评价蛋白质的糖化度的方法和装置与流程

1.本发明涉及评价蛋白质的糖化度的方法和装置。


背景技术：

2.以往，糖化蛋白使用高效液相色谱(hplc)法、酶法等来测定。hplc法是简便的测定方法，但是利用两个以上色谱柱进行的对象成分的分离和定量需要花费数十分钟时间，需要两个以上高压泵，从而装置变得大型。酶法是通常使用的简便的测定方法，但是蛋白质的总量(蛋白质浓度)的测定和糖化蛋白量(糖化蛋白浓度)的测定需要分别使用不同的显色试剂分开进行。另外，在使用比色法时，非糖化蛋白和糖化蛋白的吸收峰彼此接近。因此，在同时测定的情况下，一者的吸收峰会被另一者的峰影响，妨碍准确地进行两者的测定。因此，为了通过比色法同时测定非糖化蛋白和糖化蛋白，需要在进行一者的测定后进行褪色的步骤。
3.或者，也可以使用以往的比色法分开测定非糖化蛋白的浓度和糖化蛋白的浓度。为此，需要将2种不同的测定方法组合。但是，2个测定中会分别产生测定误差。例如，不同的稀释率会分别产生不同的误差。即，在计算蛋白质的糖化度时，在分母(蛋白质的浓度)与分子(糖化蛋白的浓度)之间可能会产生不同的误差。因此，存在测定误差变大的风险。


技术实现要素：

4.本发明的若干实施方式中，提供评价蛋白质的糖化度的方法。上述方法具备提供可能含有对象蛋白的溶液的步骤。若干实施方式中，上述方法具备：使显色指示剂与上述溶液接触的步骤；以及使用上述显色指示剂与上述对象蛋白的第一反应求出上述溶液中的上述对象蛋白的浓度的步骤。若干实施方式中，上述方法具备：使蛋白酶与上述溶液接触的步骤；以及使用上述蛋白酶与上述对象蛋白的第二反应求出糖化的上述对象蛋白的浓度的步骤。若干实施方式中，上述方法还具备：基于上述对象蛋白的浓度和上述糖化的上述对象蛋白的浓度求出上述对象蛋白的糖化度的步骤。
5.根据本发明的若干实施方式，作为一例，可以使用吸光度测定白蛋白浓度、且使用过氧化氢电极测定糖化白蛋白。换言之，可以使用不同的检测方法来测定它们。例如，以往的比色法中在波长接近的吸光度(例如546nm和600nm)下分别进行测定，与此相对，上述方法能够同时进行测定。进而，例如可以使样品称量与试剂的稀释误差相同。例如在由白蛋白浓度和糖化白蛋白浓度计算比率(ga值、ga％)时，分母和分子的误差抵消，测定精度提高。或者，能够简便且准确地评价蛋白质的糖化度。
6.根据仅示出、说明本发明的例示性实施方式的以下的详细说明，本领域技术人员容易明确本发明的进一步方式和优点。如所理解的那样，本发明可以是其它不同的实施方式，其一些详细情况可以在不脱离本发明的情况下在各种显而易见的方面加以修正。因此，附图和说明本质上应被视为例示，而不应被视为限定。
附图说明
7.图1为一个实施方式的、评价蛋白质的糖化度的方法的流程图。
8.图2为一个实施方式的、评价蛋白质的糖化度的方法的流程图。
9.图3为示出一个实施例的、两个以上白蛋白浓度下的吸光度的时间变化的图。
10.图4为示出一个实施例的、基于吸光度的白蛋白浓度的校正曲线的图。
11.图5为示出一个实施例的方法与以往的方法之间的、实际检体中的白蛋白浓度的关系的图。
12.图6为示出一个实施例的、bcp的存在的有无对ga浓度测定的影响的图。
13.图7为示出一个实施例的、两个以上白蛋白浓度下的吸光度的时间变化的图。
14.图8为示出一个实施例的、两个以上白蛋白浓度下的传感器的输出的时间变化的图。
15.图9为示出通过一个实施例的方法得到的ga测定值与通过以往的方法得到的ga值的关系的图。
16.图10为示出一个实施例的、两个以上白蛋白浓度下的吸光度的时间变化的图。
17.图11为示出通过一个实施例的方法得到的ga值与通过以往的方法得到的ga值的关系的图。
18.图12为一个实施方式的评价蛋白质的糖化度的装置的框图。
19.图13为一个实施方式的评价蛋白质的糖化度的装置的框图。
20.图14为一个实施方式的评价蛋白质的糖化度的装置的框图。
21.图15为一个实施方式的评价蛋白质的糖化度的装置的框图。
22.图16为示出一个实施例的、sds的有无对改良bcp法的影响的吸光度的图。
具体实施方式
23.＜测定对象＞
24.若干实施方式中，对象者(被检者)可以包括人，可以为人。若干实施方式中，对象者可以包括人以外的动物，可以为人以外的动物。对象者可以包括哺乳类动物，可以为哺乳类动物。对象者例如非限定性地可以为役用动物、家畜动物、观赏动物、野生动物。
25.测定对象的试样可以为溶液。“溶液”可以为体液，可以为体液来源的溶液，可以为体液的稀释液。溶液可以是不为体液(非体液来源)的溶液，可以为体液或体液来源的溶液与非体液来源的溶液的混合液。溶液可以为样品测定中使用的溶液，可以为校准用测定中使用的溶液。例如，溶液可以为标准液、校准液。例如，溶液可以是为了在校准等中使用而有意地或计划性地不含测定对象物质的液体。成为测定对象的试样可以为检体。溶液可以为含有化学物质的溶液。
[0026]“体液”可以为淋巴液，可以为组织间液、细胞间液、间质液等组织液，可以为体腔液、浆膜腔液、胸水、腹水、心包液、脑脊髓液(髓液)、关节液(滑液)、眼房水(房水)。体液可以为唾液、胃液、胆汁、胰液、肠液等消化液，可以为汗、泪液、鼻涕、尿、精液、阴道液、羊水、乳汁。体液可以为动物的体液，可以为人的体液。“体液”可以为溶液。溶液可以包括含有测定对象物质的磷酸缓冲生理盐水(pbs)、n-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液(tes)等生理缓冲液。溶液只要含有测定对象物质则没有特别限定。
[0027]
溶液可以含有测定对象物质。溶液可以具有含有测定对象物质的可能性。若干实施方式中，测定对象物质可以为分子、离子、高分子、生物分子等。测定对象物质可以具备生物分子。测定对象物质可以为蛋白质、糖化蛋白等。例如，溶液为泪液，测定对象物质为泪液中所含的白蛋白、糖化白蛋白、血红蛋白和/或糖化血红蛋白。或者，测定对象物可以为血液、血清或血浆中的白蛋白、糖化白蛋白、血红蛋白、糖化血红蛋白，可以为间质液、尿或唾液中的白蛋白、糖化白蛋白、血红蛋白、糖化血红蛋白。白蛋白可以为氧化型白蛋白(hna)、还原型白蛋白(hma)。若干实施方式中，测定对象物质可以为age(advanced glycation end products、糖基化终产物、晚期糖基化终末产物)。若干实施方式中，测定对象物质可以为糖化脂质。
[0028]
＜传感器＞
[0029]
传感器可以为化学传感器、生物传感器、离子传感器等(以下有时称为“传感器”、“生物化学传感器”、“化学传感器”或“电化学传感器”。)。传感器可以具备两个以上传感器。
[0030]
传感器可以具备电极。电极可以为安培测定型电极。电极可以具备过氧化氢电极。电极可以具备氧电极。电极可以为伏安分析型电极。电极可以为离子检测用的电极(ph电极、氰离子电极、碘离子电极等)。
[0031]
若干实施方式中，传感器可以输出电信号。若干方式中，传感器可以输出电流信号。传感器可以输出电压信号或电荷。传感器可以与电流计、电压计等进行电连接。
[0032]
＜过氧化氢的测定＞
[0033]
若干实施方式中，可以使生成的糖化氨基酸与酮胺氧化酶反应而产生过氧化氢。若干实施方式中，可以测定所产生的过氧化氢的量(浓度)。若干实施方式中，可以通过电学方式测定过氧化氢的量(浓度)。
[0034]“酮胺氧化酶”通常是指识别糖化氨基酸或含有被糖化的氨基酸残基的肽或肽片段的酮胺结构并将糖化氨基酸氧化而产生氨基酸、葡糖醛酮(α-酮醛)和过氧化氢的氧化酶。因此，酮胺氧化酶生成与所识别的糖化氨基酸或含有被糖化的氨基酸残基的肽或肽片段浓度成比例的或相关的浓度的过氧化氢。
[0035]
酮胺氧化酶可以为脱氢酶，可以为激酶，可以为氧化酶。酮胺氧化酶可以为果糖基氨基酸氧化酶(faod)、果糖基肽氧化酶、果糖基缬氨酰基组氨酸氧化酶、果糖基胺氧化酶、阿马多里酶、果糖基胺去糖化酶、这些的改造型。
[0036]
若干实施方式中，酮胺氧化酶可以为作用于α-氨基被糖化的氨基酸或肽的氧化酶(酮胺氧化酶i组)。氨基酸或肽可以为缬氨酸、甘氨酸、赖氨酰基组氨酸。通过使用作用于α-氨基被糖化的氨基酸或肽的氧化酶，可以构成糖化血红蛋白传感器或糖化血红蛋白a1c(hba1c)传感器。
