666cdr-l3767cdr-h1868cdr-h2969cdr-h31070轻链v区2272重链v区2474轻链2676重链fab2878重链igg13080重链igg4p3282
[0205]
在一个实施方案中，本发明提供了一种结合il22的抗体，其包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含以下的至少一个：
[0206]
包含seq id no：5的cdr-l1，
[0207]
包含seq id no：6的cdr-l2，和
[0208]
包含seq id no：7的cdr-l3。
[0209]
在一个实施方案中，本发明提供了一种结合il22的抗体，其包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：
[0210]
包含seq id no：5的cdr-l1，
[0211]
包含seq id no：6的cdr-l2，和
[0212]
包含seq id no：7的cdr-l3。
[0213]
在一个实施方案中，本发明提供了一种结合il22的抗体，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以下的至少一个：
[0214]
包含seq id no：8的cdr-h1，
[0215]
包含seq id no：9的cdr-h2，和
[0216]
包含seq id no：10的cdr-h3。
[0217]
在一个实施方案中，本发明提供了一种结合il22的抗体，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：
[0218]
包含seq id no：8的cdr-h1，
[0219]
包含seq id no：9的cdr-h2，和
[0220]
包含seq id no：10的cdr-h3。
[0221]
本发明的抗体分子可以分别包含互补的轻链或互补的重链。
[0222]
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种结合il22的抗体，其包含：
[0223]
轻链可变区，其包含：
[0224]
包含seq id no：5的cdr-l1，
[0225]
包含seq id no：6的cdr-l2，和
[0226]
包含seq id no：7的cdr-l3；
[0227]
重链可变区，其包含：
[0228]
包含seq id no：8的cdr-h1，
[0229]
包含seq id no：9的cdr-h2，和
[0230]
包含seq id no：10的cdr-h3。
[0231]
在一个实施方案中，本发明的抗体包含含有seq id no：22或seq id no：72中给出的序列的轻链可变区。
[0232]
在一个实施方案中，本发明的抗体包含含有seq id no：24或seq id no：74中给出的序列的重链可变区。
[0233]
在一个实施方案中，本发明的抗体包含含有seq id no：22中给出的序列的轻链可变区和含有seq id no：24中给出的序列的重链可变区。
[0234]
在一个替代实施方案中，本发明的抗体包含含有seq id no：72中给出的序列的轻链可变区和含有seq id no：74中给出的序列的重链可变区。
[0235]
在一个实施方案中，本发明的抗体是包含以下的fab：
[0236]
轻链可变区，其包含：
[0237]
包含seq id no：5的cdr-l1，
[0238]
包含seq id no：6的cdr-l2，和
[0239]
包含seq id no：7的cdr-l3；
[0240]
重链可变区，其包含：
[0241]
包含seq id no：8的cdr-h1，
[0242]
包含seq id no：9的cdr-h2，和
[0243]
包含seq id no：10的cdr-h3。
[0244]
在一个实施方案中，本发明的抗体是包含轻链和重链的fab，所述轻链包含seq id no：26中给出的序列，所述重链包含seq id no：28中给出的序列。
[0245]
在另一个实施方案中，本发明的抗体是包含轻链和重链的igg1，所述轻链包含seq id no：26中给出的序列，所述重链包含seq id no：30中给出的序列。
[0246]
在另一个实施方案中，本发明的抗体是包含轻链和重链的igg4p，所述轻链包含seq id no：26中给出的序列，所述重链包含seq id no：32中给出的序列。
[0247]
在一个替代实施方案中，本发明提供了结合il22的抗体，其包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含以下的至少一个：
[0248]
包含seq id no：65的cdr-l1，
[0249]
包含seq id no：66的cdr-l2，和
[0250]
包含seq id no：67的cdr-l3。
[0251]
在一个替代实施方案中，本发明提供了结合il22的抗体，其包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：
[0252]
包含seq id no：65的cdr-l1，
[0253]
包含seq id no：66的cdr-l2，和
[0254]
包含seq id no：67的cdr-l3
[0255]
在一个替代实施方案中，本发明提供了结合il22的抗体，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以下的至少一个：
[0256]
包含seq id no：68的cdr-h1，
[0257]
包含seq id no：69的cdr-h2，和
[0258]
包含seq id no：70的cdr-h3。
[0259]
在一个替代实施方案中，本发明提供了结合il22的抗体，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：
[0260]
包含seq id no：68的cdr-h1，
[0261]
包含seq id no：69的cdr-h2，和
[0262]
包含seq id no：70的cdr-h3。
[0263]
在一个替代实施方案中，本发明提供了结合il22的抗体，其包含：
[0264]
轻链可变区，其包含：
[0265]
包含seq id no：65的cdr-l1，
[0266]
包含seq id no：66的cdr-l2，和
[0267]
包含seq id no：67的cdr-l3；
[0268]
重链可变区，其包含：
[0269]
包含seq id no：68的cdr-h1，
[0270]
包含seq id no：69的cdr-h2，和
[0271]
包含seq id no：70的cdr-h3。
[0272]
在一个替代实施方案中，本发明的抗体是包含以下的fab：
[0273]
轻链可变区，其包含：
[0274]
包含seq id no：65的cdr-l1，
[0275]
包含seq id no：66的cdr-l2，和
[0276]
包含seq id no：67的cdr-l3；
[0277]
重链可变区，其包含：
[0278]
包含seq id no：68的cdr-h1，
[0279]
包含seq id no：69的cdr-h2，和
[0280]
包含seq id no：70的cdr-h3。
[0281]
在又一个替代实施方案中，本发明的抗体是包含轻链和重链的fab，所述轻链包含seq id no：76中给出的序列，所述重链包含seq id no：78中给出的序列。
[0282]
在另一个替代实施方案中，本发明的抗体是包含轻链和重链的igg1，所述轻链包含seq id no：76中给出的序列，所述重链包含seq id no：80中给出的序列。
[0283]
在另一个替代实施方案中，本发明的抗体是包含轻链和重链的igg4p，所述轻链包含seq id no：76中给出的序列，所述重链包含seq id no：82中给出的序列。
[0284]
在实施方案中，本发明提供了包含轻链可变区和重链可变区的抗体，所述轻链可变区含有包含seq id no：5或seq id no：65的cdr-l1、包含seq id no：6或seq id no：66的cdr-l2、包含seq id no：7或seq id no：67的cdr-l3；所述重链可变区含有包含seq id no：8或seq id no：68的cdr-h1、包含seq id no：9或seq id no：69的cdr-h2、以及包含seq id no：10或seq id no：70的cdr-h3。
[0285]
在一个实施方案中，抗体包含重链和轻链，其中重链包含ch1结构域并且轻链包含cl结构域，κ或λ。
[0286]
抗il22抗体的功能特性
[0287]
在一个实施方案中，本发明的抗体是中和抗体。优选地，根据本发明的抗体中和il22活性。具体地，该抗体能够中和il22与il22受体1(il22r1)的结合。本发明的抗il22抗体还结合il22并抑制il22与il22结合蛋白(il22ra2或il22bp)的结合。优选地，抗体能够中和il22与il22受体1(il22r1)和il22结合蛋白(l22ra2)的结合。
[0288]
本发明的抗il22抗体与il22r1结合il22上的相同区域。在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种与il22上的区域结合的抗体，使得该结合在空间上阻断il22和il22r1之间的相互作用。具体地，抗体的可变区可以在空间上阻断il22和il22r1之间的相互作用。
[0289]
在一些实施方案中，根据本发明的抗体结合不结合il22bp的il22(“游离il22”)。在一些实施方案中，根据本发明的抗体结合il22并防止il22结合il22bp。
[0290]
根据本发明的抗体对il22具有特异性。在一个实施方案中，与il22r1相比，该抗体对il22具有更强的结合亲和力。这表征为针对il22的解离亲和常数(kd)是针对il22r1或
il22bp的至少10倍。具体而言，这是使用biacore技术进行测量的。
[0291]
在一些实施方案中，抗体以足够的亲和力和特异性结合il22。在某些实施方案中，抗体以约1μm、100nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、5nm、1nm、0.5nm、0.1nm、0.05nm或0.001nm(例如10-8
m或更小，例如10-8
m至10-13
m，例如10-9
m至10-13
m)(包括这些值之间的任何范围)中任一个的kd结合人il22。在一个实施方案中，根据本发明的抗体以小于100pm的kd结合人il22。
[0292]
在某些实施方案中，抗体以约1μm、100nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、5nm、1nm、0.5nm、0.1nm、0.05nm或0.001nm(例如10-8
m或更小，例如10-8
m至10-13
m，例如10-9
m至10-13
m)(包括这些值之间的任何范围)中任一个的kd结合食蟹猴il22。在一个实施方案中，根据本发明的抗体以小于100pm的kd结合食蟹猴il22。
[0293]
技术人员应当理解，kd值可以取决于抗体的形式和整体结构而不同。例如，抗体的kd在多特异性抗体、全长抗体或抗体片段的上下文中可能不同。
[0294]
本发明的抗il22抗体能够抑制il22诱导的从细胞释放il10。
[0295]
如实施例所证明的，本发明的抗il22抗体能够抑制il22介导的角质形成细胞增殖和分化。
[0296]
本发明的抗il22抗体还能够抑制il22诱导的抗微生物肽例如s100a7的释放。
[0297]
抗体的亲和力以及抗体抑制结合的程度可以由技术人员使用常规技术，例如scatchard等人(ann.ky.acad.sci.51:660-672(1949))描述的那些技术或使用诸如biacore的系统通过表面等离子体共振(spr)来确定。对于表面等离子体共振，靶标分子被固定在固相上，并暴露于沿着流动池运行的流动相中的配体。如果配体与固定的靶标发生结合，局部折射率会发生变化，导致spr角度发生变化，这可以通过检测反射光强度的变化来实时监测。可以分析spr信号的变化率，以得出结合反应的缔合和解离阶段的表观速率常数。这些值的比率给出表观平衡常数(亲和力)(参见例如wolff等人,cancer res.53:2560-65(1993))。
[0298]
在一个实施方案中，根据本发明的抗il22抗体与未与il22结合蛋白结合的il22(“游离il22”)结合。更具体地，根据本发明的抗体结合il22并防止il22结合il22结合蛋白。
[0299]
优选地，根据本发明的抗体对il22具有特异性。
[0300]
本文涉及抗体的公开内容，特别是关于结合亲和力和特异性以及活性的公开内容也适用于抗原结合片段和抗体样分子。
[0301]
与相同表位结合的抗体
[0302]
抗体可以与上文在轻链、重链、轻链可变区(lcvr)、重链可变区(hcvr)或cdr序列方面定义的那些竞争结合il22，或结合相同的表位。
[0303]
具体地，本发明提供了与包含seq id no：5/6/7/8/9/10的cdr-l1/cdr-l2/cdr-l3/cdr-h1/cdr-h2/cdr-h3序列组合的抗体竞争结合il22或结合相同表位的抗体。抗体可以与包含seq id no：22/24的lcvr和hcvr序列对的抗体竞争结合il22，或结合相同的表位。抗体可以与包含seq id no：26/28中给出的lc和hc序列对的fab竞争结合il22，或结合相同的表位。
[0304]
或者，本发明提供了与包含seq id no：65/66/67/68/69/70的cdr-l1/cdr-l2/cdr-l3/cdr-h1/cdr-h2/cdr-h3序列组合的抗体竞争结合il22或结合相同表位的抗体。抗
体可以与包含seq id no：72/74的lcvr和hcvr序列对的抗体竞争结合il22，或结合相同的表位。抗体可以与包含seq id no：76/78中给出的lc和hc序列对的fab竞争结合il22，或结合相同的表位。
[0305]
在一个实施方案中，本发明提供了一种与il22上的表位结合的抗il22抗体，所述表位包含一个或多个残基vrligeklfhgvsm(seq id no：1，il22的氨基酸序列的残基72-85)。在一些实施方案中，本发明提供了结合多肽vrligeklfhgvsm(seq id no：96)的抗il22抗体。在实施方案中，本发明提供了结合选自由seq id no：1定义的il22的氨基酸序列的残基72-85的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或所有残基的抗体。
[0306]
在一个实施方案中，本发明提供了一种结合il22上的表位的抗il22抗体，所述表位包含选自如以小于的接触距离测定的由人il22(seq id no：1)的gln48、glu77、phe80、his81、gly82、val83、ser84、met85、arg88、leu169、met172、ser173、arg175、asn176和ile179组成的列表的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或全部残基。在实施方案中，本发明提供了结合il22上的表位的抗体，所述表位包含选自如以抗体和il22之间小于的接触距离的距离测定的由人il22(seq id no：1)的lys44、phe47、gln48、ile75、gly76、glu77、phe80、his81、gly82、val83、ser84、met85、ser86、arg88、leu169、met172、ser173、arg175、asn176和ile179组成的列表的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或全部残基。
[0307]
具体地，本发明提供了可以与包含下表4或5所列重链和轻链残基的抗体竞争结合il22或结合相同表位的抗体。更具体地，本发明的抗体包含cdr-h3序列，该cdr-h3序列包含seq id no：24的残基97-104，优选残基99-104并与如上文定义的il22上的表位结合。更具体地，本发明的抗体包含如表4或5中所定义的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3残基并且结合如上文所定义的il22上的表位。
[0308]
表4：本发明的抗il22抗体的轻链和重链的氨基酸涉及与il22的相互作用，其在抗体和il-22之间具有的接触距离。残基的位置对于轻链对应于seq id no：26和对于重链对应于seq id no：28。
[0309][0310]
表5.本发明的抗il22抗体的轻链和重链的氨基酸参与与il22的相互作用，其在抗体和il-22之间具有的接触距离。残基的位置对于轻链对应于seq id no：26和对于重链对应于seq id no：28。
[0311]
[0312][0313]
更具体地，本发明提供了结合如上文所定义的il22上的表位的抗il22抗体，并且其中所述抗体阻止il22与il22r1和il22bp的结合。更具体地，抗体的轻链在空间上阻止il22r1与il22的结合。
[0314]
