经修饰的基孔肯雅病毒和辛德毕斯病毒及其用途的制作方法

1.本公开文本涉及分子病毒学和免疫学领域，并且尤其涉及编码经修饰的病毒基因组和复制子的核酸分子、含有所述核酸分子的药物组合物、以及此类核酸分子和组合物用于在细胞培养物或活体中产生所需产物的用途。还提供了用于引发有需要的受试者的免疫应答的方法，以及用于预防和/或治疗各种健康病症的方法。相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年7月31日提交的美国临时专利申请序列号63/059,777的优先权，将其通过引用以其整体(包括任何附图)并入本文。序列表的并入
3.本技术含有序列表，将其通过引用以其整体特此并入本文。名称为“058462-501001wo_sequence listing_st25.txt”的所附序列表文本文件创建于2021年7月15日，并且为58kb。


背景技术：

4.近年来，已将若干个不同类的动物病毒通过其基因组的同源重组或直接工程化进行基因操纵。dna和rna病毒两者的反向遗传系统的可用性为使用重组病毒(例如，作为疫苗、表达载体、抗肿瘤剂、基因疗法载体和药物递送媒介物)创造了新的前景。
5.例如，许多基于病毒的表达载体已被开发用于在培养的重组细胞中表达异源蛋白。例如，经修饰的病毒载体在宿主细胞中用于基因表达的应用不断扩大。这方面的最新进展包括进一步开发用于产生多亚基蛋白质复合物以及共表达蛋白质修饰酶的技术和系统以改善异源蛋白产生。关于病毒表达载体技术的其他最新进展包括用于控制基因表达、制备病毒载体、体内基因疗法应用以及创建疫苗递送载体的许多先进的基因组工程化应用。
6.然而，据报道，宿主细胞可以形成复杂而强大的机制来检测和抵抗病原体入侵。据进一步报道，病毒、特别是致病性病毒已经与宿主细胞一起进化，以对抗这些细胞对感染和复制的防御。作为感染的结果，许多宿主细胞关闭细胞蛋白质翻译机制，以控制可能传播到其他细胞的子代的病毒复制和/或病毒产生。这种现象通常被称为“先天性免疫应答”。受感染的细胞还向其他细胞局部地和全身地发出危险信号，以建立抗病毒状态并控制感染。尽管这些细胞抗病毒系统有益于宿主细胞，但是它们也可能对旨在表达有益疫苗抗原或治疗剂的自扩增rna(称为复制子)产生负面影响。例如，如果细胞检测到表达有益蛋白的复制子rna并激活其先天免疫防御机制，则这种细胞中有益蛋白的表达可能受到影响，并且复制子的功效可能受到损害。
7.因此，仍然需要用于在基于rna复制子的表达平台中表达目的产物的更有效的方法和系统。


技术实现要素：

8.本公开文本总体上涉及开发免疫治疗剂(如重组核酸构建体和包含其的药物组合
物)以用于预防和管理各种健康病症如增殖性障碍和微生物感染。特别地，如下文更详细描述的，本公开文本的一些实施方案提供了含有编码甲病毒基孔肯雅病毒(chikv)或辛德毕斯病毒(sinv)的经修饰的基因组或复制子的序列的核酸构建体，所述经修饰的基因组或复制子缺乏编码所述病毒的一种或多种结构蛋白的病毒核酸序列的至少一部分。还公开了重组细胞和转基因动物，所述重组细胞和转基因动物已经被工程化以包含本文公开的一种或多种核酸构建体；用于产生目的分子的方法；包含以下中的一种或多种的药物组合物：(a)本公开文本的核酸构建体，(b)本公开文本的多肽，(c)本公开文本的重组细胞。本公开文本的具体方面进一步提供了用于引发有需要的受试者的免疫应答、和/或用于预防和/或治疗各种健康病症(包括增殖性障碍(例如癌症)和慢性感染)的组合物和方法。
9.在本公开文本的一方面，本文提供了核酸构建体，所述核酸构建体包含编码经修饰的基孔肯雅病毒(chikv)基因组或复制子rna的核酸序列，其中所述经修饰的chikv基因组或复制子rna缺乏编码一种或多种病毒结构蛋白的核酸序列的至少一部分。
10.在本公开文本的一方面，本文提供了核酸构建体，所述核酸构建体包含编码经修饰的辛德毕斯病毒(sinv)基因组或复制子rna的核酸序列，其中所述经修饰的sinv基因组或复制子rna缺乏编码一种或多种病毒结构蛋白的核酸序列的至少一部分。
11.本公开文本的核酸构建体的非限制性示例性实施方案可以包含以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述经修饰的病毒基因组或复制子rna缺乏编码一种或多种病毒结构蛋白的核酸序列的很大一部分。在一些实施方案中，所述经修饰的病毒基因组或复制子rna不包含编码病毒结构蛋白的核酸序列。
12.在一些实施方案中，本公开文本的核酸分子进一步包含一个或多个表达盒，其中所述表达盒中的每一个均包含与异源核酸序列可操作连接的启动子。在一些实施方案中，所述表达盒中的至少一个包含与异源核酸序列可操作连接的亚基因组(sg)启动子。在一些实施方案中，所述sg启动子是26s亚基因组启动子。在一些实施方案中，本公开文本的核酸分子进一步包含一个或多个非翻译区(utr)。在一些实施方案中，所述utr中的至少一个是异源utr。
13.在一些实施方案中，所述表达盒中的至少一个包含目的基因(goi)的编码序列。在一些实施方案中，所述goi编码选自以下的多肽：治疗性多肽、预防性多肽、诊断性多肽、营养保健性多肽、工业酶和报告多肽。在一些实施方案中，所述goi编码选自以下的多肽：抗体、抗原、免疫调节剂、酶、信号传导蛋白和细胞因子。在一些实施方案中，所述goi的编码序列被优化以用于以高于参考编码序列的表达水平的水平表达。
14.在一些实施方案中，本公开文本的核酸构建体包含如下核酸序列，所述核酸序列与选自seq id no:1-4的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
15.在一方面，本文提供了重组细胞，所述重组细胞包含如本文公开的核酸构建体。在一些实施方案中，所述重组细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞是动物细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是脊椎动物的动物细胞或无脊椎动物的动物细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是昆虫细胞。在一些实施方案中，所述昆虫细胞是蚊子细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞选自由sv40转化的猴肾cv1细胞(cos-7)、人胚肾细胞(例如，hek 293或hek 293细胞)、幼仓
鼠肾细胞(bhk)、小鼠支持细胞(例如，tm4细胞)、猴肾细胞(cv1)、人宫颈癌细胞(hela)、犬肾细胞(mdck)、水牛大鼠肝细胞(brl 3a)、人肺细胞(w138)、人肝细胞(hep g2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(mmt 060562)、tri细胞、fs4细胞、中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)、非洲绿猴肾细胞(vero细胞)、人a549细胞、人宫颈细胞、人chme5细胞、人per.c6细胞、ns0鼠骨髓瘤细胞、人表皮样喉细胞、人成纤维细胞、人huh-7细胞、人mrc-5细胞、人肌肉细胞、人内皮细胞、人星形胶质细胞、人巨噬细胞、人raw 264.7细胞、小鼠3t3细胞、小鼠l929细胞、小鼠结缔组织细胞、小鼠肌肉细胞和兔肾细胞。在相关方面，还提供了细胞培养物，所述细胞培养物包含至少一种如本文公开的重组细胞和培养基。
16.在另一方面，本文提供了包含如本文所述的核酸构建体的转基因动物。在一些实施方案中，所述转基因动物是脊椎动物或无脊椎动物。在一些实施方案中，所述转基因动物是哺乳动物。在一些实施方案中，所述转基因哺乳动物是非人哺乳动物。在一些实施方案中，所述转基因动物是昆虫。在一些实施方案中，所述转基因昆虫是转基因蚊子。
17.在另一方面，本文提供了用于产生目的多肽(goi)的方法，其中所述方法包括(i)饲养如本文公开的动物，或(ii)将包含如本文公开的核酸构建体的重组细胞在一定条件下培养，在所述条件下所述重组细胞产生由所述goi编码的多肽。
18.在另一方面，本文提供了用于在受试者中产生目的多肽的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用如本文公开的核酸构建体。在一些实施方案中，所述受试者是脊椎动物或无脊椎动物。在一些实施方案中，所述受试者是昆虫。在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物受试者。在一些实施方案中，所述哺乳动物受试者是人受试者。在又另一方面，本文提供了通过本公开文本的方法产生的重组多肽。
19.在又另一方面，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂和：a)本公开文本的核酸构建体；b)本公开文本的重组细胞；和/或c)本公开文本的重组多肽。
20.本公开文本的药物组合物的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，本文提供了组合物，所述组合物包含如本文公开的核酸构建体和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，本文提供了组合物，所述组合物包含如本文公开的重组细胞和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述组合物包含如本文公开的重组多肽和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，本文提供了组合物，所述组合物被配制在脂质体、基于脂质的纳米颗粒(lnp)或聚合物纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述组合物是免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物被配制为疫苗。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物对于受试者是基本上非免疫原性的。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制为佐剂。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于鼻内施用、结节内施用、透皮施用、腹膜内施用、肌内施用、瘤内施用、关节内施用、静脉内施用、皮下施用、阴道内施用、眼内施用、口服施用和直肠施用。
21.在另一方面，本文提供了用于引发有需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含以下的组合物：a)本公开文本的核酸构建体；b)本公开文本的重组细胞；c)本公开文本的重组多肽；和/或d)本公开文本的药物组合物。
22.在又另一方面，本文提供了用于预防和/或治疗有需要的受试者的健康病症的方法，所述方法包括向所述受试者预防性地或治疗性地施用包含以下的组合物：a)本公开文
本的核酸构建体；b)本公开文本的重组细胞；c)本公开文本的重组多肽；和/或d)本公开文本的任一项的药物组合物。
23.本公开文本的方法的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述病症是增殖性障碍或微生物感染。在一些实施方案中，所述受试者患有或被怀疑患有与增殖性障碍或微生物感染相关的病症。在一些实施方案中，所施用的组合物导致所述受试者中干扰素的产生增加。在一些实施方案中，将所述组合物作为单一疗法(单药疗法)单独地或作为第一疗法与至少一种另外的疗法组合地施用于所述受试者。在一些实施方案中，所述至少一种另外的疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法、靶向疗法和手术。
24.在又另一方面，本文提供了用于引发免疫应答、用于预防和/或用于治疗健康病症或微生物感染的试剂盒，所述试剂盒包含：a)本公开文本的核酸构建体；b)本公开文本的重组细胞；c)本公开文本的重组多肽；和/或d)本公开文本的药物组合物。
25.除非从实施方案或方面的上下文中明确或清楚地排除，否则本文所述的每个方面和实施方案都能够一起使用。
26.前述发明内容仅是说明性的，并不旨在以任何方式进行限制。除了本文描述的说明性实施方案和特征之外，根据附图、具体实施方式和权利要求，本公开文本的其他方面、实施方案、目的和特征将变得完全清楚。
附图说明
27.图1是根据本公开文本的一些实施方案的经修饰的甲病毒基因组设计的三个非限制性例子的图形表示，其中已经完全缺失编码原始病毒的病毒结构蛋白的核酸序列。示出了非结构蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4。经修饰的chikv设计的非限制性例子是基于chikv毒株s27的，并且可以进一步含有在26s亚基因组启动子控制下的异源基因(goi)。经修饰的chikv设计的非限制性例子也可以是基于chikv毒株drde-06的，含有衍生自chikv毒株s27的3’utr，并且可以进一步含有在26s亚基因组启动子控制下的异源基因(goi)。经修饰的sinv设计的非限制性例子可以是基于sinv毒株girdwood的，并且可以进一步含有在26s亚基因组启动子控制下的异源基因(goi)。
28.图2a是根据本公开文本的一些实施方案的示例性的基于甲病毒rna复制子的设计prb_008α-vee-lamp-hpv16构建体的图形说明，其中将编码经修饰的veev的序列掺入到还包含示例性目的基因(goi)(例如人乳头瘤病毒(hpv)癌蛋白e6/e7)的编码序列的表达载体中。
29.图2b是根据本公开文本的一些实施方案的示例性的基于甲病毒rna复制子的设计prb_009α-chikv-s27-lamp-hpv16构建体的图形说明，其中将编码经修饰的chikv s27的序列掺入到还包含示例性目的基因(goi)(例如人乳头瘤病毒(hpv)癌蛋白e6/e7)的编码序列的表达载体中。
30.图2c是根据本公开文本的一些实施方案的示例性的基于甲病毒rna复制子的设计prb_017α-chikv-drde-s27-lamp-hpv16构建体的图形说明，其中将编码经修饰的chikv drde的序列掺入到还包含示例性目的基因(goi)(例如人乳头瘤病毒(hpv)癌蛋白e6/e7)的编码序列的表达载体中。
31.图2d是根据本公开文本的一些实施方案的示例性的基于甲病毒rna复制子的设计prb_017α-sind-g-dlp-lamp-hpv16构建体的图形表示，其中将编码经修饰的sinv girdwood基因组的序列掺入到还包含示例性目的基因(goi)(例如人乳头瘤病毒(hpv)癌蛋白e6/e7)的编码序列的表达载体中。
32.图3a是根据本公开文本的一些实施方案的示例性的基于甲病毒rna复制子的设计vee-ha构建体的图形说明，其中将编码经修饰的veev基因组的序列掺入到还包含示例性目的基因(goi)(例如甲型流感病毒h5n1的血凝素前体(ha))的编码序列的表达载体中。
33.图3b是根据本公开文本的一些实施方案的示例性的基于甲病毒rna复制子的设计chikv-s27-ha构建体的图形说明，其中将编码经修饰的chikv s27基因组的序列掺入到还包含示例性目的基因(goi)(例如甲型流感病毒h5n1的血凝素前体(ha))的编码序列的表达载体中。
34.图3c是根据本公开文本的一些实施方案的示例性的基于甲病毒rna复制子的设计chikv-drde-ha构建体的图形说明，其中将编码经修饰的chikv drde基因组的序列掺入到还包含示例性目的基因(goi)(例如甲型流感病毒h5n1的血凝素前体(ha))的编码序列的表达载体中。
35.图3d是根据本公开文本的一些实施方案的示例性的基于甲病毒rna复制子的设计sind-gw-ha构建体的图形说明，其中将编码经修饰的sinv girdwood基因组的序列掺入到还包含示例性目的基因(goi)(例如甲型流感病毒h5n1的血凝素前体(ha))的编码序列的表达载体中。