[0037]
若干实施方式中，酮胺氧化酶可以为作用于ε-氨基被糖化的氨基酸或肽的氧化酶(酮胺氧化酶ii组)。氨基酸可以为赖氨酸。被糖化的氨基酸可以为果糖基赖氨酸。通过使用选择性作用于ε-氨基被糖化的氨基酸或肽的氧化酶，可以构成糖化白蛋白传感器。
[0038]
若干实施方式中，酮胺氧化酶可以为作用于α-氨基和/或ε-氨基被糖化的氨基酸或肽的氧化酶(酮胺氧化酶iii组)。氨基酸或肽可以为赖氨酸、缬氨酸、甘氨酸、缬氨酰基组氨酸。通过使用作用于α-氨基和/或ε-氨基被糖化的氨基酸或肽的氧化酶，可以构成糖化蛋白传感器。
[0039]
若干实施方式中，传感器可以具备检测部。检测部可以为过氧化氢检测部。“过氧化氢检测部”(过氧化氢传感器)可以为电化学方式的电极，可以为过氧化氢电极。过氧化氢电极可以具有对电极、参比电极和工作电极。一个实施方式中，检测部可以检测氧。例如，可以检测酶反应中减少的氧的量或浓度。一般认为，氧检测的灵敏度相对于成为噪声源的分子、离子而言比较低、干扰较强。通过氧检测，可以计测氧的消耗量。检测部已达到大气饱和，因此可以用于酶的感测。检测部可以按照能够选择性进行或组合进行多种检测方法的方式来构成。
[0040]
＜使用离子交换树脂的噪声降低＞
[0041]
一个实施方式的传感器可以在检测器上具有离子交换树脂。传感器可以在酮胺氧化酶层与过氧化氢电极之间具有离子交换树脂。
[0042]
例如，使用以nafion(注册商标)为代表的阳离子交换树脂，可以抑制或防止体液中存在的抗坏血酸、尿酸、特别是负离子等透过并到达检测部。例如，使用聚吡咯等阴离子交换树脂，可以抑制或防止多巴胺等、特别是正离子等透过并到达检测部。
[0043]
离子交换树脂可以含有一种、两种以上或至少一种离子交换树脂。离子交换树脂可以具有一种、两种以上或至少一种的层而构成。
[0044]
＜分子印迹聚合物传感器＞
[0045]
传感器可以具备分子印迹聚合物(molecular imprinted polymer，mip)膜。可以检测通过mip的分子识别而产生的电荷或电位的变化(伏安分析型)。可以检测通过mip的分子识别而产生的在电极中流通的电流(例如介质的电流)的变化(安培测定型)。
[0046]
＜蛋白酶＞
[0047]“蛋白酶”通常为对蛋白质、多肽进行水解、异化的肽键水解酶的总称。蛋白酶可以为将蛋白质分解为肽片段的酶。在蛋白质含有被糖化的氨基酸残基的情况下，通过蛋白酶的作用而生成的肽片段中可能存在含有被糖化的氨基酸残基的肽片段和完全未被糖化的肽片段。
[0048]“蛋白酶”可以为动物来源的蛋白酶，可以为植物来源的蛋白酶，可以为微生物来源的蛋白酶。蛋白酶可以为外肽酶，可以为内肽酶。蛋白酶可以为天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或硫醇蛋白酶。
[0049]“蛋白酶”可以含有两个以上类型或种类的蛋白酶，也可以含有一个类型或种类的蛋白酶。例如，蛋白酶可以含有内肽酶和外肽酶中的一者，也可以含有两者。有时通过将两种以上蛋白酶混合来提高分解效率。
[0050]
动物来源的蛋白酶可以为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、牛胰蛋白酶、组织蛋白酶、钙蛋白酶、蛋白酶-i型、蛋白酶-xx型、氨肽酶n、羧肽酶、胰酶(蛋白酶、淀粉酶等多种酶的混合物)等。
[0051]
植物来源的蛋白酶可以为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、生姜蛋白酶、激肽释放酶、无花果蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶等。
[0052]
微生物来源的蛋白酶可以为芽孢杆菌(bacillus)来源蛋白酶、曲霉(aspergillus)来源蛋白酶、青霉(penicillium)来源蛋白酶、链霉菌(streptomyces)来源蛋白酶、溶杆菌(lysobacter)来源蛋白酶、酵母(yeast)来源蛋白酶、麦轴梗霉(tritirachium)来源蛋白酶、栖热菌(thermus)来源蛋白酶、假单胞菌(pseudomonas)来源
蛋白酶、无色杆菌(achromobacter)来源蛋白酶等。
[0053]
若干实施方式中，蛋白酶可以以液状提供，也可以与溶液混合。若干实施方式中，蛋白酶可以以固体状(例如粉末)添加或混合于溶液中。若干实施方式中，蛋白酶可以负载于负载材料并导入到溶液中。蛋白酶可以负载于平板、曲面、球体、珠、蛋白质等生物分子、高分子等。
[0054]
＜光学测定＞
[0055]
本说明书使用的“光学测定”一般是指使用光学元件或器件确定物质的光学特性。若干实施方式中，可以对对象物质的光学测定进行测定。若干方式中，可以对与对象物质已结合的或相关的物质(以下，即使不是对象物质本身，也是与对象物质进行化学、生物或物理的结合或相关的物质(例如试剂))的特性进行测定。可以对试剂的特性进行测定。有时将该试剂称为“对象物质”。
[0056]
若干方式中，光学测定可以包括分光测定。例如，可以对对象物质的吸光度进行测定。若干方式中，可以导入与对象物质对应的显色指示剂。可以对显色指示剂进行检测或测定。
[0057]
＜显色指示剂＞
[0058]
本说明书中使用的“显色指示剂”通常是指加酸显色的化学合成物。颜色变化通常可以为可逆性的。显色指示剂例如非限定性地包括酸碱指示剂(ph指示剂)、氧化还原指示剂、吸附指示剂、tlc显色指示剂等。其根据ph而改变其溶液的颜色。ph指示剂例如非限定性地可以为溴甲酚紫(bcp)、溴甲酚绿(bcg)等。
[0059]
若干实施方式中，可以对白蛋白使用bcp或bcg。例如，白蛋白与溴甲酚绿(bcg)结合而生成白蛋白-溴甲酚绿复合体。在ph4附近时，该复合体呈现蓝色。因此，通过测定吸光度，可以求出白蛋白浓度(bcg法)。测定试剂中可以添加表面活性剂。测定试剂中可以不添加表面活性剂。例如，可以不加入蛋白质变性剂(sds等)。
[0060]
例如，白蛋白与溴甲酚紫(bcp)结合而生成白蛋白-溴甲酚紫复合体。该复合体呈现蓝色。因此，通过测定吸光度，可以求出白蛋白浓度(bcp法)。另外，通常也可以利用氧化剂的作用使还原型白蛋白全部变为氧化型白蛋白后，通过与bcp的显色反应测定白蛋白浓度(改良bcp法)。测定试剂中可以添加表面活性剂。例如，可以不加入蛋白质变性剂(sds等)。
[0061]
若干实施方式中，可以将使白蛋白与溴甲酚紫(bcp)或溴甲酚绿(bcg)结合而生成复合体的反应称为“第一反应”。
[0062]
若干实施方式中，显色指示剂可以以液状提供，也可以与溶液混合。若干实施方式中，显色指示剂可以以固体状(例如粉末)添加或混合于溶液中。
[0063]
＜吸光度的测定＞
[0064]
若干实施方式中，可以使用吸光光度计(比色计)。吸光光度计具有光源和受光器。从光源发出的光全部或一部分进入对象溶液内。从溶液通过的光全部或一部分进入受光器。可以分析对象物质所吸收的光。
[0065]
光源的波长可以根据使用的显色指示剂适当选择。例如，bcp的情况下可以在主波长600～630nm等波长下测定吸光度，bcg的情况下可以在565～660nm下测定吸光度。
[0066]
若干实施方式中，可以测定显色指示剂的吸光度的时间变化。若干方式中，可以在
至少2个(或两个以上)时刻测定吸光度。例如，可以基于2个时刻的测定值求出初始(蛋白酶分解开始前、t＝0)的蛋白质的浓度。若干方式中，可以在蛋白酶分解开始的时刻进行测定，基于与该开始时刻起的时间对应的测定值求出蛋白质的浓度。若干方式中，可以基于3个以上时刻的测定值求出蛋白质的浓度。即使从蛋白酶分解开始的时刻起的时间不明，由至少3个以上测定值有时也可以求出初始的蛋白质的浓度。
[0067]
