用于激活HEDGEHOG信号通路的强效结合剂的制作方法

用于激活hedgehog信号通路的强效结合剂
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年9月25日递交的第63/083,544号美国临时专利申请的利益和优先权，所述临时专利申请的全部内容通过本发明的引用，成为本发明的一部分。
3.关于联邦政府资助研究的声明
4.本发明根据由美国国立卫生研究院授予的合同gm102498在美国政府支持下完成。政府对本发明享有某些权利。
5.作为文本文件提供的序列表的援引并入
6.随本发明提供的序列表为文本文件(stan-1688wo_seqlist_st25.txt)，该文本文件创建于2021年9月27日，大小为45000字节。所述文本文件的内容通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。


背景技术：

7.hedgehog信号在胚胎组织模式以及组织稳态与再生的胚胎后调节方面起到一定作用。hedgehog信号通路的胚胎后再生活动清楚地表明了通路激活的潜在治疗效果。然而，经临床检验，通路调制的唯一模态是抑制，对恶性肿瘤患者有明显效果，恶性肿瘤的发生和生长依赖于肿瘤(如髓母细胞瘤和基底细胞癌)原代细胞中的通路激活突变。
8.尽管有强效小分子通路激活剂可供使用，但是在通路激活疗法方面缺少临床关注，其原因可能是由于这样一种预期，即认为这种全身治疗可能会导致间充质增生，并可能引发或加重多个器官的纤维化。通过将通路激活限于特定的细胞类型，就有可能避免这些危险的副作用。
9.与靶向剂偶联的通路激动剂将实现这一目的，但是很难将天然hedgehog蛋白工程化为具有细胞类型特异性的蛋白。成熟hedgehog蛋白包含两种脂质修饰，包括羧基端的胆固醇部分和氨基端的棕榈酰加合物(对于信号活性尤其重要)。信号脂质修饰要求对组织靶向的大规模生产、储存和进一步衍生化提出了挑战。目前缺乏其他可以容易地与靶向剂偶联的合成或基因编码肽。


技术实现要素：

10.提供了与抗原结合结构域(abd)相关的组合物及方法，所述抗原结合结构域与特异性人ptch1构象优先结合并稳定所述特异性人ptch1构象，这会激活hedgehog信号通路。所述abd由一种或多种可变区多肽组成，所述可变区多肽与ptch1特异性结合并稳定ptch1。在一个实施例中，所述abd作为纳米抗体提供，包括但不限于seq id no：24(例如seq id no：18-seq id no：23)的多肽。研究人员特别关注seq id no：23的纳米抗体。在其他实施例中，所述序列包含seq id no：1-17中任一项所述的多肽。
11.所述abd可与各种效应多肽连接(例如偶联或融合)，这些效应多肽包括但不限于纳米抗体；抗体；及其片段和衍生物。实施例包括编码abd的多核苷酸；包含编码所述abd的多核苷酸的载体；经工程化表达所述abd的细胞；以及包含经工程化表达所述abd的细胞的
药物制剂。所述abd经工程化可通过与具有组织或细胞类型特异性的抗体或其他试剂融合进行靶向。
12.在一些实施例中，所述abd作为多肽提供，所述多肽可作为scfv与免疫球蛋白效应序列连接(例如偶联或融合)，所述scfv包括fc序列，例如任何同种型的人免疫球蛋白恒定区，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga等，或单个可变区结构域，例如纳米抗体等。
13.在一些实施例中，本发明提供的纳米抗体与靶向部分偶联或融合。靶向部分可通过连接子序列(例如多肽连接子序列)与纳米抗体连接。所述部分将纳米抗体靶向特定的目标器官、组织、组织室和细胞类型。
14.在一些实施例中，靶向部分包括胶原结合肽。本领域已知的胶原结合序列有很多，并可用于此目的。在一些实施例中，所述胶原是i型胶原。在一些实施例中，所述靶向部分包括seq id no：25。此序列将纳米抗体定位到间充质组织。