可通过本领域中已知的任何合适的结合位点定位方法组合由本发明所提供的抗体中的任一种来鉴定表位。此类方法的实例包括针对与本发明的抗体或其片段的结合来筛选来源于全长靶蛋白质的具有不同长度的肽，和鉴定可特异性结合含有由抗体识别的表位的序列的抗体的片段。可以以合成方式制备靶肽。可通过例如质谱分析来鉴定结合抗体的肽。在另一实例中，可使用nmr光谱法或x射线结晶学鉴定本发明的抗体所结合的表位。通常，在通过x射线结晶学进行表位测定时，在与cdr相距内的抗原的氨基酸残基被视为表位的氨基酸残基部分。在鉴定后，表位可用于制备结合本发明的抗体的片段并且如果需要用作免疫原以获得结合相同表位的额外抗体。
[0315]
在一个实施方案中，通过x射线结晶学测定抗体的表位。
[0316]
通过使用本领域中已知的常规方法，可容易地测定抗体是否与参考抗体结合相同表位或竞争结合。例如，为测定测试抗体是否与本发明的参考抗体结合相同表位，使参考抗体在饱和条件下与蛋白质或肽结合。接着，评估测试抗体结合蛋白质或肽的能力。如果在与参考抗体的饱和结合之后测试抗体能够结合蛋白质或肽，则可得出以下结论：测试抗体与参考抗体结合不同表位。另一方面，如果在参考抗体的饱和结合之后测试抗体不能结合蛋白质或肽，则测试抗体可结合与由本发明的参考抗体所结合的表位相同的表位或参考抗体引起抗原的构象变化并且因此阻止测试抗体的结合。
[0317]
为测定抗体是否与参考抗体竞争结合，以两种不同实验设置来进行上述结合方法学。在第一设置中，使参考抗体在饱和条件下结合抗原，接着评估测试抗体与抗原的结合。在第二设置中，使测试抗体在饱和条件下结合抗原，接着评估参考抗体与蛋白质/肽的结合。在两种实验性设置中，如果仅第一(饱和)抗体能够结合蛋白质/肽，则得出以下结论：测试抗体和参考抗体竞争结合抗原。如本领域技术人员将理解，与参考抗体竞争结合的抗体可能未必与参考抗体结合相同表位，但可通过结合重叠或相邻表位而在空间上阻断参考抗体的结合或引起构象变化，其导致结合的缺乏。
[0318]
如果两种抗体中的一种竞争性地抑制(阻断)另一种与抗原的结合，则该两种抗体结合相同或重叠表位。或者，如果抗原中的减少或消除一种抗体的结合的基本上所有氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则这两种抗体具有相同表位。如果减少或消除一种抗体的结合的某些氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有重叠的表
位。
[0319]
随后，可进行其他常规实验(例如，肽突变和结合分析)以确认所观察到的测试抗体的结合的缺乏确实是归因于与参考抗体相同的抗原部分的结合或空间阻断(或另一种现象)是否引起所观察到的结合的缺乏。此类实验可使用elisa、ria、表面等离子体共振、流式细胞术或本领域中可用的任何其他定量或定性抗体结合测定来进行。
[0320]
抗体变体
[0321]
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失的抗体变体。用于取代型突变发生的感兴趣的位点包括cdr和fr。可将氨基酸取代引入感兴趣的抗体并且针对所需活性(例如，保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的adcc或cdc)筛选产物。
[0322]
在某些实施方案中，涵盖本文中所描述的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其他生物特性。抗il-22抗体的氨基酸序列变体可通过将适当修饰引入编码蛋白质的核苷酸序列或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗il22抗体的氨基酸序列内(例如一个或多个cdr和/或框架序列中或vh和/或vl结构域中)的残基的缺失和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有所需特征。
[0323]
在本文中所提供的变体vh和vl序列的某些实施方案中，每个hvr未改变或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
[0324]
将理解，可对由本发明提供的cdr进行一个或多个氨基酸取代、添加和/或缺失而不显著改变抗体结合il22和降低il22活性的能力。本领域技术人员可容易地测试任何氨基酸取代、添加和/或缺失的作用，例如通过使用本文中所描述的方法，尤其是实施例中说明的方法，以测定il22结合和il22与其受体il22r1和il22结合蛋白质的相互作用的抑制。
[0325]
因此，在变体vh和vl序列的某些实施方案中，每个cdr含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代，其中此类氨基酸取代是保守性的，并且其中抗体保持其与il22的结合特性并且阻断il22与il22r1和il22结合蛋白质的结合。
[0326]
因此，本发明提供了一种抗il22抗体，其包含选自cdr-l1(包含seq id no：5)、cdr-l2(包含seq id no：6)、cdr-l3(包含seq id no：7)、cdr-h1(包含seq id no：8)、cdr-h2(包含seq id no：9)和cdr-h3(包含seq id no：10)的一个或多个cdr，其中一个或多个cdr中的一个或多个氨基酸已被另一种氨基酸(例如如下文定义的相似氨基酸)取代。
[0327]
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗il22抗体，其包含cdr-l1(包含seq id no：5)、cdr-l2(包含seq id no：6)、cdr-l3(包含seq id no：7)、cdr-h1(包含seq id no：8)、cdr-h2(包含seq id no：9)和cdr-h3(包含seq id no：10)，例如其中一个或多个cdr中的一个或多个氨基酸已被另一种氨基酸(例如如下文定义的相似氨基酸)取代。在实施方案中，一个或多个cdr中的一个或多个氨基酸取代替代游离半胱氨酸残基或修饰潜在的天冬酰胺脱酰胺位点。在实施方案中，一个或多个cdr中的一个或多个氨基酸取代修饰潜在的天冬氨酸异构化位点。在实施方案中，一个或多个cdr中的一个或多个氨基酸取代去除潜在的dp水解位点。在实施方案中，关于cdr-l3(seq id no：7)，取代是c91s或c91v；n95d；s96a；或其组合；关于cdr-h2(seq id no：9)，取代是d54e、g55a或其组合；关于cdr-h3(seq id no：9)，取代是d107e，或所列举的取代的组合。
[0328]
在一个实施方案中，本发明的抗il22抗体包含含有三个cdr的轻链可变结构域，其中cdr-l1的序列包含与seq id no：5中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列，cdr-l2包含与seq id no：6中给出的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％同一性或相似性的序列，和/或cdr-l3包含与seq id no：7中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列。
[0329]
在一个实施方案中，本发明的抗il22抗体包含重链可变结构域，其包含三个cdr，其中cdr-h1的序列包含与seq id no：8中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列，cdr-h2包含与seq id no：9中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列，和/或cdr-h3包含与seq id no：10中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列。
[0330]
在一个实施方案中，本发明的抗il22抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含与seq id no：22中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列。
[0331]
在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区，该重链可变区包含与seq id no：24中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列。
[0332]
在一个实施方案中，本发明的抗il22抗体包含轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含与seq id no：22中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％，92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列和/或重链可变区包含与seq id no：24中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列。
[0333]
在一个实施方案中，本发明的抗il22抗体包含cdr-l1/cdr-l2/cdr-l3/cdr-h1/cdr-h2/cdr-h3序列，其分别包含seq id no：65/66/67/68/69/70，并且轻链可变区和重链可变区的其余部分分别与seq id no：72和74具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性。
[0334]
在一个实施方案中，本发明的抗il22抗体包含cdr-l1/cdr-l2/cdr-l3/cdr-h1/cdr-h2/cdr-h3序列，其分别包含seq id no：5/6/7/8/9/10，并且轻链可变区和重链可变区的其余部分分别与seq id no：22和24具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性。
[0335]
在一个实施方案中，本发明的抗il22抗体是包含轻链和重链的fab，所述轻链包含与seq id no：26中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列，所述重链包含与seq id no：28中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列。
[0336]
在一个实施方案中，本发明的抗il22抗体是包含seq id no：5/6/7/8/9/10中给出的cdr-l1/cdr-l2/cdr-l3/cdr-h1/cdr-h2/cdr-h3序列的fab，并且轻链和重链的其余部分
分别与seq id no：26和28具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性。
[0337]
在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含seq id no：22中给出的序列，其中位置91、95和/或96处的一个或多个残基已被另一种氨基酸取代；和重链可变区包含seq id no：24中给出的序列，其中位置54、55和/或107处的一个或多个残基已被另一种氨基酸取代。
[0338]
本发明提供了一种抗il22抗体，其包含选自cdr-l1(包含seq id no：65)、cdr-l2(包含seq id no：66)、cdr-l3(包含seq id no：67)、cdr-h1(包含seq id no：68)、cdr-h2(包含seq id no：69)和cdr-h3(包含seq id no：70)的一个或多个cdr，其中一个或多个cdr中的一个或多个氨基酸已被另一种氨基酸(例如如下文定义的相似氨基酸)取代。
[0339]
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗il22抗体，其包含cdr-l1(包含seq id no：65)、cdr-l2(包含seq id no：66)、cdr-l3(包含seq id no：67)、cdr-h1(包含seq id no：68)、cdr-h2(包含seq id no：69)和cdr-h3(包含seq id no：70)，例如其中一个或多个cdr中的一个或多个氨基酸已被另一种氨基酸(例如如下文定义的相似氨基酸)取代。在实施方案中，一个或多个cdr中的一个或多个氨基酸取代替代游离半胱氨酸残基或修饰潜在的天冬酰胺脱酰胺位点。在实施方案中，一个或多个cdr中的一个或多个氨基酸取代修饰潜在的天冬氨酸异构化位点。在实施方案中，一个或多个cdr中的一个或多个氨基酸取代去除潜在的dp水解位点。在实施方案中，关于cdr-h2(seq id no：69)，取代是s61t。
[0340]
在一个实施方案中，本发明的抗il22抗体包含含有三个cdr的轻链可变结构域，其中cdr-l1的序列包含与seq id no：65中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列，cdr-l2包含与seq id no：66中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列和/或cdr-l3包含与seq id no：67中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列。
[0341]
在一个实施方案中，本发明的抗il22抗体包含重链可变结构域，其包含三个cdr，其中cdr-h1的序列包含与seq id no：68中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列，cdr-h2包含与seq id no：69中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列，和/或cdr-h3包含与seq id no：70中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列。
[0342]
在一个实施方案中，本公开内容的抗il22抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含与seq id no：72中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列。
[0343]
在一个实施方案中，本公开内容的抗体包含重链可变区，该重链可变区包含与seq id no：74中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列。
[0344]
在一个实施方案中，本发明的抗il22抗体包含轻链可变区和重链可变区，其中所
述轻链可变区包含与seq id no：72中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列和/或重链可变区包含与seq id no：74中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列。
[0345]
在一个实施方案中，本发明的抗il22抗体包含cdr-l1/cdr-l2/cdr-l3/cdr-h1/cdr-h2/cdr-h3序列，其分别包含seq id no：65/66/67/68/69/70，并且轻链可变区和重链可变区的其余部分分别与seq id no：72和74具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性或相似性。
[0346]
在一个实施方案中，本发明的抗il22抗体是包含轻链和重链的fab，所述轻链包含与seq id no：76中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列，和所述重链包含与seq id no：78中给出的序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列。
[0347]
在一个实施方案中，本发明的抗il22抗体是包含分别在seq id no：65/66/67/68/69/70中给出的cdr-l1/cdr-l2/cdr-l3/cdr-h1/cdr-h2/cdr-h3序列的fab，并且轻链和重链的其余部分分别与seq id no：76和78具有至少70％、80％、90％、95％或98％同一性或相似性。
[0348]
序列同一性和相似性
[0349]
可以容易地计算序列之间的同一性和相似性程度。“％序列同一性”(或“％序列相似性”)如下计算：(1)在比较窗口(例如，较长序列的长度、较短序列的长度、指定的窗口等)内比较两个最佳比对的序列，(2)确定包含相同(或相似)氨基酸(例如，两个序列中出现相同的氨基酸，两个序列中出现相似的氨基酸)的位置的数量，以产生匹配的位置的数量，(3)将匹配的位置的数量除以比较窗口(例如，较长序列的长度、较短序列的长度、指定的窗口)中的位置总数，并且(4)将结果乘以100以获得％序列同一性或序列相似性百分比。
[0350]
用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过smith&waterman,adv.appl.math.2:482(1981)的局部同源算法进行，通过needleman&wunsch,j.mol.biol.48:443(1970)的同源比对算法进行，通过pearson&lipman,proc.nat'l.acad.sci.usa 85:2444(1988)的相似性搜索方法进行，通过这些算法的计算机化实现进行(wisconsin genetics software package,genetics computer group,575science dr.,madison,wis.中的gap、bestfit、fasta和tfasta)，或通过手动对齐和目视检查进行(参见，例如，current protocols in molecular biology(ausubel等人,eds.1995supplement))。