若干实施方式中，可以参考预先准备的表示吸光度与蛋白质浓度的关系的校正曲线来求出蛋白质的浓度。例如，预先准备表示以时间(t)变化的吸光度a(t)与该时间变化(δa(t)/δt)的关系的校正曲线。求出实际测定中某一时刻(t＝t1)的吸光度a(t1)及其斜率(δa(t1)/δt)。由此，可以求出蛋白酶的分解开始时刻t＝t0的吸光度a(t＝t0)。
[0068]
若干实施方式中，可以从蛋白酶分解的开始时刻起经过预先确定的或规定的时间后开始糖化蛋白的测定。若干实施方式中，在吸光度a变得足够小的时刻开始糖化蛋白的测定。若干实施方式中，吸光度的时间变化(δa/δt)如果实质上变为零，则判断为充分的蛋白酶的分解已完成，可以开始糖化蛋白的测定或者可以采用此时的糖化蛋白的测定结果。若干实施方式中，如果吸光度的时间变化达到规定值，则判断为已完成规定的利用蛋白酶的分解，可以开始糖化蛋白的测定或者可以采用此时的糖化蛋白的测定结果。
[0069]
若干实施方式中，可以进行吸光度测定的校准。可以对包括光学测定用池、发光元件、受光元件等的光学系统进行校准。例如，可以在将溶液导入到光学系统之前(例如光学测定用池空置的状态、其初始状态等)和之后(例如测定溶液已被导入到光学测定用池的状态)测定吸光度。可以求出它们的吸光度的差值。
[0070]
＜测定的步骤＞
[0071]
本发明的若干实施方式中，提供测定蛋白质的方法，其具备：提供可能含有对象蛋白的溶液的步骤；向该溶液中添加显色指示剂的步骤；以及之后或同时添加蛋白酶的步骤。该方法可以用于糖化蛋白的测定。但是，该方法的用途不限于此。该方法可以用于其它各种方法。
[0072]
图1示出一个实施方式的、评价白蛋白的糖化度的方法的流程图。
[0073]
步骤s101中，提供可能含有测定对象即作为蛋白质的白蛋白的溶液。
[0074]
步骤s111中，添加bcp作为显色指示剂。
[0075]
步骤s121中，进行bcp的吸光度测定。由吸光度求出白蛋白的浓度。
[0076]
步骤s112中，向已添加了bcp的测定溶液中添加蛋白酶。通过蛋白酶，白蛋白开始被分解为肽或氨基酸。
[0077]
步骤s122中，通过使与通过蛋白酶的消化反应而生成的肽或氨基酸中的糖化的氨基酸特异性反应的酮胺氧化酶进行作用，从而产生过氧化氢。使用电极测定该过氧化氢。由此，求出溶液中的糖化白蛋白(ga)的浓度。
[0078]
步骤s131中，求出所求出的糖化白蛋白(ga)相对于白蛋白的浓度的比，作为ga值。
[0079]
图1中，添加显色指示剂(s111)，测定吸光度(s121)，之后添加蛋白酶(s112)。若干实施方式中，可以在蛋白酶添加之前完成吸光度的测定。若干实施方式中，可以在吸光度的测定完成前或吸光度的测定过程中添加蛋白酶，
[0080]
图2示出一个实施方式的、评价白蛋白的糖化度的方法的流程图。
[0081]
步骤s201中，提供可能含有测定对象即作为蛋白质的白蛋白的溶液。
[0082]
步骤s211中，添加bcp作为显色指示剂。
[0083]
步骤s212中，向已添加了bcp的测定溶液中添加蛋白酶。通过蛋白酶，白蛋白开始被分解为氨基酸。
[0084]
步骤s221中，进行bcp的吸光度测定。由吸光度求出白蛋白的浓度。由于白蛋白的分解进行，吸光度会随着时间而下降。例如，通过测定蛋白酶导入时刻或分解开始时刻与从开始时刻起规定时间后的吸光度，可以求出原测定溶液中含有的白蛋白的浓度。
[0085]
步骤s222中，通过使与通过蛋白酶的消化反应而生成的肽或氨基酸中的糖化的氨基酸特异性反应的酮胺氧化酶进行作用，从而产生过氧化氢。使用电极测定该过氧化氢。由此求出溶液中的糖化白蛋白(ga)的浓度。
[0086]
步骤s231中，求出所求出的糖化白蛋白(ga)相对于白蛋白的浓度的比，作为ga值。
[0087]
图2中，添加显色指示剂(s211)，然后添加蛋白酶(s212)。但是步骤的顺序不限于此。若干实施方式中，可以实质上同时进行显色指示剂的添加(s211)和蛋白酶的添加(s212)。例如，可以将蛋白酶和显色指示剂预先混合，将该混合液添加到测定溶液中。
[0088]
图2中，在测定白蛋白的浓度(s221)之后测定糖化白蛋白浓度(s222)。但是步骤的顺序不限于此。若干实施方式中，可以实质上同时进行白蛋白浓度的测定(s221)和糖化白蛋白浓度的测定(s222)。若干实施方式中，添加显色指示剂(s211)，添加蛋白酶(s212)，之后将添加有两者的溶液分流。可以在分流出的一种溶液中测定白蛋白的浓度、在另一种溶液中测定糖化白蛋白的浓度。若干实施方式中，可以不像图2那样分开添加蛋白酶和显色指示剂。例如，可以将蛋白酶和显色指示剂预先混合，将该混合液添加到测定溶液中。
[0089]
使显色指示剂与可能含有对象蛋白的溶液接触，之后使用显色指示剂与对象蛋白的第一反应求出溶液中的对象蛋白的浓度。同样地，使蛋白酶与可能含有对象蛋白的溶液接触，之后使用蛋白酶与对象蛋白的第二反应求出糖化的对象蛋白的浓度(也称为糖化的对象蛋白的浓度、糖化蛋白的浓度。)。
[0090]
若干实施方式中，第二反应可以具备如下步骤：使生成的糖化氨基酸与酮胺氧化酶反应而产生过氧化氢。
[0091]
除了上述顺序以外，显色指示剂的导入、显色指示剂与对象蛋白的第一反应的测定、蛋白酶的导入、以及蛋白酶与对象蛋白的第二反应的测定这4个项目的顺序没有限定。
[0092]
若干实施方式中，除了将测定溶液和指示剂混合后对该指示剂混合溶液测定蛋白质、将测定溶液和蛋白酶混合后对该蛋白酶混合溶液测定糖化蛋白的顺序以外，步骤的顺序可以不作限定。
[0093]
若干实施方式中，可以将测定溶液和指示剂混合后向该指示剂混合溶液中混合蛋白酶。若干方式中，可以将测定溶液和指示剂混合，使用指示剂混合溶液测定蛋白质，向该指示剂混合溶液中混合蛋白酶，使用该指示剂蛋白酶混合溶液(混合有指示剂和蛋白酶的溶液)测定糖化蛋白。若干方式中，将测定溶液和指示剂混合，向该指示剂混合溶液中混合蛋白酶，使用该指示剂蛋白酶混合溶液(混合有指示剂和蛋白酶的溶液)测定糖化蛋白，使用该蛋白酶混合溶液测定蛋白质。若干方式中，可以按照下述顺序进行：可以将测定溶液和指示剂混合，向该指示剂混合溶液中混合蛋白酶，使用该指示剂蛋白酶混合溶液(混合有指示剂和蛋白酶的溶液)测定糖化蛋白，使用该指示剂蛋白酶混合溶液测定蛋白质。
[0094]
若干实施方式中，可以将测定溶液和蛋白酶混合后向该蛋白酶混合溶液中混合指
示剂。若干方式中，可以按照下述顺序进行：将测定溶液和蛋白酶混合，使用该蛋白酶混合溶液测定糖化蛋白，向该蛋白酶混合溶液中混合指示剂，使用蛋白酶指示剂混合溶液测定蛋白质。若干方式中，可以按照下述顺序进行：将测定溶液和蛋白酶混合，向该蛋白酶混合溶液中混合指示剂，使用该指示剂蛋白酶混合溶液测定糖化蛋白，使用该指示剂蛋白酶混合溶液测定蛋白质。若干方式中，可以按照下述顺序进行：将测定溶液和蛋白酶混合，向该蛋白酶混合溶液中混合指示剂，使用该指示剂蛋白酶混合溶液测定蛋白质，使用该指示剂蛋白酶混合溶液测定糖化蛋白。
[0095]
若干实施方式中，可以实质上同时地向测定溶液中混合指示剂和蛋白酶。
[0096]
＜糖化度的计算＞
[0097]
若干实施方式中，对于对象蛋白，可以基于对象蛋白的浓度和糖化蛋白的浓度求出对象蛋白的糖化度。蛋白质的糖化度可以通过用糖化蛋白的浓度除以蛋白质的浓度来求出。所测定的量不限于浓度。所测定的量可以为绝对量，也可以为相对量，可以为浓度，也可以为与质量或浓度有关的其它量。
[0098]
＜其它＞
[0099]
若干实施方式中，可以在添加显色指示剂和添加蛋白酶之后测定蛋白质的浓度和糖化蛋白的浓度。这种情况下，以液状添加显色指示剂和/或蛋白酶，与初始的溶液相比体积会发生变化。但是，显色指示剂和/或蛋白酶的投入量的误差所带来的偏差对于蛋白质的浓度和糖化蛋白的浓度这两者以相同的比率产生。因此，对于糖化度的计算不会造成实质性影响。因此，能够实现比较准确的具有再现性的测定。
[0100]
若干实施方式中，可以在添加显色指示剂之后进行蛋白质的浓度的测定、固态的蛋白酶的添加、糖化蛋白的浓度的测定。这种情况下，也与上述同样地，显色指示剂和/或蛋白酶的投入量的误差所带来的偏差对蛋白质的浓度和糖化蛋白这两者以相同的比率产生。因此，对于糖化度的计算不会造成实质性影响。因此，能够实现比较准确的具有再现性的测定。