36.图3e是根据本公开文本的一些实施方案的示例性的基于甲病毒rna复制子的设计vee-肿瘤学构建体的图形说明，其中将编码经修饰的veev基因组的序列掺入到还包含示例性目的基因(goi)的编码序列(例如编码与肿瘤学相关的基因或部分基因(esr1、her2和her3)的合成序列盒)的表达载体中。
37.图3f是根据本公开文本的一些实施方案的示例性的基于甲病毒rna复制子的设计chikv-s27-肿瘤学构建体的图形说明，其中编码经修饰的chikv s27基因组的序列被掺入到还包含示例性目的基因(goi)的编码序列(例如编码与肿瘤学相关的基因或部分基因(esr1、her2和her3)的合成序列盒)的表达载体中。
38.图3g是根据本公开文本的一些实施方案的示例性的基于甲病毒rna复制子的设计chikv-drde-肿瘤学构建体的图形说明，其中编码经修饰的chikv drde基因组的序列被掺入到还包含示例性目的基因(goi)的编码序列(例如编码与肿瘤学相关的基因或部分基因(esr1、her2和her3)的合成序列盒)的表达载体中。
39.图3h是根据本公开文本的一些实施方案的示例性的基于甲病毒rna复制子的设计sind-gw-肿瘤学构建体的图形说明，其中将编码经修饰的sinv girdwood基因组的序列掺入到还包含示例性目的基因(goi)的编码序列(例如编码与肿瘤学相关的基因或部分基因(esr1、her2和her3)的合成序列盒)的表达载体中。
40.图4是说明来自编码红色萤火虫萤光素酶的chikv或sinv衍生的载体的示例性表达的转基因的活性的图，显示出这些载体能够进行rna复制并且随后表达展现出生物学功能的转基因。实施例1和实施例2中所述的载体用于通过ivt制备复制子rna，并且一式两份地转化到bhk-21细胞中。在转染后18-20h，将由转化的细胞产生的红色萤火虫萤光素酶的
酶活性通过萤光素酶测定系统方案(promega)进行定量。rlu：相对光单位。
41.图5a图示地说明了抗原特异性t细胞应答受载体骨架的不同影响(用每种载体引发后的第14天)。在balb/c小鼠中体内施用编码来自h5n1的ha抗原的chikv和sinv衍生的载体产生抗原特异性cd4+和cd8+t细胞以及功能性抗体应答。与vee衍生的载体相比，chikv和sinv衍生的载体在t细胞应答的产生方面可能是有利的或不利的，因此证明了它们作为疫苗或生物治疗剂的载体的效用。几何平均值与几何sd。单因素方差分析。
42.图5b图示地说明了用每种载体免疫接种后的中和抗体应答。在用每种载体引发后(左图)或加强后(右图)第14天测量hai滴度。在balb/c小鼠中体内施用编码来自h5n1的ha抗原的chikv和sinv衍生的载体产生抗原特异性cd4+和cd8+t细胞以及功能性抗体应答。与vee衍生的载体相比，chikv和sinv衍生的载体在t细胞应答的产生方面可能是有利的或不利的，因此证明了它们作为疫苗或生物治疗剂的载体的效用。sfu：斑点形成单位。几何平均值与几何sd。单因素方差分析。
43.图6是说明由一些而不是所有抗原诱导载体依赖性差异性t细胞应答(用每种抗体增强后第14天)的图。在balb/c小鼠中体内施用chikv和sinv衍生的载体(其编码来自esr1和pi3k的激活突变以及截短的her2和激酶失活(kinase-dead)her3蛋白)产生稳健的t细胞应答。应答因编码的单独抗原以及每种载体而异，并且因此与vee衍生的载体相比，在t细胞应答的产生方面处于优势或劣势，这证明了它们作为疫苗或生物治疗剂的载体的效用。几何平均值与几何sd。单因素方差分析。
具体实施方式
44.本文尤其提供了具有优异表达潜力的病毒表达系统，其适于在重组细胞中表达异源分子，例如像疫苗和治疗性多肽。例如，本公开文本的一些实施方案涉及核酸构建体(例如像表达构建体和载体)，所述核酸构建体含有经修饰的基孔肯雅病毒(chikv)或辛德毕斯病毒(sinv)的基因组或复制子rna，其中已经缺失其编码结构蛋白的原始病毒序列中的至少一些。在本公开文本的一些实施方案中还提供了基于病毒的表达载体，所述表达载体包含一个或多个编码异源多肽的表达盒。进一步提供了重组细胞，所述重组细胞经基因工程化以包含本文公开的核酸分子中的一种或多种。衍生自此类重组细胞的生物材料和重组产物也在本技术的范围内。还提供了可用于引发有需要的受试者的免疫应答的组合物和方法，以及用于预防和/或治疗各种健康病症的方法。
45.基于rna病毒(例如甲病毒)的自扩增rna(复制子)可以用作稳健的表达系统。例如，据报道，使用甲病毒(如chikv和sinv)作为病毒表达载体的优势在于，它们可以指导重组宿主细胞中大量异源蛋白的合成。除这些优点外，多肽(如治疗性单链抗体)如果在体内以高水平表达则可以是最有效的。此外，为了产生从培养(离体)的细胞纯化的重组抗体，来自复制子rna的高蛋白表达可以增加抗体产物的总产量。此外，如果所表达的蛋白质是疫苗抗原，则高水平表达可以诱导体内最稳健的免疫应答。
46.甲病毒利用其utr、结构区域和非结构区域中包含的基序来影响其在宿主细胞中的复制。这些区域还包含逃避宿主细胞先天性免疫的机制。然而，据报道甲病毒物种之间存在显著差异。例如，新世界和旧世界甲病毒已经进化出不同的组分以利用细胞内的应激颗粒、jak-stat信号传导、fxr和g3bp蛋白来组装病毒复制复合物。基因组的哪一部分包含这
些组分也在甲病毒之间有所不同。例如，绕过pkr的激活和随后的eif2α磷酸化在一些旧世界甲病毒(例如辛德毕斯)中是经由下游回路完成的，但是人们认为在基孔肯雅(其缺乏可识别的dlp)中绕过此通路是经由nsp4完成的。此外，除了各个甲病毒之间的变异之外，甲病毒毒株内也经常存在差异，这也可以解释诸如毒力等特征的变化。例如，东部马脑炎病毒(eeev)的北美毒株与南美毒株之间的序列变异改变了调节stat1通路的能力，导致i型干扰素的差异性诱导并产生毒力的变化。
47.鉴于在甲病毒的非结构区域和结构区域中宿主细胞减毒因子的差异性存在，使结构基因缺失以允许在合成载体中异源基因表达将对单独载体产生不同的影响。在非结构区域中具有不同宿主衰减因子的合成复制子在诱导对所表达的异源基因的免疫应答方面具有不同的优势。基孔肯雅通过保留在nsp区域中的基序、i型干扰素的稳健激活来绕过pkr激活和随后的eif2α磷酸化的能力，以及利用应激颗粒、jak-stat信号传导和g3bp蛋白的能力使其具有用作疫苗载体的优势。相反，无毒的辛德毕斯girdwood毒株无法抑制stat1，这使其成为表达异源蛋白而不会对所编码的蛋白质形成稳健的免疫应答的有利载体。作为进一步的例子，sinv毒株s.a.ar86(ar86)迅速且稳健地抑制响应于ifn-γ和/或ifn-β的stat1和stat2的酪氨酸磷酸化。ar86 nsp1中位置538处的独特苏氨酸导致相关sinv毒株girdwood的非结构蛋白加工较慢以及亚基因组rna合成延迟(这有助于成年小鼠神经毒力表型)，并且可能有利于异源蛋白表达的动力学和产量，并且有助于对从基于ar86的复制子载体表达的疫苗抗原的更稳健的免疫应答。到目前为止，这些单独的载体赋予的优势一直是未被完全探索和预测的。
48.如下文更详细描述，初步观察到，公开可得的甲病毒基因组数据并不总是提供这样的核苷酸序列，其能够直接替换编码具有目的基因(goi)的结构蛋白的核酸序列，以产生自我复制的rna和转基因表达复制子。例如，发现可以将chikv毒株s27中的结构多蛋白基因(genbank af369024)用合成的hpv e6/e7基因(人乳头瘤病毒e6/e7基因)(参见例如图2b)或甲型流感病毒h5n1的血凝素前体(ha)基因(参见例如图3b)或红色萤火虫萤光素酶基因替换，以产生能够在转染的bhk-21细胞中进行rna复制和转基因表达的复制子，然而，用于类似地替换chikv毒株drde-06中的结构多蛋白基因(genbank ef210157)的基因序列不能进行rna复制或表达转基因。因此，将chikv结构蛋白用使用可用的已公开的序列的异源基因简单替换不一定足以产生功能性复制子。换句话说，需要进一步的工程化(如使用异源5’和/或3’utr序列)以创建适于在疫苗和治疗中使用的复制子系统。
49.值得注意的是，尽管在chikv毒株s27和drde-06的基因组中发现了许多序列的进化差异，但是本文呈现的实验数据表明，可以通过将drde 3’utr用来自chikv毒株s27的3’utr替换来生成功能性chikv毒株drde复制子(参见例如，图2c)。此外，发现本文公开的chikv和sinv复制子平台系统能够表达高水平的目的异源多肽。定义
50.除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他科学术语或用辞旨在具有本技术所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于引用而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的这些定义不必被解释为代表与本领域通常所理解的意义有实质性差异。本文描述或提及的许多技术和程序是本领域技术人员很好理解的并且通常由本领域技术人员使用常规方法加以采用。
51.除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指示物。例如，术语“细胞”包括一个或多个细胞，包括其混合物。本文中使用“a和/或b”来包括所有的以下替代形式：“a”、“b”、“a或b”以及“a和b”。
52.如本文所用，术语“施用(administration)”和“施用(administering)”是指生物活性组合物或配制品通过施用途径的递送，所述施用途径包括但不限于鼻内、透皮、静脉内、动脉内、肌内、结节内、瘤内、关节内、腹膜内、皮下、肌内、口服、直肠、阴道内、眼内和局部施用或其组合。所述术语包括但不限于由医学专业人员进行的施用和自我施用。
53.术语“细胞”、“细胞培养物”和“细胞系”不仅指代特定的主题细胞、细胞培养物或细胞系，而且指代这样的细胞、细胞培养物或细胞系的后代或潜在后代，而不考虑培养中的转移或传代次数。应当理解的是，并非所有后代都与亲代细胞完全相同。这是因为某些修饰可能由于突变(例如，故意或无意的突变)或环境影响(例如，甲基化或其他表观遗传修饰)而在后代中发生，使得后代实际上可能与亲本细胞不同，但是仍被包括在如本文所用的术语的范围内，只要后代保留与原始细胞、细胞培养物或细胞系的功能相同的功能即可。
54.术语本公开文本的组合物(例如，核酸构建体、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物)的“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”通常是指相对于不存在组合物而言足以使组合物实现所述目的(例如，实现其施用的效果，刺激免疫应答，预防或治疗疾病，或者减轻疾病障碍、感染或健康病症的一种或多种症状)的量。“有效量”的例子是足以促成治疗、预防或减轻疾病的一种或多种症状的量，其也可以称为“治疗有效量”。症状的“减轻”意指一种或多种症状的严重程度或频率的降低或者一种或多种症状的消除。组合物的确切量(包括“治疗有效量”)将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见例如，lieberman,pharmaceutical dosage forms(第1-3卷,1992)；lloyd,the art,science and technology of pharmaceutical compounding(1999)；pickar,dosage calculations(1999)；以及remington:the science and practice of pharmacy,第20版,2003,gennaro编辑,lippincott,williams&wilkins)。
55.在提供值范围的情况下，应理解的是除非上下文另外明确规定，否则在该范围的上限值与下限值之间的每个中间值(至下限值的单位的十分之一)以及所陈述的范围内的任何其他所陈述的或中间值都被涵盖在本公开文本内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且也涵盖在本公开文本内，属于陈述的范围内的任何明确排除的界限。在所陈述的范围包括一个或两个限值的情况下，排除那些被包括的限值中的任一个或两个的范围也被包括在本公开文本中。
56.本文给出了某些范围，其数值前面是术语“约”，如本文所用，所述约具有大约的普通含义。术语“约”用于对其后的精确数值以及接近或近似于所述术语后的数值提供文字支持。在确定数字是否接近或近似于具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在呈现它的上下文中提供具体列举的数字的基本等效形式的数字。如果根据上下文原本不清楚近似程度，则“约”意指在提供的值的正负10％以内，或四舍五入到最接近的有效数字，在所有情况下包括所提供的值。
57.术语“构建体”是指包含来自异源的一个或多个分离的核酸序列的重组分子。例如，核酸构建体可以是嵌合核酸分子，其中两个或更多个不同来源的核酸序列被组装成单个核酸分子。因此，代表性核酸构建体包括含有以下的任何构建体：(1)核酸序列，包括未发
现彼此天然邻接的调控序列和编码序列(例如，所述核苷酸序列中的至少一个相对于它的其他核苷酸序列中的至少一个是异源的)，或(2)编码未天然邻接的功能性rna分子或蛋白质的部分的序列，或(3)未天然邻接的启动子的部分。代表性核酸构建体可以包含任何重组核酸分子，其是线性或环状、单链或双链dna或rna核酸分子，衍生自任何来源(如质粒、粘粒、病毒、自主复制的多核苷酸分子、噬菌体)，能够进行基因组整合或自主复制，包含其中一个或多个核酸序列已经可操作连接的核酸分子。本公开文本的构建体可以包含必要的元件以指导表达也包含在构建体中的目的核酸序列。此类元件可以包括控制元件，如可操作连接至(以便引导转录)目的核酸序列的启动子，并且任选地包括多腺苷酸化序列。在本公开文本的一些实施方案中，可以将所述核酸构建体掺入载体内。除了构建体的组分之外，所述载体可以包括例如一个或多个可选择的标记物、一个或多个复制起点(如原核和真核起点)、至少一个多克隆位点、和/或促进构建体稳定整合到细胞基因组中的元件。可以将两个或更多个构建体掺入单个核酸分子(如单个载体)内，或者可以包含在两个或更多个单独的核酸分子(如两个或更多个单独的载体)内。“表达构建体”通常包括可操作连接至目的核苷酸序列的至少一个控制序列。以这种方式，例如，在表达构建体中提供与待表达的核苷酸序列可操作连接的启动子，用于在细胞中表达。对于本公开文本的实施，用于制备和使用构建体和细胞的组合物和方法对于本领域技术人员是已知的。
58.如本文所用，术语“可操作连接”表示两个或更多个元件(例如，多肽序列或多核苷酸序列)之间的物理或功能连接，其允许它们以它们预期的方式操作。例如，当在本文所述的核酸分子或核酸分子中的编码序列和启动子序列的上下文中使用时，术语“可操作连接”意指编码序列和启动子序列是框内的并且在远离的适当空间和距离内，以允许通过转录因子或rna聚合酶的相应结合对转录施加影响。应当理解，可操作连接的元件可以是连续的或非连续的(例如，通过接头彼此连接)。在多肽构建体的上下文中，“可操作连接”是指氨基酸序列(例如，不同区段、部分、区域或结构域)之间的物理连接(例如，直接或间接连接)以提供构建体的所需活性。本文公开的多肽或核酸分子的可操作连接的区段、部分、区域和结构域可以是连续的或非连续的(例如通过接头彼此连接)。
