用于预防或治疗胶质母细胞瘤的包括肽核酸复合物作为活性成分的组合物的制作方法

1.本发明涉及用于预防或治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，该药物组合物包括核酸复合物作为活性成分，更具体地，涉及用于预防或治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，该药物组合物包括核酸复合物，其中载体肽核酸与具有能够结合tgf-β2基因的序列的生物活性肽核酸互补结合。


背景技术：

2.胶质母细胞瘤是源自脑中胶质细胞的肿瘤中恶性程度最高的肿瘤，其中在组织学上观察到核异型、有丝分裂期、血管内皮细胞的增殖以及坏死。胶质母细胞瘤占胶质瘤的大多数，是组织学上第二频发的并且是脑和中枢神经系统中最频发的恶性肿瘤，其5年生存率仅为5％(美国)。在韩国，胶质母细胞瘤是最常见的脑胶质瘤(encephalotheloma)，占所有脑和cns原癌(protocarcinomas)的15.1％，并且占所有胶质瘤的34.4％。
3.胶质母细胞瘤是一种生长非常迅速的肿瘤，因此，颅内压会迅速升高，其引起成人头痛、恶心、呕吐等，并经常抽搐。另外，肿瘤本身或伴随肿瘤的脑水肿引起附近神经的功能退化，并导致各种症状，诸如肢体运动丧失、感官退化、面瘫、语言障碍、认知下降、左右辨别障碍等。根据肿瘤的位置，身体这些部位的神经缺陷大不相同，因此不可能仅基于一种症状进行诊断。
4.当胶质母细胞瘤发生时，通常通过手术切除尽可能多地切除肿瘤。由于胶质母细胞瘤切除可能会引起严重的并发症，因此应仔细确定切除的程度。在通过手术后移除的组织在组织学上确认胶质母细胞瘤后，进行放射疗法和化疗。
5.胶质母细胞瘤的标准一线治疗是手术疗法、化疗(诸如替莫唑胺(temozolomide,tmz))和放射疗法(rt)的联合疗法。
6.针对中枢神经系统癌症的nccn指南示出，tmz是一种烷化(甲基化)剂，目前，对于处于年轻年龄具有良好预后的gbm患者来说，认为tmz连同术后rt一起是标准疗法。然而，可以应用这种标准疗法的患者群体非常有限，并且治疗后的预后非常差，以至于所有胶质母细胞瘤患者的5年存活率低于5％。
7.另外，尽管疗法包括手术、放射疗法和化疗，胶质母细胞瘤保留了被称为“胶质母细胞瘤干细胞”的干细胞样癌细胞，并且因此具有非常高的治疗抗性，这导致治疗后的不良预后。
8.根据这种需要，正在积极进行开展用于胶质母细胞瘤的新型治疗剂的研究。例如，国际专利公开第2012-061120号公开了用于使用纯化的胶质母细胞瘤gbm6-ad干细胞治疗胶质母细胞瘤的方法，以及国际专利公开第2012-104822号公开了通过给药马西滕坦(macitentan)治疗胶质母细胞瘤的方法。
9.tgf-β2已知是致癌基因，通过smad下游通路调节肿瘤微环境并对于肿瘤增殖、迁移和侵袭来说至关重要(joanna l.birch et al.,cellular signaling,2020,volume 72,
109638)。尤其是，tgf-β2在胶质母细胞瘤患者体内高度表达，并且发现患者的存活率与基因表达率相关(roy lo,poirier mb,fortin d.,int.j.mol.sci.,2018,19(4),1113)。
10.同时，与传统药物不同，核酸药物抑制靶标特异性信使rna(mrna)的表达，并且因此正在研究在其中用靶向蛋白质的传统药物治疗是不可行的领域中的核酸药物的用途(kole r.et al.,nature rev.drug discov.11；125,2012.,wilson c.et al.,curr.opin.chem.bio.2006；10:607,2006)。由于核酸作为药物的性能和优点，使用核酸的各种临床试验正在进行中，尽管使用基于核酸的治疗剂越来越多，但是使用用于细胞内导入或血脑屏障穿透的载体仍极其有限。
11.近来，为了促进药物更安全且更有效地使用，不仅适用于药物的制剂，而且将药物有效递送至体内靶位点的方法也受到关注。尤其是，存在对药物递送系统(dds)的实际应用的需求，在需要时该药物递送系统有效地将所需量的药物输送到所需的位置。
12.在这方面，本发明人已经发现，其中生物活性核酸与经修饰为具有净正电荷的载体肽核酸互补结合的核酸复合物具有令人惊讶的改善的细胞渗透性，并且这使得靶基因的表达能够被非常有效地调控，并且提交了关于具有低细胞毒性和改善的细胞渗透性以及调控生物活性核酸的基因表达的能力的新型构建体的专利申请(pct/kr2017/008636)。另外，本发明人对该构建体的功能进行了持续的研究，并开发出了具有高效穿透血脑屏障能力的新型构建体(韩国专利公开第10-2019-0128465号)。
13.因此，作为将具有优异细胞渗透性的核酸复合物应用于胶质母细胞瘤治疗的加倍努力的结果，本发明人已经发现其中靶向tgf-β2基因的生物活性肽核酸与载体肽核酸互补结合的核酸复合物在预防或治疗胶质母细胞瘤中非常有效，并且因此完成了本发明。


技术实现要素：

14.本发明的一个目的是提供包括作为活性成分的核酸复合物用于预防或治疗胶质母细胞瘤的药物组合物。
15.为了实现上述目的，本发明提供了一种用于预防、改善或治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，该药物组合物包括作为活性成分的细胞渗透性核酸复合物，在该细胞渗透性核酸复合物中，载体肽核酸与靶向tgf-β2基因的生物活性核酸互补结合。
16.另外，本发明提供了一种治疗或预防胶质母细胞瘤的方法，该方法包括给药细胞渗透性核酸复合物，在该细胞渗透性核酸复合物中，载体肽核酸与靶向tgf-β2基因的生物活性核酸互补结合。
17.另外，本发明提供了细胞渗透性核酸复合物用于预防或治疗胶质母细胞瘤的用途，在该细胞渗透性核酸复合物中，载体肽核酸与靶向tgf-β2基因的生物活性核酸互补结合。