[0101]
＜显色指示剂和蛋白酶的条件＞
[0102]
若干实施方式中，显色指示剂的反应或测定以及蛋白酶的反应或测定中的各种条件(例如ph、温度等)可以进行调整或变更。
[0103]
若干实施方式中，可以调节ph。可以在显色指示剂的添加或反应(第一反应)时、以及利用蛋白酶的分解(第二反应)时改变ph。例如，添加bcp时，可以将ph调节到包括其通常的最适范围的范围，可以以达到ph＝4.5～8.5、ph＝5.0～6.8等范围的方式进行调节。导入蛋白酶后，可以将ph调节到包括其通常的最适范围的范围，可以以达到ph＝6.0～9.0、ph＝7.0～8.5等范围的方式进行调节。
[0104]
若干实施方式中，可以在实质上相同的ph下进行第一反应和第二反应。例如，对于第一反应和第二反应这两者，可以将ph调节到ph＝5.0～9.0、ph＝7.0～8.5等范围。若干实施方式中，ph的值通常可以与最适范围不同。例如，关于第一反应中的ph，可以在碱性(ph＝7.0～9.0)下进行，关于第二反应中的ph，可以在碱性(ph＝7.0～9.0)下进行。若干实施方式中，可以在第一反应之后进行第二反应。
[0105]
若干实施方式中，第一反应和第二反应(至少部分地)同时进行时，可以将一个ph应用于两个反应。其值可以以达到适合于两者的范围的方式调节。例如，对于第一反应和第
二反应这两者，可以将ph调节到ph＝5.0～9.0、ph＝7.0～8.5等范围。若干实施方式中，ph的值通常与最适范围不同。
[0106]
若干实施方式中，可以调节温度。可以在显色指示剂的添加或反应(第一反应)时、以及利用蛋白酶的分解(第二反应)时改变温度。例如，添加bcp时，可以以达到其通常的最适温度即20℃至70℃的方式调节温度，在导入蛋白酶后，可以以达到25℃至70℃、50～70℃或55～65℃的方式调节温度。在吸光度测定后且蛋白酶导入前，可以将温度暂时升至蛋白酶分解用温度。在蛋白酶分解后进行酮胺氧化酶反应时，可以以达到25℃至75℃、30℃至65℃、35℃至65℃、37℃附近或55℃附近的方式调节温度。
[0107]
若干实施方式中，在第一反应和第二反应(至少部分地)同时进行时，可以将一个温度用于两个反应。其值可以以达到适合于两者的范围的方式调节。例如，对于第一反应和第二反应这两者，可以将温度调节到25℃至50℃、25℃至45℃或30℃至45℃的范围。例如，对于第一反应和第二反应这两者，可以将温度调节到25℃至70℃、30℃至70℃、40℃至70℃、50℃至70℃或55℃至65℃的范围。
[0108]
＜实施例1：alb浓度测定＞
[0109]
作为一个实施例，使用吸光度法测定白蛋白浓度。作为白蛋白样品溶液，使用市售的糖化白蛋白测定试剂盒(lucica(注册商标)ga-l)用校准品(ga-l校准品、旭化成制药株式会社)，准备pbs中的稀释系列(7.93mg/ml、3.97mg/ml、1.98mg/ml)。还准备了仅pbs的溶液(空白pbs)作为空白样品。作为蛋白酶溶液，将
オリエンターゼ
22bf(
エイチビィアイ
株式会社)320mg溶解于hepes缓冲液4ml。显色反应中使用bcp溶液(0.02mm、ph8.0)。吸光度使用糖尿病检查项目自动分析装置dm-jack ex(日立化成
ダイアグノスティック
·
システム
株式会社)以12秒间隔经时进行测定。在时刻t＝0分钟时，向样品溶液18μl中添加bcp溶液180μl。在t＝约4分钟时，添加蛋白酶溶液18μl。在t＝0分钟至约9分钟测定吸光度。
[0110]
＜alb校正曲线的生成＞
[0111]
图3示出从对两个以上白蛋白浓度得到的吸光度a减去空白pbs的吸光度a0而得的δa的时间变化。由于t＝0分钟以前不存在bcp，因此吸光度δa＝0。相对于t＝0分钟时的吸光度(δa＝0)，添加bcp后吸光度(δa)确认到变化。至t＝4分钟为止的期间的吸光度变化量(δa)实质上恒定。这表明能够稳定地测定bcp的吸光度。
[0112]
显示恒定值时的δa对应于白蛋白的浓度。若干实施方式中，可以基于未添加蛋白酶的溶液中的吸光度来求出白蛋白的浓度。图3中，相对于alb＝1.98mg/ml、3.97mg/ml、7.93mg/ml，分别为δa＝0.05、0.1、0.18，它们之间的关系几乎为线性。
[0113]
如果在t＝4分钟时添加蛋白酶，则吸光度δa衰减。这表明白蛋白被蛋白酶分解，与bcp进行反应的白蛋白浓度降低。衰减曲线均相似。在任意的点处，3个浓度之间的比例关系均恒定。
[0114]
若干实施方式中，可以基于从添加蛋白酶起规定时间的吸光度的值(a或δa)求出白蛋白的浓度。例如，可以使用终点法。若干实施方式中，可以基于吸光度的时间变换率(da/dt或d(δa)/dt)求出白蛋白的浓度。例如，可以使用速率分析。若干实施方式中，可基于吸光度的高阶微分系数(d2a/dt2或d2(δa)/dt2等)求出白蛋白的浓度。
[0115]
若干实施方式中，可以基于经过了足够时间的时刻的吸光度(δa)求出白蛋白的浓度。若干实施方式中，可以在δa不再变化的时刻以后测定ga。例如，t＝10分钟以后(未图
示)，δa成为恒定值，可解释为白蛋白的分解反应已完成。若干实施方式中，可以在规定时间(作为一例，t＝10分钟以后)的时刻测定ga。
[0116]
图4示出通过样品溶液的白蛋白的浓度与da/dt的关系求出的校正曲线。可知显示非常强的负相关关系。
[0117]
＜实际检体中的alb测定＞
[0118]
通过与上述同样的方法测定10人份的健康者实际检体中的白蛋白浓度。实际检体使用将从健康者采集的血浆用pbs稀释10倍而准备的溶液。对于该检体，使用市售的糖化白蛋白测定试剂盒lucica(注册商标)ga-l测定白蛋白浓度，进行比较。图5示出两者的关系。可知显示非常强的正相关关系。
[0119]
＜实施例2：糖化白蛋白浓度测定＞
[0120]
作为一个实施例，使用酶电极法测定糖化白蛋白浓度。
[0121]
作为样品溶液，向hsa(富士胶片和光纯药株式会社)中加入葡萄糖，在37℃下孵育，由此准备糖化率不同的ga溶液(40mg/ml)。各样品的糖化率使用市售的糖化白蛋白测定试剂盒(lucica(注册商标)ga-l、旭化成制药株式会社)来确认。蛋白酶溶液是将amano k(天野酶株式会社)2mg溶解于tes缓冲液200μl而准备的。向蛋白酶溶液20μl中添加bcp溶液(1mm)8μl。对该溶液进行加热处理，在4℃下保管。
[0122]
将该样品添加于具有固定有酮胺氧化酶膜的过氧化氢电极的电化学传感器。测定输出电流，从而求出糖化白蛋白浓度。
[0123]
图6示出bcp的有无下的糖化白蛋白浓度与酶传感器输出的关系。横轴表示溶液中的糖化白蛋白浓度，纵轴表示测得的电流值。另外，白色圆形示出“无bcp”的测定，黑色圆形示出“有bcp”的测定。
[0124]
任一者均得到了同样的ga值，进而得到了同样的浓度依赖性。这表明bcp的存在对利用蛋白酶的白蛋白的分解和利用酮胺氧化酶的糖化氨基酸的测定均未造成实质性影响。对于bcg，也得到了同样的结果(未图示)。因此认为，其它显色指示剂的添加对此后的利用蛋白酶的白蛋白的分解和利用酮胺氧化酶的糖化氨基酸的测定均不会造成实质性影响。
[0125]
＜实施例3：ga值测定-1＞
[0126]
本实施例示出ga值测定的一例。对于含有糖化白蛋白的试样添加bcp，进行基于吸光度的白蛋白浓度测定，之后向该溶液中添加蛋白酶，利用具有固定有faod膜的过氧化氢电极的电化学传感器进行糖化白蛋白浓度测定。以下更具体地进行说明。
[0127]
＜ga校正曲线的生成＞
[0128]
图7示出由吸光度测定得到的用于生成白蛋白浓度的校正曲线的测定结果的一例。吸光度测定中使用含有1.3mg/ml、2.4mg/ml和4.7mg/ml的白蛋白的试样。图7的0秒时，将bcp液(含有十二烷基硫酸钠(sds)，tritonx-100，5,5
’‑