[0351]
适合于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的优选实例包括blast和blast 2.0算法，其描述于altschul等人,nuc.acids res.25:3389-3402(1977)和altschul等人,j.mol.biol.215:403-410(1990)。还可以使用fasta使用默认或推荐参数来比较多肽序列。fasta(例如fasta2和fasta3)提供查询序列和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比。
[0352]
在某些实施方案中，取代、插入或缺失可以发生在一个或多个cdr内，只要此类改变不会显著降低抗体结合靶标的能力。
[0353]
例如，可以在cdr中进行不显著降低结合亲和力的保守改变。此类改变可以在cdr中的抗原接触残基之外进行。
[0354]
保守取代与更实质性的“示例性取代”一起显示在表6中。
[0355]
表6.氨基酸取代的实例
[0356][0357][0358]
可通过选择在保持取代区域中的多肽主链的结构、靶位点处的分子的电荷或疏水性或侧链的主体的作用方面显著不同的取代来实现抗体变体的生物特性的实质性修饰。可根据氨基酸侧链的特性的相似性将氨基酸分组(a.l.lehninger,biochemistry second ed.,pp.73-75,worth publishers,new york(1975))。
[0359]
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(人源化或人抗体)的一个或多个cdr区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体与亲本抗体相比将具有某些生物特性的变化(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)和/或将实质上保留亲本抗体的某些生物特性。示例性
取代变体为亲和力成熟抗体，其可例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地产生。简而言之，使一个或多个cdr残基发生突变，并且在噬菌体上展示变体抗体并且针对特定生物活性(例如，结合亲和力)进行筛选。
[0360]
可在cdr中进行变化(例如，取代)以例如改善抗体亲和力。此类变化可在hvr“热点”(即，由在体细胞成熟过程期间经历高频突变的密码子编码的残基(参见例如chowdhury,methods mol.biol.207:179-196(2008))，和/或使抗原与测试结合亲和力的所得变体vh或vl接触的残基)中进行。通过构建二级文库和从二级文库再选择来实现亲和力成熟已描述于hoogenboom等人,methods in molecular biology 178:1-37(o'brien等人编,human press,totowa,nj,(2001))中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过各种方法(例如，易错pcr、链改组或寡核苷酸引导的突变发生)中的任一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。随后产生二级文库。随后筛选该文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。
[0361]
一种可用于鉴定可作为突变发生的靶标的抗体的残基或区域的方法为丙氨酸扫描突变发生(cunningham和wells(1989)science,244:1081-1085)。在此方法中，鉴定残基或多个靶标残基并且用丙氨酸置换以测定抗体与抗原的相互作用是否受影响。或者或另外地，可使用抗原-抗体复合物的x射线结构鉴定抗体与其抗原之间的接触点。可筛选变体以测定其是否含有所需特性。
[0362]
恒定区变体
[0363]
在一些实施方案中，可将一个或多个氨基酸修饰引入本文中所提供的抗体的fc区中，由此产生fc区变体。fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，取代)的人fc区序列(例如，人igg1、igg2、igg3或igg4 fc区)。
[0364]
描述了具有改善或减弱的与fcr的结合的某些抗体变体(参见例如us 6,737,056；wo 2004/056312，和shields等人,j.biol.chem.9(2):6591-6604(2001))。
[0365]
具有延长的半衰期和改善的与新生儿fc受体(fcrn)的结合的抗体描述于us2005/0014934中。这些抗体包含具有一个或多个取代的fc区，所述取代改善fc区与fcrn的结合。
[0366]
在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个氨基酸取代的fc区，所述取代改善adcc，例如fc区的位置298、333和/或334(残基的eu编号)处的取代。
[0367]
效应功能降低的抗体包括具有fc区残基234、235、237、238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的抗体(参见例如us 6,737,056)。此类fc突变体包括具有氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个处的取代的fc突变体，其中氨基酸残基是根据eu编号系统编号。
[0368]
可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认cdc和/或adcc活性的降低/损耗。例如，可进行fc受体(fcr)结合测定以确保抗体不具有fcγr结合(因此可能不具有adcc活性)，但保留fcrn结合能力。用于介导adcc的原代细胞(nk细胞)仅表达fcγriii，而单核细胞表达fcri、fcγrii和fcγriii。造血细胞上的fcr表达概述于ravetch和kinet,annu.rev.immunol.9:457-492(1991)中。用于评估感兴趣的分子的adcc活性的体外测定的非限制性实例描述于us5,500,362、us5,821,337中。或者或另外地，可体内评估感兴趣的分子的adcc活性，例如在如公开于clynes等人,proc.proc.nat l acad.sci.usa 95:652-656(1998)中的动物模型中。还可进行clq结合测定以证实抗体不能结合clq并且因此不具有
cdc活性。参见例如wo 2006/029879和wo 2005/100402中的clq和c3c结合elisa。为评估补体活化，可进行cdc测定(参见例如gazzano-santoro等人,j.immunol.methods 202:163(1996)；cragg,m.s.等人,blood 101:1045-1052(2003)；和cragg,m.s.和m.i glennie,blood103:2738-2743(2004))。还可使用本领域中已知的方法进行fcrn结合和体内清除率/半衰期测定(参见例如petkova,s.b.等人,int l.immunol.18(12):1759-1769(2006))。
[0369]
本发明的抗体分子的恒定区结构域(如果存在)可根据抗体分子的建议功能并且特别是可能需要的效应功能来选择。例如，恒定区结构域可以是人iga、igd、ige、igg或igm结构域。特别地，当抗体分子意欲用于治疗用途并且需要抗体效应功能时，可使用人igg恒定区结构域，特别是igg1和igg3同种型。或者，当抗体分子意欲用于治疗目的并且不需要抗体效应功能时，可使用igg2和igg4同种型。应理解，还可使用这些恒定区结构域的序列变体。
[0370]
糖基化变体
[0371]
在某些实施方案中，对本文中所提供的抗体进行改变以增加或降低抗体糖基化的程度。抗体中的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以使得产生或移除一个或多个糖基化位点来方便地实现。
[0372]
人源化抗体、人抗体和嵌合抗体
[0373]
本发明的抗体可以是但不限于人源化抗体、完全人抗体或嵌合抗体。
[0374]
在一个实施方案中，抗体是人源化的。更具体地，抗il22抗体是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
[0375]
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。嵌合抗体的实例描述于例如us4,816,567；和morrison等人,proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855(1984))。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物，例如猴的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类别或亚类已从亲本抗体的类别或亚类发生改变。
[0376]
嵌合抗体由源自两个不同物种的元件组成，使得元件保留其源自的物种的特征。一般而言，嵌合抗体将包含来自一个物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的可变区和来自另一物种(例如人)的恒定区。
[0377]
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。
[0378]
应当理解，可能仅需要转移cdr的特异性决定残基而不是整个cdr(参见例如kashmiri等人,2005,methods,36,25-34)。人源化抗体还可任选地包含源自cdr所源自的非人物种的一个或多个框架残基。
[0379]
合适地，根据本发明的人源化抗体具有可变结构域，其包含人受体框架区以及一个或多个cdr并且任选地进一步包括一个或多个供体框架残基。
[0380]
在一个实施方案中，抗体是人源化抗体，其中可变结构域包含人受体框架区和非人供体cdr。
[0381]
当cdr被移植时，考虑到cdr所源自的供体抗体的类别/类型，可以使用任何合适的受体可变区框架序列，包括小鼠、灵长类动物和人框架区。
[0382]
可用于本发明的人框架的实例是kol、newm、rei、eu、tur、tei、lay和pom(kabat等人)。例如，kol和newm可用于重链，rei可用于轻链，eu、lay和pom可用于重链和轻链。或者，
therapeutics,83,67-123)。特定化学程序包括例如wo 93/06231、wo 92/22583、wo 89/00195、wo 89/01476和wo 03/031581中所描述的程序。或者，在效应分子是蛋白质或多肽的情况下，键联可使用重组dna程序，例如wo 86/01533和ep0392745中所描述的来实现。
[0390]
效应分子的实例可包括细胞毒素或细胞毒性剂，包括任何对细胞有害的(例如，杀伤)试剂。实例包括康普瑞汀(combrestatin)、海兔毒素(dolastatin)、埃博霉素(epothilone)、星形孢菌素(staurosporin)、类美登素(maytansinoid)、海绵素(spongistatin)、根瘤菌素(rhizoxin)、软海绵素(halichondrin)、杆孢菌素(roridin)、海米斯林(hemiasterlin)、紫杉醇(taxol)、细胞迟缓素b(cytochalasin b)、短杆菌素d(gramicidin d)、溴化乙锭(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、特诺波赛(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、阿霉素(doxorubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素d(actinomycin d)、1-去氢睾固酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)以及其类似物或同源物。
[0391]
效应分子还包括(但不限于)抗代谢物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪(decarbazine))、烷基化剂(例如，甲氮芥(mechlorethamine)、噻替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine；bsnu)和洛莫司汀(lomustine；ccnu)、环硫磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链佐霉素(streptozotocin)、丝裂霉素c和顺-二氯二胺铂(ii)(ddp)、顺铂(cisplatin))、蒽环霉素(anthracycline)(例如，道诺霉素(先前为柔红霉素(daunomycin))和阿霉素(doxorubicin))、抗生素(例如，放线菌素d(dactinomycin)(先前为放射菌素(actinomycin))、博莱霉素(bleomycin)、光辉霉素、安曲霉素(anthramycin；amc)、卡奇霉素(calicheamicin)或倍癌霉素(duocarmycin))和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))。
[0392]
其他效应分子可包括螯合型放射核素，例如111in和90y、lu177、铋213、锎252、铱192和钨188/铼188；或药物，例如(但不限于)烷基磷酸胆碱、拓朴异构酶i抑制剂、类紫杉醇(taxoid)和苏拉明(suramin)。
[0393]
其他效应分子包括蛋白质、肽和酶。感兴趣的酶包括(但不限于)蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、异构酶、转移酶。感兴趣的蛋白质、多肽和肽包括(但不限于)免疫球蛋白、毒素(例如相思子毒素、蓖麻毒素a、假单胞菌外毒素(pseudomonas exotoxin)或白喉毒素)、蛋白质(例如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子或组织纤维蛋白溶酶原活化因子)、血栓剂或抗血管生成剂(例如血管生长抑素或内皮生长抑素)或生物反应调节剂(例如淋巴因子、白介素-1(il-1)、白介素-2(il-2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、神经生长因子(ngf)或其他生长因子和免疫球蛋白。
[0394]
其他效应分子可包括适用于例如诊断的可检测物质。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性核素、正电子发射金属(用于正电子发
射断层摄影术)和非放射性顺磁性金属离子。关于可缀合至抗体以用于诊断学的金属离子，通常参见us4,741,900。合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括链霉亲和素、抗生素蛋白和生物素；合适的荧光物质包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基氨荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白；合适的发光物质包括鲁米诺；合适的生物发光物质包括萤光素酶、萤光素和水母蛋白；并且合适的放射性核素包括125i、131i、111in和99tc。
[0395]
在另一实例中，效应分子可延长抗体的体内半衰期，和/或降低抗体的免疫原性和/或增强抗体跨越上皮屏障递送至免疫系统。此类型的合适的效应分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白质或白蛋白结合化合物，例如wo2005/117984中所描述的化合物。
[0396]
在效应分子是聚合物的情况下，其通常可以是合成或天然存在的聚合物，例如任选取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧化烯聚合物，或分支或未分支多糖，例如同多糖或杂多糖。
[0397]
可存在于上文所提及的合成聚合物上的特定任选取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。
[0398]
合成聚合物的特定实例包括任选取代的直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，特别是任选取代的聚(乙二醇)，例如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。
[0399]
天然存在的特定聚合物包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。
[0400]