18.另外，本发明提供了细胞渗透性核酸复合物在制备用于预防或治疗胶质母细胞瘤的药物中的用途，在该细胞渗透性核酸复合物中，载体肽核酸与靶向tgf-β2基因的生物活性核酸互补结合。
附图说明
19.图1示出了用本发明的肽核酸复合物治疗人胶质母细胞瘤细胞(u87mg)后，每个组
合的tgf-β靶基因以及下游基因的表达，更具体地，图1a示出了组合1至5的结果，以及图1b示出了组合1和6的结果。
20.图2a示出了用本发明的肽-核酸复合物治疗人胶质母细胞瘤细胞(u87mg)后，每种组合的细胞迁移，以及图2b示出了其定量结果。
21.图3示出了用本发明的肽-核酸复合物治疗人胶质母细胞瘤细胞(u87mg)的原位动物模型后获得的肿瘤组织的表型。
22.图4示出了用本发明的肽-核酸复合物通过浓缩治疗人胶质母细胞瘤细胞(u87mg)的原位动物模型后获得的肿瘤组织的表型。
23.图5示出了用本发明的肽核酸复合物治疗人胶质母细胞瘤细胞(u87mg)的原位动物模型后获得的肿瘤组织中靶向tgf-β的基因以及下游基因的表达，更具体地，图5a示出了组合3的结果，以及图5b示出了组合6的结果。
具体实施方式
24.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所理解的相同含义。通常，本文所用的术语是本领域公知的，并且是通常使用的。
25.本发明人目的在于确定给药核酸复合物在预防或治疗胶质母细胞瘤中是否高度有效，在该核酸复合物中，靶向tgf-β2基因的生物活性肽核酸与载体肽核酸互补结合。
26.也就是说，在本发明的一种实施方式中，向胶质母细胞瘤细胞系和胶质母细胞瘤细胞系原位模型给药核酸复合物，其中，具有结合tgf-β2基因的序列的生物活性肽核酸与载体肽核酸互补结合，引起有效抑制tgf-β2基因及其下游基因的表达，并且从而有效治疗胶质母细胞瘤。
27.因此，在一个方面，本发明涉及用于预防、改善或治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，该药物组合物包括作为活性成分的核酸复合物，在该核酸复合物中，载体肽核酸与靶向tgf-β2基因的生物活性核酸互补结合。
28.在本发明中，生物活性核酸可以是生物活性肽核酸。
29.在本发明中，其中生物活性肽核酸与载体肽互补结合的核酸复合物具有由下式(1)表示的结构：
30.式(1)
31.[a≡c
(+)
]
[0032]
其中
[0033]
a是生物活性核酸，其具有能够结合靶基因或靶基因序列的序列，
[0034]
c是载体肽核酸，其能够结合生物活性核酸，以及
[0035]“≡”意指生物活性核酸和载体肽核酸之间的互补结合，
[0036]
其中，由a表示的生物活性核酸是具有净负电荷的肽核酸，
[0037]
由c
(+)
表示的载体肽核酸具有净正电荷，
[0038]
由a≡c
(+)
表示的式(1)的核酸复合物具有净正电荷，并且
[0039]
载体肽核酸包括至少一种γ-或α-主链修饰的肽核酸单体，使得载体肽核酸具有净正电荷，并且γ-或α-主链修饰的肽核酸单体包括具有带正电荷的氨基酸的单体，其数量高于具有带负电荷的氨基酸的单体的数量，因此载体肽核酸具有净正电荷。
[0040]
如本文所用，术语“生物活性核酸”是指具有能够与作为表达抑制的靶标的基因结合的互补序列的核酸，尤其是，具有能够与作为表达抑制的靶标的基因的mrna结合的互补序列的核酸，或具有作为表达促进的靶标的序列的核酸，意指参与基因表达调节的核酸，诸如抑制或促进相应基因的表达，或者具有与作为表达抑制或促进的靶标的基因互补的序列的核酸，或者具有与单链rna序列诸如前mrna、mirna和mrna互补的序列的核酸。
[0041]
尤其是，本文所用的“生物活性肽核酸”在体外或体内与靶基因和包括靶基因的核苷酸序列结合，并且从而激活或抑制相应基因的固有功能(转录物表达或蛋白质表达)，或调控前mrna的剪接(例如，外显子跳跃)，并且碱基序列是基因调控序列、基因编码序列或剪接调控序列。基因调控区是启动子、转录增强子、5'非翻译区、3'非翻译区、病毒包装序列和选择性标志物。基因区可以是外显子或内含子，并且基因区可以存在于基因转录起始位点的10、5、3或1kb或500、300或200bp内，例如，存在于起始位点的上游或下游。另外，剪接调控区可以包括与外显子跳跃、隐蔽剪接、假剪接位点激活、内含子保留和可变剪接失调(alternative splicing deregulation)相关的序列。
[0042]
因此，本发明中的“生物活性核酸”优选为tgf-β2的反义肽核酸，其为胶质母细胞瘤的靶基因，以及更优选具有seq id no:1所表示的序列，但不限于此。
[0043]
如本文所用，术语“载体肽核酸”是指核酸，其碱基部分或全部互补地结合生物活性核酸以赋予其功能，并且本文所用的载体肽核酸可以是肽核酸(pna)或与其相似的经修饰的核酸，以及优选是肽核酸，但不限于此。
[0044]
尤其是，载体肽核酸优选包括选自由seq id no:4-7和9所表示的序列组成的组的序列，但不限于此。
[0045]
如本文所用，核酸复合物能够允许生物活性物质进入体内，最终进入细胞，并且特别是能够通过血脑屏障将生物活性物质递送至体内。
[0046]
因此，在本发明中，核酸复合物能够穿透血脑屏障。
[0047]
在本发明中，生物活性核酸和载体肽核酸中的每一种可以包括2至50个，优选5至30个，更优选10至25个，最优选15至17个核酸单体。
[0048]
在本发明中，核酸复合物包括具有由seq id no:1所表示的序列的生物活性核酸，以及具有由选自由seq id no:4-7和9组成的组中任一种所表示的序列的载体肽核酸，但不限于此。
[0049]
本发明的组合物包括作为活性成分的(i)包括具有由seq id no:1所表示的序列的生物活性核酸以及具有由seq id no:4所表示的序列的载体肽核酸的核酸复合物；