二硫代双(2-硝基苯甲酸(dtnb)，hepes(ph8.0)，nacl)导入到光学测定用池。约30秒时，将白蛋白试样添加到bcp液中。由此，吸光度下降。之后通过移液操作将溶液混合。约40秒左右观察到的尖峰、变动是由于混合所引起的液体运动、移液管所引起的光路遮断而产生的。约50秒后，白蛋白试样的吸光度均达到恒定。由图7可知，吸光度显示出白蛋白浓度依赖性，因此求出白蛋白浓度与吸光度的关系，生成其校正曲线(未图示)。
[0129]
图8示出利用电化学传感器测定的糖化白蛋白浓度的校正曲线生成中使用的测定
结果的一例。测定中使用含有0.4mg/ml、0.7mg/ml和1.5mg/ml的糖化白蛋白的试样。这些溶液含有bcp。向吸光度测定后的溶液中添加蛋白酶，在55℃下进行30分钟消化反应。之后，在图8的0秒时，将消化反应后的溶液导入电化学传感器。测定该电化学传感器的输出电流。可知在任一浓度下均在约60秒至80秒取得极大值(拐点)。此时，可以求出例如60秒时的输出电流与糖化白蛋白浓度的关系。使用这样的数据求出糖化白蛋白浓度与电化学传感器的输出电流的关系，示出其校正曲线。
[0130]
使用如此求出的白蛋白浓度的校正曲线和糖化白蛋白浓度的校正曲线，可以求出未知试样的ga值。
[0131]
＜未知试样的ga值测定＞
[0132]
然后，使用与上述同样的方法测定未知试样的ga值。作为测定试样，将高浓度ga值试样和低浓度ga值试样以若干种比例混合而准备两个以上测定溶液。低浓度ga值试样使用人血清白蛋白试剂(sigma-aldrich)。高浓度ga值试样是向人血清白蛋白试剂(sigma-aldrich)中加入葡萄糖并进行孵育而制作的。这些为人工制备的试样，但实际的ga值未知。
[0133]
对于这些测定试样应用本实施例的测定方法，求出ga值。对于相同的测定试样，使用作为现有方法的市售的糖化白蛋白测定试剂盒(lucica(注册商标)ga-l)求出ga值(％)。图9示出对于4个不同的未知浓度的试样得到的两种测定值。横轴示出利用lucica得到的测定ga值，纵轴示出利用本实施例的测定方法得到的ga值(任意单位。未示出ga值(％)。)。由此可知，通过使用本发明的方法之一，可以极良好地求出ga值。
[0134]
＜实施例4：ga值测定-2＞
[0135]
本实施例示出ga值(％)测定的一例。对于含有糖化白蛋白的试样添加bcp与蛋白酶混合液，之后进行光学测定而测定白蛋白浓度，并且使用具有固定有faod膜的过氧化氢电极的电化学传感器测定糖化白蛋白浓度。以下更具体地进行说明。
[0136]
＜alb校正曲线的生成＞
[0137]
图10示出利用吸光度测定的白蛋白浓度的校正曲线生成中使用的测定结果的一例。测定中使用含有1.2mg/ml、2.5mg/ml和5.0mg/ml的白蛋白的试样。在图10的-10秒之前，将bcp与蛋白酶混合液(添加有sds,tritonx-100,dtnb,hepes(ph8.0),nacl，蛋白酶)导入到光学测定用池。0秒时，将白蛋白试样添加到bcp与蛋白酶的混合液中。由此，吸光度下降。之后通过移液操作将溶液混合。在约15秒左右观察到的尖峰、变动是由于混合所引起的液体运动、移液管所引起的光路遮断而产生的。自约20秒以后，吸光度显示出稳定的衰减。
[0138]
由此，20秒时刻的吸光度、20秒时刻和此后的时刻(例如90秒时的吸光度的差异、吸光度的时间变化(时间微分)等与吸光度有关的值由初始的白蛋白浓度决定。使用这样的数据求出白蛋白浓度与吸光度的关系，生成其校正曲线。
[0139]
使用与图8同样的方法求出糖化白蛋白浓度与电化学传感器的输出电流的关系，生成其校正曲线。(未图示)
[0140]
＜未知试样的ga值(％)测定＞
[0141]
与实施例3同样地准备测定试样。
[0142]
对于这些测定试样应用本实施例的测定方法，求出ga值(％)。对于相同的测定试样，使用作为现有方法的市售的糖化白蛋白测定试剂盒(lucica(注册商标)ga-l)求出ga值(％)。图11示出对5个不同的未知浓度的试样得到的两种测定值的关系。横轴示出利用现有
的测定方法得到的ga值(％)，纵轴示出利用本实施例的测定方法得到的ga值(％)。由此可知，通过使用本发明的方法之一，可以极良好地求出ga值(％)。
[0143]
＜实施例5：弱碱性改良bcp法的一例＞
[0144]
上述实施例中含有sds，但在其它实施方式中，也可以不含sds。示出在弱碱性(本实施例中为ph＝8.0)下进行第一反应和第二反应这两者的实施例。以下对第一反应进行说明。
[0145]
基于改良bcp法的白蛋白测定通常使用氧化剂和sds在酸性条件下进行。一般认为在导入dtnb之类的氧化剂时sds这种蛋白质变性剂容易使白蛋白氧化。在该状态下导入bcp。
[0146]
另一方面，作为第二反应的蛋白酶反应通常要求弱碱性。为了同时、连续或串行地进行第一反应和第二反应，优选使第一反应也在同样的碱性环境下进行。不再需要改变ph。
[0147]
高ph(弱碱性、例如ph8.0)下，氧化速度对于一般的测定效率而言足够大，因此认为即使没有sds也可使白蛋白充分氧化。另外认为，如果没有sds，则可避免蛋白质的高级结构的变形，例如可以避免蛋白酶活性下降。若干实施方式中，在弱碱性下进行的改良bcp法中，溶液优选不含sds。
[0148]
因此，本实施例中确认ph＝8.0下改良bcp法能否发挥功能。首先，将ga-l校准品(旭化成制药株式会社)稀释，准备白蛋白浓度为0g/dl、0.23g/dl、0.45g/dl的样品。作为弱酸性的缓冲液，使用琥珀酸溶液(ph5.4)，作为弱碱性的缓冲液，使用hepes溶液(ph8.0)和三(羟甲基)甲基甘氨酸溶液(tricine)(ph8.0)。hepes频繁地被用于同样的测定，但是由于具有磺基(so
3-)而可能与dtnb发生反应。因此，还使用三(羟甲基)甲基甘氨酸。作为氧化试剂，使用0.1mm dtnb。含有sds的反应液制备成0.02％sds的浓度。由此，通过3种缓冲液和sds的有无而准备了总计6种反应试剂。
[0149]
将样品和反应试剂混合后，升温至37℃，5分钟后测定412nm的吸光度。dtnb与白蛋白的还原型半胱氨酸残基反应后生成的化合物具有412nm的极大吸收波长。图16示出针对3种缓冲液、琥珀酸溶液、hepes溶液(hepes、圆形)、三(羟甲基)甲基甘氨酸溶液(tricine、三角形)的、关于有sds(sds+、黑色实心)和无sds(sds-、白色空心)的吸光度。
[0150]
对于ph5.4的琥珀酸溶液(suc、方形)，在有sds(sds+、黑色实心)和无sds(sds-、白色空心)之间观察到吸光度差异。即，确认了：在弱酸性下，如果没有sds，则氧化反应不能充分进行。
[0151]
另一方面，在ph＝8.0的hepes溶液(hepes、圆形)、三(羟甲基)甲基甘氨酸溶液(tricine、三角形)的情况下，在有sds(sds+、黑色实心)和无sds(sds-、白色空心)中的任一情况下，吸光度均未观察到实质性差异。即，确认了：在弱碱性下，不论有无sds，氧化均充分进行。如果没有sds，则可以避免蛋白质的高级结构的变形，例如可以避免蛋白酶活性下降。
[0152]
＜装置构成的例1＞
[0153]
图12示意性示出一个实施方式的装置100的构成。装置100具备光学测定部110、蛋白酶反应部120和糖化蛋白测定部130。样品溶液从其导入单元140被导入到光学测定部110，依次流到蛋白酶反应部120、糖化蛋白测定部130。显色指示剂槽150以与光学测定部110连接、向光学测定部110提供显色指示剂的方式构成。蛋白酶溶液槽160以与蛋白酶反应部120连接、向蛋白酶反应部120提供蛋白酶溶液的方式构成。
[0154]
溶液的导入和送液通过送液机构170来控制。送液机构170可以控制样品溶液向光学测定部110导入的时机和其量。送液机构170同样地可以控制从显色指示剂溶液槽150向光学测定部110的、显色指示剂溶液的导入的时机和其量，可以控制从蛋白酶溶液槽160向蛋白酶反应部120的、蛋白酶溶液的导入的时机和其量。
[0155]
送液机构170例如可以具备泵。光学测定部110、蛋白酶反应部120和糖化蛋白测定部130为闭合流路时，可以对上游侧施加正压而控制溶液的移动。送液机构170可以为安装于各溶液槽的挤压机构。各溶液槽为可变形的容器时，可以通过使容器变形而将规定量的溶液送出到外部。