15.在一些实施例中，靶向部分包括将纳米抗体锚定在初级纤毛膜上的胞质尾区，所述靶向部分可与跨膜结构域连接。由于纤毛是抑制smoothened的定位和patched作用的主要部位，这种靶向作用使纳米抗体成为hh信号通路的特别强效激活剂。膜拴系进一步将其作用限制在细胞内，在细胞内表达(但通常不可扩散)。这种方法允许将通路激活限制在任何细胞类型，该细胞类型可以特异性靶向进行纳米抗体表达，例如采用对特定细胞类型具有嗜性的病毒，或通过在细胞类型特异性启动子控制下的表达。
16.在一些实施例中，所述abd包括具有所提供序列(即seq id no：1-23，包括但不限于seq id no：10及其变体，即seq id no：18-23)的一种或多种cdr的氨基酸序列变体。变体可包括cdr残基内或邻近cdr残基的一个或多个氨基酸插入，和/或cdr残基内或邻近cdr残基的缺失，和/或cdr残基的取代(其中取代是产生这种变体的优选类型的氨基酸改变)。这种变体通常具有结合亲和力或更高的亲和力；以及与seq id no：23的表位特异性相同的表位特异性。特别地，seq id no：24中指出的变异所需的残基经证明可用于增加abd的亲和力。
17.在一些实施例中，提供了一种治疗方法。通路激活在舌头味觉受体细胞的再生(化疗患者的味觉受体细胞通常会丧失或减少)、预防或恢复结肠炎等疾病、减少前列腺肥大组织增生、加快糖尿病骨骼愈合等方面具有治疗益处。一种方法可包括将本发明公开的abd多肽(例如包含seq id no：23的纳米抗体)引入到有需要的受体中。
18.在一些实施例中，提供了一种包括多核苷酸序列(编码包含本发明公开的abd的多肽，例如编码包含seq id no：23的纳米抗体)的载体，其中，所述编码序列与所需细胞中具有活性的启动子可操作地连接。在一些实施例中，所述启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。本领域已知的载体有很多种，并且可用于此目的，例如病毒载体、质粒载体、微环载体，这些载体可以整合到靶细胞基因组中，或者可以通过游离体维持。所述载体和/或多肽可以在试剂盒中提供。
附图说明
19.当结合附图阅读时，可以根据以下具体实施方式获得对本发明的最佳理解。需要强调的是，按照惯例，附图的各种特征并非等比例特征。相反，为了清楚起见，各种特征的尺寸经过了任意扩大或缩小。附图中包括以下图片。
20.图1.构象选择性纳米抗体的选择。(a)来自不同rnd转运蛋白的跨膜4(由上到下seq id no：31-34)和10(由上到下seq id no：35-38)的比对。带电残基标有星号。(b)纳米抗体选择步骤流程图。首先，对于与ptch1-nnq变体结合的克隆，采用macs对酵母文库进行富集，然后使用具有不同荧光标记的ptch1-nnq和ptch1-wt，在facs中选择偏好nnq变体的群体。(c)用ptch1-nnq(fitc标记)和ptch1-wt(alexa 647标记)染色的酵母细胞如facs图所示。右下象限中为偏好nnq变体(而非wt变体)的细胞。由于与fitc荧光团相比，与alexa 647荧光团的非特异性结合较多，因此双阳性群体向左上象限转移。(d)在hedgehog反应性3t3细胞上，采用gli依赖性荧光素酶报告基因，对大肠杆菌中表达和纯化的纳米抗体进行测试。gdc-0449(一种通路拮抗剂)是一种对照物，表明纳米抗体17、20和23在该测定中表现出弱激活。(e)对克隆17、20和23的初始纳米抗体序列进行诱变处理，并在酵母展示中进行选择，获得更高亲和力的克隆(亲和力成熟)。经过两轮亲和力成熟，新的纳米抗体变体ti23在3t3细胞中表现出的ec50为8.6nm，与天然hedgehog配体接近。(f)通过两轮亲和力成熟得到的ti23克隆表现出与ptch1-nnq变体结合的偏好。将表达nb23、t23或ti23的酵母细胞与1∶1蛋白c标记的ptch1-wt和1d4标记的ptch1-nnq蛋白的混合物孵育，然后用针对蛋白c标签或1d4标签的抗体进行染色。之所以将onecomp微球作为非选择性结合的对照物，是因为这些微球与κ链的恒定区结合，并且不区分用于染色的不同抗体。(g)根据qpcr测定的结果，在人间充质细胞系hepm中，ti23激活hedgehog反应并诱导通路靶标gli1(ec