[0050]
(ii)包括具有由seq id no:1所表示的序列的生物活性核酸以及具有由seq id no:5所表示的序列的载体肽核酸的核酸复合物；
[0051]
(iii)包括具有由seq id no:1所表示的序列的生物活性核酸以及具有由seq id no:6所表示的序列的载体肽核酸的核酸复合物；
[0052]
(iv)包括具有由seq id no:1所表示的序列的生物活性核酸以及具有由seq id no:7所表示的序列的载体肽核酸的核酸复合物；
[0053]
(v)包括具有由seq id no:1所表示的序列的生物活性核酸和具有由seq id no:9所表示的序列的载体肽核酸的核酸复合物；
[0054]
在本发明中，生物活性核酸或载体肽核酸可以进一步包括用于促进内体逃逸的物
质，该物质额外地结合每个核酸的5'端或3'端。也就是说，生物活性核酸或载体肽核酸可进一步包括促进生物活性核酸和载体肽核酸的内体逃逸的物质，并且因此具有由下式(2)表示的结构。
[0055]
式(2)
[0056]
[ma≡mc
(+)
]
[0057]
其中
[0058]“m”表示促进生物活性核酸和载体肽核酸的内体逃逸的物质。
[0059]
在本发明中，“促进内体逃逸的物质”可以通过增加内体中的渗透压或使内体的膜不稳定来促进生物活性核酸从内体中逃逸，这意指“促进内体逃逸的物质”能够使生物活性核酸更有效且快速地移动到细胞核或细胞质中，并与靶基因相遇以及作用(d.w.pack,a.s.hoffman,s.pun,p.s.stayton,“design and development of polymers for gene delivery,”nat.rev.drug.discov.,4,581-593(2005))。
[0060]
在本发明中，促进内体逃逸的物质是选自由以下组成的组的至少一种：肽、脂质纳米颗粒、聚复合纳米颗粒、聚合物纳米球、无机纳米颗粒、阳离子脂质基纳米颗粒、阳离子聚合物和ph敏感性聚合物。
[0061]
在本发明中，作为促进内体逃逸的物质，具有glfdiikkiaesf(seq id no:10)的序列的肽可以经由接头与生物活性核酸结合，以及组氨酸(10)可以经由接头与载体肽核酸结合，但是本发明不限于此。
[0062]
在本发明中，脂质纳米颗粒可选自由以下组成的组：脂质、磷脂、棕榈酸乙酰酯、泊洛沙姆18、吐温85、三硬脂酸甘油酯以及吐温80。
[0063]
在本发明中，聚复合纳米颗粒可以是聚酰胺-胺(poly(amidoamine))或聚乙烯亚胺(pei)。
[0064]
在本发明中，聚合物纳米球可以选自由以下组成的组：聚己内酯、聚(丙交酯-co-乙交酯)、聚丙交酯、聚乙交酯、聚(d,l-丙交酯)、壳聚糖和plga-聚乙二醇。
[0065]
在本发明中，无机纳米颗粒可以选自由以下组成的组：fe2o3、fe3o4、wo3和wo2.9。
[0066]
在本发明中，阳离子脂质基纳米颗粒可以选自由以下组成的组：1-(氨乙基)亚氨基双[n-(油基半胱氨酸-1-氨基-乙基)丙酰胺]、pta的n-烷基化衍生物和3,5-二十二烷氧基苯甲脒。
[0067]
在本发明中，阳离子聚合物可以选自由以下组成的组：乙烯基吡咯烷酮-n,n-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯酸共聚物硫酸二乙酯、聚异丁烯和聚(n-乙烯基咔唑)。
[0068]
在本发明中，ph敏感性聚合物可以选自由以下组成的组：多元酸、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)和水解聚丙烯酰胺。
[0069]
在本发明中，生物活性核酸可以由天然核酸碱基和/或经修饰的核酸单体组成。载体肽核酸可以具有与生物活性核酸的碱基序列部分或完全互补的序列。
[0070]
尤其是，载体肽核酸可以包括一个或多个通用碱基，并且所有的载体肽核酸可以包括通用碱基。
[0071]
在本发明中，生物活性核酸选自由以下组成的组：dna、rna或者经修饰的核酸，该经修饰的核酸包括肽核酸(pna)、磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(pmo)、锁核酸(lna)、乙二醇核酸(gna)和苏糖核酸(tna)、反义寡核苷酸、适配体、小干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、
核酶和dna酶。优选地，生物活性核酸选自由以下组成的组：dna、rna或经修饰的核酸，该经修饰的核酸包括肽核酸(pna)、磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(pmo)、锁核酸(lna)、乙二醇核酸(gna)和苏糖核酸(tna)。
[0072]
在本发明中，当用于生物活性核酸的单体是pna时，它被称为生物活性肽核酸，且当使用其它单体时，它们以相同的方式被提及。
[0073]
在本发明中，生物活性核酸和载体肽核酸可以进一步包括选自由以下组成的组的至少一种官能团：磷酸二酯、2
’‑
o-甲基、2
’‑
甲氧基-乙基、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯和硫代磷酸酯。
[0074]
在本发明中，载体肽核酸可以具有与生物活性核酸部分或完全互补的核苷酸序列。尤其是，载体肽核酸可以包括至少一个通用碱基，并且载体肽核酸可以完全由通用碱基组成。
[0075]
在本发明中，关于电特性，核酸复合物中的生物活性核酸和载体肽核酸中的每一种可以具有净正电荷(正)、净负电荷(负)或中性(不带电荷)。
[0076]