[0156]
具有温度传感器和加热器(未图示)的温度控制单元118、128、138分别配置在光学测定部110、蛋白酶反应部120和糖化蛋白测定部130。温度控制单元118、128、138与温度控制机构(驱动器)180连接，其可以从温度传感器接收测定温度信息、向加热器输送加热的开始停止的指示和电力。
[0157]
具备发光元件和受光元件(未图示)的光学测定单元119配置于光学测定部110。从发光元件发出的光从光学测定部110内的溶液通过，透过的光被受光元件感知。光学测定单元119可以输出此时的吸光度信息。
[0158]
传感器139配置于糖化蛋白测定部130。传感器139可以配置在糖化蛋白测定部130的内部，与内部的溶液直接接触。该传感器139以测定糖化蛋白的浓度的方式构成。
[0159]
装置100还具备计算机系统190。计算机系统190至少具备中央处理单元(cpu)195，其进行必要的运算。计算机系统190分别具有送液机构170与温度控制机构180的通信接口197、198。计算机系统190分别具有光学测定单元119与传感器139的通信接口191、193。
[0160]
cpu195借助送液机构用通信接口197对送液机构170输送必要的操作项目(应导入的溶液和导入目的地的构成)、其时机、其量等必要信息。送液机构170基于接收到的信息执行必要的操作。送液机构170可以将各操作已执行这一信息、执行失败等信息等发送到通信接口197。
[0161]
cpu195借助温度控制机构用通信接口198对温度控制机构180输送必要的操作项目(温度的测定、各反应所必需的温度等)、其时机、其温度和时间等必要的信息。温度控制机构180基于接收到的信息执行必要的操作。温度控制机构180可以将各操作已执行这一信息、执行失败等信息等发送到通信接口198。
[0162]
光学测定单元用通信接口191接收来自配置于光学测定部110的光学测定单元119的关于吸光度的信息。糖化蛋白传感器用通信接口193从配置于糖化蛋白测定部130的传感器139接收关于糖化蛋白浓度的信息。
[0163]
光学测定单元用通信接口191对配置于光学测定部110的光学测定单元119发出吸光度测定的开始、结束等指令，从其接收通过测定得到的关于蛋白质浓度的信息。糖化蛋白传感器用通信接口193对配置于糖化蛋白测定部130的传感器139发出电流测定的开始、结束等指令，从其接收通过测定得到的关于糖化蛋白浓度的信息。
[0164]
cpu195借助通信接口191、193接收关于吸光度的信息和关于糖化蛋白的信息，进行规定的变换，计算糖化度。
[0165]
＜装置构成的例2＞
[0166]
图13示意性示出一个实施方式的装置200的构成。装置200具备光学测定部210和
糖化蛋白测定部230。样品溶液从其导入单元240被导入到光学测定部210，流到糖化蛋白测定部230。测定液(显色指示剂蛋白酶溶液)槽250与光学测定部210连接，以向光学测定部210提供显色指示剂与蛋白酶的混合液的方式构成。
[0167]
溶液的导入和送液通过送液机构270来控制。
[0168]
具有温度传感器和加热器(未图示)的温度控制单元218、238分别配置于光学测定部210和糖化蛋白测定部230。
[0169]
光学测定单元219配置于光学测定部210，可以测定吸光度、并将测得的关于吸光度的信息输出。
[0170]
传感器239配置于糖化蛋白测定部230，以测定糖化蛋白的浓度、并将测得的关于糖化蛋白的信息输出的方式构成。
[0171]
装置200还具备计算机系统290。计算机系统290至少具备中央处理单元(cpu)295，其进行必要的运算。计算机系统290可以借助通信接口297、298与送液机构270和温度控制机构280进行通信。计算机系统290可以借助通信接口291、293与光学测定单元219和传感器239进行通信。
[0172]
cpu295借助通信接口291、293接收关于吸光度的信息和关于糖化蛋白的信息，进行规定的变换，计算糖化度。
[0173]
＜装置构成的例3＞
[0174]
图14示意性示出一个实施方式的装置300的构成。装置300具备显色指示剂反应部305、光学测定部310、蛋白酶反应部320和糖化蛋白测定部330。样品溶液从其导入单元340被导入到显色指示剂反应部305，依次流到光学测定部310、蛋白酶反应部320、糖化蛋白测定部330。
[0175]
显色指示剂反应部305预先收容显色指示剂。导入到显色指示剂反应部305的溶液与显色指示剂混合并进行反应。蛋白酶反应部320预先收容蛋白酶。导入到蛋白酶反应部320的溶液与蛋白酶接触并进行反应。
[0176]
溶液的导入和送液通过送液机构370来控制。
[0177]
具有温度传感器和加热器(未图示)的温度控制单元318、328、338分别配置于光学测定部310、蛋白酶反应部320和糖化蛋白测定部330。
[0178]
光学测定单元319配置于光学测定部310，可以测定吸光度、并将测得的关于吸光度的信息输出。
[0179]
传感器339配置于糖化蛋白测定部330，以测定糖化蛋白的浓度、并将测得的关于糖化蛋白的信息输出的方式构成。
[0180]
装置300还具备计算机系统390。计算机系统390至少具备中央处理单元(cpu)395，其进行必要的运算。计算机系统390可以借助通信接口397、398与送液机构370和温度控制机构380进行通信。计算机系统390可以借助通信接口391、393与光学测定单元319和传感器339进行通信。
[0181]
cpu395借助通信接口391、393接收关于吸光度的信息和关于糖化蛋白的信息，进行规定的变换，计算糖化度。
[0182]
＜装置构成的例4＞
[0183]
图15示意性示出一个实施方式的装置400的构成。装置400具备显色指示剂蛋白酶
溶液反应部405、光学测定部410和糖化蛋白测定部430。样品溶液从其导入单元440被导入到显色指示剂反应部405，依次流到光学测定部410、糖化蛋白测定部430。
[0184]
显色指示剂蛋白酶溶液反应部405预先收容有显色指示剂和蛋白酶。导入到显色指示剂蛋白酶溶液反应部405的溶液与显色指示剂混合并进行反应，并且与蛋白酶接触并进行反应。
[0185]
溶液的导入和送液通过送液机构470来控制。
[0186]
具有温度传感器和加热器(未图示)的温度控制单元418、438配置于光学测定部410和糖化蛋白测定部430。
[0187]
光学测定单元419配置于光学测定部410，可以测定吸光度、并将测得的关于吸光度的信息输出。
[0188]
传感器439配置于糖化蛋白测定部430，以测定糖化蛋白的浓度、并将测得的关于糖化蛋白的信息输出的方式构成。
[0189]
装置400还具备计算机系统490。计算机系统490至少具备中央处理单元(cpu)495，其进行必要的运算。计算机系统490可以借助通信接口497、498与送液机构470和温度控制机构480进行通信。计算机系统490可以借助通信接口491、493与光学测定单元419和传感器439进行通信。
[0190]
cpu495借助通信接口491、493接收关于吸光度的信息和关于糖化蛋白的信息，进行规定的变换，计算糖化度。
[0191]
装置构成不限于上述实施例。若干实施方式中，装置或系统可以为自动分注装置或系统(有时也简称为自动分注装置)。自动分注装置可以具有收容试剂或它们中的至少2种的混合液的孔。若干实施方式中，可以提供具有两个以上孔的组件(微孔板)。装置或组件可以具备电化学传感器，可以以安装有电化学传感器的方式构成。试样和溶液可以通过移液器操作进行定量、从孔向其它孔转移或进行混合。自动分注装置可以具备加热器，加热器可以控制孔或孔内的溶液的温度。自动分注装置可以具备光学测定系统。
[0192]
若干实施方式中，装置可以具备废液槽。从光学测定部、糖化蛋白测定部等通过的溶液可以回收到废液槽中。由此，可以降低含有体液的溶液漏出到外部的风险。
[0193]
本发明还提供以下的实施方式。