50
＝16.0nm)和ptch1(ec
50
＝18.5nm)的转录。(h)在gli荧光素酶检测中，在nih-3t3细胞中滴定测量shhnp和ti23。经测定，shhnp和ti23的ec
50
分别为1.4nm和6.9nm。误差条表示标准差，所有数据点表示三次测试的平均值。
21.图2.小鼠ptch1：：ti23复合物结构概述。(a)ptch1：：ti23复合物的冷冻电镜图显示了蛋白质的清晰特征。ptch1，紫色；ti23，黄色。(b)具有ptch1和ti23的复合物的蛋白质模型颜色如a所示。图中发现的脂质样密度在位点i到iv中模型化。(c)ptch1示意图，显示了ti23的二级结构元件和相对位置以及脂质样密度。参与构象变化的关键螺旋突出显示为“开关螺旋”。(d)ti23在ptch1上的结合位点与shh(蓝绿色)的结合位点重叠。以紫色突出显示的开关螺旋夹在ti23的cdr1和cdr3中间。(e，f)详细显示了ti23 cdr与ptch1之间的相互作用。cdr1为橙色，cdr3为绿色，开关螺旋为紫色。cdr1的疏水相互作用在e中从膜上方观察，而cdr3的氢键相互作用在f中从ptch1蛋白的ecd2侧观察。
22.图3.ti23诱导的构象变化。(a)鼠类ptch1单独(pdb id：6mg8)或与ti23复合时形成的结构重叠表明，胞外结构域出现了两个主要变化。tm7与tm8之间的胞外结构域2在其与跨膜结构域的连接处绕枢轴转动5
°
。胞外结构域1中的短螺旋(开关螺旋)向膜的方向旋转约32
°
。单独ptch1中和复合物中的构象分别称为位姿1和位姿2。(b)其他已公布的ptch1结构也属于位姿1和位姿2类别。在其他ptch1结构的重叠中，位姿1样结构以红色阴影显示，位姿2样结构以蓝色阴影表示。(c)开关螺旋的旋转使胞外结构域内空腔形状发生改变。在ptch1结构中，导管末端加盖，如虚线(...)所示，而在ti23结构中，导管末端向外敞开，下部限流，用虚线(
‑‑‑
)标记。(d)这里绘制了沿导管分布的不同点处的半径，发生改变的部分用两条垂直线标记。ti23结合打开了导管上端，但关闭了脂质位点i的下部。(e)位点i中脂质样密度的位置随着ti23结合而发生变化。开关螺旋的旋转可以向外推动结合的底物，同时关闭进入路线。(f)在用ptch1转染的ptch1-/-mef中，在添加纯化的ti23或hedgehog配体
(shhn)后，质膜内叶(ipm)胆固醇活性立即增加。hedgehog配体导致ipm胆固醇活性增加速度稍快，约6分钟后趋于平稳。这种现象可能反映出这两种配体在疗效方面的差异，这是因为在gli依赖性荧光素酶检测中，ti23可在饱和浓度下诱导约75％的最大通路活性。在对照条件下，胆固醇活性在检测期间未发生改变。在终点(t＝10)处，ti23或shhn组的胆固醇活性显著高于缓冲液处理组(one-za\anova zlwk多重比较校正，p＜0.0001)。误差条表示标准差。对于shhn或ti23，n＝10。对于仅缓冲液对照，n＝5。
23.图4.皮肤中ti23活性的验证。(a)在收集皮肤进行组织学分析之前，小鼠注射aav-dj或使用小分子sag21k处理2周。在接受ti23、shhn或小分子sag21k的动物背部皮肤中，gli1表达(相对于hprt1)发生激活，表明ti23激活了皮肤中的hedgehog信号通路。绘制平均值和平均值标准误差曲线图。(b)背部皮肤的组织学表明，对照组的毛囊处于静止休止期，而在ti23、shhn或sag21k处理中，毛囊生长并侵入脂肪细胞层，表明存在生长期诱导。(c)与对照组相比，在经ti23或shhn处理的动物中，在注射病毒两周后观察到，毛发再生速度大大加快，表明这些毛囊正处于活跃的生长期。(d)舌背面示意图。在生理状态下，具有活跃hedgehog信号通路反应的细胞主要位于菌状乳头中。(e)舌上皮细胞(位于菌状乳头和丝状乳头中)中ti23诱导的gli1表达，如利用rnascope技术进行的原位杂交所示。注射后2周，处死接受aav-dj(编码对照纳米抗体(nb4)、ti23或shhn)的动物。在有通路激动剂ti23、shhn或小分子sag21k的情况下，在含有味觉受体细胞(ck8