术语“净”在电特性的表达中意指从外部观察时生物活性核酸或载体肽核酸的各自电荷的总电特性，而不是单个碱基的电特性。例如，即使生物活性核酸中的一些单体是带正电荷的，当带负电荷的单体数量大于带正电荷的单体数量时，就“净”电特性而言生物活性核酸是带负电荷的。当带正电荷的碱基和/或主链的数量大于带负电荷的碱基和/或主链的数量时，即使载体肽核酸中的一些碱基和/或主链成分带负电荷，就其“净”电特性而言，认为载体肽核酸是带正电荷的。
[0077]
因此，可以认为本发明的核酸复合物具有净正电荷。在核酸复合物中，优选地，生物活性核酸就总体电特性而言具有净负电荷或者是中性的，比并且载体肽核酸就总体电特性而言具有净正电荷，但不限于此。
[0078]
在本发明中，经修饰的肽核酸单体可以用于赋予生物活性核酸和载体肽核酸电特性，并且经修饰的肽核酸单体包括选自由以下组成的组的至少一种带正电荷的核酸作为带正电荷的载体肽核酸：赖氨酸(lys，k)、精氨酸(arg，r)、组氨酸(his，h)、二氨基丁酸(dab)、鸟氨酸(orn)和氨基酸类似物，并且包括谷氨酸(glu，e)(其为带负电荷的氨基酸)或氨基酸类似物(其为带负电荷的氨基酸)作为带负电荷的载体肽核酸。
[0079]
在本发明中，为了使载体肽核酸具有净正电荷，载体肽核酸可以包括至少一种γ-或α-主链修饰的肽核酸单体。
[0080]
为了使载体肽核酸具有净正电荷，该γ-或α-主链修饰的肽核酸单体在其主链中包括选自由以下组成的组的至少一个带正电荷的氨基酸：赖氨酸(lys，k)、精氨酸(arg，r)、组氨酸(his，h)、二氨基丁酸、鸟氨酸(orn)和氨基酸类似物。
[0081]
在本发明中，肽核酸单体除了主链修饰之外还可以具有经修饰的核碱基，可以用于修饰肽核酸单体以赋予其电荷。优选地，胺、三唑或咪唑部分可以包括在核碱基中以赋予其正电荷，或者羧酸可以包括在碱基中以赋予其负电荷。
[0082]
在本发明中，载体肽核酸的经修饰的肽核酸单体可以在主链或核碱基中进一步包括负电荷。然而，优选地，经修饰的肽核酸单体包括比带负电荷的单体更多的带正电荷的单体，使得载体肽核酸带正电荷。
[0083]
在根据本发明的核酸复合物中，选自由以下组成的组的至少一种物质与生物活性
核酸和/或载体肽核酸结合：疏水性部分、亲水性部分、靶抗原特异性抗体、适配体和荧光/发光标志物。优选地，选自由以下组成的组的至少一种物质可以与载体肽核酸结合：疏水性部分、亲水性部分、靶抗原特异性抗体、适配体和用于成像的荧光/发光标志物。
[0084]
在本发明中，选自由疏水性部分、亲水性部分、靶抗原特异性抗体、适配体、猝灭剂、荧光标志物和发光标志物组成的组的至少一种物质与生物活性核酸和/或载体肽核酸的结合可以是简单的共价键或由接头介导的共价键，但不限于此。优选地，与核酸载体结合的细胞渗透性、溶解性、稳定性、运输和成像相关物质(例如，疏水性残基等)独立于调控靶基因表达的生物活性核酸而存在。
[0085]
在本发明中，如上所述，生物活性核酸和载体肽核酸的互补结合通常是反向平行结合或平行结合。互补结合形成在生物活性核酸的靶序列(与生物活性核酸互补的序列)存在时分离的结构。
[0086]
反向平行结合和平行结合取决于dna-dna或dna-pna结合模式中的5'方向和3'方向来确定。反向平行结合是dna-dna或dna-pna的普遍结合方式。例如，在根据本发明的核酸复合物中，5'至3'方向的生物活性核酸与3'至5'方向的载体肽核酸结合。平行结合具有比反向平行结合略低的结合力，而生物活性核酸和载体肽核酸以相同方向彼此结合，即5'至3'方向或3'至5'方向。
[0087]
在根据本发明的核酸复合物中，优选地，生物活性核酸和载体肽核酸之间的结合力低于生物活性核酸和由生物活性核酸靶向的靶基因(特别是靶基因的mrna)之间的结合力。结合力由解链温度(tm)决定。
[0088]
与生物活性核酸和由生物活性核酸靶向的靶基因(特别是靶基因的mrna)之间的结合力相比，使生物活性核酸和载体肽核酸之间的结合力(解链温度，tm)更低的特定方法的实例包括生物活性核酸和载体肽核酸之间的平行结合或部分特异性结合，但不限于此。
[0089]
作为另一实例，载体肽核酸包括选自由以下组成的组的至少一种肽核酸碱基：接头、通用碱基和包括与生物活性核酸的相应碱基不互补的碱基的肽核酸碱基，但不限于此。
[0090]
在本发明中，通用碱基是与天然碱基(诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)非选择性结合的碱基，并且具有低于互补结合力的结合力，并且可以是选自由以下组成的组的至少一种：肌苷pna、吲哚pna、硝基吲哚pna和脱碱基pna，并且优选肌苷pna。
[0091]
本发明提供了用于控制核酸复合物功能的核酸的结合模式和电特性的组合，并使用核酸的结合模式和电特性的组合来控制颗粒大小和作用时间，并改善细胞渗透性、溶解性和特异性。
[0092]
在本发明中，在靶基因的存在下，通过控制生物活性肽核酸和载体肽核酸之间的结合力，可以控制生物活性肽核酸与靶序列结合的时间点(诸如生物活性核酸被靶序列取代的时间点，以及靶特异性释放和结合发生的时间点)。
[0093]
在根据本发明的核酸复合物中，通过用于复合物的非特异性结合的载体核酸的非特异性碱基、通用碱基和接头的存在、数量和位置，可以对生物活性核酸被靶基因置换(链取代)的时间点以及靶特异性释放和结合的时间点进行控制。由于上述因素和平行或反向平行结合的组合，这种控制是可行的，该平行或反向平行结合是肽复合物的互补结合模式。
[0094]
如本文所用，术语“血脑屏障”可与“bbb”互换使用，并且是指因为血液循环通过脑组织而存在于血液中的渗透性屏障，其密切调节和严格限制血液和脑组织之间的交换。血
脑屏障的组成部分包括形成所有血管最深内层的内皮细胞、在结构上与bbb相关的相邻内皮细胞之间的致密连接、内皮细胞的基底膜以及覆盖几乎所有暴露的血管外表面的相邻星形胶质细胞的延伸足突(foot process)。bbb阻止血液中的大多数物质(包括其中的大多数大分子，诸如ig、抗体、补体、白蛋白和药物以及小分子)进入脑组织。