[0194]
a001
[0195]
一种评价蛋白质的糖化度的方法，其具备：
[0196]
提供可能含有对象蛋白的溶液的步骤；
[0197]
使上述溶液与显色指示剂接触的步骤；
[0198]
使上述溶液与蛋白酶接触的步骤；
[0199]
使用上述显色指示剂与上述对象蛋白的第一反应求出上述溶液中的上述对象蛋白的浓度的步骤；
[0200]
使用上述蛋白酶与上述对象蛋白的第二反应求出糖化的上述对象蛋白的浓度的步骤；以及
[0201]
基于上述对象蛋白的浓度和上述糖化的上述对象蛋白的浓度求出上述对象蛋白的糖化度的步骤。
[0202]
a011
[0203]
根据实施方式a001所述的方法，其中，使上述溶液与蛋白酶接触的步骤包括向使上述溶液与上述显色指示剂接触而生成的显色指示剂混合液中添加上述蛋白酶的步骤。
[0204]
a012
[0205]
根据实施方式a001所述的方法，其中，使上述溶液与显色指示剂接触的步骤以及使上述溶液与蛋白酶接触的步骤实质上同时进行。
[0206]
a012b
[0207]
根据实施方式a001所述的方法，其中，包括使上述显色指示剂和上述蛋白酶实质上同时地与上述溶液混合的步骤。
[0208]
a013
[0209]
根据实施方式a001所述的方法，其中，使上述溶液与显色指示剂接触的步骤包括向使上述溶液与上述蛋白酶接触而生成的蛋白酶混合液中添加上述显色指示剂的步骤。
[0210]
a021
[0211]
根据实施方式a001至a013中任一项所述的方法，其中，对上述显色指示剂与上述对象蛋白的第一反应进行测定的步骤具备测定上述显色指示剂的吸光度的步骤。
[0212]
a022
[0213]
根据实施方式a021所述的方法，其中，测定上述显色指示剂的吸收光度的步骤具备测定上述吸光度的时间变化的步骤。
[0214]
a023
[0215]
根据实施方式a022所述的方法，其中，测定上述吸光度的时间变化的步骤包括在至少2个(或两个以上)时刻测定上述吸光度的步骤。
[0216]
a024
[0217]
根据实施方式a022或a023所述的方法，其中，基于上述吸光度的时间变化求出糖化的上述对象蛋白的浓度。
[0218]
a031
[0219]
根据实施方式a001至a024中任一项所述的方法，其中，上述对象蛋白为白蛋白。
[0220]
a032
[0221]
根据实施方式a031所述的方法，其中，
[0222]
使用上述蛋白酶与上述白蛋白的第二反应求出糖化白蛋白的浓度的步骤具备：
[0223]
使上述蛋白酶分解上述白蛋白而生成肽的步骤；
[0224]
使上述生成的肽与酮胺氧化酶反应而生成过氧化氢的步骤；
[0225]
测定上述生成的过氧化氢的浓度的步骤；以及
[0226]
基于上述过氧化氢的浓度求出上述糖化白蛋白的浓度的步骤。
[0227]
a033
[0228]
根据实施方式a032所述的方法，其中，测定上述过氧化氢的浓度的步骤使用过氧化氢电极。
[0229]
a034
[0230]
根据实施方式a033所述的方法，其中，测定上述过氧化氢的浓度的步骤包括使从离子交换树脂通过的上述过氧化氢与上述过氧化氢电极接触的步骤。
[0231]
a041
[0232]
根据实施方式a001至a034中任一项所述的方法，其中，上述显色指示剂为ph指示剂。
[0233]
a042
[0234]
根据实施方式a031至a034中任一项所述的方法，其中，上述显色指示剂为溴甲酚紫(bcp)或溴甲酚绿(bcg)。
[0235]
a051
[0236]
根据实施方式a042所述的方法，其中，
[0237]
上述显色指示剂为溴甲酚紫(bcp)或溴甲酚绿(bcg)，
[0238]
所述方法还具备如下步骤：在上述第一反应期间，将上述溶液的ph调节到4.5至8.5的范围；以及在上述第二反应期间，将上述溶液的ph调节到6.0至9.0的范围。
[0239]
a052
[0240]
根据实施方式a001至a042中任一项所述的方法，其中，
[0241]
在上述显色指示剂与上述对象蛋白的第一反应以及上述显色指示剂与上述对象蛋白的第二反应(至少部分地)同时进行时，将上述溶液的ph调节到适合于上述第一反应和上述第二反应这两者的范围。
[0242]
a053
[0243]
根据实施方式a052所述的方法，其中，上述显色指示剂为溴甲酚紫(bcp)或溴甲酚绿(bcg)，将上述ph调节到7.0至8.5的范围。
[0244]
a054
[0245]
根据实施方式a051或a053所述的方法，其中，
[0246]
将上述ph调节到7.0至8.5的范围，
[0247]
在上述第一反应时，上述溶液的混合液不含(不含有)蛋白质变性剂(sds)。
[0248]
a055
[0249]
根据实施方式a032至a054中任一项所述的方法，上述显色指示剂为溴甲酚紫(bcp)或溴甲酚绿(bcg)，
[0250]
所述方法还具备如下步骤：在上述第一反应期间，将上述溶液的温度调节到20℃至70℃的范围；以及在上述第二反应期间，将上述溶液的温度调节到25℃至70℃的范围。
[0251]
a056
[0252]
根据实施方式a001至a054中任一项所述的方法，其中，
[0253]
在上述显色指示剂与上述对象蛋白的第一反应以及上述显色指示剂与上述对象蛋白的第二反应(至少部分地)同时进行时，将上述溶液的温度调节到适合于上述第一反应和上述第二反应这两者的范围。
[0254]
a057
[0255]
根据实施方式a056所述的方法，其中，将上述温度调节到25℃至70℃的范围。
[0256]
a058
[0257]
根据实施方式a032至a034中任一项所述的方法，其中，还具备将上述酮胺氧化酶的温度调节到25℃至75℃的范围的步骤。
[0258]
a061
[0259]
根据实施方式a032至a058中任一项所述的方法，其中，
[0260]
上述酮胺氧化酶为作用于α-氨基被糖化的氨基酸或肽的氧化酶(酮胺氧化酶i组)，测定上述生成的过氧化氢的浓度的步骤具备使用含有果糖基缬氨酸、果糖基甘氨酸和果糖基缬氨酰基组氨酸中的至少一种的基准液进行测定的校准的步骤。
[0261]
a062
[0262]
根据实施方式a032至a058中任一项所述的方法，其中，
[0263]
上述酮胺氧化酶为作用于ε-氨基被糖化的氨基酸或肽的氧化酶(酮胺氧化酶ii组)，测定上述生成的过氧化氢的浓度的步骤具备使用含有果糖基赖氨酸的基准液进行测定的校准的步骤。
[0264]
a063
[0265]
根据实施方式a032至a058中任一项所述的方法，其中，
[0266]
上述酮胺氧化酶为作用于α-氨基和/或ε-氨基被糖化的氨基酸或肽的氧化酶(酮胺氧化酶iii组)，
[0267]
测定上述生成的过氧化氢的浓度的步骤具备使用含有果糖基赖氨酸、果糖基缬氨酸、果糖基甘氨酸和果糖基缬氨酰基组氨酸中的至少一种的基准液进行测定的校准的步骤。
[0268]
b01
[0269]
一种程序，其用于使计算机系统执行实施方式a001至a063中任一项所述的方法。
[0270]
b11
[0271]
一种存储介质，其存储实施方式b01所述的程序。
[0272]
c01
[0273]
一种用于评价蛋白质的糖化度的装置，其具备蛋白质浓度测定部、糖化蛋白测定部和运算处理部，
[0274]
所述蛋白质浓度测定部具备：
[0275]
体液的导入单元(或导入口)；
[0276]
将上述体液和显色指示剂溶液混合的机构；和
[0277]
测定上述体液与上述显色指示剂溶液的混合液中的蛋白质的浓度的光学测定单元，
[0278]
所述糖化蛋白测定部具备：
[0279]
将上述体液和蛋白酶溶液混合的机构；和
[0280]
测定上述体液与上述蛋白酶的混合液中的糖化蛋白的浓度的电极单元(传感器)，
[0281]
所述运算处理部与上述白蛋白浓度测定部和上述糖化蛋白测定部进行通信。
[0282]
c02
[0283]
根据实施方式c01所述的装置，其中，将上述体液和蛋白酶溶液混合的步骤包括向上述体液与上述显色指示剂溶液的混合液中混合上述蛋白酶溶液的步骤。
[0284]
c11
[0285]