+
，红色)的菌状乳头和丝状乳头中，gli1表达均有所增加，如插图所示。对于每个组，n＝4。(f)比较gli1在菌状乳头和丝状乳头区域之间的平均荧光强度。采用tukey多重比较的单向方差分析表明，与对照条件相比，ti23、shhn或小分子sag21k、gli1的表达水平有所增加。*，p＜0.05；**，p＜0.005；***，p＜0.0005；****，p＜0.0001。对于菌状区域，nb4、ti23、shhn和sag21k的n分别等于5、3、4和4。对于丝状区域，nb4、ti23、shhn和sag21k的n分别等于5、4、3和5。
24.图5.纳米抗体的选择。(a)采用facs过程中使用的抗体，对表达初始克隆的酵母细胞进行染色，以确保纳米抗体与ptch1蛋白直接结合。如b所述，克隆4、9和15表现出与抗体的强结合，因此在选择过程中是假阳性克隆。然后，纯化所有其他克隆，并测试除克隆13以外细胞的活性，克隆13不能从细菌中表达或纯化。(c)第一轮亲和力成熟的流程图。采用易错pcr，对来自克隆17、20和23的纳米抗体序列进行诱变处理，并转化到酵母中。在采用macs针对ptch1结合克隆富集后，在facs中选择酵母细胞。在最后的facs步骤中，首先将细胞与ptch1孵育，使纳米抗体结合，洗涤后，将细胞与亲本纳米抗体蛋白孵育，与ptch1竞争脱离细胞表面。竞争性追逐前后的facs图如d所示。由facs选择保留与ptch1结合的细胞。(e)第二轮亲和力成熟的流程图。采用一锅诱变法，对该序列进行诱变，并转化到酵母中。在具有类似的竞争性追逐的facs中，选择表达纳米抗体的酵母细胞。竞争前后的facs图如f所示。(g)采用miseq确定第2轮亲和力成熟文库的氨基酸序列，并在这里绘制成图。针对t77n和y102i变体，进行选择富集。(h)表达nb23、t23或ti23的酵母细胞优先与ptch1-wt结合，而非与ptch1-nnq结合。将与所有抗体同样结合良好的onecomp微球作为对照物。
25.图6.冷冻电镜数据验证。(a)在原始冷冻电镜显微照片中，蛋白粒子清晰可见。(b)对比度传递函数(ctf)的参数非常适合该数据集。(c)2d分类显示了ptch1-ti23复合物的清晰视图。(d)这里的流程图对冷冻电镜数据处理进行了总结。除最后一个局部细化步骤(该步骤由cistem进行)以外，所有步骤均在cryosparc中进行。(e)这里的球形直方图中总结了
粒子的定向。大多数粒子沿蛋白质的赤道进行定向。(f)这里绘制了最终细化的fsc曲线。根据0.143金标准fsc，最终图的分辨率估计为(g)在cryosparc中估计最终重建的局部分辨率，并在这里的3d模型中显示。除纳米抗体的一部分以外，大多数区域的分辨率都较高。
26.图7.蛋白质模型的特征。(a)蛋白质模型与冷冻电镜非常吻合。高质量图不仅能够对胞外结构域中的α螺旋结构进行可靠建模，而且能够对胞外结构域中的β链进行可靠建模。关键跨膜螺旋4和10中存在透明侧链密度能够实现关键带电三元组相互作用的建模。(b)胞外结构域中存在的大密度与gdn非常吻合，因此很可能是结合的gdn分子。(c)如模型图fsc曲线所示，该模型与冷冻电镜图非常吻合。(d)tm4和tm10之间的相互作用在ti23结合的鼠类ptch1结构(左)和shh结合的人ptch1结构(右；h1099、e1095和d513与鼠类残基h1085、e1081和d499相对应)之间区别很明显。
27.图8.acrb和ptch1构象变化的比较。(a)在acrb的三种不同构象(pdb id：2gif，链a中显示的l态，链b中显示的t态，链c中显示的o态)中，两个不同的位点(用三角形标记，一个靠近膜平面的下位点，以及一个靠近胞外结构域上部出口的上位点)交替打开和关闭。(b)膜远端的单个位点改变了已知ptch1结构中的构象。ptch1：ti23和单独的ptch1(6mg8)在这里作为示例显示。