[0095]
如本文所用，术语“疾病”和“疾患”可互换使用，并且是指阻碍和/或破坏功能的执行的身体状况或某些器官的任何变化，引起诸如不适和功能障碍的症状，或导致患病者死亡或与其接触者死亡。
[0096]
在本发明中，术语“治疗组合物”可以与“药物组合物”互换使用，并且是指包括核酸复合物作为活性成分的组合物，该核酸复合物包括生物活性核酸和与根据本发明的核酸结合的载体肽核酸，并且可以进一步包括与核酸复合物结合的用于治疗期望疾病的治疗药物。
[0097]
根据标准药学实践，本发明的治疗组合物可以配制成能够通过血脑屏障递送的形式。除了活性成分之外，这些制剂还可以包括适用于药学上可接受的制剂的添加剂，诸如载体、赋形剂、佐剂或稀释剂。
[0098]
术语“生理学上可接受的”是指不损害化合物的生物活性和物理特性的特性。
[0099]
术语“载体”定义为促进核酸复合物转运至细胞或组织中的化合物。例如，二甲基亚砜(dmso)是一种常用的载体，其有助于使许多有机化合物结合至生物的细胞或组织中。
[0100]
术语“稀释剂”定义为稳定靶标化合物的生物活性形式并稀释于溶解有靶标化合物的水中的化合物。在本领域中，将溶解在缓冲溶液中的盐用作稀释剂。常用的缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水，因为它模拟人体体液的盐度。因为缓冲盐可以在低浓度下控制溶液的ph，缓冲稀释剂很少改变化合物的生物活性。
[0101]
本发明中包括核酸复合物的物质可以单独向患者给药，或者作为与其它活性成分或者与合适的载体或赋形剂混合的药物组合物(即，以组合疗法)向患者给药。
[0102]
适用于本发明的药物组合物包括含有达到其预期目的有效量的活性成分的组合物。更具体地，治疗有效量意指有效延长待治疗受试者的存活时间，或有效预防、减轻或缓解疾病症状的化合物的量。本领域技术人员可以确定治疗有效量，尤其是考虑到本文提供的详细描述。
[0103]
如本文所用的术语“预防”意指通过给药包括核酸复合物的治疗组合物来预防疾病发作或抑制其进展的任何行为。
[0104]
如本文所用术语“减轻”是指通过给药包括核酸复合物的治疗组合物，至少降低与待治疗病症相关的参数的程度(例如，症状的严重程度)的任何行为。
[0105]
另外，如本文所用的术语“治疗”是指其中通过给药包括核酸复合物的治疗组合物来减轻或消除疾病症状的任何行为。
[0106]
包括根据本发明的核酸复合物的组合物可以以药物有效量来施用以治疗胶质母细胞瘤或抑制(或减轻)胶质母细胞瘤的症状。药物有效量可以根据各种因素，诸如胶质母细胞瘤的类型、患者的年龄和体重、症状的特征和程度、当前疗法的类型、进行的治疗次数以及施用形式和途径而变化，并且可以由本领域的专家容易地确定。本发明的组合物可以与上述药理学或生理学组分同时或顺序组合来施用，并且可以与额外的常规治疗剂顺序或同时组合来施用。给药可以在一个或多个施用中进行。
[0107]
如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，优选人，其患有病症或疾病或者处于病症或疾病的风险中，该病症或疾病可以通过对其给药根据本发明的核酸复合物来缓解、抑制或治疗。
[0108]
另外，向人体给药的本发明化合物的量可以根据患者的年龄、体重和性别、给药形式、健康状况和疾病的严重程度而变化，并且基于体重为70kg的成年患者，其通常为0.001～1000mg/天，优选0.01～500mg/天，并且可以根据医生或药师的处方每天一次或每天以固定的时间间隔多次以多剂量(以分份的方式)来给药。
[0109]
包括本文所述核酸复合物的组合物的毒性和治疗效率例如通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序来估计，以确定ld50(对于50％的群体的致死剂量)、ed50(对50％的群体提供治疗效果的剂量)和ic50(对50％的群体提供治疗和抑制效果的剂量)。剂量的毒性与治疗效果的比率称为治疗指数，并且可以表示为ld50与ed50(或ic50)的比率。具有高治疗指数的化合物是优选的。从这些细胞培养试验中获得的数据可用于估计人应用的剂量范围。这种化合物的给药量(剂量)优选在包括几乎没有或没有毒性的ed50(或ic50)的循环浓度范围内。
[0110]
如本文所用，术语“给药”是指通过任何合适的方法将本发明的药物组合物引入受试者的行为，并且给药可以通过各种途径中的任何一种进行，或口服或肠胃外，只要它能使组合物到达靶组织。
[0111]
本发明的药物组合物可以以药物有效量来给药。本文所用的术语“药学上有效量”意指足以以适用于医学治疗或预防的合理效益/风险比率用于治疗或预防疾病的量。有效量的确定取决于多种因素，包括疾病的严重程度、药物的活性、患者的年龄、体重、健康状况和性别、患者对药物的敏感性、给药时间、给药途径、以及排泄速率和所用本发明组合物的治疗时期、与本发明组合物组合或同时使用的药物，以及药学领域公知的其它因素。
[0112]
本发明的药物组合物可以作为单一治疗剂或与其他治疗剂组合按顺序或同时来给药。本发明的药物组合物可以以单剂量或多剂量来给药。考虑到这些因素，重要的是以足以实现最大功效且无副作用的最小量给药该组合物。
[0113]
另外，本领域技术人员可以鉴于使用目的、疾病的严重程度、患者的年龄、体重、性别和病史或用作活性成分的物质来确定根据本发明的药物组合物的剂量(给药量)。例如，该药物组合物可以以10mg/kg至100mg/kg，更优选1mg/kg至30mg/kg的每日剂量向成人给药。本发明组合物的给药频率没有特别限制，并且该组合物可以1天1至3次给药，或者可以分成多剂量并全天给药。
[0114]
另一方面，本发明涉及预防或治疗胶质母细胞瘤的方法，该方法包括向受试者给药核酸复合物和/或包括该核酸复合物的组合物，在该核酸复合物中，具有能够结合tgf-β2基因的序列的生物活性肽核酸与载体肽核酸互补结合。