59.如本文所用的术语“部分(portion)”是指一部分(a fraction)。关于其特定结构(如多核苷酸序列或氨基酸序列或蛋白质)的术语“部分”可以表示所述结构的连续或不连续部分。例如，氨基酸序列的一部分包含所述氨基酸序列的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％和至少90％的氨基酸。另外地或可替代地，如果所述部分是不连续部分，则所述不连续部分由结构(例如蛋白质的结构域)的2、3、4、5、6、7、8或更多个部分构成，每个部分都是结构的连续元件。例如，氨基酸序列的不连续部分可以由2、3、4、5、6、7、8或更多个，例如不多于4个部分的所述氨基酸序列构成，其中每个部分包含所述氨基酸序列的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个连续氨基酸、至少10个连续氨基酸、至少20个连续氨基酸、或至少30个连续氨基酸。
60.在提供值范围的情况下，应理解的是除非上下文另外明确规定，否则在该范围的上限值与下限值之间的每个中间值(至下限值的单位的十分之一)以及所陈述的范围内的任何其他所陈述的或中间值都被涵盖在本公开文本内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且也涵盖在本公开文本内，属于陈述的范围内的任何明确排除的界限。在所陈述的范围包括一个或两个限值的情况下，排除那些被包括的限值中的任一个
或两个的范围也被包括在本公开文本中。
61.在两个或更多个核酸或蛋白质的上下文中，如本文所用的术语“同一性百分比”是指两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸(例如，当在比较窗口或指定区域上比较和比对以获得最大对应时，约60％序列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)，如使用采用如下所述的默认参数的blast或blast 2.0序列比较算法或通过手动比对和视觉检查所测量。参见例如，在ncbi.nlm.nih.gov/blast的ncbi网站。然后，此类序列被说成“基本上相同”。此定义也涉及或可以应用于序列的互补体。此定义还包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的那些序列。可以使用已公布的技术和广泛可用的计算机程序来计算序列同一性，所述计算机程序如gcs程序包(devereux等人,nucleic acids res.12:387,1984)、blastp、blastn、fasta(atschul等人,j mol biol215:403,1990)。可以使用序列分析软件采用其默认参数来测量序列同一性，所述序列分析软件如university of wisconsin biotechnology center(大学大道1710号，威斯康星州麦迪逊，53705)的genetics computer group的序列分析软件包。
62.如本文所用的术语“药学上可接受的赋形剂”是指提供用于向受试者施用一种或多种目的化合物的药学上可接受的载体、添加剂或稀释剂的任何合适的物质。因此，“药学上可接受的赋形剂”可以涵盖被称为药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的添加剂和药学上可接受的载体的物质。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括但不限于与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。也可以将补充活性化合物(例如，抗生素和另外的治疗剂)掺入组合物中。
63.如本文所用，“受试者”或“个体”包括动物，如人(例如，人个体)和非人动物。在一些实施方案中，“受试者”或“个体”是在医生的护理下的患者。因此，所述受试者可以是患有、有风险患上或怀疑患有目的健康病症(例如，癌症或感染)和/或健康病症的一种或多种症状的人患者或个体。受试者也可以是在诊断时或之后被诊断为有目的健康病症的风险的个体。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物(例如啮齿动物，例如小鼠，非人灵长类动物)和其他哺乳动物(例如像，绵羊、狗、牛、鸡)以及非哺乳动物(如两栖动物、爬行动物等)。
64.应当理解，本文描述的本公开文本的方面和实施方案包括“包含(comprising)”、“组成为(consisting)”方面和实施方案，以及“基本上由方面和实施方案组成(consisting essentially of)”。如本文所用，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包含性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。如本文所用，“由
……
组成”排除在要求保护的组合物或方法中未指定的任何要素、步骤或成分。如本文所用，“基本上由
……
组成”并不排除不会实质性地影响要求保护的组合物或方法的基本和新颖特征的材料或步骤。术语“包含”在本文中的任何叙述，特别是在组合物的组分的描述中或在方法的步骤的描述中，被理解为涵盖基本上由所列举组分或步骤组成以及由所列举组分或步骤组成的那些组合物和方法。
65.应了解，为明确起见在单独实施方案的上下文中描述的本公开文本的某些特征也可在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的上下文中描述的本公开文本的各种特征也可单独地或以任何合适的子组合提供。属于本公开文本的实施方案的
所有组合都确切地被本公开文本所涵盖并且在本文中公开，如同每一个组合都单独且明确地公开一样。此外，各种实施方案及其要素的所有子组合也确切地涵盖在本公开文本中并且在本文中公开如同每个和每一种这样的子组合均单独地和明确地在本文中公开一样。基孔肯雅病毒(chikv)和辛德毕斯病毒(sinv)
66.基孔肯雅病毒(chikv)和辛德毕斯病毒(sinv)是甲病毒属的成员，所述甲病毒属中包括iv组披膜病毒科(togaviridae)的一组遗传、结构和血清学相关的病毒。目前，甲病毒属包括辛德毕斯病毒(sinv)、塞姆利基森林病毒(sfv)、罗斯河病毒(rrv)、委内瑞拉马脑炎病毒(veev)和东部马脑炎病毒(eeev)，它们都是密切相关的并且能够感染各种脊椎动物(如哺乳动物、啮齿动物、鱼类、鸟类)和大型哺乳动物(如人和马)以及无脊椎动物(如昆虫)。特别地，辛德毕斯和塞姆利基森林病毒已经被广泛研究，并且这些病毒的生命周期、复制模式等都是良好表征的。sinv是西部马脑炎病毒复合物的成员，而chikv是塞姆利基森林病毒复合物的成员并且与罗斯河病毒、阿尼昂尼昂病毒和塞姆利基森林病毒密切相关。特别地，甲病毒已经被证明在动物细胞中非常高效地复制，这使得它们作为在此类细胞中产生蛋白质和核酸的载体很有价值。物种与个体之间的传播主要是经由蚊子进行，从而使甲病毒成为收集虫媒病毒或节肢动物传播病毒的贡献者。
67.这些甲病毒中的每一种都具有正极性的单链rna基因组，所述单链rna基因组被包裹在由含有病毒刺突蛋白的包膜包围的核衣壳中。甲病毒颗粒是包膜的，倾向于球形(尽管略呈多形态的)，并具有等距核衣壳。甲病毒基因组是长度为约11-12kb的正极性的单链rna，包含5’帽、3’聚a尾和两个开放阅读框，其中第一框编码具有酶促功能的非结构蛋白并且第二框编码病毒结构蛋白(例如，衣壳蛋白cp、e1糖蛋白、e2糖蛋白、e3蛋白和6k蛋白)。
68.甲病毒基因组的5'端三分之二编码病毒rna转录和复制所必需的多种非结构蛋白。这些蛋白质直接从rna翻译，并且与细胞蛋白一起形成rna依赖性rna聚合酶，所述酶对于病毒基因组复制和亚基因组rna转录至关重要。四个非结构蛋白(nsp1-4)作为单个多蛋白产生，构成病毒的复制机制。多蛋白的加工以高度调节的方式发生，其中p2/3连接处的切割会影响基因组复制期间rna模板的使用。此位点位于狭窄的裂口的底部并且不易到达。一旦被切割，nsp3就会创建一个环绕nsp2的环形结构。这两种蛋白质具有广泛的界面。产生非细胞致病变病毒或温度敏感表型的nsp2中的突变在p2/p3界面区域聚集。与nsp2非细胞致病变突变的位置相对的p3突变阻止了p2/3的有效切割。这进而会影响rna感染性，从而改变病毒rna产生水平。
69.基因组的3’端三分之一包含亚基因组rna，其用作形成病毒颗粒所需的所有结构蛋白(核心核衣壳蛋白c和作为异二聚体缔合的包膜蛋白p62和e1)的翻译模板。病毒膜锚定的表面糖蛋白负责受体识别并且通过膜融合进入靶细胞。亚基因组rna从存在于编码nsp4蛋白的rna序列3'末端处的p26s亚基因组启动子转录。p62向e2和e3的蛋白水解成熟会导致病毒表面发生变化。e1、e2、和有时e3、糖蛋白“刺突”一起形成e1/e2二聚体或e1/e2/e3三聚体，其中e2从中心延伸到顶点，e1填充顶点之间的空间，以及e3(如果存在)位于刺突的远端。当病毒暴露于内涵体的酸度时，e1与e2解离以形成e1同三聚体，这对于驱动细胞膜与病毒膜一起的融合步骤是必需的。甲病毒糖蛋白e1是ii类病毒融合蛋白，其与流感病毒和hiv中发现的i类融合蛋白在结构上不同。e2糖蛋白通过其胞质结构域与核衣壳相互作用起作用，而其胞外结构域则负责结合细胞受体。大多数甲病毒失去外周蛋白e3，而在塞姆利基病
毒中，它仍然与病毒表面缔合。
70.据报道，甲病毒复制发生在宿主细胞内的膜表面上。在感染周期的第一步中，基因组rna的5'末端被翻译成具有rna聚合酶活性的多蛋白(nsp1-4)，其产生与基因组rna互补的负链。在第二步中，将负链分别用作产生以下两种rna的模板：(1)与通过翻译产生其他nsp蛋白的次级病毒的基因组相对应并且充当病毒基因组的阳性基因组rna；和(2)编码形成感染颗粒的病毒的结构蛋白的亚基因组rna。阳性基因组rna/亚基因组rna比率通过多蛋白与nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的蛋白水解自切割调节。实际上，病毒基因表达分两个阶段进行。在第一阶段，主要合成阳性基因组链和阴性链。在第二阶段期间，亚基因组rna的合成实际上是排他性的，因此导致产生大量的结构蛋白。本公开文本的组合物
71.如下文更详细描述地，本公开文本的一方面涉及包含编码经修饰的病毒基因组或复制子rna的核酸序列的核酸构建体，其中，经修饰的基因组或复制子rna缺乏(例如，不包括)编码相应的未经修饰的病毒基因组或复制子rna的一种或多种结构蛋白的核酸序列的至少一部分。本公开文本的一些实施方案提供了一种经修饰的甲病毒基因组或复制子rna，其中存在非结构蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的编码序列，然而编码一种或多种结构蛋白的序列的至少一部分或整个序列是不存在的。还提供了重组细胞和细胞培养物，所述重组细胞和细胞培养物已经被工程化以包括如本文公开的核酸构建体。a.核酸构建体
72.如下文更详细地描述的，本公开文本的一方面涉及新型核酸构建体，所述核酸构建体包含编码甲病毒(如基孔肯雅病毒(chikv)或辛德毕斯病毒(sinv))的经修饰的基因组或复制子rna的核酸序列。例如，经修饰的甲病毒基因组可以包括在亲本甲病毒基因组的一个或多个基因组区域中的一个或多个缺失、一个或多个取代和/或一个或多个插入。
73.本公开文本的核酸构建体的非限制性示例性实施方案可以包含以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述核酸构建体包含编码经修饰的chikv基因组或复制子rna的核酸序列，其中所述经修饰的chikv基因组或复制子rna缺乏编码未经修饰的chikv基因组或复制子rna的一种或多种结构蛋白的核酸序列的至少一部分，例如所述经修饰的chikv基因组或复制子rna不包含chikv结构蛋白cp、e1、e2、e3和6k中的一种或多种的编码序列的至少一部分。强毒和无毒chikv毒株都是合适的。适用于本公开文本的组合物和方法的chikv毒株的非限制性例子包括chikv s27、chikv lr2006-opy-1、chikv yo123223、chikv drde、chikv 37997、chikv 99653、chikv ag41855和nagpur(印度)653496毒株。适用于本公开文本的组合物和方法的chikv毒株的另外的例子包括但不限于描述于afreen等人microbiol.immunol.2014,58:688-696，lanciotti和lambert astmh 2016,94(4):800-803以及langsjoen等人mbio.2018,9(2):e02449-17中的那些。在一些实施方案中，所述经修饰的chikv基因组或复制子rna衍生自chikv毒株s27株。在一些实施方案中，所述经修饰的chikv基因组或复制子rna衍生自chikv毒株drde。在一些实施方案中，所述经修饰的chikv基因组或复制子rna衍生自chikv毒株drde-06。在一些实施方案中，所述经修饰的chikv基因组或复制子rna衍生自chikv毒株drde-07。
74.在一些实施方案中，所述核酸构建体包含编码经修饰的sinv基因组或复制子rna的核酸序列，其中所述经修饰的sinv基因组或复制子rna缺乏编码未经修饰的sinv基因组
或复制子rna的一种或多种结构蛋白的核酸序列的至少一部分，例如所述经修饰的chikv基因组或复制子rna不包含sinv结构蛋白cp、e1、e2、e3和6k中的一种或多种的编码序列的至少一部分。强毒和无毒的sinv毒株都是合适的。适用于本公开文本的组合物和方法的sinv毒株的非限制性例子包括sinv毒株ar339和girdwood。适用于本公开文本的组合物和方法的sinv毒株的另外的例子包括但不限于描述于sammels等人j.gen.virol.1999,80(3):739-748，和pfeffer vector borne zoonotic dis.2010,10(9):889-907，sigei等人arch.of virol.2018,163:2465-2469以及ling等人j.virol.2019,93:e00620-19中的那些。在一些实施方案中，所述经修饰的sinv基因组或复制子rna衍生自sinv毒株girdwood。在一些实施方案中，所述经修饰的sinv基因组或复制子rna衍生自sinv毒株ar86。
75.本公开文本的核酸构建体的非限制性示例性实施方案可以包含以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述经修饰的病毒基因组或复制子rna缺乏编码所述未经修饰的病毒基因组或复制子rna的病毒结构蛋白cp、e1、e2、e3和6k中的一种或多种的核酸序列的至少一部分。在一些实施方案中，所述经修饰的病毒基因组或复制子rna缺乏编码cp的序列的一部分或整个序列。在一些实施方案中，所述经修饰的病毒基因组或复制子rna缺乏编码e1的序列的一部分或整个序列。在一些实施方案中，所述经修饰的病毒基因组或复制子rna缺乏编码e2的序列的一部分或整个序列。在一些实施方案中，所述经修饰的病毒基因组或复制子rna缺乏编码e3的序列的一部分或整个序列。在一些实施方案中，所述经修饰的病毒基因组或复制子rna缺乏编码6k的序列的一部分或整个序列。在一些实施方案中，所述经修饰的病毒基因组或复制子rna缺乏编码cp、e1、e2、e3和6k的组合的序列的一部分或整个序列。本公开文本的一些实施方案提供了一种经修饰的chikv基因组或复制子rna，其中存在未经修饰的chikv基因组或复制子rna的非结构蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的编码序列，然而编码chikv基因组或复制子rna的一种或多种结构蛋白(例如，cp、e1、e2、e3和6k)的序列的至少一部分或整个序列是不存在的。本公开文本的一些实施方案提供了一种经修饰的sinv基因组或复制子rna，其中存在未经修饰的sinv基因组或复制子rna的非结构蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的编码序列，然而编码sinv基因组或复制子rna的一种或多种结构蛋白(例如，cp、e1、e2、e3和6k)的序列的至少一部分或整个序列是不存在的。