28.图9.a：ti23collagen1(seq id no：26)的构建设计。sp：信号肽。b：舌背面(含上皮和间充质室)图。c和d：标准化为hprt管家基因的gli1相对表达的qpcr结果。用aav-dj包装好aav，并通过眼眶后注射，进入7-8周龄的fvb小鼠体内。请注意，无collagen1靶向序列的ti23以比ti23col1和nb4高11.7倍和13.5倍的滴度注射。病毒滴度表示为每只小鼠注射的病毒基因组(vg)：nb4collagen1的病毒滴度为7.1e+010vg/小鼠(阴性对照)，ti23collagen1的病毒滴度为8.2e+010vg/小鼠，ti23的病毒滴度为9.57e+011vg/小鼠。
29.图10.上图：纤毛膜拴系ti23纳米抗体的设计。将信号肽(sp)与ti23纳米抗体的n端融合进行分泌通路靶向，使用cd8的跨膜结构域(cd8tm)进行纳米抗体的细胞表面展示。通过将纤毛定位序列从sstr3融合到cd8跨膜结构域的c端，实现纤毛靶向。下图：纤毛膜拴系ti23的定位和活性验证。将编码纤毛膜拴系ti23的质粒转染到hedgehog信号通路活性报告基因细胞系中，当通路被激活时，该细胞系在gli启动子下表达h2b柠檬酸报告基因。由ti23与纤毛标志物乙酰化微管蛋白的共定位可以推知，mcherry信号显示了ti23的纤毛定位。柠檬酸报告基因仅在表达ti23的细胞中表达(箭头)，而未在相邻的未转染细胞中表达(箭头)，证明通过纤毛膜拴系ti23实现的通路激活是细胞自主性通路激活。比例尺，20μm。
30.图11.在nih 3t3细胞中使用双荧光素酶报告基因测定法验证纤毛膜拴系ti23的通路激活。构建体1-4单独采用gli-萤火虫/sv40海肾荧光素酶双报告基因质粒进行共转染。萤火虫/海肾荧光素酶的相对比率反映了hedgehog信号通路激活情况。与阴性对照gfp纳米抗体(构建体1)相比，纤毛膜拴系ti23(构建体2)表现出强劲的激活。sag21k是一种小分子通路激动剂。
具体实施方式
31.定义
32.在进一步描述本公开的实施例之前，应理解，本公开并不局限于所述的特定实施
例，当然，实施例可能会有所变化。还应理解，由于本公开的范围仅受所附权利要求书的限制，本发明中使用的术语仅旨在描述特定实施例，而非限制特定实施例。
33.除非另有定义，否则本发明中使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。在本公开实施例的实践或测试中也可采用与本发明所述方法和材料类似或等同的任何方法和材料。
34.必须注意，除非上下文另有明确规定，本发明和所附权利要求书中使用单数形式“一种(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指称对象。因此，提及“一种化合物”不仅包括单一化合物，而且包括两种或多种化合物的组合，提及“一种取代基”包括单一取代基以及两种或多种取代基，等等。
35.在描述和要求保护本发明时，将按照如下所列的定义使用某些术语。应理解，本发明中提供的定义并非旨在相互排斥。因此，某些化学部分可能属于一个以上术语的定义范围。
36.本发明中使用的短语“例如(for example)”、“例如(for instance)”、“如(such as)”或“包括(including)”旨在引入示例，进一步阐明更一般性的主题。这些示例仅作为理解本公开的辅助手段，而非旨在以任何方式限制本公开。
37.一般而言，本发明中采用的是本领域技术范围内蛋白质合成、重组细胞培养和蛋白质分离的常规方法以及重组dna技术。文献中对这类技术给出了全面解释说明，参见maniatis、fritsch和sambrook的《分子克隆：实验室手册》(1982)；sambrook、russell和sambrook的《分子克隆：实验室手册》(2001)；harlow、lane和harlow的《使用抗体：实验室手册：一号可移植方案》，美国冷泉港实验室出版社(1998)；以及harlow和lane的《抗体：实验室手册》，美国冷泉港实验室出版社；(1988)。