[0115]
另一方面，本发明涉及核酸复合物和/或包括该核酸复合物的组合物在制备用于预防和治疗胶质母细胞瘤的药物的用途，在该核酸复合物中，具有能够结合tgf-β2基因的序列的生物活性肽核酸与载体肽核酸互补结合。
[0116]
另一方面，本发明涉及核酸复合物和/或包括该核酸复合物的组合物用于预防或治疗胶质母细胞瘤的用途，在该核酸复合物中，具有能够结合tgf-β2基因的序列的生物活性肽核酸与载体肽核酸互补结合。
[0117]
[实施例]
[0118]
在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，对于本领域技术人员来说，显然以下实施例仅用于说明本发明，并且不应被解释为基于本发明的主题限制本发明的范围。
[0119]
实施例1：生物活性肽核酸和载体肽核酸以及使用该生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物的制备
[0120]
使用tgf-β2作为靶基因来验证本发明的核酸复合物对胶质母细胞瘤的效果。使用反义肽核酸(反义pna)作为针对tgf-β2的生物活性核酸来确定对胶质母细胞瘤的治疗效果。
[0121]
用于确定对胶质母细胞瘤治疗效果的生物活性核酸(反义pna)具有seq id no:1和2所表示的序列，以及用作本发明对照的生物活性核酸(反义pna)具有seq id no:3所表示的序列。
[0122]
本实施例中使用的基于肽-核酸的生物活性核酸，由seq id no:2和3表示，具有与glfdiikkiaesf结合的5'端，glfdiikkiaesf是促进内体逃逸的肽，并且由seq id no:1表示的核酸序列是在没有促进内体逃逸的肽的情况下合成的。除了由seq id no:9所表示的序列之外，本实施例中使用的所有载体肽核酸具有与促进内体逃逸的肽结合的5'或3'端，并且具有由seq id no:4至8所表示的序列。碱基序列、单体修饰和结构如下表1所示。本发明中使用的所有肽核酸都是在(panagene，韩国)通过hplc纯化合成的(表1)。
[0123]
[表1]
[0124]
验证对胶质母细胞瘤的治疗效果的生物活性核酸和载体肽核酸的序列
[0125][0126]
上文表1示出了用于确定靶向tgf-β2的胶质母细胞瘤的抗癌效果的生物活性肽核酸和载体肽核酸的序列信息，以及用作对照的生物活性肽核酸和载体肽核酸的序列信息。
[0127]
为了赋予电特性，对单体进行修饰以产生经修饰的肽核酸主链，设计所述经修饰的肽核酸主链使得肽核酸主链包括带正电荷的赖氨酸(lys，k(+))，并且经修饰的肽核酸主链包括带负电荷的谷氨酸(glu，e(-))。
[0128]
生物活性核酸和载体肽核酸的相应组合在dmso存在下杂交，产生包括生物活性核酸和载体肽核酸的复合物。
[0129]
实施例2：使用核酸复合物的胶质母细胞瘤的治疗效果的分析
[0130]
根据实施例1，使用包括载体肽核酸和靶向tgf-β2的生物活性肽核酸的核酸复合物来分析对胶质母细胞瘤的抗癌效果，该核酸复合物被制备成具有下表2的结构。
[0131]
[表2]
[0132]
用于人胶质母细胞瘤细胞系中基因表达分析的核酸复合物的组合
[0133]
项目核酸复合物1seq id no:3和8(对照)2seq id no:2和43seq id no:2和54seq id no:2和65seq id no:2和76seq id no:1和9
[0134]
实施例2-1：细胞培养
[0135]
将从atcc(美国标准培养物收藏所(american type culture collection)，usa)获得的人胶质母细胞瘤细胞(u87mg，atcc no.htb-14)于37℃在5％(v/v)co2的存在下在补充有10％(v/v)胎牛血清、100单位/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素的rpmi-1640培养基(wellgene，韩国)中温育。
[0136]
实施例2-2：用肽核酸复合物治疗的细胞中基因表达的分析
[0137]
将人胶质母细胞瘤细胞以1
×
105接种在96孔板中，培养24小时，并在实施例2-1的实验条件下测试，用500nm的包括生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物治疗细胞系，温育24、48、72、96和120小时，并向每个孔中加入30μl的ripa缓冲液以获得蛋白质裂解物。
[0138]
使用bca检测试剂盒(thermo fisher，usa)从蛋白质裂解物中检测蛋白质，通过电泳按大小分离30μg的蛋白质，并将该蛋白质转移至pvdf膜上，随后用第一抗体tgf-β2(santa cruz biotechnology，usa)和p-smad3(cell signaling technology，usa)以1∶1000的比率处理，并允许在4℃下放置一天。
[0139]
用1xt bs-t洗涤产物，用作为第二抗体的山羊抗兔(cell signaling technology，usa)和抗小鼠(santa cruz biotechnology，usa)以1∶2000的比例处理，并允许在室温下静置1小时。用supersignal
tm west femto超敏底物(thermo fisher,usa)处理结果，并使用imager 600(amersham，德国)分析抑制靶基因表达的效率。
[0140]
结果，从图1可以看出，用seq id no:2和5的组合的核酸复合物以及seq id nos:2和7的组合的核酸复合物治疗的组抑制靶基因和下游基因的表达最多长达72小时(图1a)。
[0141]