76.在一些实施方案中，所述经修饰的病毒基因组或复制子rna缺乏编码一种或多种病毒结构蛋白的核酸序列的很大一部分。熟练技术人员将理解，编码病毒结构多肽的核酸序列的大部分可以包含编码病毒结构多肽的足够的核酸序列，以提供该多肽的推定鉴定，抑或通过本领域技术人员对序列的手动评价，抑或通过使用诸如blast之类的算法的计算机自动序列比较和鉴定(参见例如，“basic local alignment search tool”；altschul sf等人,j.mol.biol.215:403-410,1993)。因此，核苷酸序列的大部分包含足够的序列以提供包含所述序列的核酸片段的特异性鉴定和/或分离。例如，核酸序列的主要部分可以包含全长核酸序列的至少约20％，例如约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％。如上文所述，本公开文本提供了核酸分子和构建体，所述核酸分子和构建体缺乏编码一种或多种病毒结构蛋白的部分或完整的核酸序列。熟练技术人员，受益于如本文公开的序列，可以容易地将所公开的序列的全部或大部分用于本公开文本的组合物和方法。因此，本技术包括如本文公开的完整序列，例如在随附序列表中示出的那些序列，以及如上文
所定义的那些序列的大部分。
77.在一些实施方案中，所述经修饰的病毒基因组或复制子rna缺乏编码病毒结构蛋白的整个序列，例如，所述经修饰的病毒基因组或复制子rna不包含编码病毒未经修饰的基因组或复制子rna的结构蛋白的核酸序列。
78.在一些实施方案中，本公开文本的核酸构建体进一步包含一个或多个表达盒。原则上，本文公开的核酸构建体通常可以包含任何数量的表达盒。在一些实施方案中，本文公开的核酸构建体可以包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个表达盒。熟练技术人员将理解，术语“表达盒”是指遗传物质的构建体，其含有编码序列和足够的调节信息以引导编码序列在体内和/或离体的细胞中恰当转录和/或翻译。可以将所述表达盒插入用于靶向期望的宿主细胞的载体中和/或受试者中。因此，在一些实施方案中，术语表达盒可以与术语“表达构建体”互换使用。在一些实施方案中，术语“表达盒”是指这样的核酸构建体，其包含与调节元件(例如像，启动子和/或终止信号，并且任选地，影响基因转录或翻译的任何其他核酸序列或其他核酸序列的组合)可操作连接的编码蛋白质的基因或功能rna。
79.在一些实施方案中，所述表达盒中的至少一个包含与异源核酸序列可操作连接的启动子。因此，发现如本文提供的核酸构建体可以用作例如表达载体，当表达载体包含与异源核酸序列可操作连接的调节元件(例如启动子)时，所述表达载体可以影响所述异源核酸序列的表达。在一些实施方案中，所述表达盒中的至少一个包含与异源核酸序列可操作连接的亚基因组(sg)启动子。在一些实施方案中，所述sg启动子是26s亚基因组启动子。在一些实施方案中，本公开文本的核酸分子进一步包含一个或多个非翻译区(utr)。在一些实施方案中，所述utr中的至少一个是异源utr。在一些实施方案中，异源utr中的至少一个包含与seq id no:5的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，异源utr中的至少一个包含与seq id no:6的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
80.在一些实施方案中，所述表达盒中的至少一个包含目的基因(goi)的编码序列。在一些实施例中，goi的编码序列被优化以用于所需特性。例如，在一些实施方案中，所述goi的编码序列被优化以用于以高于参考编码序列的表达水平的水平表达。关于核苷酸序列的序列优化，遗传密码的简并性提供了将编码蛋白质的基因序列的至少一个碱基用不同的碱基取代而不会导致由所述基因产生的多肽的氨基酸序列被改变的可能性。因此，本公开文本的核酸构建体还可以具有根据遗传密码的简并性通过取代从本文公开的任何多核苷酸序列改变的任何碱基序列。易于公开获得描述密码子使用的参考文献。在一些实施方案中，可以出于多种原因产生多核苷酸序列变体，例如以优化特定宿主的表达(例如，将甲病毒mrna中的密码子使用改变为其他生物体(例如人、非人灵长类动物、仓鼠、小鼠或猴)优选的那些)。因此，在一些实施方案中，所述goi的编码序列被优化以用于通过使用经优化用于表达的密码子而在靶宿主细胞中表达。用于使用最佳用于宿主细胞表达的优选的密码子构建编码goi的合成核酸序列的技术可以通过本领域熟知的技术通过分析编码宿主细胞基因组的天然蛋白质的密码子使用的简并性及其相对丰度的计算方法来确定。密码子使用数据库(http://www.kazusa.or.jp/codon)可用于生成哺乳动物细胞环境中的密码子优化的序
列。此外，各种软件工具可用于将一种生物体的序列转换为用于不同宿主生物体的最佳密码子，如jcat密码子优化工具(www.jcat.de)、集成dna技术(idt)密码子优化工具(https://www.idtdna.com/codonopt)或优化器在线密码子优化工具(http://genomes.urv.es/optimizer)。这种合成序列可以通过本领域已知的用于构建合成核酸分子的技术来构建，并且可以从各种商业供应商获得。
81.在一些实施方案中，goi的编码序列被优化以用于增强rna稳定性和/或表达。rna的稳定性通常与rna的“半衰期”相关。“半衰期”涉及消除分子活性、数量或数量的一半所需的时间。在本公开文本的上下文中，rna的半衰期指示所述rna的稳定性。rna的半衰期可能会影响rna的“表达持续时间”。关于用于增强rna稳定性的规则、策略和方法的另外的信息可以在例如leppek k.等人,combinatorial optimization of mrna structure,stability,and translation for rna-based therapeutics.biorxiv.(preprint).2021年3月30日.doi:10.1101/2021.03.29.437587中找到。
82.由goi编码的多肽通常可以是任何多肽，并且可以是例如治疗性多肽、预防性多肽、诊断性多肽、营养保健性多肽、工业酶和报告多肽。在一些实施方案中，所述goi编码选自以下的多肽：抗体、抗原、免疫调节剂、酶、信号传导蛋白和细胞因子。
83.在一些实施方案中，本公开文本的核酸构建体包含与选自seq id no:1-4的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的编码经修饰的chikv或经修饰的sinv的核酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的核酸构建体包含与seq id no:1的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的编码经修饰的chikv或经修饰的sinv的核酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的核酸构建体包含与seq id no:2的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的编码经修饰的chikv或经修饰的sinv的核酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的核酸构建体包含与seq id no:3的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的编码经修饰的chikv或经修饰的sinv的核酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的核酸构建体包含与seq id no:4的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的编码经修饰的chikv或经修饰的sinv的核酸序列。
84.与目的经修饰的chikv或经修饰的sinv的序列具有高度序列同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的核酸序列可以通过使用本文鉴定的序列(例如，seq id no:1-4)或本领域已知的任何其他序列，通过用来自各自chikv或sinv基因组中鉴定的序列的简并引物或基因特异性引物的基因组序列分析、杂交和/或pcr进行鉴定和/或分离。b.重组细胞
85.可以将本公开文本的核酸构建体引入宿主细胞中以产生含有所述核酸分子的重组细胞。因此，含有编码如本文所述的经修饰的chikv或sinv基因组的核酸构建体的原核细胞或真核细胞也是本公开文本的特征。在相关方面，本文公开的一些实施方案涉及转化细胞的方法，所述方法包括将如本文提供的核酸构建体引入宿主细胞(如动物细胞)中，然后
选择或筛选转化的细胞。将本公开文本的核酸构建体引入细胞可以通过本领域技术人员已知的方法进行，所述方法例如像病毒感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质体转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(pei)介导的转染、deae-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、直接显微注射、纳米颗粒介导的核酸递送等。
86.在一方面，本公开文本的一些实施方案涉及重组细胞，例如，包含本文所述的核酸构建体的重组动物细胞。例如，核酸构建体可以稳定地整合到宿主基因组中、或者可以以附加体复制、或者作为微环表达载体存在于重组宿主细胞中以用于稳定或瞬时表达。因此，在本文公开的一些实施方案中，将所述核酸构建体在重组宿主细胞中作为附加体单元维持和复制。在一些实施方案中，将所述核酸构建体稳定地整合到所述重组细胞的基因组中。稳定整合可以使用经典随机基因组重组技术或更精确的基因组编辑技术(如使用指导rna引导的crispr/cas9、或talen基因组编辑)完成。在一些实施方案中，核酸分子作为微环表达载体存在于重组宿主细胞中以用于稳定或瞬时表达。
87.在一些实施方案中，所述重组细胞是原核细胞(如细菌大肠杆菌(e.coli))或真核宿细胞(如昆虫细胞(例如，蚊子细胞或sf21细胞)或哺乳动物细胞(例如，cos细胞、nih 3t3细胞或hela细胞))。在一些实施方案中，所述细胞是体内的，例如，活体中的重组细胞，例如转基因受试者的细胞。在一些实施方案中，所述受试者是脊椎动物或无脊椎动物。在一些实施方案中，所述受试者是昆虫。在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物受试者。在一些实施方案中，所述哺乳动物受试者是人受试者。在一些实施方案中，所述细胞是离体的。在一些实施方案中，所述细胞在体外。在一些实施方案中，所述重组细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞是动物细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是脊椎动物的动物细胞或无脊椎动物的动物细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞选自由sv40转化的猴肾cv1细胞(cos-7)、人胚胎细胞(例如，hek 293或hek 293细胞)、幼仓鼠肾细胞(bhk)、小鼠支持细胞(例如，tm4细胞)、猴肾细胞(cv1)、人宫颈癌细胞(hela)、犬肾细胞(mdck)、水牛大鼠肝细胞(brl 3a)、人肺细胞(w138)、人肝细胞(hep g2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(mmt 060562)、tri细胞、fs4细胞、中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)、非洲绿猴肾细胞(vero细胞)、人a549细胞、人宫颈细胞、人chme5细胞、人per.c6细胞、ns0鼠骨髓瘤细胞、人表皮样喉细胞、人成纤维细胞、人huh-7细胞、人mrc-5细胞、人肌肉细胞、人内皮细胞、人星形胶质细胞、人巨噬细胞、人raw 264.7细胞、小鼠3t3细胞、小鼠l929细胞、小鼠结缔组织细胞、小鼠肌肉细胞和兔肾细胞。
88.在一些实施方案中，所述重组细胞是昆虫细胞，例如，昆虫细胞系的细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞是sf21细胞。另外的合适的昆虫细胞系包括但不限于，从昆虫目双翅目(diptera)、鳞翅目(lepidoptera)和半翅目(hemiptera)建立的细胞系，并且可以源自不同的组织来源。在一些实施方案中，所述重组细胞是鳞翅目细胞系的细胞。在过去的几十年中，所述鳞翅目昆虫细胞系的可用性以每十年约50个系增加。关于可用的鳞翅目昆虫细胞系的更多信息可以在例如lynn d.e.,available lepidopteran insect cell lines.methods mol biol.2007；388:117-38中找到，将其通过引用并入本文。在一些实施方案中，所述重组细胞是蚊子细胞，按蚊属(anopheles，an.)、库蚊属(culex，cx.)和伊蚊属(aedes)(埃及伊蚊(stegomyia))(ae.)内的蚊子物种的细胞。适用于本文所述的组合物和方法的示例性蚊子细胞系包括来自以下蚊子物种的细胞系：埃及伊蚊(aedes aegypti)、白
纹伊蚊(aedes albopictus)、伪盾纹伊蚊(aedes pseudoscutellaris)、三序伊蚊(aedes triseriatus)、刺扰伊蚊(aedes vexans)、冈比亚按蚊(anopheles gambiae)、斯氏按蚊(anopheles stephensi)、白魔按蚊(anopheles albimanus)、致倦库蚊(culex quinquefasciatus)、泰氏库蚊(culex theileri)、三带喙库蚊(culex tritaeniorhynchus)、二带喙库蚊(culex bitaeniorhynchus)和安邦巨蚊(toxorhynchites amboinensis)。合适的蚊子细胞系包括但不限于ccl-125、aag-2、rml-12、c6/26、c6/36、c7-10、ap-61、a.t.grip-1、a.t.grip-2、um-ave1、mos.55、sua1b、4a-3b、mos.43、msq43和lsb-aa695bb。在一些实施方案中，所述蚊子细胞是c6/26细胞系的细胞。
89.在另一个方面，本文提供了包括至少一种如本文公开的重组细胞和培养基的细胞培养物。通常，培养基可以是用于培养本文所述的细胞的任何合适的培养基。用于转化各种各样的上文提到的宿主细胞和物种的技术是本领域已知的并且描述于技术和科学文献中。因此，包括至少一种如本文公开的重组细胞的细胞培养物也在本技术的范围内。适合于产生和维持细胞培养物的方法和系统是本领域已知的。c.转基因动物
90.在另一方面，还提供了包括如本文所述的核酸构建体的转基因动物。在一些实施方案中，所述转基因动物是脊椎动物或无脊椎动物。在一些实施方案中，所述转基因动物是昆虫。在一些实施方案中，所述昆虫是蚊子。在一些实施方案中，所述转基因动物是哺乳动物。在一些实施方案中，所述转基因哺乳动物是非人哺乳动物。在一些实施方案中，所述转基因动物产生如本文所述的目的蛋白。