在一个实施方案中，聚合物为白蛋白或其片段，例如人血清白蛋白或其片段。
[0401]
如果需要，聚合物尺寸可变化，但平均分子量通常在500da至50000da的范围内，例如5000da至40000da，例如20000da至40000da。聚合物尺寸可尤其基于产物的预期用途，例如定位至某些组织例如肿瘤或延长循环半衰期的能力而选择(关于综述，参见chapman,2002,advanced drug delivery reviews,54,531-545)。因此，例如，在产物意欲离开循环并且渗透组织，例如用于治疗肿瘤的情况下，可能有利的是使用例如分子量为约5000da的小分子量聚合物。对于产物保留在循环中的应用，可能有利的是使用较高分子量聚合物，例如具有在20000da至40000da范围内的分子量。
[0402]
合适的聚合物包括聚亚烷基聚合物，例如聚(乙二醇)或特别是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，和特别是分子量在约15000da至约40000da范围内的聚合物。
[0403]
在一个实例中，根据本发明的抗体连接至聚(乙二醇)(peg)部分。在一个特定实施方案中，根据本发明的抗原结合片段和peg分子可经由定位于抗体片段中的任何可用氨基酸侧链或末端氨基酸官能团(例如，任何游离氨基、亚氨基、巯基、羟基或羧基)连接。此类氨基酸可天然存在于抗体片段中或可使用重组dna方法工程改造至片段中(参见例如us 5,219,996；us 5,667,425；wo98/25971、wo2008/038024)。在一个实例中，本发明的抗体分子为经修饰的fab片段，其中该修饰为一个或多个氨基酸添加至其重链的c端以允许效应分子的连接。适当地，额外氨基酸形成含有一个或多个可与效应分子连接的半胱氨酸残基的经修饰的铰链区。可使用多个位点来连接两个或更多个peg分子。
[0404]
合适的peg分子通过位于抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的硫醇基共价连接。连接至经修饰的抗体片段的每个聚合物分子可共价连接至位于片段中的半胱氨酸残基的硫原子。共价键将通常为二硫键或尤其硫-碳键。在硫醇基用作连接点的情况下，可使用
适当活化的效应分子，例如硫醇选择性衍生物，例如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。活化的聚合物可用作用于制备如上文所描述的聚合物修饰的抗体片段的起始物质。活化的聚合物可以是含有硫醇反应性基团的任何聚合物，例如α-卤代羧酸或酯，例如碘乙酰胺、酰亚胺(例如，马来酰亚胺)、乙烯基砜或二硫化物。此类起始物质可商购获得(例如，购自nektar，先前为shearwater polymers inc.,huntsville,al,usa)或可使用常规化学程序由市售起始物质制备。特定peg分子包括20k甲氧基-peg-胺(可获自nektar，先前为shearwater；rapp polymere；以及sunbio)和m-peg-spa(可获自nektar，先前为shearwater)。
[0405]
在一个实施方案中，抗体是聚乙二醇化的经修饰的fab片段、fab'片段或difab，即，具有与其共价连接的peg(聚(乙二醇))，例如根据公开于ep0948544或ep1090037中的方法[还参见"poly(ethyleneglycol)chemistry,biotechnical and biomedical applications",1992,j.milton harris(ed),plenum press,new york,"poly(ethyleneglycol)chemistry and biological applications",1997,j.milton harris and s.zalipsky(eds),american chemical society,washington dc和"bioconjugation protein coupling techniques for the biomedical sciences",1998,m.aslam和a.dent,grove publishers,new york；chapman,a.2002,advanced drug delivery reviews 2002,54:531-545]。在一个实例中，peg连接至铰链区中的半胱氨酸。在一个实例中，经peg修饰的fab片段具有共价连接至经修饰的铰链区中的单一硫醇基的马来酰亚胺基团。赖氨酸残基可共价连接至马来酰亚胺基团并且赖氨酸残基上的每个氨基可连接分子量为约20,000da的甲氧基聚(乙二醇)聚合物。因此，连接至fab片段的peg的总分子量可以是约40,000da。
[0406]
在一个实施方案中，抗体是经修饰的fab'片段，该经修饰的fab'片段在其重链的c端具有经修饰的铰链区，该经修饰的铰链区含有至少一个与效应分子连接的半胱氨酸残基。适合地，效应分子为peg并且使用wo 98/25971和wo 2004072116或wo 2007/003898中所描述的方法连接。可使用国际专利申请wo 2005/003169、wo 2005/003170和wo 2005/003171中所描述的方法将效应分子连接至抗体片段。
[0407]
在一个实施方案中，抗体不与效应分子连接。
[0408]
多核苷酸和载体
[0409]
本发明还提供了编码根据本发明的抗体或其部分的分离的多核苷酸。根据本发明的分离的多核苷酸可以包含例如通过化学处理产生的合成dna、cdna、基因组dna或其任何组合。
[0410]
表7.抗il22抗体的氨基酸序列及其相应的核酸序列。
[0411][0412]
本文提供了合适序列的实例。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种编码抗体的分离的多核苷酸，其包含seq id no：23、25、27、29、31、33、73、75、77、79、81和83中给出的序列。
[0413]
在一个实施方案中，本发明提供了编码本发明的抗体fab片段或igg1或igg4p抗体的重链的分离的多核苷酸，其分别包含seq id no：29、31、33中给出的序列。
[0414]
还提供了编码本发明的抗体fab片段或igg1或igg4抗体的轻链的分离的多核苷酸，其分别包含seq id no：79、81、83中给出的序列。
[0415]
在另一个实施方案中，本发明提供了编码本发明的fab抗体的重链和轻链的分离的多核苷酸，其中编码重链的多核苷酸包含seq id no：29或79中给出的序列，并且编码轻链的多核苷酸包含seq id no：27或77中给出的序列。
[0416]
本发明还提供了包含本文所述的一种或多种多核苷酸的克隆或表达载体。在一个实例中，根据本发明的克隆或表达载体包含一种或多种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自seq id no：23、25、27、29、31、33、73、75、77、79、81和83的序列。
[0417]
分子生物学的标准技术可用于制备编码本发明的抗体或其抗原结合片段的dna序列。所需dna序列可使用寡核苷酸合成技术完全或部分合成。根据需要可使用定点突变发生和聚合酶链反应(pcr)技术。
[0418]
可用于构建载体的一般方法、转染方法和培养方法是本领域技术人员熟知的。在此方面，参考“current protocols in molecular biology”,1999,f.m.ausubel(编),wiley interscience,new york和由cold spring harbor publishing出版的maniatis manual。
[0419]
用于产生抗体及其抗原结合片段的宿主细胞
[0420]
还提供了宿主细胞，其包含根据本发明的一种或多种分离的多核苷酸序列或包含编码本发明的抗体的一种或多种分离的多核苷酸序列的一种或多种克隆或表达载体。任何合适的宿主细胞/载体系统可用于表达编码本发明的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列。可使用细菌，例如大肠杆菌及其他微生物系统，或还可使用真核(例如哺乳动物)宿主细胞表达系统。合适的哺乳动物宿主细胞包括cho、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
[0421]
在其他实施方案中，提供了包含此类核酸或载体的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经转化有)：(1)载体，其包含编码包含抗il22抗体的vl的氨基酸序列和包含抗il22抗体的vh的氨基酸序列的核酸，或(2)包含编码包含抗il22抗体的vl的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗il22抗体的vh的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞为真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞或淋巴细胞(例如，y0、ns0、sp20细胞)。在一个实施方案中，宿主细胞为原核细胞，例如大肠杆菌细胞。在一个实施方案中，提供了用于制备抗il22抗体的方法，其中该方法包括在适于表达抗体的条件下培养如上文所提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
[0422]
适用于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文中所描述的原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，尤其在不需要糖基化和fc效应功能时。关于抗体片段和多肽于细菌中的表达，参见例如us 5,648,237、5,789,199和5,840,523(还参见charlton,methods in molecular biology,第248卷(b.k.c.lo,ed.,humana press,totowa,nj,2003),pp.245-254，描述了大肠杆菌中抗体片段的表达)。在表达之后，抗体可从细菌细胞糊中作为可溶性级分分离并可进一步纯化。
[0423]
除原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母是合适的编码抗体的载体的克隆和/或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，从而产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。参见gerngross,nat.biotech.22:1409-1414(2004)，和li等人,nat.biotech.24:210-215(2006)。
[0424]
用于本发明的中国仓鼠卵巢(cho细胞)的适合类型可包括cho和cho-k1细胞，包括dhfr-cho细胞，例如可与dhfr选择性标记物一起使用的cho-dg44细胞和cho-dxb11细胞，或可与谷氨酰胺合成酶选择性标记物一起使用的chok1-sv细胞。用于表达抗体的其他细胞类型包括淋巴细胞性细胞系，例如ns0骨髓瘤细胞和sp2细胞、cos细胞。宿主细胞可用根据本发明的分离的多核苷酸序列或表达载体稳定转化或转染。
[0425]
抗体的产生方法
[0426]
本发明还提供了用于产生根据本发明的抗体的方法，包括在适合产生根据本发明的抗体的条件下培养根据本发明的宿主细胞并分离抗体。
[0427]
抗体可以仅包含重链或轻链多肽，在这种情况下，仅需要使用重链或轻链多肽编码序列来转染宿主细胞。为了产生包含重链和轻链的抗体或其抗原结合片段，可以用两种载体转染细胞系，第一载体编码轻链多肽，第二载体编码重链多肽。或者，可以使用单一载体，该载体包括编码轻链和重链多肽的序列。
[0428]
因此，提供了培养宿主细胞和表达抗体、分离抗体和任选纯化抗体以提供分离的抗体的方法。在一个实施方案中，该方法还包括将效应分子与分离的抗体缀合的步骤。
[0429]
本发明还提供了用于产生根据本发明的抗体的方法，包括在适于导致从编码本发明的抗体分子的dna表达蛋白质的条件下培养含有本发明的载体的宿主细胞，和分离抗体分子。
[0430]
抗体分子可以仅包含重链或轻链多肽，在这种情况下，仅需要使用重链或轻链多肽编码序列来转染宿主细胞。为了产生包含重链和轻链的产物，可以用两种载体转染细胞系，第一载体编码轻链多肽，第二载体编码重链多肽。或者，可以使用单一载体，该载体包括编码轻链和重链多肽的序列。
[0431]
根据本发明的抗体以良好水平从宿主细胞表达。因此，抗体的特性似乎针对商业加工进行了优化。
[0432]
纯化的抗体
[0433]
在一个实施方案中，提供了纯化的抗体，例如人源化抗体，特别是本发明的抗体，其基本上经纯化以特别地不含或基本上不含内毒素和/或宿主细胞蛋白质或dna。
[0434]
基本上不含内毒素通常意指每毫克抗体产物的内毒素含量为1eu或更低，例如每毫克产物0.5或0.1eu。
[0435]
基本上不含宿主细胞蛋白质或dna通常意指每毫克抗体产物的宿主细胞蛋白质和/或dna含量为400μg或更低，根据需要例如每毫克100μg或更低，特别地，每毫克20μg。
[0436]
抗体的体外和离体用途
[0437]
本发明还提供了体外或离体抑制il-22诱导的stat3磷酸化的方法，该方法包括用本发明的抗体接触和孵育角质形成细胞。可使用任何角质形成细胞及其衍生物，包括例如hacat细胞。
[0438]
本发明还提供了体外或离体抑制il-22诱导的il-10释放的方法，该方法包括用根据本发明的抗体接触和孵育上皮细胞。更具体地，可使用colo205细胞。
[0439]
还提供了体外或离体抑制il22诱导的s100a7释放的方法，该方法包括用根据本发明的抗体接触和孵育角质形成细胞。
[0440]
还提供了体外或离体抑制与异常角质形成细胞分化和角化不全相关的il22诱导的表皮或角膜增厚的方法，该方法包括用根据本发明的抗体接触和孵育由角质形成细胞和真皮纤维母细胞组成的重构上皮。特别地，抑制由il22诱导的由表皮/角膜增厚和角化不全显示的异常角质形成细胞增殖和分化。
[0441]
通常将细胞孵育足够的时间以使抗体与il22结合并引起生物效应。
[0442]
实施例提供了涉及可用于实现某些生物效应的抗il22抗体的方法的描述。
[0443]
抗体的治疗用途
[0444]
可以施用本发明的抗体、其制剂或药物组合物用于预防性和/或治疗性治疗。
[0445]
本发明提供了用作药物的本发明的抗il22抗体或其药物组合物。
[0446]
在预防性应用中，将抗体、制剂或组合物以足以预防或减少病状或其一种或多种症状的随后影响的量施用至处于本文所述的病症或病状的风险中的受试者。
[0447]
在治疗应用中，将抗体以足以治愈、减轻或部分阻止病状或其一种或多种症状的量施用至已经患有本文所述的病症或病状的受试者。这种治疗性治疗可导致疾病症状的严重程度降低，或无症状期的频率或持续时间增加。
[0448]
待治疗的受试者可以是动物。优选地，根据本发明的药物组合物适应于施用至人
受试者。
[0449]
本发明提供了在有需要的受试者中治疗本文所述的病症或病状的方法，该方法包括向受试者施用根据本发明的抗体。此类抗体以治疗有效量施用。
[0450]
本发明还提供了本发明的抗体，其用于治疗本文所述的病症或病状。
[0451]
治疗适应症
[0452]
本发明的抗体可用于治疗、预防或改善与il22或il22r1活性相关的任何病状；例如，全部或部分由通过il22r1受体的信号传导导致的任何病状。
[0453]
已在人银屑病斑块中发现高水平的il22(boniface等人,clin exp immunol.150:407-415(2007))，并且已在皮肤炎症的小鼠模型中证明了该细胞因子参与银屑病的发病机制(van belle等人,j immunol.january 1；188(1):462-9(2012))。通过il22r1发出信号的配体(例如il22)与许多疾病有关，并且由于il22r1主要在上皮细胞和基质细胞中表达，因此关键疾病是影响基质和上皮细胞的疾病，例如皮肤中的疾病。
[0454]
本发明的抗体和组合物可用于治疗炎性皮肤病状。在某些实施方案中，炎性皮肤病状选自银屑病、银屑病关节炎、接触性皮炎、慢性手部湿疹或特应性皮炎。更具体地，炎症性皮肤病是特应性皮炎。
[0455]
具体地，本发明的抗体和组合物可用于通过减少异常il22介导的角质形成细胞增殖和分化来抑制诊断患有炎性皮肤病状的受试者中与异常角质形成细胞分化和角化不全相关的il22介导的表皮增厚。
[0456]
因此，本发明提供了一种在被诊断患有炎性皮肤病状的受试者中减弱皮肤屏障功能受损和/或角化不全和/或细胞因子和/或抗微生物肽(例如s100a7)释放的方法，该方法包括向所述受试者施用本发明提供的抗体。
[0457]
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的抗体，其用于在被诊断患有炎性皮肤病状的受试者中减弱皮肤屏障功能受损和/或角化不全和/或细胞因子和/或抗微生物肽(例如，s100a7)的释放。
[0458]
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的抗体在制备用于在被诊断患有炎性皮肤病状的受试者中减弱皮肤屏障功能受损和/或角化不全和/或细胞因子和/或抗微生物肽(例如，s100a7)的释放的药物中的用途。
[0459]