根据实施方式c01或c02所述的装置，其中，上述蛋白质浓度测定部与上述糖化蛋白测定部以串联方式进行流体连接。
[0286]
c12
[0287]
根据实施方式c11所述的装置，其中，上述体液的导入单元、上述蛋白质浓度测定
部和上述糖化蛋白测定部按照该顺序以串联方式进行流体连接。
[0288]
c13
[0289]
根据实施方式c01或c02所述的装置，其中，上述蛋白质浓度测定部与上述糖化蛋白测定部彼此并联，并且与上述导入单元连接。
[0290]
c21
[0291]
根据实施方式c01至c13中任一项所述的装置，其中，还具备与上述蛋白质浓度测定部和上述糖化蛋白测定部的下游进行流体连接的废液部(槽)。
[0292]
c31
[0293]
根据实施方式c01至c21中任一项所述的装置，其中，上述光学测定单元具备吸光度计。
[0294]
c41
[0295]
根据实施方式c01至c31中任一项所述的装置，其中，测定上述糖化蛋白浓度的电极单元(传感器)包含酮胺氧化酶和过氧化氢电极。
[0296]
c42
[0297]
根据实施方式c41所述的装置，其中，上述传感器还具备覆盖上述过氧化氢电极的离子交换膜。
[0298]
c43
[0299]
根据实施方式c41或c42所述的装置，其中，还具备测定上述过氧化氢电极中产生的电流的安培计。
[0300]
c51
[0301]
根据实施方式c01至c043中任一项所述的装置，其中，还具备收容上述bcp溶液的显色指示剂溶液槽和收容上述蛋白酶溶液的蛋白酶溶液槽。
[0302]
c52
[0303]
根据实施方式c01至c043中任一项所述的装置，其中，还具备收容上述显色指示剂溶液与上述蛋白酶溶液的混合溶液的处理液槽。
[0304]
c61
[0305]
根据实施方式c01至c52中任一项所述的装置，其中，上述蛋白质为白蛋白。
[0306]
c62
[0307]
根据实施方式c61所述的装置，其中，上述显色指示剂为bcp或bcg。
[0308]
c71
[0309]
根据c01至c62中任一项所述的装置，其中，上述装置为自动分注装置或器件，或者上述装置具备自动分注装置或器件。
[0310]
以上对本发明的若干实施方式和实施例进行了说明，但是这些实施方式和实施例是对本发明进行例示性说明的。例如，上述各实施方式是为了容易理解地说明本发明而详细说明的，可以根据需要追加变更尺寸、构成、材质、电路。需要说明的是，将上述列举的本发明的一个或两个以上特征任意组合而成的实施方式也包含在本发明的范围内。在不脱离本发明的技术思想的范围内，权利要求书包括针对实施方式的多种变形方式。因此，本说明书公开的实施方式和实施例是用于例示而示出的，不应认为是对本发明的范围进行限定。

技术特征：
1.一种评价蛋白质的糖化度的方法，其具备：提供可能含有对象蛋白的溶液的步骤；使所述溶液与显色指示剂接触的步骤；使所述溶液与蛋白酶接触的步骤；使用所述显色指示剂与所述对象蛋白的第一反应求出所述溶液中的所述对象蛋白的浓度的步骤；使用所述蛋白酶与所述对象蛋白的第二反应求出糖化的所述对象蛋白的浓度的步骤；以及基于所述对象蛋白的浓度和所述糖化的所述对象蛋白的浓度求出所述对象蛋白的糖化度的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其中，使所述溶液与蛋白酶接触的步骤包括向使所述溶液与所述显色指示剂接触而生成的显色指示剂混合液中添加所述蛋白酶的步骤。3.根据权利要求1所述的方法，其中，使所述溶液与显色指示剂接触的步骤以及使所述溶液与蛋白酶接触的步骤实质上同时进行。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，对所述显色指示剂与所述对象蛋白的第一反应进行测定的步骤具备测定所述显色指示剂的吸光度的步骤。5.根据权利要求4所述的方法，其中，测定所述显色指示剂的吸收光度的步骤具备测定所述吸光度的时间变化的步骤。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述对象蛋白为白蛋白。7.根据权利要求6所述的方法，其中，使用所述蛋白酶与所述白蛋白的第二反应求出糖化白蛋白的浓度的步骤具备：使所述蛋白酶分解所述白蛋白而生成肽的步骤；使所述生成的肽与酮胺氧化酶反应而生成过氧化氢的步骤；测定所述生成的过氧化氢的浓度的步骤；以及基于所述过氧化氢的浓度求出所述糖化白蛋白的浓度的步骤。8.根据权利要求7所述的方法，其中，测定所述过氧化氢的浓度的步骤使用过氧化氢电极。9.根据权利要求8所述的方法，其中，测定所述过氧化氢的浓度的步骤包括使从离子交换树脂通过的所述过氧化氢与所述过氧化氢电极接触的步骤。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述显色指示剂为ph指示剂。11.根据权利要求6至9中任一项所述的方法，其中，所述显色指示剂为溴甲酚紫(bcp)或溴甲酚绿(bcg)。12.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中，所述显色指示剂为溴甲酚紫(bcp)或溴甲酚绿(bcg)，所述方法还具备如下步骤：在所述第一反应期间，将所述溶液的ph调节到4.5至8.5的
范围；以及在所述第二反应期间，将所述溶液的ph调节到6.0至9.0的范围。13.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，在所述显色指示剂与所述对象蛋白的第一反应以及所述显色指示剂与所述对象蛋白的第二反应同时进行时，将所述溶液的ph调节到适合于所述第一反应和所述第二反应这两者的范围。14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述显色指示剂为溴甲酚紫(bcp)或溴甲酚绿(bcg)，将所述ph调节到7.0至8.5的范围。15.根据权利要求12或14所述的方法，其中，将所述ph调节到7.0至8.5的范围，在所述第一反应时，所述溶液的混合液不含蛋白质变性剂。16.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中，所述显色指示剂为溴甲酚紫(bcp)或溴甲酚绿(bcg)，所述方法还具备如下步骤：在所述第一反应期间，将所述溶液的温度调节到20℃至70℃的范围；以及在所述第二反应期间，将所述溶液的温度调节到25℃至70℃的范围。17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，在所述显色指示剂与所述对象蛋白的第一反应以及所述显色指示剂与所述对象蛋白的第二反应至少部分地同时进行时，将所述溶液的温度调节到适合于所述第一反应和所述第二反应这两者的范围。18.根据权利要求17所述的方法，其中，将所述温度调节到25℃至70℃的范围。19.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中，还具备将所述酮胺氧化酶的温度调节到25℃至75℃的范围的步骤。20.根据权利要求7至19中任一项所述的方法，其中，所述酮胺氧化酶为作用于ε-氨基被糖化的氨基酸或肽的氧化酶(酮胺氧化酶ii组)，测定所述生成的过氧化氢的浓度的步骤具备使用含有果糖基赖氨酸的基准液进行测定的校准的步骤。

技术总结
根据本发明的一个实施方式，提供评价蛋白质的糖化度的方法，其具备：提供可能含有对象蛋白的溶液的步骤；使上述溶液与显色指示剂接触的步骤；使上述溶液与蛋白酶接触的步骤；使用上述显色指示剂与上述对象蛋白的第一反应求出上述溶液中的上述对象蛋白的浓度的步骤；使用上述蛋白酶与上述对象蛋白的第二反应求出糖化的上述对象蛋白的浓度的步骤；以及基于上述对象蛋白的浓度和上述糖化的上述对象蛋白的浓度求出上述对象蛋白的糖化度的步骤。白的浓度求出上述对象蛋白的糖化度的步骤。白的浓度求出上述对象蛋白的糖化度的步骤。


技术研发人员：片山宪和 熊谷阳子 伊藤成史 宫内纪子
受保护的技术使用者：株式会社普欧威盖特
技术研发日：2022.01.21
技术公布日：2023/9/23