91.使用本领域已知的用于将外源核酸引入非人动物的基因组中的标准方法来制备本公开文本的转基因非人宿主动物。在一些实施方案中，本公开文本的非人动物是非人灵长类动物。适用于本公开文本的组合物和方法的其他动物物种包括这样的动物，其(i)适用于转基因作用，并且(ii)能够将免疫球蛋白基因区段重排以产生抗体应答。此类物种的例子包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、鸡、山羊、猪、绵羊和牛。用于制备转基因非人动物的方式和方法是本领域已知的。示例性方法包括原核显微注射、dna显微注射、慢病毒载体介导的将dna转移至早期胚胎中和精子介导的转基因作用、腺病毒介导的将dna引入动物精子中(例如，在猪中)、逆转录病毒载体(例如，鸟类物种)、体细胞核转移(例如，在山羊中)。转基因家畜农场动物的制备中的最新技术水平综述于niemann,h.等人(2005)rev.sci.tech.24:285-298中。
92.在本公开文本的一些实施方案中，所述转基因动物是脊椎动物或无脊椎动物。在一些实施方案中，所述动物是昆虫。在一些实施方案中，所述昆虫是蚊子。在一些实施方案中，动物是哺乳动物受试者。在一些实施方案中，哺乳动物是非人动物。在一些实施方案中，哺乳动物是非人灵长类动物。在一些实施方案中，本公开文本的转基因动物可以使用经典随机基因组重组技术或者用更精确的技术来制备，所述更精确的技术如指导rna引导的crispr/cas基因组编辑，或采用ngago(格氏嗜盐碱杆菌(natronobacterium gregoryi)阿尔古蛋白)的dna指导的核酸内切酶基因组编辑，或talen基因组编辑(转录激活因子样效应物核酸酶)。在一些实施方案中，本公开文本的转基因动物可以使用转基因显微注射技术来制备，并且不需要使用同源重组技术，因此被认为比使用同源重组的方法更易于制备和选择。在另一方面，本文提供了用于产生目的多肽的方法，其中所述方法包括(i)饲养如本文
公开的动物，或(ii)将包含如本文公开的核酸构建体的重组细胞在一定条件下培养，其中所述转基因动物或所述重组细胞产生由所述goi编码的多肽。
93.在另一方面，本文提供了用于产生目的多肽的方法，其中所述方法包括(i)饲养如本文公开的动物，或(ii)将包含如本文公开的核酸构建体的重组细胞在一定条件下培养，其中所述转基因动物或所述重组细胞产生由所述goi编码的多肽。在另一方面，本文提供了用于在受试者中产生目的多肽的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用如本文公开的核酸构建体。在一些实施方案中，所述受试者是脊椎动物或无脊椎动物。在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物受试者。在一些实施方案中，所述哺乳动物受试者是人受试者。因此，通过本文公开的方法产生的重组多肽也在本公开文本的范围内。
94.所公开的用于产生重组多肽的方法的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，用于产生本公开文本的重组多肽的方法进一步包括分离和/或纯化所产生的多肽。在一些实施方案中，用于产生本公开文本的多肽的方法进一步包括在结构上修饰所产生的多肽以延长半衰期。d.药物组合物
95.可以将本公开文本的核酸构建体、重组细胞、重组多肽掺入组合物(包括药物组合物)中。此类组合物通常包括核酸构建体、重组细胞、本文所述和提供的重组多肽中的一种或多种以及药学上可接受的赋形剂例如载体。在一些实施方案中，本公开文本的组合物被配制用于预防、治疗或管理健康病症，如免疫性疾病或微生物感染。例如，本公开文本的组合物可以被配制为包含药学上可接受的赋形剂的预防性组合物、治疗性组合物或药物组合物或其混合物。在一些实施方案中，本公开文本的组合物被配制用作疫苗。在一些实施方案中，本技术的组合物被配制用作佐剂。
96.因此，在一方面，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂和：a)本公开文本的核酸构建体；b)本公开文本的重组细胞；和/或c)本公开文本的重组多肽。
97.本公开文本的药物组合物的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，本文提供了组合物，所述组合物包含如本文公开的核酸构建体和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，本文提供了组合物，所述组合物包含如本文公开的重组细胞和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述组合物包含如本文公开的重组多肽和药学上可接受的赋形剂。
98.在一些实施方案中，本公开文本的组合物被配制在脂质体中。在一些实施方案中，本公开文本的组合物被配制在基于脂质的纳米颗粒(lnp)中。在一些实施方案中，本公开文本的组合物被配制在聚合物纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述组合物是免疫原性组合物，例如，可以刺激受试者的免疫应答的组合物。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物被配制为疫苗。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制为佐剂。
99.在一些实施方案中，所述免疫原性组合物对受试者基本上是非免疫原性的，例如最小地刺激受试者的免疫应答的组合物。在一些实施方案中，所述非免疫原性或最小免疫原性组合物被配制为生物治疗剂。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于鼻内施用、透皮施用、腹膜内施用、肌内施用、结节内施用、瘤内施用、关节内施用、静脉内施用、皮下施用、阴道内施用、眼内施用、直肠施用和口服施用中的一种或多种。
100.适用于注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液或分散体，以及用于无菌可注射溶液或分散体的临时制备的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophor el
tm
(basf，新泽西州帕西帕尼)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。在这些情况下，所述组合物应是无菌的并且应是易于注射的程度的流体。它可以在制造和储存的条件下稳定，并且可以抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而被保存。所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可以通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散体的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠)来维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，组合物中通常将包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)和/或氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以实现可注射组合物的延长吸收。
101.无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性化合物以所需量掺入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，然后过滤灭菌。通常，通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。
102.在一些实施方案中，所述组合物被配制用于鼻内施用、透皮施用、肌内施用、结节内施用、瘤内施用、关节内施用、静脉内施用、腹膜内施用、口服施用、阴道内施用、眼内施用、直肠施用或颅内施用中的一种或多种。在一些实施方案中，所施用的组合物导致所述受试者中干扰素的产生增加。本公开文本的方法
103.本文所述的治疗性组合物中的任一种(例如核酸构建体、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物)的施用可用于治疗相关健康病症，如增殖性障碍(例如癌症)和慢性感染(例如病毒感染)。在一些实施方案中，可以将如本文所述的核酸构建体、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物掺入到治疗剂中以用于治疗患有、怀疑患有或者可能有高风险患上一种或多种相关健康病症或疾病的个体的方法中。示例性健康病症或疾病可以包括但不限于癌症、免疫性疾病、基因疗法、基因替代、心血管疾病、年龄相关病理学、急性感染和慢性感染。在一些实施方案中，所述个体是在医生照料下的患者。
104.因此，在一方面，本文提供了用于引发有需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含以下的组合物：a)本公开文本的核酸构建体；b)本公开文本的重组细胞；c)本公开文本的重组多肽；和/或d)本公开文本的药物组合物。
105.在另一方面，本文提供了用于预防和/或治疗有需要的受试者的健康病症的方法，所述方法包括向所述受试者预防性或治疗性地施用包含以下的组合物：a)本公开文本的核酸构建体；b)本公开文本的重组细胞；c)本公开文本的重组多肽；和/或d)本公开文本的任一项的药物组合物。
106.在一些实施方案中，所述健康病症是增殖性障碍或微生物感染。在一些实施方案中，所述受试者患有或被怀疑患有与增殖性障碍或微生物感染相关的病症。
107.在一些实施方案中，所公开的组合物被配制为与其预期的施用途径相容。例如，本公开文本的核酸构建体、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物可以口服或通过吸入给予，
但更可能的是，它们将通过肠胃外途径施用。肠胃外施用途径的例子包括例如，静脉内、结节内、皮内、皮下、透皮(局部)、经粘膜、阴道内、眼内和直肠施用。用于肠胃外应用的溶液或悬浮液可以包含以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸(edta)；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调节张力的药剂(如氯化钠或右旋糖)。可以用酸或碱(如磷酸二氢钠和/或磷酸二钠、盐酸或氢氧化钠)来调节ph(例如，调节至约7.2-7.8，例如7.5的ph)。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
108.可以在细胞培养物或实验动物中通过例如用于确定ld50(对50％群体致死的剂量)和ed
50
(在50％的群体中治疗有效的剂量)的标准药物程序来确定本公开文本的此类主题核酸构建体、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物的剂量、毒性和治疗功效。毒性效应与治疗效果之间的剂量比率是治疗指数，并且其可以被表示为比率ld
50
/ed
50
。展现高治疗指数的化合物通常是合适的。尽管可以使用展现出毒副作用的化合物，但是应谨慎设计将此类化合物靶向至患病组织部位的递送系统，以最小化对未感染细胞的潜在损伤，从而减少副作用。
109.例如，从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制用于人的剂量范围。此类化合物的剂量通常处于包括ed
50
而具有很小或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可取决于所采用的剂型和所利用的施用途径而在这个范围内变化。对于在本公开文本的方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以首先根据细胞培养测定估计。可以在动物模型中配制剂量以实现循环血浆浓度范围，包括如在细胞培养中测定的ic
50
(例如，实现对症状的半最大抑制的测试化合物浓度)。这样的信息可以用于更准确地确定在人中的有用剂量。可以例如通过高效液相色谱测量血浆中的水平。
110.可以每天施用一次或多次至每周施用一次或多次；包括每隔一天施用一次本文所述的治疗组合物，例如核酸构建体、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物。本领域技术人员将理解，某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量和时程，这些因素包括但不限于，疾病的严重性、先前的治疗、受试者的一般健康病症和/或年龄、以及存在的其他疾病。此外，使用治疗有效量的本公开文本的主题多价多肽和多价抗体治疗受试者可以包括单一治疗，或者可以包括一系列治疗。在一些实施方案中，将组合物每8小时施用持续五天，随后是2至14天(例如9天)的休息时间，然后另外五天每8小时施用。关于核酸构建体和重组多肽，本公开文本的核酸构建体或重组多肽的治疗有效量(例如有效剂量)取决于所选择的核酸构建体或重组多肽。例如，可以施用约0.001至0.1mg/kg患者体重范围内的单一剂量量。在一些实施方案中，可以施用约0.005、0.01、0.05mg/kg。在一些实施方案中，可以施用约0.03μg至300μg/kg患者体重范围内的单一剂量量。在一些实施方案中，可以施用约0.3mg至3mg/kg患者体重范围内的单一剂量量。
111.如上文所讨论的，治疗有效量包括治疗性组合物当施用于受试者时足以促进特定作用的量，所述受试者是如患有、怀疑患有或有风险患上健康病症(例如，疾病或感染)的受试者。在一些实施方案中，有效量包括足以预防或延迟疾病或感染的症状的发展、改变疾病或感染的症状的进程(例如但不限于，减缓疾病或感染的症状的进展)或逆转疾病或感染的症状的量。应理解，对于任何给定的病例，本领域普通技术人员使用常规实验可以确定适当
的有效量。
112.包括所公开组合物的用于治疗疾病或感染的治疗的功效可以通过熟练的临床医生确定。然而，如果疾病的至少任何一种或全部体征或症状得到改善或改进，则治疗被认为是有效的治疗。还可以通过如住院治疗或对医疗干预的需要(例如，疾病或感染进展停止或至少减缓)所评估的个体恶化的失败来测量功效。测量这些指示物的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中描述。治疗包括对受试者或动物的疾病或感染的任何治疗(一些非限制性例子包括人或哺乳动物)并且包括：(1)抑制疾病或感染，例如，停止或减缓症状的进展；或(2)缓解疾病或感染，例如，导致症状消退；以及(3)预防或减少症状发展的可能性。
113.在一些实施方案中，可以将本公开文本的核酸构建体、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物以具有药学上可接受的载体的组合物并且以有效刺激免疫应答的量施用于受试者。总体上，受试者可以通过最初的一系列注射(或通过下文所述的其他途径之一施用)进行免疫，并且随后给予增强剂以增加最初的一系列施用所提供的保护。以刺激受试者的免疫应答所必需的剂量和并且经刺激受试者的免疫应答所必需的时间段施用初始系列的注射和随后的增强剂。在一些实施方案中，所施用的组合物导致所述受试者中干扰素的产生增加。在所公开的方法的一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。
114.如上所述，适用于注射使用的药学上可接受的载体包括无菌水溶液(水溶性的)或分散体，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在这些情况下，组合物必须是无菌的并且应当是易于注射的程度的流体。所述组合物在制造和储存条件下必须也是稳定的并且必须抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物以及植物油。例如通过使用包衣(如卵磷脂)，在分散液的情况下通过维持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。