具体地，受损的皮肤屏障功能的这种减弱是通过减少异常的il-22介导的角质形成细胞增殖和分化来实现的。
[0460]
本发明的抗体和组合物可用于直接或间接抑制免疫细胞或造血细胞例如骨髓细胞、淋巴细胞或红细胞或其前体细胞的增殖、分化和/或存活。
[0461]
本发明的抗体和组合物可用于治疗多种免疫病症和过度增殖病症。
[0462]
可以治疗的免疫病症的实例包括但不限于自身免疫病症，例如关节炎(包括类风湿性关节炎(ra)、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、狼疮相关关节炎或强直性脊柱炎)、硬皮病、系统性红斑狼疮、hiv、干燥综合征、血管炎、多发性硬化症、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)、重症肌无力、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、结肠炎、糖尿病(i型)；例如，皮肤(例如，银屑病)、心血管系统(例如，动脉粥样硬化)、神经系统(例如，阿尔茨海默病)、肝脏(例如，肝炎)、肾脏(例如，肾炎)和胰腺(例如，胰腺炎)的炎性病状；心血管疾病，例如胆固醇代谢紊乱、氧自由基损伤、缺血；与伤口愈合相关的疾
病；呼吸系统疾病，例如哮喘和copd(例如囊性纤维化)；急性炎性病状(例如内毒素血症、败血症和败血病、中毒性休克综合征和传染病)；移植排斥和过敏。
[0463]
本发明的抗体和组合物可用于治疗il-22相关病症，例如关节炎病症，例如类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎或强直性脊柱炎；呼吸系统疾病(例如哮喘、慢性阻塞性肺病(copd))；心血管系统(例如动脉粥样硬化)、神经系统(例如阿尔茨海默病)、肝脏(例如肝炎)、肾脏(例如肾炎)、胰腺(例如、胰腺炎)和胃肠道器官，例如结肠炎、克罗恩病和ibd；急性炎性病状，例如内毒素血症、败血症和败血病、中毒性休克综合征和传染病；多器官衰竭；呼吸系统疾病(ard)；淀粉样变性；肾病，例如肾小球硬化症、膜性神经病、肾动脉硬化、肾小球肾炎、肾脏纤维增生性疾病以及其他肾功能障碍和肾肿瘤。
[0464]
本发明的抗il-22抗体和组合物可用于治疗上皮癌，例如癌、黑色素瘤等。wo03/083062公开了这些及其他疾病状态中的il-22抑制
[0465]
本发明的抗体和组合物可类似地用于治疗人的多发性硬化症。在多发性硬化症的小鼠模型中(tuohy等人(j.immunol.(1988)141:1126-1130)、sobel等人(j.immunol.(1984)132:2393-2401)和traugott(cell immunol.(1989)119:114-129))，用抗il22抗体治疗小鼠可以显著延迟疾病的发作。
[0466]
本发明的抗体和组合物可用于治疗类风湿性关节炎(ra)或其他关节炎疾病。在ra滑膜活检中，在波形蛋白+滑膜成纤维细胞和一些cd68+巨噬细胞中检测到il22蛋白，而在滑膜成纤维细胞中检测到il22r1。il22抑制剂改善类风湿性关节炎的症状(wo2005/000897；us 6,939,545)。
[0467]
本发明的抗体和组合物可用于减少混合淋巴细胞反应(mlr)并治疗依赖于il22的移植排斥和相关疾病(例如移植物抗宿主病)。mlr和移植模型已由current protocols in immunology,第2版,coligan等人eds.,john wiley&sons,1994；kasaian等人(immunity(2002)16:559-569))描述。
[0468]
本发明的抗体和组合物还可以用于通过施用足以抑制或减少受试者中il22和/或il22r1和/或il10r2应答细胞的过度增殖的量的抗体来治疗与il22应答细胞和il22r1/il10r2应答细胞的异常活性相关的过度增殖性疾病。
[0469]
因此，本发明的抗体可用于抑制肿瘤的进展，例如鳞状细胞癌、基底细胞癌、移行细胞乳头状瘤和癌、腺瘤、腺癌、皮革样胃(linitis plastica)、胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、vipoma、胆管癌、肝细胞癌、腺样囊性癌、阑尾类癌、催乳素瘤、嗜酸细胞瘤、huthle细胞腺瘤、肾细胞癌、grawitz瘤、多发性内分泌腺瘤、子宫内膜样腺瘤、附件和皮肤附属器肿瘤、粘液表皮样肿瘤、囊性、粘液性和浆液性肿瘤、囊腺瘤、腹膜假粘液瘤、导管、小叶和髓质肿瘤、腺泡细胞肿瘤、复杂上皮肿瘤、warthin肿瘤、胸腺瘤、特殊性腺肿瘤、性索间质肿瘤、卵泡膜瘤、颗粒细胞肿瘤、肾母细胞瘤、支持间质细胞肿瘤、副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、血管球瘤、黑素细胞痣、恶性黑色素瘤、黑色素瘤、结节性黑色素瘤、发育不良痣、恶性雀斑样痣、浅表扩散性黑色素瘤或肢端雀斑样黑色素瘤。
[0470]
本发明的抗体和组合物还可用于减少受试者的急性期反应。
[0471]
本发明的抗体和组合物还可用于治疗干燥综合征或选自肝癌、脂肪肉瘤、口腔鳞状细胞癌、结肠癌和结直肠癌、胰腺癌、小细胞和大细胞肺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、皮肤t
细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤的癌症。
[0472]
抗体及其抗原结合片段的诊断用途
[0473]
本发明还提供了本发明的抗体作为诊断性活性剂或在诊断性测定中的用途，例如用于诊断皮肤炎性疾病或其严重程度。
[0474]
优选可对生物样品进行诊断。“生物样品”涵盖获自个体的多种样品类型并且可用于诊断或监测测定。该定义涵盖脑脊髓液，血液例如血浆和血清，和生物来源的其他液体样品，例如尿液和唾液，固体组织样品，例如活检样本或组织培养物或从其衍生的细胞及其子代。定义还包括在获取之后已以任何方式操控的样品，例如通过试剂处理，增溶，或富集某些组分，例如多核苷酸。
[0475]
诊断测试优选可对不与人或动物身体接触的生物样品进行。此类诊断测试也被称为体外测试。体外诊断测试可依赖于检测已从受试者获得的生物样品中的游离il22(例如未与il22bp结合)的体外方法。
[0476]
药物和诊断组合物
[0477]
本发明的抗体可以在药物组合物中提供。药物组合物将通常为无菌的并且可额外包含药学上可接受的佐剂和/或载体。
[0478]
由于本发明的抗体适用于治疗、诊断和/或预防如本文中所描述的病症或病状，因此本发明还提供了药物或诊断组合物，其包含与药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的一种或多种组合的根据本发明的抗体或其抗原结合片段。
[0479]
特别地，以包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体中的一种或多种的药物组合物形式提供抗体或其抗原结合片段。
[0480]
除治疗活性成分以外，这些组合物可包含药学上可接受的赋形剂、载体、稀释剂、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料。此类材料应为无毒的并且不应干扰活性成分的功效。
[0481]
还提供了组合物，包括药物制剂，其包含本发明的抗il22抗体或包含编码本发明的抗体的序列的多核苷酸。在某些实施方案中，组合物包含本发明的一种或多种抗体，或一种或多种包含编码本发明的一种或多种抗体的序列的多核苷酸。这些组合物可进一步包含本领域中熟知的合适的载体，例如药学上可接受的赋形剂和/或佐剂，包括缓冲液。
[0482]
本发明的抗体的药物组合物是通过将具有所需纯度的此类抗体与一种或多种任选的药学上可接受的载体以冻干制剂或水性溶液的形式混合来制备。
[0483]
上文所提及的技术和方案的实例可见于remington'spharmaceutical sciences,第20版,2000,pub.lippincott,williams&wilkins中。
[0484]
药学上可接受的载体通常在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒性，并且包括(但不限于)：缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如edta；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，
例如钠；金属络合物(例如，zn-蛋白质络合物)；和/或非离子性界面活性剂，例如聚乙二醇(peg)。本文中的示例性药学上可接受的载体进一步包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性玻尿酸酶糖蛋白(shasegp)，例如人可溶性ph-20玻尿酸酶糖蛋白，例如rhuph20(baxter international,inc.)。某些示例性shasegp和使用方法(包括rhuph20)描述于us2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面中，shasegp与一种或多种其他葡萄糖胺聚糖酶(例如软骨素酶)组合。
[0485]
示例性冻干抗体制剂描述于us 6,267,958中。水性抗体制剂包括us 6,171,586和wo 2006/044908中所描述的制剂，后者的制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
[0486]
活性成分可包封于例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的微胶囊(例如分别为羟基甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中或粗滴乳液中。此类技术公开于remington's pharmaceutical sciences第16版,osol,a.ed.(1980)中。
[0487]
还可制备缓释制剂。缓释制剂的合适的实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品形式，例如膜或微胶囊。
[0488]
用于体内施用的制剂通常为无菌的。无菌性可例如通过经由无菌过滤膜过滤来容易地实现。
[0489]
示例性冻干抗体制剂描述于us 6,267,958中。水性抗体制剂包括us 6,171,586和wo2006/044908中所描述的制剂，后者的制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
[0490]
本发明的药物组合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。
[0491]
药学上可接受的载体包含水性载体或稀释剂。可用于本发明的药物组合物的合适的水性载体的实例包括水、缓冲水和生理盐水。其他载体的实例包括乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇及其类似物)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。在许多情况下，组合物中需要包括等张剂(例如糖)、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。
[0492]
药物组合物通常必须在制造和储存条件下是无菌和稳定的。组合物可配制为溶液、微乳液、脂质体或其他适合于高药物浓度的有序结构。
[0493]
在一个实施方案中，本发明的抗体是单一活性成分。在另一个实施方案中，本发明的抗体与一种或多种额外活性成分组合。或者，药物组合物包含本发明的抗体，该抗体是单一活性成分并且其可与其他药剂、药物或激素组合(例如同时、依序或分开)单独地向患者施用。
[0494]
载体或其他材料的确切性质可取决于施用途径，例如经口、静脉内、皮肤或皮下、经鼻、肌肉内和腹膜内途径。例如，固体口服形式可含有与活性物质一起的稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙和/或聚乙二醇；结合剂，例如淀粉、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧基甲基纤维素或聚乙烯吡咯啶酮；崩解剂，例如淀粉、褐藻酸、海藻酸盐或淀粉羟乙酸钠；发泡混合物；染料；甜味剂；湿润剂，例如卵磷脂、聚山梨醇酯、十二烷磺酸酯；和通常用于药物制剂中的无毒并且药理学上非活性物质。可以以已知方式，例如通过混合、粒化、制锭、糖包覆或膜包覆过程来制造此类药物制剂。
[0495]
口服制剂包括常用的赋形剂，例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、
纤维素、碳酸镁等。这些组合物呈溶液、悬浮液、锭剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或散剂形式并且含有10％至95％，优选25％至70％的活性成分。当将药物组合物冻干时，可在施用之前将冻干材料重构，例如悬浮液。优选在缓冲液中进行重构。
[0496]
用于静脉内施用或输注的溶液可含有例如无菌水作为载体或优选其可呈无菌水性等张生理盐水溶液形式。
[0497]
优选地，药物或诊断组合物包含根据本发明的人源化抗体。
[0498]
治疗有效量和剂量确定
[0499]
可适当地向患者施用根据本发明的抗体和药物组合物以鉴定所需治疗有效量。对于任何抗体，治疗有效量可最初在细胞培养测定中或在动物模型中(通常在啮齿动物、兔、犬、猪或灵长类动物中)评估。动物模型还可用于确定适当浓度范围和施用途径。此类信息可随后用于确定适用于在人中的施用的剂量和途径。
[0500]
用于人受试者的精确治疗有效量将取决于疾病状态的严重程度、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、施用时间和频率、药物组合、反应敏感性和对疗法的耐受性/反应。组合物可以方便地以每剂量含有预定量的本公开内容的活性剂的单位剂型呈现。本文所描述的任何实施方案的剂量范围和方案包括(但不限于)在1mg-1000mg单位剂量范围内的剂量。
[0501]
本发明的抗体或药物组合物的合适的剂量可由熟练的医学从业者确定。本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可变化，以获得在对患者无毒性的情况下有效实现特定患者、组合物和施用模式的所需治疗反应的活性成分的量。所选剂量水平将取决于各种药物动力学因素，包括所使用的本发明的特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所使用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所使用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质、所治疗的患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状况和先前病史，和医学技术中熟知的相似因素。
[0502]
合适的剂量可例如在约0.01μg/kg至约1000mg/kg所治疗的患者的体重，通常约0.1μg/kg至约100mg/kg所治疗的患者的体重的范围内。
[0503]
可调节剂量方案以得到最佳所需反应(例如，治疗反应)。例如，可施用单次剂量、可随时间推移而施用几个分次剂量，或可如治疗情况的紧急所指示的而按比例减少或增加剂量。如本文中所使用的单位剂型是指适合作为单个剂量用于所治疗的受试者的物理离散单元；每个单元含有与所需药物载体缔合的经计算以产生所需治疗作用的预定量的活性化合物。
[0504]
药物组合物或制剂的施用
[0505]
可施用本文所述的抗体或其制剂或组合物以用于预防性和/或治疗性治疗。
[0506]
可使用本领域中已知的各种方法中的一种或多种，经由一种或多种施用途径施用本发明的抗体或药物组合物。如本领域技术人员将理解，施用途径和/或模式将取决于所需结果而变化。本发明的抗体或药物组合物的施用途径的实例包括静脉内、肌肉内、皮内、眼内、腹膜内、皮下、脊椎或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。或者，本发明的抗体或药物组合物可经由非肠胃外途径施用，例如局部、表皮或黏膜施用途径。本发明的抗体或药物组合物可用于经口施用。
[0507]
合适的施用形式包括适用于肠胃外施用的形式，例如通过注射或输注，例如通过
推注注射或连续输注、静脉内、吸入或皮下形式。在产品用于注射或输注的情况下，其可呈在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式并且其可含有其他试剂，例如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。或者，根据本发明的抗体或其抗原结合片段可呈干燥形式，用于在使用之前用合适的无菌液体重构。还可制备适合于在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式。
[0508]
在配制之后，可将本发明的药物组合物直接施用至受试者。因此，本文中提供了根据本发明的抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途。
[0509]
制品和试剂盒
[0510]
本公开内容还提供了试剂盒，其包含本发明的抗il22抗体和使用说明书。试剂盒可进一步含有一种或多种其他试剂，例如上文所讨论的其他治疗剂或预防剂。