[0038]“包括”表示在组合物/方法/试剂盒中需要使用所述元件，而在权利要求范围内，可以包括其他元件，以形成组合物/方法/试剂盒等。
[0039]“基本上由......组成”表示将所述组合物或方法的范围限制在不会对主题发明的基本特征和新颖特征产生实质性影响的规定材料或步骤。
[0040]“由......组成”表示从组合物、方法或试剂盒中排除权利要求中未规定的任何元件、步骤或成分。
[0041]
本发明中使用的“纳米抗体”系指一种单域抗体，可命名为sdab，是一种由能够与抗原选择性结合的单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。纳米抗体可包括重链可变结构域或轻链可变结构域。具体地，本公开的纳米抗体包括重链可变结构域。纳米抗体可来源于骆驼科动物(vhh片段)或软骨鱼类(v
nar
片段)。可替代地，纳米抗体可来源于将来自igg的二聚可变结构域分裂成单体这一过程。
[0042]
纳米抗体包括主要负责抗原识别和结合的可变区，以及框架区。所述“可变区”，又称为“互补决定区”(cdr)，包括基于抗原识别在大小和序列上有很大差异的环。cdr通常负责纳米抗体的结合特异性。框架区与cdr截然不同。框架区相对保守，在整体蛋白质结构中起到辅助作用。框架区可包括由β-折叠和环结构组成的大溶剂暴露面。可包括本领域已知的信号序列，然后从成熟的纳米抗体上切割所述信号序列。
[0043]
本公开提供了与patched结合并激活hedgehog信号通路的纳米抗体。所述纳米抗体包括单个可变区抗原结合结构域(abd)。本发明中使用的术语abd系指与所需抗原特异性
结合的可变区多肽。abd是包含完整抗原识别和结合位点的最小片段，在本发明中作为单个多肽。正是在这种构型中，可变结构域的cdrs定义了结构域表面上的抗原结合位点。纳米抗体的示例包括本发明所述的示例，包括但不限于seq id no：10；以及seq id no：18-23，特别是seq id no：23。
[0044]
可以使用本领域已知的方法进行抗原亲和力的测定，例如biacore测量等。纳米抗体家族的成员可具有对同源抗原的亲和力，kd为约10-7-约10-11
，包括但不限于：约10-7-约10-10
；约10-7-约10-9
；约10-7-约10-8
约10-8-约10-11
；约10-8-约10-10
；约10-8-约10-9
；约10-9-约10-11
；约10-9-约10-10
；或这些范围内的任何值。亲和选择可以通过体外或临床前模型中活性的生物学评估以及潜在毒性评估进行确认。
[0045]
与目标抗原“结合”的纳米抗体或abd系指以足够的亲和力与抗原结合，使所述纳米抗体或结合分子可用作靶向抗原的诊断剂和/或治疗剂，并且不会与其他蛋白质发生显著的交叉反应。在这些实施例中，根据荧光激活细胞分选(facs)分析或放射免疫沉淀(ria)的测定结果，纳米抗体或其他结合分子与非靶向抗原的结合程度通常不会超过10％。
[0046]“功能性”或“生物活性”纳米抗体或抗原结合分子是一种能够在结构性、调节性、生物化学或生物物理事件中发挥一种或多种自然活性的分子。例如，功能性纳米抗体或其他结合分子可具有与抗原特异性结合的能力，并且这种结合反过来可以引起或改变细胞事件或分子事件，例如信号转导或酶活性。
[0047]
术语“可变”系指可变结构域的某些部分在序列上有很大差异，并用于每个特定可变结构域对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并非均匀分布在整个可变结构域中，而是集中在高变区。可变结构域的更多高度保守部分称为框架区(fr)。
[0048]
本发明中使用的术语“高变区”系指负责抗原结合的氨基酸残基。所述高变区可包括来自“互补决定区”或“cdr”的氨基酸残基，和/或来自“高变环”的残基。“框架区”或“fr”残基是除了本发明中定义的高变区残基以外的可变结构域残基。