115.无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将核酸构建体、重组细胞和/或重组多肽以所需量根据需要掺入到具有上文所列举的成分中的一种或组合的适当溶剂中，随后过滤灭菌。
116.当如上所述的核酸构建体、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物被适当保护时，它们可以例如用惰性稀释剂或可同化的可食用载体口服施用。也可以将核酸构建体、重组细胞、重组多肽、和/或药物组合物和其它成分封装在硬或软壳明胶胶囊中、压缩成片剂、或直接掺入个体的饮食中。对于口服治疗施用，所述活性化合物可以与赋形剂合并并且以可摄入片剂、口含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。
117.在一些实施方案中，本公开文本的核酸构建体和重组多肽可以通过基于脂质的纳米颗粒(lnp)递送至细胞或受试者。lnp的免疫原性通常低于病毒颗粒。尽管许多人对病毒颗粒具有预先存在的免疫力，但是对lnp却没有预先存在的免疫力。此外，不太可能发生针对lnp的适应性免疫应答，因此可以重复给药lnp。
118.已经开发出几种不同的可电离阳离子脂质用于lnp。这些尤其包括c12-200、mc3、ln16和md1。例如，在一种类型的lnp中，galnac部分附接至lnp的外部，并且充当配体，以经
由脱唾液酸糖蛋白(asialyloglycoprotein)受体吸收到肝脏中。这些阳离子脂质中的任一种可用于配制lnp以将本公开文本的核酸构建体和重组多肽递送至肝脏。
119.在一些实施方案中，lnp是指直径小于1000nm、500nm、250nm、200nm、150nm、100nm、75nm、50nm或25nm的任何颗粒。可替代地，纳米颗粒的尺寸可以在1-1000nm、1-500nm、1-250nm、25-200nm、25-100nm、35-75nm或25-60nm的范围内。
120.lnp可以由阳离子、阴离子或中性脂质制成。中性脂质(如促融合磷脂dope或膜组分胆固醇)可以作为“辅助脂质”被包含在lnp中以增强转染活性和纳米颗粒稳定性。阳离子脂质的局限性包括由于稳定性差和快速清除而导致的低功效，以及产生炎性应答或抗炎性应答。lnp也可以具有疏水性脂质、亲水性脂质、或既疏水又亲水的脂质。
121.本领域已知的任何脂质或脂质的组合可用于产生lnp。用于产生lnp的脂质的例子是：dotma、dospa、dotap、dmrie、dc-胆固醇、dotap-胆固醇、gap-dmorie-dpype和gl67a-dope-dmpe-聚乙二醇(peg)。阳离子脂质的例子是：98n12-5、c12-200、dlin-kc2-dma(kc2)、dlin-mc3-dma(mc3)、xtc、md1和7c1。中性脂质的例子是：dpsc、dppc、popc、dope和sm。peg修饰的脂质的例子是：peg-dmg、peg-cerc14和peg-cerc20。
122.在一些实施方案中，脂质可以任意数目的摩尔比率组合以产生lnp。此外，一种或多种多核苷酸可以以宽范围的摩尔比率与一种或多种脂质组合以产生lnp。
123.在一些实施方案中，可以将本文所述的治疗性组合物(例如，核酸构建体、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物)掺入到治疗性组合物中以用于预防或治疗患有、怀疑患有或者可能有高风险患上癌症、自身免疫性疾病和/或感染的受试者的方法中。
124.在一些实施方案中，将本文所述的治疗性组合物(例如，核酸、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物)掺入治疗性组合物中以用于预防或治疗患有、怀疑患有或可能有高风险患上微生物感染的受试者的方法中。在一些实施方案中，所述微生物感染是细菌感染。在一些实施方案中，所述微生物感染是真菌感染。在一些实施方案中，所述微生物感染是病毒感染。另外的疗法
125.在一些实施方案中，将根据本公开文本的组合物作为单一疗法(单药疗法)单独地或作为第一疗法与至少一种另外的疗法(例如，第二疗法)组合地施用于所述受试者。在一些实施方案中，所述第二疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法、靶向疗法和手术。在一些实施方案中，所述第二疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法或手术。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法伴随施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法与所述第二疗法同时施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法依序施用。在一些实施方案中，在所述第二疗法之前施用所述第一疗法。在一些实施方案中，在所述第二疗法之后施用所述第一疗法。在一些实施方案中，在所述第二疗法之前和/或之后施用所述第一疗法。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法轮流施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法以单一配制品一起施用。试剂盒
126.本文还提供了用于实践本文所述方法的各种试剂盒。具体地，本公开文本的一些实施例提供了用于引发受试者的免疫应答的试剂盒。一些其他实施方案涉及用于预防有需
要的受试者的健康病症的试剂盒。一些其他实施方案涉及用于治疗有需要的受试者的健康病症的方法的试剂盒。例如，在一些实施方案中，本文提供了试剂盒，所述试剂盒包含如本文提供和描述的核酸构建体、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物中的一种或多种，以及制备和使用它们的书面说明书。
127.在一些实施方案中，本公开文本的试剂盒进一步包含一种或多种可用于向受试者施用所提供的核酸构建体、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物中的任一种的手段。例如，在一些实施方案中，本公开文本的试剂盒进一步包含一个或多个注射器(包括预充注射器)和/或导管(包括预充注射器)，以用于将所提供的核酸构建体、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物中的任一种施用于受试者。在一些实施方案中，试剂盒可以具有一种或多种另外的治疗剂，所述一种或多种另外的治疗剂可与其他试剂盒组分同时或依序施用以用于期望目的，例如用于诊断、预防或治疗有需要的受试者的病症。
128.上述试剂盒中的任一个可以进一步包含一种或多种另外的试剂，其中此类另外的试剂可以选自：稀释缓冲液；重构溶液、洗涤缓冲液、对照试剂、对照表达载体、阴性对照、阳性对照、适用于体外产生本公开文本所提供的核酸构建体、重组细胞、重组多肽和/或药物组合物的试剂。
129.在一些实施方案中，所述试剂盒的组分可以在分开的容器中。在一些其他实施方案中，所述试剂盒的组分可以在单个容器中合并。
130.在一些实施方案中，试剂盒还可以包含使用试剂盒的组分来实践本文所公开方法的说明书。用于实践所述方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在衬底如纸或塑料等上。说明书可以作为药品说明书存在于试剂盒中，存在于试剂盒的容器或其组件的标记(例如，与包装或分包装相连)中等。说明书可以作为存在于合适的计算机可读存储介质例如cd-rom、软盘、闪存驱动器等上的电子存储数据文件而存在。在一些情况下，实际说明书不存在于试剂盒中，但是可以提供用于从远程来源(例如，经由互联网)获得说明书的手段。此实施方案的例子是包括网址的试剂盒，在所述网址中可以查看说明书和/或可以从其下载说明书。与说明书一样，可以将这种用于获得说明书的手段记录在合适的基材上。
131.将本公开文本中提到的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，并入程度如同确切且单独地指示每个单独出版物或专利申请都通过引用并入一般。
132.不承认本文引用的任何参考文献构成现有技术。参考文献的讨论内容陈述了其作者所主张的观点，并且本技术人保留对所引用文件的准确性和针对性提出质疑的权利。应清楚地理解的是，尽管在本文中提及许多信息源，包括科学期刊文章、专利文件和教科书；但此提及并不构成承认任何这些文件构成本领域公知常识的一部分。
133.本文给出的一般方法的讨论仅旨在用于说明目的。在审阅本公开文本后，其他替代方法和替代方案对于本领域技术人员而言将是清楚的，并且将被包括在本技术的精神和范围内。
134.在以下实施例中进一步详细公开了另外的实施方案，所述实施例仅以说明方式提供，而并非旨在以任何方式限制本公开文本或权利要求的范围。实施例
135.除非另外指示，否则本公开文本的实践将采用本领域技术人员熟知的分子生物
学、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术。这样的技术充分解释于文献中，如sambrook,j.,&russell,d.w.(2012).molecular cloning:a laboratory manual(第4版).cold spring harbor,ny:cold spring harbor laboratory以及sambrook,j.和russel,d.w.(2001).molecular cloning:a laboratory manual(第3版).cold spring harbor,ny:cold spring harbor laboratory(在本文中联合称为“sambrook”)；ausubel,f.m.(1987).current protocols in molecular biology.new york,ny:wiley(包括至2014年的补充)；bollag,d.m.等人(1996).protein methods.new york,ny:wiley-liss；huang,l.等人(2005).nonviral vectors for gene therapy.san diego:academic press；kaplitt,m.g.等人(1995).viral vectors:gene therapy and neuroscience applications.san diego,ca:academic press；lefkovits,i.(1997).the immunology methods manual:the comprehensive sourcebook of techniques.san diego,ca:academic press；doyle,a.等人(1998).cell and tissue culture:laboratory procedures in biotechnology.new york,ny:wiley；mullis,k.b.,ferr
é
,f.和gibbs,r.(1994).pcr:the polymerase chain reaction.boston:birkhauser publisher；greenfield,e.a.(2014).antibodies:a laboratory manual(第2版).new york,ny:cold spring harbor laboratory press；beaucage,s.l.等人(2000).current protocols in nucleic acid chemistry.new york,ny:wiley,(包括至2014年的补充)；以及makrides,s.c.(2003).gene transfer and expression in mammalian cells.amsterdam,nl:elsevier sciences b.v.，将所述文献的公开内容通过引用并入本文。
136.在以下实施例中进一步详细公开了另外的实施方案，所述实施例仅以说明方式提供，而并非旨在以任何方式限制本公开文本或权利要求的范围。实施例1.chikv载体的构建
137.此实施例描述了实验的结果，所述实验被执行以构建多个基础chikv载体(例如，不含异源基因)，其随后用于表达目的基因，所述多个基础chikv载体是例如，(i)甲型流感病毒h5n1的血凝素前体(ha)，或(ii)合成序列盒，所述合成序列盒编码与肿瘤学相关的基因或部分基因(如雌激素受体α(esr1)、表皮生长因子受体2(her2)和人表皮生长因子受体(her3))、或报告基因(如红色萤火虫萤光素酶)、或细胞因子(如白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)或白介素-12(il12))。可替代地，也可以使用人乳头瘤病毒(hpv)e6/e7基因。
138.初步观察到，公开可得的甲病毒基因组数据并不总是提供这样的核苷酸序列，其能够直接替换编码具有目的基因(goi)的结构蛋白的核酸序列，以导致自我复制的rna和转基因表达的复制子。如下文更详细描述的，虽然可以将chikv毒株s27中的结构多蛋白基因(genbank af369024)用合成的hpv e6/e7基因(人乳头瘤病毒e6/e7基因)(参见例如，图2c)、来自甲型流感病毒h5n1的血凝素(ha)基因(参见例如，图3b)或红色萤火虫萤光素酶基因替换也可以用于在转染的bhk-21细胞中产生能够rna复制和转基因表达的复制子，但是用于类似地替换chikv毒株drde-06中的结构多蛋白基因(genbank ef210157)的相同的合成序列不能进行rna复制或表达转基因。因此，将chikv结构蛋白用使用可用的已公开的序列的异源基因简单替换将不足以产生功能性复制子。换句话说，需要进一步的工程化(如使用异源5’和/或3’utr序列)以创建适于在疫苗和治疗中使用的复制子系统。
139.如下文更详细描述的，尽管在chikv毒株s27和drde-06的基因组中发现了许多序
列的进化差异，但是本文呈现的实验数据表明，可以通过将drde 3’utr用来自chikv毒株s27的3’utr替换来生成功能性chikv毒株drde复制子(参见例如，图2c)。
140.在这些实验中，用来自具有独特的限制性酶切位点(spei，5
’‑
a'ctag,t-3’)的参考序列(对于毒株s27和drde-06，分别为genbank af369024和ef210157)的四个约4kb部分(twist bioscience，thermo fisher geneart)替换chikv结构基因的编码序列(其中5’a与结构多蛋白的atg起始密码子的位置匹配，并且3’t与结构多蛋白的终止密码子taa的位置匹配)，从头合成基础chikv载体(s27和drde-06)。在chikv基因组序列的上游包含噬菌体t7 rna聚合酶启动子(5
’‑
taatacgactcactatag-3’；seq id no:7)，并且下游包含(37-a)聚a序列，然后是t7终止子序列(5
’‑
aacccctctctaaacggaggggttttttt-3’；seq id no:8)，然后是独特的限制性酶切位点(noti，5
’‑
gc'ggcc,gc-3’)。将所述部分在五件式gibson反应(线性化的pyl骨架和四个合成片段)中合并以产生chikv基础载体。得到的chikv s27和chikv drde基础载体分别是seq id no:1和seq id no:2。seq id no:1对应于含有s27 5’utr和s27 3’utr序列的chikv s27基础载体。seq id no:2对应于含有drde 5’utr和drde 3’utr序列的chikv drde基础载体。观察到此chikv drde基础载体无法进行复制。