[0511]
本发明提供了根据本发明的抗体或其药物组合物用于制备药物的用途。
[0512]
本发明还提供了本发明的抗体用于制备用于治疗如本文中所描述的病症或病状的药物中的用途。
[0513]
在某些实施方案中，制品或试剂盒包含含有一种或多种本发明的抗体或本文中所描述的组合物的容器。在某些实施方案中，制品或试剂盒包含含有编码一种(或多种)本文中所描述的抗体或组合物的一种或多种核酸的容器。在一些实施方案中，试剂盒包含产生如本文中所描述的抗体的细胞或细胞系。
[0514]
在某些实施方案中，制品或试剂盒包含容器和容器上或与容器随附的标签或药品说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、iv溶液袋等。容器可由各种材料形成，例如玻璃或塑胶。容器容纳单独的或与可有效用于治疗、预防和/或诊断的另一种组合物组合的组合物并且可具有无菌接取口。组合物中的至少一种药剂是本发明的抗体。标签或药品说明书指示组合物是用于治疗炎性皮肤病状，更具体地，特应性皮炎。
[0515]
应注意，上文所提及的实施方案说明而非限制本发明，并且本领域技术人员将能够在不偏离权利要求范围的情况下设计许多替代性实施方案。在权利要求中，置于括号之间的任何附图标记不应被解释为限制权利要求。
[0516]
本发明包含的序列如表8-10所示：
[0517]
表8.il22的序列
[0518]
[0519][0520]
表9.11041抗体和相关变体的序列
[0521]
[0522]
[0523]
[0524]
[0525]
[0526]
[0527]
[0528]
[0529]
[0530]
[0531][0532]
表9.11070抗体和相关变体的序列
[0533]
[0534]
[0535]
[0536]
[0537]
[0538]
[0539]
[0540]
实施例
[0541]
实施例1.治疗性抗il22抗体11041和11070的产生和选择
[0542]
用经纯化的自制或市售人il22(r&d systems)对跨越不同物种的多种动物(包括小鼠、大鼠和兔)进行免疫接种。在3-5次注射之后，将动物处死并且收集pbmc、脾脏、骨髓和淋巴结。在elisa中针对与人和食蟹猕猴il22的结合来监测血清。
[0543]
在11041的情况下，设置记忆性b细胞培养物并且用ttp labtech mirrorball系统，在基于珠粒的测定中首先针对结合人和食蟹猕猴il22的能力筛选上清液。这是均质多重测定，其使用涂布于sol-r链霉亲和素珠粒(ttp labtech)上的生物素化人il22和生物素化食蟹猴il22以及作为揭示剂的山羊抗兔fc-fitc缀合物。
[0544]
从总共12个(164-400)板b培养物实验，在初始mirrorball筛选中鉴定出约4500个il22特异性阳性命中。然后，通过以下步骤对来自此测定的阳性上清液进行进一步表征：
[0545]
●
elisa，以确认与人和食蟹猴il-22的结合，
[0546]
●
进行il22依赖性hacat磷酸stat3 htrf细胞测定(cisbio)以鉴定中和剂，和
[0547]
●
在biacore中进行分析以评估解离速率和表征中和的作用模式。
[0548]
将中和作用分类为第1组或第2组。第1组表示结合人il22并且阻止il22r1的结合的抗体。第2组表示结合人il22但允许il22r1结合的抗体。我们选择通过第1组操作的抗体。使用荧光焦点方法对在磷酸stat3 htrf测定中显示中和作用的孔和/或具有期望的biacore概况的孔进行v区回收。
[0549]
还使用荧光焦点方法针对结合人il22的能力来直接筛选来自骨髓的浆细胞(与11070相关)。本文中，使用山羊抗大鼠fc-fitc缀合物揭示剂，在固定在链霉亲和素珠粒上的生物素化人il22上收集分泌il22特异性抗体的b细胞。收集约300个直接焦点。
[0550]
在对所收集的细胞进行反转录(rt)和pcr之后，产生编码抗体的v区的“转录活性pcr”(tap)产物并且用于瞬时转染hek-293细胞。测试含有重组抗体的所得tap上清液的以下能力：结合人和食蟹猴il22、在biacore中阻断il22r1结合和在hacat磷酸stat3htrf细胞测定中中和il22。
[0551]
随后，以兔或小鼠fab抗体形式克隆来自感兴趣的tap产物的重链和轻链可变区基因对并且在hek-293瞬时表达系统中再表达。对总共131个v区进行克隆和测序。随后，再测试重组克隆抗体的结合人和食蟹猴il22、在biacore中阻断il22r1结合和在基于colo205il-10htrf细胞的测定(cisbio)中中和il22依赖性il-10释放的能力。在此表征之后，2种抗体满足标准，即，兔衍生的11041和大鼠衍生的11070。
[0552]
基于中和效力、针对人和食蟹猴il22的亲和力、人源化移植物中的供体内容物(参见下文)和表达数据，选择兔衍生的11041进行进一步研究。
[0553]
实施例2.兔11041与人、食蟹猴和小鼠il22的结合
[0554]
使用biacore t200仪器(ge healthcare)，通过将兔11041fab捕获至经固定的抗兔igg f(ab')2，接着滴定来自各物种的il22来评估经纯化的11041兔fab对人、食蟹猴和小鼠il22的亲和力。经由胺偶联化学方法将亲和纯化山羊抗兔igg-f(ab')2特异性片段(jackson immunoresearch)固定在cm5传感器晶片上以达到约5000个反应单位(ru)的捕获水平。使用hbs-ep+缓冲液(10mm hepes ph 7.4、0.15m nacl、3mm edta、0.05％表面活性剂p20，ge healthcare)作为操作缓冲液，其流动速率为10μl/min。以0.5μg/ml使用10μl 11041fab注射剂进行由固定的山羊抗兔fab进行的捕获。以30μl/min的流动速率在捕获的11041fab上滴定人il22、食蟹猴il22和小鼠il22(在0nm、0.6nm、1.8nm、5.5nm、16.6nm和50nm下)。通过注射100nm il-22(持续180秒，30μl/min)，接着注射人il22r1(50nm，持续180秒)来评估人il22r1的阻断。
[0555]
通过以10μl/min的流速进行50mm hcl的2
×
10μl注射，其间穿插5mm naoh的10μl注射来生成表面。使用biacore t200评估软件根据标准程序分析减去背景的结合曲线。由拟合算法测定动力学参数。结合人、食蟹猴和小鼠il22的纯化的11041的动力学参数显示于表11中。
[0556]
表11.结合人、食蟹猴和小鼠il22的兔11041的动力学参数
[0557][0558]
实施例3.11041的人源化
[0559]
通过将来自兔v区的cdr移植至人生殖系抗体v区框架上来对抗体11041进行人源化。为了恢复抗体活性，来自兔v区域的许多框架残基还保留于人源化序列中。使用adair等人(1991)(wo91/09967)概述的方案选择这些残基。兔抗体(供体)v区序列与人生殖系(受体)v区序列的比对以及所设计的人源化序列显示于图1和图2中。除在cdr-h1中使用组合型chothia/kabat定义(参见adair等人,wo91/09967)以外，从供体移植至受体序列的cdr如kabat(kabat等人,1987)所定义。
[0560]
选择人v区igkv1d-13加igkj4 j区(imgt，www.imgt.org/)作为抗体11041轻链cdr的受体。除其中分别保留供体残基缬氨酸(v2)和缬氨酸(v3)的来自包含残基2和3(参考seq id no：38gl1)的组的零个、一个或两个残基以外，人源化移植物变体中的轻链框架残基均来自人生殖系基因。在一些人源化移植物变体中，通过突变成缬氨酸(c91v)或丝氨酸(c91s)来移除cdrl3中的位置91处的不成对/游离半胱氨酸残基，游离半胱氨酸残基可经历翻译后修饰，例如半胱氨酸化，并且可促成共价聚集和不良的稳定性。此残基的突变意外地分别引起结合亲和力增加15至50倍，如通过表面等离子体共振所测量(表12，gl1gh1(642pm)与gl1(c91v)gh1(41.9pm)或gl1(c91s)gh1(12.4pm)相比较)。在一些人源化移植物变体中，通过用天冬氨酸置换位置95处的天冬酰胺残基(n95d)或用丙氨酸置换位置96处的丝氨酸残基(s96a)来修饰cdrl3中的潜在天冬酰胺脱酰胺化位点。通过s96a突变进行的脱酰胺化位点的修饰显著降低脱酰胺化的基础水平。
[0561]
选择人v区ighv3-66加ighj4 j区(imgt，www.imgt.org/)作为抗体11041的重链cdr的受体。与许多兔抗体相同，抗体11041的vh基因比所选择的人受体短。当与人受体序列比对时，抗体11041的vh区的框架1缺乏保留在人源化抗体中的n端残基(图2)。11041兔vh区域的框架3还缺乏β折叠链d与e之间的环中的两个残基(75和76，参考seq id no：49gh1)，在人源化移植物变体中，空位由来自所选择的人受体序列的相应残基(赖氨酸75，k75；天冬酰胺76，n76)填充(图2)。除其中分别保留供体残基缬氨酸(v24)、异亮氨酸(i48)、甘氨酸(g49)、丝氨酸(s73)和缬氨酸(v78)的残基24、48、49、73和78(参考seq id no：49gh1)以外，人源化移植物变体中的重链框架残基均来自人生殖系基因。保留供体残基v24、i48、g49和v78对于人il22的最高结合亲和力而言是必需的，如通过表面等离子体共振所测量。在一些人源化移植物变体中，通过用谷氨酸置换位置54处的天冬氨酸残基(d54e)或用丙氨酸置换位置55处的甘氨酸残基(g55a)来修饰cdrh2中的潜在天冬氨酸异构化位点。在一些人源化移植物变体中，通过用谷氨酸置换位置107处的天冬氨酸残基(d107e)来修饰cdrh3中的潜在水解位点。
[0562]
表12.所产生的11041抗体的不同变体的结合亲和力
[0563]
[0564]
[0565]
[0566][0567]
实施例4.11070的人源化
[0568]
通过将来自大鼠v区的cdr移植至人生殖系抗体v区框架上来对抗体11070进行人源化。为了恢复抗体活性，来自大鼠v区的许多框架残基还保留于人源化序列中。使用adair等人(1991)(wo91/09967)概述的方案选择这些残基。大鼠抗体(供体)v区序列与人生殖系(受体)v区序列的比对以及所设计的人源化序列显示于图3a和图3b中。除在cdr-h1中使用组合型chothia/kabat定义(参见adair等人,wo91/09967)以外，从供体移植至受体序列的cdr如kabat(kabat等人,1987)所定义。
[0569]
选择人v区igkv1-12加igkj2 j区(imgt，www.imgt.org/)作为抗体11070轻链cdr的受体。除其中分别保留供体残基缬氨酸(v3)、天冬酰胺(n44)、苏氨酸(t58)和丝氨酸(s68)的一个或多个来自包含残基3、44、58和68(参考seq id no：88，gl1)的组的残基以外，人源化移植物变体中的轻链框架残基均来自人生殖系基因。保留供体残基n44对于人il22的最高结合亲和力而言是必需的，如通过表面等离子体共振所测量(表13)。
[0570]
选择人v区ighv4-31加ighj6 j区(imgt，www.imgt.org/)作为抗体11070的重链cdr的受体。除其中分别保留供体残基缬氨酸(v37)、丝氨酸(s41)、甲硫氨酸(m48)、亮氨酸(l67)、精氨酸(r71)、丝氨酸(s76)和缬氨酸(v78)的一个或多个来自包含残基37、41、48、67、71、76和78(参考seq id no：89，gh1)的组的残基以外，人源化移植物变体中的重链框架残基均来自人生殖系基因。用谷氨酸(e1)置换人框架的位置1处的谷氨酰胺残基以实现均质产物的表达和纯化：广泛报道了抗体和抗体片段的n端处的谷氨酰胺转化成焦谷氨酸。保留供体残基v37、l67、r71和v78对于人il-22的最高结合亲和力而言是必需的，如通过表面等离子体共振所测量(表13)。在一些人源化移植物变体中，通过用苏氨酸置换位置61处的丝氨酸残基(s61t)来修饰cdrh2中的潜在天冬酰胺脱酰胺化位点。
[0571]
表13.所产生的11070抗体的不同变体的结合亲和力
[0572][0573]
实施例5.变体的克隆和制备
[0574]
由atum(newark,ca)，通过自动合成方法来设计和构建编码重链和轻链v区序列的不同变体的基因。通过寡核苷酸引导的突变发生(在一些情况下包括cdr内的突变)修饰vh和vk基因来产生重链和轻链v区的其他变体。为了在哺乳动物细胞中瞬时表达，将人源化轻链v区基因克隆至ucb轻链表达载体pmhck中，该表达载体含有编码人κ链恒定区(km3同种异型)的dna。将人源化重链v区基因克隆至ucb人γ-1fab重链表达载体pmhfabnh中，该表达载体含有编码人γ-1ch1铰链结构域的dna。将所得重链和轻链载体共同转染至expi293tm悬浮液细胞中，产生呈人fab形式的人源化重组抗体的表达。评估变体人源化fab抗体对人il22的结合亲和力(与亲本抗体相比)、其在体外测定中的效力、其生物物理特性和在随后处理中的适用性。
[0575]
实施例6.人源化11041抗体的结合特性
[0576]
通过在固定的抗人igg-f(ab’)2上捕获样品，接着在捕获表面上滴定人il22来测试11041抗体的人源化样品。用biacore 8k仪器(ge healthcare)进行测定并且使用biacore 8000评估软件进行bia(生物分子相互作用分析(biomolecular interaction analysis))。经由胺偶联化学方法将亲和纯化山羊抗人igg-f(ab’)2特异性片段(jackson immunoresearch)固定在cm5传感器晶片上以达到约5000个反应单位(ru)的捕获水平。使用hbs-ep+缓冲液(10mm hepes ph 7.4、0.15m nacl、3mm edta、0.05％表面活性剂p20，ge healthcare)作为操作缓冲液，其流动速率为10μl/min。以0.5μg/ml使用10μl 11041抗体的人源化样品注射剂进行由固定的山羊抗人fab igg进行的捕获。在30μl/min的流动速率下，在所捕获的11041抗体上滴定人il22(50nm、16.7nm、5.6nm、1.9nm和617pm)。
[0577]
通过以10μl/min的流动速率进行50mm hcl的2
×
10μl注射，其间穿插5mm naoh的5μl注射来生成表面。使用insight评估软件根据标准程序分析减去背景的结合曲线。由拟合算法测定动力学参数。由单一实验测定的il22亲和力显示于表14中并且证实小于100pm。
[0578]
表14.人源化11041fab与il22之间的结合亲和力
[0579][0580]
实施例7.11041fab对il22/il22r1相互作用的阻断
[0581]
在biacore 4000(ge healthcare)上进行交叉阻断测定，以确定11041兔抗体是否与il22r1结合相同的结合位点。
[0582]
cm5传感器芯片通过使用edc/nhs(ge healthcare)混合物的7分钟注射(10μl min-1)，接着在ph5.0的醋酸盐缓冲液(ge healthcare)中浓度为50μg/ml的兔fab特异性山羊fab'2(jackson immuno research)的7分钟注射进行活化以达到约5500ru的固定水平来制备。最后，进行1m盐酸乙醇胺-naoh ph8.5的7分钟注射(10μl min-1)以灭活表面。如上制备参考表面，省略兔-fc特异性捕获抗体。
[0583]
交叉竞争在25℃下在hbs-ep+缓冲液(ge healthcare)中进行。每个分析周期涉及可变区(格式化为兔fab)的注射，接着100nm的人il-22的注射和最后50nm的il-22r1的注射。减去缓冲液空白和无捕获对照样品后计算结合反应。il-22r1的阳性反应表明11041抗体与来自il-22r1的不同表位结合。对il-22r1的反应缺乏表明11041抗体在il-22上的结合位点与il-22r1结合位点重叠。每个循环后，表面通过以下注射再生：60秒50mm hcl、60秒5mm naoh和60秒hcl，均为10μl min-1。
[0584]
如表15所示，当在11041上注射人il-22时观察到清晰的结合反应，但对于注射il22r1没有观察到反应。这表明11041抗体和il-22r1具有重叠的结合位点。
[0585]
表15.11041抗体与人il22和il22r1的分组
[0586][0587]
实施例8.il22上的il22bp结合位点的阻断的评估
[0588]
使用表面等离子体共振(biacore t200)评估11041gl13gh14fab(作为双特异性抗体的一部分)或非扎奴单抗是否能够阻断il22的il22bp结合位点。
[0589]
经由胺偶联化学方法将山羊抗人igg fab特异性抗体(jackson immunoresearch)固定在cm5传感器晶片上以达到约6000ru的水平。
[0590]
每个分析周期由以下组成：将11041gl13gh14 fab或非扎奴单抗分子捕获至抗fab表面，注射20nm il22(自制)，接着注射100nm il22bp，其中每次注射以30μl/min进行180秒。在每个周期结束时，以10μl/min的流动速率，使用50mm hcl的60秒注射，接着5mm naoh的30秒注射和最终50mm hcl的60秒注射使表面再生。使用由缓冲液捕获或缓冲液分析物注射组成的对照周期减去背景结合和偏移。
[0591]
表16.il22和il22bp结合反应
[0592][0593]