另外，与seq id no:2和5(组合3)的核酸复合物相比，测定了不具有促进内体逃逸功能的肽的序列的核酸复合物(seq id no:1和9，组合6)抑制靶基因表达的效率。结果显示，核酸复合物(seq id no:1和9，组合6)抑制靶基因(tgf-β2)和下游基因(p-smad3)的表达长达96小时，并且比具有促进内体逃逸功能的肽的核酸复合物组合(seq id no:2和5，组合3)抑制靶基因更长时间(图1b)。
[0142]
实施例2-3：用肽核酸复合物治疗的细胞的细胞迁移的分析
[0143]
将细胞培养插入物(bd，usa)固定在24孔板中，并且然后使用不含胎牛血清的培养基将人胶质母细胞瘤细胞以1
×
104接种在插入物内，并将含10％胎牛血清的培养基加入到24孔板中位于插入物(insert)下面的部分，随后温育24小时，在实施例2-1的条件下进行实验，并用500nm的包括生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物治疗结果。将细胞培养24、48和72小时，用4％ pfa(多聚甲醛)固定10分钟，并用0.1％结晶紫溶液染色30分钟，用棉签除去插入物内的剩余细胞，并用水洗涤染色溶液。将插入物膜干燥约一天，并在显微镜下观察迁移细胞的数量。
[0144]
结果，从图2可以看出，在seq id no:2和5的核酸复合物的组合中，细胞迁移效率受到最大程度地抑制，并且这种抑制作用持续长达72小时(图2a)。
[0145]
另外，在seq id no:2和5(组合3)的核酸复合物中观察到不具有促进内体逃逸功能的肽的序列的核酸复合物(seq id no:1和9，组合6)的细胞迁移抑制效率。结果显示，用不含肽的核酸复合物治疗的组也抑制细胞迁移，并且表现出比用含肽的核酸复合物治疗的组(组合3)更高的抑制效率(图2a)。
[0146]
使用imagej程序定量地确认迁移的细胞。结果显示，与对照组相比，用seq id no:2和5(组合3)的核酸复合物组合治疗的组在72小时内减少了约50％或更多，而用不含肽的核酸复合物治疗的组(组合6)从24小时起减少了超过70％的细胞迁移，并且抑制细胞的速度比用促进内体逃逸的肽(seq id no:2和5，组合3)的核酸复合物更快(图2b)。
[0147]
实施例3：原位小鼠模型中胶质母细胞瘤表型效应的分析
[0148]
为了验证在原位动物模型中的功效，使用了7周龄的雌性裸小鼠(orient bio，韩国)。为了构建肿瘤模型，用阿费丁(avertin)(5mg/kg)麻醉小鼠，将其固定在用于小动物的脑立体定位装置(立体定位仪，stoelting co，usa)中，并使用hamilton注射器注射3x105个u87mg细胞。注射坐标为ap+0.5mm、ml+2.0mm和dv-3mm。在使肿瘤生长10天后，通过尾静脉每周两次给药核酸复合物，并且将galunisertib(medchemexpress，usa)作为阳性对照，一种tgf-β受体抑制剂，以75mg/kg的剂量每日口服给药。在给药期期间，每周两次测量体重，并在3周内给药6次后，对所有动物进行安乐死。
[0149]
在本实施例中，选择其效果在实施例2中得到验证的核酸组合，并在u87mg胶质母细胞瘤细胞的原位动物模型中分析tgf-β2的组织学发现和基因表达变化。所用的核酸复合物组合如表3所示。
[0150]
[表3]
[0151]
用于分析胶质母细胞瘤原位动物模型中肿瘤治疗效果的核酸复合物的组合
[0152][0153][0154]
实施例3-1：使用h&e染色的胶质母细胞瘤原位移植动物模型中的表型分析
[0155]
该实验在实施例3的条件下进行。在最终实验结束时，对小鼠脑组织进行活检，在4％的福尔马林溶液中固定一天，浸入30％的糖溶液中，脱水3天，并且然后包埋在oct溶液中。将所包埋的组织在-20℃下保存并冷冻，并且然后将组织在低温恒温器(cryostat，leica，usa)中以20μm切片并固定在载玻片上。将所固定的组织用苏木精:伊红染色溶液染
色一段时间，用1x pbs洗涤，并且然后在显微镜下分析肿瘤的大小变化。
[0156]
结果，从图3可以看出，与植入肿瘤的诱导组(dmso)相比，用seq id no:2和5(组合3)的核酸复合物的组合治疗的组显著减小了肿瘤的大小，并且高浓度给药组(pna 3，20mg/kg)比阳性对照(pc)减小了更多的肿瘤的大小(图3)。通过使用imagej程序测量肿瘤的水平和垂直长度，并且然后计算面积，来定量地表达肿瘤的大小。
[0157]
另外，在seq id no:2和5(组合3)的核酸复合物中证实了不含促进内体逃逸功能的肽的序列的核酸复合物(seq id no:1和9，组合6)的组织学肿瘤大小变化。结果显示，与肿瘤诱导对照(dmso)相比，随着治疗浓度的增加，用不含肽的核酸复合物治疗的组减小了肿瘤的大小。此外，使用imagej程序测量和定量化肿瘤的面积。结果显示，用核酸复合物治疗的组以浓度依赖性方式减小了肿瘤的大小(图4)。尤其是，与具有肽的核酸复合物(组合3)相比，将剂量减少一半的10mg/kg给药组(pna 6，10mg/kg)显著减小了肿瘤的大小，并表现出与具有肽的核酸复合物的高浓度治疗组(组合3，20mg/kg)相似的抑制效率(图3和4)。
[0158]
实施例3-2：蛋白质印迹法对基因表达的分析
[0159]
在实施例3的条件下进行实验后，向经活检的小鼠肿瘤组织中加入200μl的ripa缓冲液，以获得蛋白质裂解物。使用bca检测试剂盒(thermo fisher，usa)从蛋白质裂解物中检测蛋白质，通过电泳按大小分离30μg的蛋白质，并将该蛋白质转移至pvdf膜上，用第一抗体，即tgf-β2(santa cruz biotechnology，us)、p-smad3(cell signaling technology，us)以1:1000的比率处理，并允许在4℃下放置一天。