141.如下构建经修饰的chikv drde基础载体。通过以下构建chikv drde载体(图3c)：对drde-06基础载体进行spei和noti限制性消化，并且在两件式gibson反应中与线性化骨架和来自含有3’utr(seq id no:6)、聚a和t7终止子序列(seq id no:8)的chikv s27载体的pcr产物组合。得到的chikv drde基础载体是seq id no:3。此chikv drde基础载体含有drde 5’utr和s27 3’utr序列，并且发现所述载体能够进行复制。
142.如下构建编码表达报告基因的chikv载体。合成红色萤火虫萤光素酶(rff)报告基因，并且通过spei限制性核酸内切酶消化以及与含有与线性化基础载体具有同源末端的rff基因的pcr产物进行两片段式gibson反应将其插入到上文所述的chikv基础载体中。
143.通过以下构建chikv s27载体(图2b)：对s27基础载体进行spei限制性消化，并且在两件式gibson反应中与线性化骨架和含有合成的hpv e6/e7基因的pcr产物组合。
144.通过以下构建chikv drde载体(图2c)：对drde基础载体进行spei和noti限制性消化，并且在三件式gibson反应中与(i)线性化骨架、(ii)含有合成的hpv e6/e7基因的pcr产物，和(iii)来自含有3’utr(seq id no:6)、聚a和t7终止子序列(seq id no:8)的chikv s27载体的pcr产物组合。
145.如下构建表达ha的chikv载体。将来自流感的血凝素(ha)基因(genbank ay651334)针对电脑模拟的人表达进行密码子优化/重构，并且从头合成(idt)，并且通过spei限制性核酸内切酶消化以及与含有与线性化基础载体具有同源末端的ha基因的pcr产物进行两片段式gibson反应插入到上述chikv基础载体中。得到的chikv s27和chikv drde载体分别描述于图3b和图3c中。
146.通过spei限制性核酸内切酶消化以及与含有与线性化基础载体具有同源末端的合成盒的pcr产物进行两片段式gibson反应将合成盒插入到上述chikv基础载
体中，从而类似地构建编码人il-1ra和il-12的表达盒的chikv载体。
147.通过含有来自esr1、her2和her3的与spei线性化基础chikv载体具有同源末端的序列的pcr产物的两片段式gibson程序(gibson等人,nat.methods 6,343-345,2009)类似地构建表达肿瘤相关多肽的chikv载体。得到的chikv s27和chikv drde载体分别描述于图3f和图3g中。
148.如上文针对chikv基础载体所述类似地构建图2a、图3a、图3e中所述的对照vee载体、rff报告基因和人il-1ra和il-12盒。从参考序列(genbank l01443)从头合成对照vee载体。实施例2.sinv载体的构建
149.此实施例描述了许多基础sinv载体(例如，不含异源基因)的设计和构建，所述基础sinv载体随后用于表达目的基因(例如，甲型流感病毒h5n1的血凝素前体(ha)、或编码与肿瘤学相关的基因或部分基因(如esr1、her2和her3)、或红色萤火虫萤光素酶、或细胞因子(如il-1ra或il12)的合成序列盒)。可替代地，也可以使用人乳头瘤病毒(hpv)e6/e7基因。
150.用来自具有独特的限制性酶切位点(spei，5
’‑
a'ctag,t-3’)的girdwood毒株参考序列(genbank mf459683)的四个约4kb部分(twist bioscience，thermo fisher geneart)代替sinv结构基因的编码序列(其中5’a是在结构多蛋白基因的核苷酸93之后的p2a序列之后的下一个核苷酸，并且3’t与结构多蛋白的终止密码子tga的位置匹配)，从头合成基础sinv girdwood载体。在sinv基因组序列的上游包含噬菌体t7 rna聚合酶启动子(5
’‑
taatacgactcactatag-3’；seq id no:7)，并且下游包含(37-a)聚a序列，然后是t7终止子序列(5
’‑
aacccctctctaaacggaggggttttttt-3’；seq id no:8)，然后是独特的限制性酶切位点(noti，5
’‑
gc'ggcc,gc-3’)。将所述部分在五件式gibson反应(例如，线性化pyl骨架和四个合成片段)中组合以产生sinv基础载体(seq id no:4)。
151.用来自具有独特的限制性酶切位点(spei，5
’‑
a'ctag,t-3’)的ar86参考序列(genbank u38305)的四个约4kb部分(twist bioscience)代替sinv结构基因的编码序列(其中5’a是在结构多蛋白基因的核苷酸93之后的p2a序列之后的下一个核苷酸，并且3’t与结构多蛋白的终止密码子tga的位置匹配)，从头合成基础sinv ar86载体。在sinv基因组序列的上游包含噬菌体t7 rna聚合酶启动子(5
’‑
taatacgactcactatag-3’；seq id no:7)，并且下游包含(37-a)聚a序列，然后是t7终止子序列(5
’‑
aacccctctctaaacggaggggttttttt-3’；seq id no:8)，然后是独特的限制性酶切位点(noti，5
’‑
gc'ggcc,gc-3’)。将所述部分在五件式gibson反应(例如，线性化的pyl骨架和四个合成片段)中组合以产生sinv ar86基础载体，其还包含另外的修饰以改善功能性。
152.如下构建编码表达报告基因的sinv载体。合成红色萤火虫萤光素酶(rff)报告基因，并且通过spei限制性核酸内切酶消化以及与含有与线性化基础载体具有同源末端的rff基因的pcr产物进行两片段式gibson反应将其插入到上文所述的sinv基础载体中。
153.如下构建图3d中所述的sinv载体。将来自流感的血凝素(ha)基因(genbank ay651334)针对电脑模拟的人表达进行密码子优化/重构，并且从头合成(idt)，并且通过spei限制性消化以及与含有与基础载体具有同源末端的ha基因的pcr产物进行两片段式
gibson反应插入到上述sinv girdwood基础载体中以得到最终载体。在另一个实验中，使用上文实施例2中所述的sinv ar86基础载体类似地构建含有密码子优化的ha基因的sinv ar86载体(数据未示出)。
154.通过spei限制性核酸内切酶消化以及与含有与线性化基础载体具有同源末端的合成盒的pcr产物进行两片段式gibson反应将合成盒插入到上述sinv基础载体中，从而类似地构建编码人il-1ra和il-12的表达盒的sinv载体。
155.通过含有来自esr1、her2和her3的与spei线性化基础sinv载体具有同源末端的序列的pcr产物的两片段式gibson反应类似地构建表达肿瘤学相关多肽的sinv载体。sinv girdwood载体的示意图描述于图3i中。实施例3.经修饰的chikv和sinv载体的体外评价
156.此实施例描述了为了评价上文实施例1和2所述的合成chikv和sinv复制子构建体的表达水平以及为了研究其任何差异性行为(例如，复制和蛋白质表达)而进行的体外实验的结果。
157.在这些实验中，设计并且随后评价了衍生自以下甲病毒的合成复制子构建体：vee、chikv s27、chikv drde、sinv ar86和sinv girdwood。
158.体外转录：利用5’arca帽(hiscribe
tm
t7 arca mrna试剂盒，neb)或通过无帽转录(hiscribe
tm
t7高产量rna合成试剂盒，neb)然后添加5’帽1(vaccinia capping system，mrna帽2
′‑
o-甲基转移酶，neb)使用噬菌体t7聚合酶通过体外转录制备rna。然后将rna使用苯酚/氯仿提取或柱纯化(rna清除试剂盒，neb)来纯化。通过在260nm处的吸光度测定rna浓度(nanodrop，thermo fisher scientific)。
159.复制：通过电穿孔将rna转化到bhk-21或vero细胞(例如，4d-nucleofector
tm
，lonza)中。在转化后18-20小时，将细胞固定并且透性化处理(ebioscience
tm
foxp3/转录因子染色缓冲集，invitrogen)，随后使用pe缀合的抗dsrna小鼠单克隆抗体(j2，scicons)进行染色，以通过荧光流式细胞术定量dsrna+细胞的频率和单个细胞中的dsrna的平均荧光强度(mfi)。
160.蛋白质表达：通过电穿孔将rna转化到bhk-21或vero细胞(例如，4d-nucleofector
tm
，lonza)中。在转化后18-20小时，对一种或多种转基因的表达进行定量。对于表达rff的复制子，使用萤光素酶测定系统方案(promega)定量萤光素酶活性(图4)。从这些转染了复制子的细胞中检测到的发光表明，复制子能够进行rna复制并且表达目的基因(goi)。在这个例子中，goi是展现出生物学功能的报告酶。在可替代实验中，可以将细胞固定并且透性化处理(ebioscience
tm
foxp3/转录因子染色缓冲集，invitrogen)，并且使用fitc缀合的抗lamp1小鼠单克隆抗体(ha3，biolegend)进行染色，以通过荧光流式细胞术定量lamp-融合蛋白+细胞的频率和单个细胞中的lamp-融合蛋白的平均荧光强度(mfi)。
161.对于表达il-12的复制子，收集来自细胞的培养基并且通过elisa(r&dbiosystems)或在il-12生物活性测定(promega)中定量il-12。对于表达il-1ra的复制子，收集培养基并且如所述，通过elisa(r&d biosystems)或使用hek-blue
tm
il-1r(invivogen)细胞在生物活性测定中定量il-1ra。hek-blue
tm
il-1r细胞响应于il-1b而表达seap。首先，将5e4 hek-blue
tm
il-1r细胞接种在96孔板上的每个孔中。将hek-blue
tm
il-1r细胞与连续
稀释的测试培养基一起在一式两份的孔中孵育40分钟。为了生成标准曲线，将hek-blue
tm
il-1r细胞与滴定浓度的重组il-1ra(peprotech)一起在一式两份的孔中孵育40分钟。然后将重组il-1b(invivogen)添加到每个孔中，最终浓度为1ng/ml。第二天，使用quanti-blue
tm
溶液(invivogen)定量seap表达以定量il-1ra生物活性。
162.另外的实验：在rna电穿孔之前，将bhk-21或vero细胞用重组干扰素(ifn)预处理，并且使用上述测定来测量对每种载体的复制和蛋白质表达的影响。实施例4.经修饰的chikv和sinv载体的体内评价-流感
163.此实施例描述了为了评价用上文实施例1和2中所述的合成chikv和sinv复制子构建体(例如，未配制的载体和lnp配制的载体)进行疫苗接种后的任何差异性免疫应答而进行的体内实验的结果。
164.在这些实验中，设计并且随后评价了衍生自以下甲病毒的合成复制子构建体：vee、chikv s27、chikv drde、sinv ar86和sinv girdwood。
165.小鼠和注射剂：雌性balb/c小鼠购自charles river labs、envigo或jackson laboratories。在给药当天，将10μg(单剂量组，即仅初免)或5μg(两个剂量组，即初免-增强)的材料分别肌内注射到两个四头肌中。以在盐水中未配制的形式或lnp配制的形式施用载体。在整个研究过程中，对动物进行体重监测和其他综合观察。对于免疫原性研究，在第0天和第21天向动物给药(仅两个剂量组)。在第14天(单一10μg剂量组)和第35天(单一5μg剂量组)收集脾脏，并且在第14天和第35天分离血清。对于蛋白质表达研究，可以在第0天向动物给药，并且可以在第1、3和7天评估生物发光。可以在指定的时间点使用ivis系统进行萤光素酶活性的体内成像。
166.lnp配制品：将复制子rna使用微流体混合器配制在脂质纳米颗粒中，并且使用动态光散射和包封率分析粒度、多分散性。在此实施例中，用于配制lnp颗粒的脂质的摩尔比率为35％ c12-200、46.5％胆固醇、2.5％ peg-2k和16％ dope。
167.elispot：对于在免疫接种后t细胞应答的检测，根据制造商的方案使用小鼠ifnγelispot试剂盒(mabtech)。简言之，制备单个脾细胞悬浮液，并且将其以5
×
106个细胞/ml铺板于具有以下刺激条件的aim v培养基中：仅培养基(模拟)、pma和离子霉素(阳性对照)、以及来自甲型流感/越南/2004/1203(h5n1)ha的cd4(kssffrnvvwlikkn)(seq id no:9)和cd8(iystvassl)(seq id no:10)肽。使用1-10μg/ml的最终浓度的肽。对斑点形成单位进行成像，并且量化并绘制每百万个细胞。
168.可以如下测量hpv特异性t细胞应答的强度：可以根据制造商的说明使用小鼠ifnγelispot plus试剂盒(hrp)(mabtech)进行ifnγelispot分析。简言之，可以分离脾细胞，并且将其在含有代表针对hpv的cd4+或cd8+t细胞表位的肽、作为阳性对照的pma/离子霉素、或作为模拟刺激的dmso的培养基中重悬至5
×
106个细胞/ml的浓度。
169.细胞内细胞因子染色。可以根据elispots概述的方法分离脾脏，并且可以将1
×
106个细胞以每孔200μl的总体积添加到含有细胞的培养基中。每个孔可以含有代表针对hpv的cd4+或cd8+t细胞表位的肽、作为阳性对照的pma/离子霉素、或作为模拟刺激的dmso。1小时后，可以将golgiplug
tm
蛋白质转运抑制剂(bd biosciences)添加到每个孔中。可以将细胞再孵育5小时。孵育后，可以使用标准方法将细胞针对cd8+(53-6.7)、cd4+(gk1.5)、b220(b238128)、gr-1(rb6-8c5)、cd16/32(m93)进行表面染色。表面染色之后，可以将细胞
固定并且按照标准方法针对ifnγ(rpa-t8)、il-2(jes6-5h4)和tnf(mp6-xt22)的细胞内蛋白进行染色。随后可以将细胞在流式细胞仪上进行分析，并且使用flowjo软件10.4.1版分析获取的fcs文件。
170.抗体.根据制造商的说明，可以使用来自alpha diagnostic international的elisa试剂盒测量用于测量总hpv e6/e7特异性igg的抗体应答。
171.血凝抑制测定(hai)：为了制备血清，根据制造商说明书制备rde溶液。可以将未使用的溶液在-15℃至-25℃下在1ml等分试样中储存长达一年。在单独的微量离心管中，为每个待测试样品和阳性对照移液20μl血清。将80μl rde添加到每个管中。如果需要另外的血清，可以使用相同的比率(例如，40μl血清和160μl rde)增加量。可以将高滴度血清和阳性对照预先稀释，然后添加rde(例如，5μl血清和20μl pbs，加100μl rde)。将样品和阳性对照在37℃
±
1℃水浴中孵育18-20小时(第1天)。通过在56℃
±