当il22结合表面捕获的11041gl13gh14 fab时，il22bp不能与il22结合。当il22结合表面捕获的非扎奴单抗时，il22bp仍能够与il22结合。总之，11041gl13gh14 fab(作为双特异性抗体的一部分)阻断il22的il22bp结合位点，而非扎奴单抗并未如此。
[0594]
实施例9.il22的纯化
[0595]
如nagem等人[nagem等人,structure.2002aug；10(8):1051-62]所描述基本上纯化il22的his标记的版本。用编码his标记的il22的表达构建体通过热休克转化bl21(de3)大肠杆菌菌株。
[0596]
编码的蛋白质序列为：
[0597]
mgsshhhhhhssgenlyfqgsqggaaapisshcrldksnfqqpyitnrtfmlakeasladnntdvrligeklfhgvsmsercylmkqvlnftleevlfpqsdrfqpymqevvpflarlsnrlstchiegddlhiqrnvqklkdtvkklgesgeikaigeldllfmslrnaci(seq id no:3)
[0598]
tev裂解之后的il22蛋白质序列(参见下文)：
[0599]
gsqggaaapisshcrldksnfqqpyitnrtfmlakeasladnntdvrligeklfhgvsmsercylmkqvlnftleevlfpqsdrfqpymqevvpflarlsnrlstchiegddlhiqrnvqklkdtvkklgesgeikaigeldllfmslrnaci(seq id no:4)
[0600]
细胞在存在100μg/ml的氨苄青霉素的情况下生长，并且当细胞的光学密度(在600nm下测量)达到1时，通过添加iptg达到1mm的浓度来诱导蛋白质表达。在4小时之后，通过离心来收集细胞。在用高压细胞均质器进行细胞裂解之后，通过高速离心来收集含有il22的包涵体。包涵体用50mm tris-hcl、100mm nacl、1mm edta、1mm dtt和0.5％(w/v)doc(ph 8)洗涤，并且接着用不含清洁剂的相同缓冲液再次洗涤。将经洗涤的包涵体在4℃下，在含有50mm mes、10mm edta、1mm dtt和8m尿素的缓冲液中过夜溶解。通过离心分离不可溶物质，并且通过在100mm tris-hcl、2mm edta、0.5m精氨酸、1mm还原谷胱甘肽和0.1mm氧化谷胱甘肽(其中最终ph值为8.0)中稀释至0.1mg/ml来使可溶部分中的il22再折叠。在4℃下孵育72小时之后，将蛋白质浓缩，并且在用25mm mes ph 5.4和150mm nacl平衡的hiload 26/600superdex 75pg柱上通过尺寸排阻层析来纯化。随后，蛋白质在-80℃下冷冻直至再次使用。
[0601]
通过将il22蛋白质与tev蛋白酶一起在4℃下孵育过夜来移除his标签。在含有25mm咪唑的pbs中稀释蛋白质之后，经裂解的蛋白质通过5ml histrap
tm
高效柱(ge healthcare)并且在流通物中收集。
[0602]
实施例10.在存在11041gl13gh14 fab和11070gl7gh16 fab的情况下的il22的hdx-ms
[0603]
使用氢氘交换质谱(hdx-ms)进行针对11041gl13gh14 fab和11070gl7gh16 fab的il22的表位定位。
[0604]
样品制备和数据收集
[0605]
对于hdx-ms分析，制备30μm il22(如实施例9中所描述制备)和与90μm 11041gl13gh14 fab或11070gl7gh16 fab复合的30μmil22并且在4℃下孵育1小时。在25℃下，在57μl含10mm磷酸的h2o(ph 7.0)或含10mm磷酸的d2o(pd 7.0)中稀释4μl il22、il22/11041gl13gh14 fab或il22/11070gl7gh16 fab复合物。随后，将经氘化的样品在25℃下孵育0.5、2、15和60分钟。在反应之后，在1℃下通过以1:1与淬灭缓冲液(4m盐酸胍、250mm盐酸三(2-羧基乙基)膦(tcep)、100mm磷酸)混合来淬灭所有样品。混合溶液的最终ph值为2.5。将混合物立即注射至nanoacquity hdx模块(waters corp.)中以进行胃蛋白酶消化。随后，使用酶线上消化柱(waters)，在含0.2％甲酸的水中，在20℃下并且以100μl/min的流动速率线上进行肽消化。一式三份地进行所有氘化时间点和非氘化对照，并且在每个数据点之间进行空白对照。
[0606]
随后，使用acquity beh c18 1.7μm vanguard冷冻前柱捕集肽片段持续3分钟。随后，使用以下梯度将肽洗脱至经冷冻的acquity uplc beh c18 1.7μm 1.0
×
100中：0分钟，5％ b；6分钟，35％ b；7分钟，40％ b；8分钟，95％ b；11分钟，5％ b；12分钟，95％ b；13分钟，5％ b；14分钟，95％ b；15分钟，5％ b(a：h2o中的0.2％hcooh，b：乙腈中的0.2％ hcooh)。通过正电喷雾至synapt g2-si质谱仪(waters)中来将肽片段离子化。使用mse方法，在50-2000th的m/z范围内，在仅tof模式下进行数据收集(低碰撞能量，4v；高碰撞能量：从18v上升至40v)。使用glu-1-纤维蛋白肽b肽进行内部锁定质量校正。
[0607]
hdx-ms数据处理
[0608]
用waters protein lynx global server 2.5.1(plgs)，使用来自il22、il22/11041gl13gh14 fab或il22/11070gl7gh16 fab复合物的非氘化对照样品的mse数据进行序列鉴定。针对仅il22序列的数据库进行肽检索，其中前体强度阈值为500个计数并且需要3个匹配的产物离子以用于分配。将3个对照样品的离子核算档案合并至输入dynamx v3.0软件的肽列表中。
[0609]
肽在dynamx中经历进一步过滤。所使用的过滤参数为：最小和最大肽序列长度分别为4和25，最小强度为1000，最小ms/ms产物为2，每个氨基酸的最小产物为0.2，和最大mh+误差阈值为10ppm。使用dynamx v3.0定量在每个时间点时，每个肽的由氘摄取产生的同位素包膜。此外，检验并且目视检查所有谱图以确保m/z峰的正确分配，并且仅使用具有高信号对噪声比的肽进行hdx-ms分析。
[0610]
在dynamx中人工过滤之后，使用deuteros(www.academic.oup.com/bioinformatics/article/35/17/3171/5288775)进行统计分析和过滤，其使用由houde等人,2011(www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21491437)公开的统计分析。deuteros产生森林图，其显示肽长度、起始和末端残基、整体覆盖率和y轴量度(其为绝对摄取)(道尔顿)。其为在存在配体(结合)和apo形式的情况下的摄取差异。森林图首先对每个时间点时的所有肽进行置信度过滤。位于所选择的置信界限之外的具有不同氘化的肽为非显著的并且以浅灰色显示。显著肽以深灰色和黑色显示。使用自制算法过滤结果和鉴定表位。在0.5分钟氘化孵育之后呈现数据。
[0611]
il22的覆盖图
[0612]
在单一实验中用11041gl13gh14 fab和11070gl7gh16 fab进行il22的hdx分析。对于hdx-ms实验，从47种肽获得总共91.3％覆盖率。过滤和分析之后的肽冗余为3.48。(图4)
[0613]
在存在11041gl13gh14 fab的情况下的il22的hdx-ms
[0614]
观察到在抗体结合时显示统计显著降低的氘并入的七种肽(即，潜在表位)，其中六种与speed分析一致(图5a，在森林图中以黑色突出显示)：72vrligeklfhgvs84、72vrligeklfhgvsm85、75igeklfhgvs84、75igeklfhgvsm85、76geklfhgvs84和80fhgvsm85。在三种肽中观察到氘摄取的增加(即，潜在构象变化)：101eevlfpqsdrf111、103vlfpqsdrfqpym115和103vlfpqsdrfqpymqe117。将11041gl13gh14 fab表位投影至il22的结构上(图5b)。由于构象变化而在抗体结合时受保护或去保护的其他区域在图5b中显示并以深灰色突出显示。
[0615]
总之，代表11041gl13gh14 fab的表位区域的受保护区域为残基72-85(vrligeklfhgvsm)。
[0616]
在存在11070gl7gh16 fab的情况下的il22的hdx-ms
[0617]
观察到在抗体结合时显示统计显著降低的氘并入的四种肽(即，潜在表位)，其中三种与speed分析一致(图6a，在森林图中以黑色突出显示)：72vrligeklfhgvsm85、75igeklfhgvsm85和80fhgvsm85。在两种肽中观察到氘摄取的增加(即，潜在构象的变化)：43dksnfqqpyitnrtfm58和105fpqsdrfqpymqe117。将11070gl7gh16 fab表位投影至il22的结构上(图6b)。由于构象变化而在抗体结合时受保护或去保护的其他区域在图6b中显示并以深灰色突出显示。
[0618]
总之，代表11070gl7gh16 fab的表位区域的受保护区域为残基72-85(vrligeklfhgvsm)。
[0619]
表17.通过hdx-ms测量的在抗体结合时显示显著变化的肽的列表
[0620][0621]
实施例11.il-22/11041gl13gh14复合物的纯化和结构分析
[0622]
如实施例9中所述纯化il22。
[0623]
将裂解的il-22与11041gl13gh14 fab混合并且在用10mm tris ph 7.4和150mm nacl平衡的26/60075pg柱(ge healthcare)上通过尺寸排阻层析来纯化。
[0624]
将il-22/11041gl13gh14 fab复合物浓缩至10.1mg/ml。使用几种市售结晶筛选器来鉴定复合物的结晶条件。这些鉴定是使用swissci96孔2-滴mrc结晶板(来源于molecular dimensions，目录号md11-00-100)以沉滴形式进行的。首先，使用microlab star液体处理系统(hamilton)，向储集器中填充筛选器中的75μl每种结晶条件。随后，使用mosquito液体处理器(ttp labtech)，将300nl il-22/fab复合物和300nl储集器溶液分配于结晶板的孔中。在nextal tubes jcsg+筛选器(qiagen目录号：130720)的条件59(含有0.16m六水合乙酸钙、0.08m二甲胂酸钠ph 6.5、14.4％ peg8000和20％甘油)中鉴定初始结晶条件。此条件
还将被称为jcsg+59。通过向来源于molecular dimensions(目录号mdsr-37-e11)的jcsg+59中以0.01m添加六水合氯化钇(iii)(其包括于additive screen(hampton research目录号hr2-138)中)来获得最佳晶体。使用250μl储集器体积以及由与2μl il-22/fab复合物混合的2μl储集器溶液组成的液滴，最佳晶体在mrc maxi 48孔结晶板(swissci)中生长。将晶体转移至4μl低温保护溶液液滴中，随后在液氮中急骤冷冻。此溶液通过混合40μl最佳化储集器溶液与cryoprotx
tm
试剂盒(molecular dimensions md1-61)中所包括的10μl cryomixes
tm 7溶液来制备。cryomixes
tm 7含有12.5％v/v的二乙二醇、12.5％v/v的乙二醇、25％v/v的1,2-丙二醇、12.5％v/v的二甲亚砜和12.5％v/v的甘油。
[0625]
在射束线i04(diamond light source,uk)处收集衍射数据。使用xds[kabsch,w.acta cryst.d66,125-132(2010)]将数据编索引和整合，接着使用aimless[evans等人,acta crystallogr d biol crystallogr.2013；69(pt 7):1204-1214]进行缩放。使用phenix软件套件[adams等人,methods.2011；55(1):94-106]中的移相器[mccoy等人,j.appl.cryst.(2007).40,658-674]，通过分子置换来解析il-22/fab结构。在此程序中，使用il-22结构1ykb[xu等人,acta crystallogr dbiol crystallogr.2005jul；61(pt 7):942-50]和fab结构5bvj[rondeau等人,mabs.2015；7(6):1151-60]作为分子置换模板。在随后的人工模型完成和优化周期中使用coot[p.emsley等人,(2010).acta crystallographica.d66:486-501]和phenix.refine[p.v.afonine等人,acta crystallogr d biol crystallogr 68,352-67(2012)]。使用molprobity[williams等人,(2018)protein science 27:293-315]分析最终模型的质量。
[0626]
在晶体不对称单元中观察到三种il-22/11041gl13gh14 fab复合物。
[0627]
图7a显示了11041gl13gh14 fab与il-22的相互作用，以及相互作用界面的详细视图(图7b)。使用ccp4软件套件[winn md等人,acta crystallogr d biol crystallogr.2011apr；67(pt 4):235-42]中的ncont测定由fab分子识别的il-22上的表位。il-22氨基酸编号基于unitprotkb条目q9gzx6。
[0628]
在与fab分子的接触距离时，il-22表位由以下残基构成：gln48、glu77、phe80、his81、gly82、val83、ser84、met85、arg88、leu169、met172、ser173、arg175、asn176和ile179。
[0629]
在与fab分子的接触距离时，il-22表位由以下残基构成：lys44、phe47、gln48、ile75、gly76、glu77、phe80、his81、gly82、val83、ser84、met85、ser86、arg88、leu169、met172、ser173、arg175、asn176和ile179。
[0630]
表18.11041gl13gh14 fab的轻链及其在il22上的相应接触点的氨基酸。以粗体表示的残基涉及与之间的接触点。其他残基具有抗体与il22之间的接触距离。
[0631]
[0632][0633]
表19.11041gl13gh14 fab的重链及其在il22上的相应接触点的氨基酸。以粗体表示的残基涉及与之间的接触点。其他残基具有抗体与il22之间的接触距
离。
[0634]
[0635]
[0636][0637]
11041gl13gh14 fab分子阻止il-22与il22r1受体的相互作用，因为fab轻链结合il22上的相同区域(图8)。
[0638]
实施例11.通过冷冻电镜进行的与非扎奴单抗和vr11070复合的il-22的结构测定
[0639]
对il22/11041gl13gh14复合物进行结构分析后，使用冷冻电镜技术对与非扎奴单抗和11070gl7gh16 fab(vr11070)复合的il22进行结构测定。
[0640]
使用与n端人fc标签融合的expi293细胞表达il-22。在通过离心来清洁细胞之后，将上清液装载在5ml hitrap蛋白质a柱(cytiva)上。在ph 2.0下，用pbs至0.1m柠檬酸钠的缓冲液梯度洗脱蛋白质。使用tev蛋白酶使hfc标签裂解并且经由通过重力流再次通过4ml经填充的蛋白质a树脂来分离经裂解的标签和il22。在从树脂洗脱之后，在pbs中平衡的hiload 26/600superdex75 pg柱(cytiva)上进一步纯化il-22。
[0641]
将70微升vr11070 fab(12.1mg/ml)、153微升非扎奴单抗fab(11.5mg/ml)和153微升il22(1.36mg/ml)混合。将55微升注射至在10mm hepes ph 7.4和150mm nacl中平衡的superdex200 5/150柱上。收集含有1.7mg/ml的il-22+vr11070+非扎奴单抗复合物的部分并且用于制备冷冻电镜栅格。
[0642]
在即将使用之前，将r 1.2/1.3多孔碳栅格(spt labtech)在pelco easyglow
tm
中在22ma下辉光放电45秒。在凝胶过滤之后，在100％湿度和4℃下，在腔室中将il22与11070gl7gh16fab和非扎奴单抗fab一起施用至vitrobot mark iv(thermo fisher scientific)中的新鲜辉光放电的栅格持续2秒。随后，在新的滤纸上在第7级力度下对栅格进行印迹持续4秒并且插入液态乙烷中。在配备有falcon 3照相机并且在200kev下操作的内部glacios中首先针对冰厚度和粒子分布来筛选栅格。随后，用配备有falcon 4并且在300kev加速电压下操作的剑桥联盟(cambridge consortium)的krios2收集数据。对于遍及42个部分分布的的最终电子通量，使用epu软件，在的像素尺寸和12.2秒暴露下，在-1至-2.5μm的散焦范围内，以计数模式自动收集5700个影片。用cryosparc，2.15版本(structura biotechnology inc)进行所有后续数据分析。使用patch motion比对影片，使用patch ctf评估对比传送功能参数(ctf)，并且用斑点收集器初步收集粒子并且产生总共5.5m个粒子。对所收集的粒子进行2次分组达到300个像素的框尺寸并且经历第一轮2d分类，其导致选择具有不同特征的488,000个粒子。产生五个从头模型，其中2个在il22的糖基化位点方面彼此不同。将这两种类别(总共240,000个粒子)合并在一起并且使用黄金标准fsc 0.143准则的非均匀精化产生的解析估计值。