[0160]
用1xt bs-t洗涤产物，用第二抗体，即山羊抗兔(cell signaling technology，usa)和抗小鼠(santa cruz biotechnology，usa)以1:2000的比率处理，并允许在室温下静置1小时。用supersignal
tm west femto超敏底物(thermo fisher,usa)处理结果产物，并使用imager 600(amersham，德国)在小鼠脑组织中分析抑制靶基因表达的效率。
[0161]
结果，从图5可以看出，与肿瘤诱导组相比，用seq id no:2和5(组合3)的核酸复合物治疗的组抑制了靶向基因tgf-β2的表达和下游基因p-smad3的表达(图2a)，并且高浓度治疗组(pna 3，20mg/kg)抑制了n＝3的靶基因和下游基因的表达(图5a)。
[0162]
另外，在seq id no:2和5(组合3)的核酸复合物中，与肿瘤诱导组相比，用不具有促进内体逃逸功能的肽的序列的核酸复合物(seq id no:1和9，组合6)治疗的组抑制了靶基因。尤其是，与其他肿瘤诱导组相比，两个高浓度治疗组(pna 6，5mg/kg和10mg/kg)抑制了n＝3的靶基因和下游基因的表达(图5b)。
[0163]
工业实用性
[0164]
根据本发明的核酸复合物具有优异的细胞穿透性和细胞内活性，并有效抑制tgf-β2基因及其下游基因的表达，因此可用于预防或治疗胶质母细胞瘤。
[0165]
尽管已经详细描述了本发明的特定配置，但是本领域的技术人员将会理解，提供该描述是为了说明的目的而阐述优选实施方式，并且不应该被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物来限定。
[0166]
文本的序列表
[0167]
附上电子文件。

技术特征：
1.一种用于预防、改善或治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，所述药物组合物包括作为活性成分的细胞渗透性核酸复合物，在所述细胞渗透性核酸复合物中，载体肽核酸与靶向tgf-β2基因的生物活性核酸互补结合。2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述生物活性肽核酸包括由seq id no:1所表示的序列。3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述载体肽核酸包括选自由seq id no：4至7和9所表示序列组成的组的序列。4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述核酸复合物选自由以下组成的组：(i)包括具有由seq id no:1所表示的序列的生物活性核酸以及具有由seq id no:4所表示的序列的载体肽核酸的核酸复合物；(ii)包括具有由seq id no:1所表示的序列的生物活性核酸以及具有由seq id no:5所表示的序列的载体肽核酸的核酸复合物；(iii)包括具有由seq id no:1所表示的序列的生物活性核酸以及具有由seq id no:6所表示的序列的载体肽核酸的核酸复合物；(iv)包括具有由seq id no:1所表示的序列的生物活性核酸以及具有由seq id no:7所表示的序列的载体肽核酸的核酸复合物；以及(v)包括具有由seq id no:1所表示的序列的生物活性核酸和具有由seq id no:9所表示的序列的载体肽核酸的核酸复合物。5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述生物活性核酸或所述载体肽核酸包括促进内体逃逸的物质，所述物质额外地结合每个核酸的5'端或3'端。6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中，促进内体逃逸的所述物质是选自由以下组成的组的至少一种：肽、脂质纳米颗粒、聚复合纳米颗粒、聚合物纳米球、无机纳米颗粒、阳离子脂质基纳米颗粒、阳离子聚合物和ph敏感性聚合物。7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中，所述促进内体逃逸的所述肽是glfdiikkiaesf(seq id no:10)或组氨酸(10)。8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述生物活性核酸具有净负电荷或呈中性。9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述载体肽核酸具有净正电荷。10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述核酸复合物具有净正电荷。11.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述核酸复合物能够穿透血脑屏障。

技术总结
本发明涉及用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，该药物组合物包括作为活性成分的核酸复合物，并且更具体地，涉及用于预防或治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，该药物组合物包括具有以下互补结合的核酸复合物：具有与TGF-β2基因结合的序列的生物活性肽核酸；以及载体肽核酸。根据本发明的核酸复合物具有优异的细胞渗透性和细胞内活性，并能有效抑制TGF-β2基因及其下位基因的表达，并且因此可用于预防或治疗胶质母细胞瘤。治疗胶质母细胞瘤。治疗胶质母细胞瘤。


技术研发人员：朴旻贞 金惠周 柳之娟 朴希卿
受保护的技术使用者：海阳制药
技术研发日：2021.12.14
技术公布日：2023/9/23