2℃的水浴中加热35-45分钟使血清和rde灭活(第2天)。将血清短暂离心以去除管盖上的冷凝物。对于每个100μl处理的血清添加100μl 1x pbs，以开始1:10的稀释。在1x pbs/0.75％ bsa中将病毒稀释至4个血凝单位/25μl，并置于湿冰上。对于对照板，将25μl pbs添加到96孔v底板的第9-10列中。将50μl pbs添加到仅第c-h行第11-12列中。对于样品板，将25μl pbs添加到第b-h行中的所有孔(第1-12列)中。将50μl血清样品添加到第a行中重复的相邻孔中。将25μl阴性对照血清添加到对照板上的孔11a、11b、12a、12b中。将25μl阳性对照添加到对照板上的孔9a和10a中。在一个或多个样品板上，将第a行(第1-12列)混合3-4次。将25μl转移到第b行，继续两倍稀释至第h行。丢弃来自第h行的25μl。在对照板上，将第a行(第1-10列)混合3-4次。将25μl转移到第b行，继续两倍稀释至第h行。丢弃来自第h行的25μl。将25μl稀释的病毒添加到一个或多个样品板的所有孔中以及对照板的第9-10列中。还将病毒添加到对照板上的孔11a、11b、12a和12b中。将50μl稀释的病毒添加到孔11e和12e中，混合3-4次，并且对孔11h和12h进行两倍稀释。将板在室温下孵育50-60分钟。将50μl 1.1％ hrbc添加到所有孔中。将板在室温下孵育50-60分钟。将板倾斜以读取凝集模式。
172.为了评估chikv和sinv衍生的载体的体内影响，在此实验中，将它们与衍生自tc-83的vee合成复制子(其在此领域中常用)进行比较。在此实施例中，在每种载体中在所有动物中单一剂量后14天，lnp配制的材料显示hai滴度。类似地，如通过elispot分析测量，所有lnp配制的载体均在脾脏中产生cd4+和cd8+ha特异性t细胞应答。在此，观察到一些chikv和sinv衍生的载体具有显著改善的cd4+或cd8+t细胞应答，这取决于哪个表位被用于刺激(图5a-图5b)。这表明，与基于立体vee的载体相比，chikv和sinv衍生的载体本身可以产生差异性应答。针对编码的蛋白质的较高的t细胞应答和抗体应答对于用作疫苗是所希望的，而针对编码的蛋白质的较低的t细胞应答和抗体应答对于生物治疗剂是优选的。实施例5.经修饰的chikv和sinv载体的体内评价-肿瘤学
173.此实施例描述了为了评价用上文实施例1和2中所述的合成chikv和sinv复制子构建体(例如，未配制的载体和lnp配制的载体)进行疫苗接种后的任何差异性免疫应答而进行的体内实验的结果。在这些实验中，设计并且随后评价了衍生自以下甲病毒的合成复制子构建体：vee、chikv s27、chikv drde、sinv ar86和sinv girdwood。
174.小鼠和注射剂。雌性balb/c小鼠购自charles river labs、envigo或jackson laboratories。在给药当天，将10μg的材料分别肌内注射到两个四头肌中。以在盐水中未配
制的形式或lnp配制的形式施用载体。在整个研究过程中，对动物进行体重监测和其他综合观察。对于免疫原性研究，将动物在第0天和第21天给药。在第35天收集脾脏。
175.lnp配制品。将复制子rna使用微流体混合器配制在脂质纳米颗粒中，并且使用动态光散射和包封率分析粒度、多分散性。用于配制lnp颗粒的脂质的摩尔比率为35％c12-200、46.5％胆固醇、2.5％ peg-2k和16％ dope。可替代地，可以使用从另一实体获得的脂质的即用型配制品，如由precision nanosystems,inc.提供的那些。
176.elispot。为了测量esr1、her2或her3特异性t细胞应答的强度，根据制造商的说明使用小鼠ifnγelispot plus试剂盒(hrp)(mabtech)进行ifnγelispot分析。简言之，可以分离脾细胞，并且将其在含有代表针对esr1的cd4+或cd8+t细胞表位的肽(参见例如，表1)、和针对her2 ecd的肽文库、作为阳性对照的pma/离子霉素、或作为模拟刺激的dmso的培养基中重悬至5
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106个细胞/ml的浓度(图6)。表1.esr1肽esr1肽序列seq id noesr1 k303rlwpsplmikrskrnslalsltadqmseq id no:11esr1 e380qvdltlhdqvhllqcawleilmiglvseq id no:12esr1 y537nsmkcknvvplndlllemldahrlseq id no:13esr1 y537ssmkcknvvplsdlllemldahrlseq id no:14esr1 y537csmkcknvvplcdlllemldahrlseq id no:15esr1 d538gsmkcknvvplyglllemldahrlseq id no:16
177.为了评估chikv和sinv衍生的载体的体内影响，在此实验中，将它们与衍生自tc-83的vee合成复制子(其在此领域中常用)进行比较。在此实施例中，在同一骨架上针对esr1和pi3k(截短的肿瘤相关抗原(her2的细胞外和跨膜结构域，即erbb2基因)和激酶死亡肿瘤相关抗原(her3，即erbb3基因))编码了几个激活新抗原突变(编码为以突变为中心的约31聚体肽)。与流感研究相似，所有lnp配制的载体在一些或所有小鼠中显示出针对esr1突变和her2的t细胞应答。通过elispot测量的总t细胞应答的强度因每种抗原而异。然而，在对每种单独的抗原的应答中，在一些情况下，单独载体与vee显著不同，而在其他情况下，每个载体的表现与vee是可比较的(图6)。这证实了新chikv载体和sinv载体的表现与vee不同，并且当与实施例4组合时，显示出差异根据所编码的蛋白质也是不可预测的。这证实了在逐个靶标的基础上这些载体由于对疫苗或生物治疗剂有利而具有效用。
178.虽然已经公开了本公开文本的特定替代方案，但应理解的是，各种修改和组合是可能的并且被考虑在所附权利要求的真实精神和范围内。因此，无意限制于本文呈现的确切摘要和公开文本。

技术特征：
1.一种核酸构建体，所述核酸构建体包含编码经修饰的基孔肯雅病毒(chikv)基因组或复制子rna的核酸序列，其中所述经修饰的chikv基因组或复制子rna缺乏编码一种或多种病毒结构蛋白的核酸序列的至少一部分。2.一种核酸构建体，所述核酸构建体包含编码经修饰的辛德毕斯病毒(sinv)基因组或复制子rna的核酸序列，其中所述经修饰的sinv基因组或复制子rna缺乏编码一种或多种病毒结构蛋白的核酸序列的至少一部分。3.根据权利要求1-2中任一项所述的核酸构建体，其中所述经修饰的病毒基因组或复制子rna缺乏编码一种或多种病毒结构蛋白的核酸序列的很大一部分。4.根据权利要求1-3中任一项所述的核酸构建体，其中所述经修饰的病毒基因组或复制子rna不包含编码病毒结构蛋白的核酸序列。5.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸构建体，所述核酸构建体进一步包含一个或多个表达盒，其中所述表达盒中的每一个均包含与异源核酸序列可操作连接的启动子。6.根据权利要求5所述的核酸构建体，其中所述表达盒中的至少一个包含与所述异源核酸序列可操作连接的亚基因组(sg)启动子。7.根据权利要求6所述的核酸构建体，其中所述sg启动子是26s亚基因组启动子。8.根据权利要求1-7中任一项所述的核酸构建体，所述核酸构建体进一步包含一个或多个非翻译区(utr)。9.根据权利要求8所述的核酸构建体，其中所述utr中的至少一个是异源utr。10.根据权利要求5-9中任一项所述的核酸构建体，其中所述表达盒中的至少一个包含目的基因(goi)的编码序列。11.根据权利要求10所述的核酸构建体，其中所述goi编码选自以下的多肽：治疗性多肽、预防性多肽、诊断性多肽、营养保健性多肽、工业酶和报告多肽。12.根据权利要求10-11中任一项所述的核酸构建体，其中所述goi编码选自以下的多肽：抗体、抗原、免疫调节剂、酶、信号传导蛋白和细胞因子。13.根据权利要求10-12中任一项所述的核酸构建体，其中所述goi的编码序列被优化以用于以高于参考编码序列的表达水平的水平表达。14.根据权利要求1-13中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸序列与选自seq id no:1-4的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。15.一种重组细胞，所述重组细胞包含根据权利要求1-14中任一项所述的核酸构建体。16.根据权利要求15所述的重组细胞，其中所述重组细胞是真核细胞。17.根据权利要求16所述的重组细胞，其中所述重组细胞是动物细胞。18.根据权利要求17所述的重组细胞，其中所述动物细胞是脊椎动物细胞或无脊椎动物细胞。19.根据权利要求18所述的重组细胞，其中所述重组细胞是昆虫细胞。20.根据权利要求19所述的重组细胞，其中所述昆虫细胞是蚊子细胞。21.根据权利要求18所述的重组细胞，其中所述重组细胞是哺乳动物细胞。22.根据权利要求18所述的重组细胞，其中所述重组细胞选自由sv40转化的猴肾cv1细胞(cos-7)、人胚肾细胞(例如，hek 293或hek 293细胞)、幼仓鼠肾细胞(bhk)、小鼠支持细
胞(例如，tm4细胞)、猴肾细胞(cv1)、人宫颈癌细胞(hela)、犬肾细胞(mdck)、水牛大鼠肝细胞(brl 3a)、人肺细胞(w138)、人肝细胞(hep g2)、小鼠乳腺肿瘤(mmt 060562)、tri细胞、fs4细胞、中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)、非洲绿猴肾细胞(vero细胞)、人a549细胞、人宫颈细胞、人chme5细胞、人per.c6细胞、ns0鼠骨髓瘤细胞、人表皮样喉细胞、人成纤维细胞、人huh-7细胞、人mrc-5细胞、人肌肉细胞、人内皮细胞、人星形胶质细胞、人巨噬细胞、人raw 264.7细胞、小鼠3t3细胞、小鼠l929细胞、小鼠结缔组织细胞、小鼠肌肉细胞和兔肾细胞。23.一种细胞培养物，所述细胞培养物包含至少一种根据权利要求15-22中任一项所述的重组细胞和培养基。24.一种转基因动物，所述转基因动物包含根据权利要求1-14中任一项所述的核酸构建体。25.根据权利要求24所述的转基因动物，其中所述动物是脊椎动物或无脊椎动物。26.根据权利要求25所述的转基因动物，其中所述动物是昆虫。27.根据权利要求26所述的转基因动物，其中所述昆虫是蚊子。28.根据权利要求25所述的转基因动物，其中所述动物是哺乳动物。29.根据权利要求28所述的转基因动物，其中所述动物是非人哺乳动物。30.一种用于产生目的多肽的方法，所述方法包括(i)饲养根据权利要求24-29中任一项所述的转基因动物，或(ii)将包含根据权利要求11-14中任一项所述的核酸构建体的重组细胞在一定条件下培养，在所述条件下所述转基因动物或所述重组细胞产生由所述goi编码的多肽。31.一种用于在受试者中产生目的多肽的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求11-14中任一项所述的核酸构建体。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述受试者是脊椎动物或无脊椎动物。33.根据权利要求31-32中任一项所述的方法，其中所述受试者是昆虫。34.根据权利要求31-32中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物受试者。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述哺乳动物受试者是人受试者。36.一种由根据权利要求30-35中任一项所述的方法产生的重组多肽。37.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂和：(a)根据权利要求1-14中任一项所述的核酸构建体；(b)根据权利要求15-22中任一项所述的重组细胞；和/或(c)根据权利要求36所述的重组多肽。38.根据权利要求37所述的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-14中任一项所述的核酸构建体和药学上可接受的赋形剂。39.根据权利要求37所述的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求15-22中任一项所述的重组细胞和药学上可接受的赋形剂。40.根据权利要求37所述的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求36所述的重组多肽和药学上可接受的赋形剂。41.根据权利要求37-40中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物被配制在脂质体、基于脂质的纳米颗粒(lnp)或聚合物纳米颗粒中。42.根据权利要求37-41中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物是免疫原性组合
物。43.根据权利要求42所述的药物组合物，其中所述免疫原性组合物被配制为疫苗。44.根据权利要求37-41中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物对受试者是基本上非免疫原性的。45.根据权利要求37-44中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制为佐剂。46.根据权利要求37-45中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于鼻内施用、透皮施用、腹膜内施用、肌内施用、结节内施用、瘤内施用、关节内施用、静脉内施用、皮下施用、阴道内施用、眼内施用、直肠施用和口服施用中的一种或多种。47.一种引发有需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含：(a)根据权利要求1-14中任一项所述的核酸构建体；(b)根据权利要求15-22中任一项所述的重组细胞；(c)根据权利要求36所述的重组多肽；和/或(d)根据权利要求37-46中任一项所述的药物组合物。48.一种用于预防和/或治疗有需要的受试者的健康病症的方法，所述方法包括向所述受试者预防性地或治疗性地施用组合物，所述组合物包含：(a)根据权利要求1-14中任一项所述的核酸构建体；(b)根据权利要求15-22中任一项所述的重组细胞；(c)根据权利要求36所述的重组多肽；和/或(d)根据权利要求37-46中任一项所述的药物组合物。49.根据权利要求48所述的方法，其中所述健康病症是增殖性障碍或微生物感染。50.根据权利要求47-49中任一项所述的方法，其中所述受试者患有或被怀疑患有与增殖性障碍或微生物感染相关的病症。51.根据权利要求47-50中任一项所述的方法，其中所施用的组合物导致所述受试者中干扰素的产生增加。52.根据权利要求47-51中任一项所述的方法，其中将所述组合物作为单一疗法(单药疗法)单独地或作为第一疗法与至少一种另外的疗法组合地施用于所述受试者。53.根据权利要求52所述的方法，其中所述至少一种另外的疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法、靶向疗法和手术。54.一种用于引发免疫应答、用于预防和/或用于治疗健康病症或微生物感染的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)根据权利要求1-14中任一项所述的核酸构建体；(b)根据权利要求15-22中任一项所述的重组细胞；(c)根据权利要求36所述的重组多肽；和/或(d)根据权利要求37-46中任一项所述的药物组合物。

技术总结
本公开文本涉及分子病毒学领域，包括包含经修饰的病毒基因组或复制子的核酸分子、含有所述核酸分子的药物组合物、以及此类核酸分子和组合物用于在细胞培养物或活体中产生所需产物的用途。还提供了用于引发有需要的受试者的免疫应答的方法，以及用于预防和/或治疗各种健康病症的方法。种健康病症的方法。种健康病症的方法。


技术研发人员：N
受保护的技术使用者：复制生物科学公司
技术研发日：2021.07.30
技术公布日：2023/9/23