[0049]
本发明中使用的术语“抗体”系在最广泛的意义上使用，具体涵盖了单克隆抗体、多克隆抗体、单体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、仅重链抗体、三链抗体、单链fv、纳米抗体等，还包括抗体片段(只要它们表现出所需的生物活性)(miller等人(2003)《免疫学杂志》170：4854-4861)。抗体可以是鼠抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或来源于其他物种的抗体。术语“抗体”可指全长重链、全长轻链、完整的免疫球蛋白分子；或这些多肽中任一种的免疫活性部分，即一种包括与目标靶标抗原或其一部分免疫特异性结合的抗原结合位点的多肽。免疫球蛋白可以是任何类型(例如igg、ige、igm、igd和iga)、类(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或子类的免疫球蛋白分子，包括经工程化的子类(具有改变的fc部分)，所述改变的fc部分提供降低或增强的效应细胞活性。免疫球蛋白可来源于任何物种。在一个方面，免疫球蛋白主要来源于人类。
[0050]
除非特别指出与此相反的情况，否则本发明所述和要求保护的术语“偶联物”系指通过一个或多个纳米抗体片段共价连接到一个或更多个附加分子(如聚合物分子、标记、细胞毒性剂、靶向部分等)而形成的异质分子。例如，聚合物可溶于水，即可溶于生理体液(如血液)，并且其中所述异质分子不含任何结构化聚集体。目标偶联物是peg。本发明中使用的词语“标签”系指与纳米抗体直接或间接偶联的可检测化合物或组合物。标记本身可以通过自身检测(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者对于酶标记，可以对可检测的底物化
合物或组合物的化学改变进行催化。
[0051]
连接子。可以通过连接子(例如多肽连接子或非肽连接子等)分离蛋白质的结构域。在一些实施例中，所述连接子是刚性连接子，在其他实施例中，所述连接子是柔性连接子。在一些方面，所述连接子部分是肽连接子。在一些实施例中，所述肽连接子包括2-100个氨基酸。在一些实施例中，所述肽连接子包括2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个氨基酸，但不大于100个氨基酸。在一些实施例中，所述肽连接子的长度介于5-75个、5-50个、5-25个、5-20个、5-15个、5-10个或5-9个氨基酸之间。示例性连接子包括具有至少两个氨基酸残基(例如gly-gly、gly-ala-gly、gly-pro-ala、gly-gly-gly-gly-ser)的线性肽。合适的线性肽包括聚甘氨酸、聚丝氨酸、聚脯氨酸、聚丙氨酸以及由丙氨酰残基和/或丝氨酸残基和/或脯氨酸残基和/或甘氨酰氨基酸残基组成的寡肽类。在一些实施例中，所述肽连接子包括选自由以下物质组成的基团的氨基酸序列：gly9、glu9、ser9、gly
5-cys-pro
2-cys、(gly
4-ser)3、ser-cys-val-pro-leu-met-arg-cys-gly-gly-cys-cys-asn、pro-ser-cys-val-pro-leu-met-arg-cys-gly-gly-cys-cys-asn、gly-asp-leu-ile-tyr-arg-asn-gln-lys和gly
9-pro-ser-cys-val-pro-leu-met-arg-cys-gly-gly-cys-cys-asn。在一个实施例中，连接子包括氨基酸序列gstsgsgkssegkg或(ggggs)n，其中，n为1、2、3、4、5等；但是本领域已知并使用了很多这样的连接子，这些连接子可用于此目的。
[0052]
在连接结合结构域方面得到应用的化学基团包括本领域已知的氨基甲酸酯；酰胺(胺加羧酸)；酯(乙醇加羧酸)、硫醚(卤代烷烃加巯基；马来酰亚胺加巯基)、希夫碱(胺加醛)、尿素(胺加异氰酸酯)、硫脲(胺加异硫氰酸酯)、磺胺(胺加磺酰氯)、二硫化物；脂类等。