[0643]
使用ucsf chimera[pettersen等人,j.comput.chem.25(13):1605-1612(2004).]将两个fab分子和il22结构拟合到冷冻电镜密度中。使用coot[emsley等人(2010)acta crystallographica.d66:486-501.]进一步手动建立模型后，使用phenix[liebschner等
人,acta cryst.d75,861-877(2019)]中的autosharpen[terwilliger,.(2018).acta cryst.d74,545-559.]工具锐化图谱并使用phenix中的实空间精化[afonine等人acta cryst.d74,531-544(2018)]工具进一步精化模型。
[0644]
ccp4软件套件中的ncont[winn等人,acta crystallogr d biol crystallogr.2011apr；67(pt 4):235-42]用于确定il22上的表位，其由11070gl7gh16 fab和非扎奴单抗fab分子识别。下面的il22氨基酸编号基于unitprotkb条目q9gzx6。
[0645]
在与11070gl7gh16 fab分子的接触距离时，il22表位由以下残基组成：glu77、lys78、his81、ser84、met85、ser86、arg88、asn176、ala177
[0646]
在与11070gl7gh16 fab分子的接触距离时，il22表位由以下残基组成：ile75、gly76、glu77、lys78、phe80、his81、ser84、met85、ser86、arg88、leu169、met172、ser173、asn176、ala177
[0647]
在与非扎奴单抗fab分子的接触距离时，il22表位由以下残基组成：gln49、tyr51、phe105、ser108、asp109、gln112、pro113、tyr114、gln116、glu117、pro120、ala123、arg124
[0648]
在与非扎奴单抗fab分子的接触距离时，il22表位由以下残基组成：gln49、pro50、tyr51、ile52、arg55、phe105、pro106、ser108、asp109、gln112、pro113、tyr114、gln116、glu117、val119、pro120、phe121、ala123、arg124
[0649]
结构分析揭示，11070fab在il-22上具有与非扎奴单抗不同的表位。此外，11070gl7gh16 fab(vr11070)与il22上的11041gl13gh14fab(vr11041)的表位相似。(图9a和9b)。与11041gl13gh14 fab一样，11070gl7gh16 fab通过阻止与il-22r1受体的相互作用来阻断il22信号传导(图10a)。相反，非扎奴单抗通过阻止il22与il10r2的相互作用来阻断il22信号传导(图10b)。
[0650]
实施例12.colo205 il-10释放测定
[0651]
在体外细胞测定中测试抗体针对人il22的活性。colo205细胞系是人结直肠癌上皮细胞系。il22结合细胞表面上的il22r1和il-10r2以诱导stat3磷酸化和下游细胞因子释放(例如，il-10)。在此测定中，在存在或不存在抗il22抗体的情况下用il22刺激colo205细胞。随后，使用均质时间解析fret(htrf)试剂盒(cisbio)在细胞培养物上清液中测量所得的il-10反应。
[0652]
在组织培养物处理的平底96孔板中以25000个细胞/孔接种colo205细胞。将人il22(最终测定浓度30pm)与抗体(最终测定浓度3nm-1.4pm)一起在37℃下预孵育一小时。随后，将抗体/细胞因子复合物转移至colo205细胞并且在37℃，5％ co2下孵育48小时。随后，收集不含细胞的细胞培养物上清液并且在-80℃下储存。将细胞培养物上清液在冰上解冻并且通过htrf测定il-10的含量。
[0653]
样品可以单份运行，或可以一式两份运行。
[0654]
11041fab结果
[0655]
结果证实，在colo205 il-10释放测定中，11041fab抑制colo205细胞的il-22诱导的il-10反应。如两次测定的几何平均值测定的，11041fab的ic50为56.78pm(表20)。这些测量被认为是可靠的，因为发现在每次重复测定中测量的ic50的范围在每种情况下变化小于
三倍。
[0656]
表20：colo205 il-10释放测定中11041fab的数据的表。
[0657][0658]
11041gl13gh14 fab结果
[0659]
结果证实，在colo205 il-10释放测定中，11041gl13gh14 fab抑制colo205细胞的il-22诱导的il-10反应。11041gl13gh14 fab具有42.7pm的ic50，如通过2次测定的几何平均值测定的(表21)。这些测量被认为是可靠的，因为发现在每次重复测定中测量的ic50范围在每种情况下变化小于三倍。
[0660]
表21：colo205 il-10释放测定中11041gl13gh14 fab的数据的表。
[0661][0662]
实施例13.11041gl13gh14 fab针对人il22的基于体外人原代角质形成细胞的活性
[0663]
测试抗体分子11041gl13gh14 fab在体外细胞测定中针对人il-22(内部生产)的活性。来自包皮的原代人新生儿表皮角质形成细胞(nhek)符合伦理地来源于供体(promocell，目录号#c-12001)，在培养物中扩增并用于测定。nhek细胞通过分泌可溶性分子(包括s100a7(银屑素))来响应il-22刺激，这些可溶性分子可以在细胞上清液中检测到(图11a)。s100a7已在测定中用作评估11041gl13gh14fab活性的生物标志物。
[0664]
将2次和3次传代的来自两个供体的nhek细胞以每孔104个细胞在预先涂有细胞外基质(theromofisher，目录号#r011k)的48孔板(corning，clear tc处理的板，目录号#3548)中接种于含有角质形成细胞生长试剂盒(lgc，目录号#atcc-pcs-200-040)的真皮基础培养基(lgc，目录号#atcc-pcs-200-030)中。角质形成细胞在标准条件(37℃、5％co2、100％湿度)下培养直至达到汇合。第3天，从所有孔中吸出生长培养基，并用200μl基础真皮培养基洗涤细胞，以去除任何死亡细胞和生长因子。将浓度范围为50至0.01nm(2500-1ng/ml)的抗il22抗体11041gl13gh14 fab与100ng/ml il22在真皮基础培养基中于37℃预孵育30分钟。还将50nm(2500ng/ml)的fab形式的非扎奴单抗(抗il-22抗体，内部储液，批号#pb7490)与100ng/ml il22在真皮基础培养基中于37℃预孵育30分钟。然后将抗体/细胞因子溶液(每孔400μl)转移至细胞。刺激48小时后，收集上清液并使用elisa(lsbio，目录号#ls-f50031)测量s100a7的水平。
[0665]
il22刺激后测量到s100a7的增加(图11a)。50nm非扎奴单抗fab完全抑制由il22诱
导的s100a7信号。50nm的11041gl13gh14fab也显示出对s100a7的完全抑制(图11a)。11041gl13gh14 fab显示s100a7的浓度依赖性抑制(图11b)。
[0666]
总之，在人原代角质形成细胞测定中测试的11041gl13gh14 fab显示出对il-22依赖性生物标志物(s100a7)的剂量依赖性抑制。
[0667]
实施例14.il22磷酸stat3方法
[0668]
在100μl dmem+10％ fbs+2mm l-谷氨酰胺/孔中，将hacat细胞以150,000个细胞/孔添加96孔平底组织培养板中并且在37℃和5％co2下孵育过夜。在模拟上清液培养基中稀释抗il22抗体达到18.75nm的最终测定浓度，并且将60μl添加至96孔聚丙烯v形底部板的1列和12列中作为最小信号对照物。向96孔聚丙烯v形底部板的2列和11列中添加60μl模拟上清液培养基作为最大信号对照物。将样品以1:3滴定至模拟上清液培养基中，使96孔聚丙烯v形底部板的3-10列中的最终体积为60μl。向所有孔中添加30μl il22溶液，达到30ng/ml的fac的最终测定浓度。将板在37℃下预孵育1小时。75μl培养基来自细胞培养板，在板中保留25μl。将75μl样品滴定物/对照物+il22转移至细胞板中。将这些板在37℃下孵育30分钟。移除上清液。使用cisbio stat3 phospho y705试剂盒裂解剩余细胞并且从每个孔的裂解物产生htrf信号。将板密封并且在振荡器上，在室温下孵育过夜持续18小时。用synergy neo 2酶标仪，使用htrf方案测量孔信号。11041和11070抗体显示il22诱导的stat3磷酸化的明显抑制。
[0669]
本文中所引用的所有参考文献(包括专利、专利申请、论文、教科书等)及其中引用的参考文献(就尚未引用而言)以全文引用的方式并入本文中。

技术特征：
1.一种分离的抗体，其结合白介素22(il22)并抑制或减弱il22与il22受体1(il22r1)的结合。2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体与il22上的区域结合，使得所述结合在空间上阻断il22和il22r1之间的相互作用。3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体抑制或减弱il22与il22结合蛋白(il22ra2)的结合。4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合人和/或食蟹猴il22。5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体，其中所述抗体对于人il22具有小于100pm的解离平衡常数(kd)。6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中所述抗体特异性结合对应于由seq id no：1定义的il22的氨基酸序列的残基72-85的多肽vrligeklfhgvsm(seq id no：96)。7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合人il22的表位，所述表位包含选自人il22(seq id no：1)的如以抗体和il22之间小于的接触距离测定的lys44、phe47、gln48、ile75、gly76、glu77、phe80、his81、gly82、val83、ser84、met85、ser86、arg88、leu169、met172、ser173、arg175、asn176和ile179的五个或更多个残基。8.根据权利要求7所述的抗体，其中所述结合使用x射线晶体学测定。9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体，其包含：轻链可变区，其包含：包含seq id no：5的cdr-l1，包含seq id no：6的cdr-l2，和包含seq id no：7的cdr-l3；以及重链可变区，其包含：包含seq id no：8的cdr-h1，包含seq id no：9的cdr-h2，和包含seq id no：10的cdr-h3。10.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体，其中所述轻链可变区包含seq id no：22中给出的序列。11.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体，其中所述重链可变区包含seq id no：24中给出的序列。12.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体，其中所述轻链可变区包含seq id no：22中给出的序列，或与其至少90％相同的序列；并且所述重链可变区包含seq id no：24中给出的序列，或与其至少90％相同的序列。13.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含seq id no：22中给出的序列，其中位置91、95和/或96处的一个或多个残基已被另一种氨基酸取代；以及重链可变区包含seq id no：24中给出的序列，其中位置54、55和/或107处的一个或多
个残基已被另一种氨基酸取代。14.根据权利要求9所述的抗体，其中每个cdr含有多至三个氨基酸取代，并且其中此类氨基酸取代是保守的。15.根据权利要求9所述的抗体，其中轻链可变区和重链可变区的其余部分分别与seq id no：22和24具有至少90％的同一性。16.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体，其中所述抗体是全长抗体。17.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体，其中所述抗体是抗体片段。18.根据权利要求17所述的抗体，其中所述抗体片段是fab、fab’、f(ab’)2、fv、dsfv、scfv或dsscfv。19.根据权利要求18所述的抗体，其中所述抗体是包含轻链和重链的fab，所述轻链包含seq id no：26中给出的序列，所述重链包含seq id no：28中给出的序列。20.根据权利要求18所述的抗体，其中所述抗体是包含含有分别在seq id no：5/6/7/8/9/10中给出的序列的cdr-l1/cdr-l2/cdr-l3/cdr-h1/cdr-h2/cdr-h3的fab，并且轻链和重链的其余部分分别与seq id no：26和28具有至少90％的同一性或相似性。21.根据权利要求16所述的抗体，其中所述抗体是包含轻链和重链的igg1，所述轻链包含seq id no：26中给出的序列，所述重链包含seq id no：30中给出的序列。22.根据权利要求16所述的抗体，其中所述抗体是包含含有分别在seq id no：5/6/7/8/9/10中给出的序列的cdr-l1/cdr-l2/cdr-l3/cdr-h1/cdr-h2/cdr-h3的igg1，并且轻链和重链的其余部分分别与seq id no：26和30具有至少90％的同一性或相似性。23.根据权利要求16所述的抗体，其中所述抗体是包含轻链和重链的igg4p，所述轻链包含seq id no：26中给出的序列，所述重链包含seq id no：32中给出的序列。24.根据权利要求16所述的抗体，其中所述抗体是包含含有分别在seq id no：5/6/7/8/9/10中给出的序列的cdr-l1/cdr-l2/cdr-l3/cdr-h1/cdr-h2/cdr-h3的igg4p，并且轻链和重链的其余部分分别与seq id no：26和32具有至少90％的同一性或相似性。25.一种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至24中任一项所述的抗体。26.一种携带权利要求25的多核苷酸的表达载体。27.一种宿主细胞，其包含如权利要求26所定义的载体。28.一种产生权利要求1至24中任一项的抗体的方法，其包括在允许产生抗体的条件下培养权利要求27的宿主细胞，并回收所产生的抗体。29.一种药物组合物，其包含权利要求1至24中任一项的抗体和药学上可接受的佐剂或载体。30.权利要求1至24中任一项的抗体或如权利要求29所定义的药物组合物，其用于通过疗法来治疗人体或动物体的方法中。31.权利要求1至24中任一项的抗体或如权利要求29所定义的药物组合物，其用作药物。32.权利要求1-24中任一项的抗体或如权利要求29所定义的药物组合物用于制造药物的用途。33.如权利要求1-24中任一项所定义的抗体或根据权利要求29所述的药物组合物，其用于治疗炎性皮肤病状。
34.一种治疗或预防炎性皮肤病状的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的如权利要求1-24中任一项所定义的抗体或如权利要求29所定义的药物组合物。35.根据权利要求1-24中任一项所述的抗体或根据权利要求29所述的药物组合物在制备用于治疗炎性皮肤病状的药物中的用途。36.根据权利要求33所述的抗体或药物组合物、根据权利要求34所述的方法或根据权利要求35所述的用途，其中所述炎性皮肤病状是银屑病、银屑病关节炎、接触性皮炎、慢性手部湿疹或特应性皮炎。

技术总结
本发明涉及与IL22结合并抑制其与其一种或多种天然配体相互作用的抗体。提供了此类抗体的具体实例。还提供了抗体的治疗用途以及产生此类抗体的方法。生此类抗体的方法。


技术研发人员：J
受保护的技术使用者：UCB生物制药有限责任公司
技术研发日：2021.12.06
技术公布日：2023/9/23