[0053]
跨膜结构域。本公开的蛋白质可包括将表面结构域与细胞内胞浆结构域连接的跨膜结构域。所述跨膜结构域由在真核细胞膜中具有热力学稳定性的任何多肽序列组成。跨膜结构域可来源于天然存在的跨膜蛋白的跨膜结构域，或者可以是合成跨膜结构域。在设计合成跨膜结构域时，优选有利于α螺旋结构的氨基酸。跨膜结构域可由大约10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、22个、23个、24个或更多个有利于形成并具有α螺旋二级结构的氨基酸组成。在本领域内，有利于α螺旋构象的氨基酸是众所周知的。参见pace等人(1998)《生物物理杂志》75：422-427。在α螺旋构象中，特别优势的氨基酸包括甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸和赖氨酸。在一些实施例中，所述跨膜结构域可来源于来自i型跨膜蛋白的跨膜结构域，例如cd3ζ、cd4、cd8、cd28等，包括但不限于seq id no：28。
[0054]
本发明中使用的“靶向部分”是能够与治疗的预期靶标“结合配偶体”结合以定位到目标细胞或组织等的任何部分。例如，在靶标是细胞受体的情况下，靶向部分可以是受体配体。在一些实施例中，靶向部分是抗原结合结构域，在其他实施例中，优选较短的多肽序列；靶向部分的其他示例是本领域已知的示例，并且可以使用，例如适体、高亲和性多聚体
(avimer)、受体结合配体、核酸、生物素-亲和素结合对、结合肽或蛋白质等。在一些实施例中，靶向部分通过连接肽与本发明中公开的纳米抗体连接。
[0055]
靶向部分可以是与目标细胞表面分子结合的肽，包括但不限于胶原结合肽；具有rgd基序的整合素结合肽；纤毛定位序列(seq id no：29)等。胶原结合肽包括(seq id no：26)，纤连蛋白胶原结合序列，如cqdsetrtfy(seq id no：30)；或本领域已知的其他序列，参见farndale(2019)《生物化学评论》63(3)：337-348，所述出版物通过本发明的引用，成为本发明的一部分。在一些实施例中，所述靶向部分本身是与所需细胞类型或细胞外室结合的纳米抗体或单链抗体。
[0056]
两个序列之间的“同源性”由序列同一性决定。如果需要相互比较的两个序列的长度不同，则序列同一性优选涉及与较长序列的核苷酸残基相同的较短序列的核苷酸残基的百分比。可通过使用计算机程序，如最佳匹配(bestfit)程序(威斯康星序列分析包，unix第8版，威斯康星州麦迪逊科技园大道575号大学研究园遗传学计算机课题组，邮编53711)，确定序列同一性。为了找到两个序列之间具有最高序列同一性的片段，bestfit采用了smith和waterman的《应用数学进展2》(1981)482-489页的局部同源性算法。当使用bestfit或另一序列比对程序来确定某一特定的序列是否与本发明的参考序列具有95％的同一性时，优选以此方式调整参数，使得在参考序列的整个长度上计算同一性的百分比，并且允许同源性间隙占参考序列中核苷酸总数的5％。当使用bestfit时，所谓的任选参数优选保留其预设(“默认”)值。在给定的序列与本发明的上述序列之间进行的比较中出现的偏差可能由添加、缺失、取代、插入或重组导致。优选地，也可使用程序“fasta20u66”(2.0u66版本，1998年9月，由william r.pearson和弗吉尼亚大学开发；另见w.r.pearson(1990)《酶学方法》183，63-98，附加示例和http：//workbench.sdsc.edu/)进行这种序列比较。为此，可以使用“默认”参数设置。
[0057]“变体”系指具有在某种程度上与天然序列多肽不同的氨基酸序列的多肽。在通常情况下，氨基酸序列变体将具有至少约80％的序列同一性，更优选地，至少约90％、至少95％、至少99％的序列同源性，例如在参考氨基酸序列内的某些位置具有1个、2个、3个、4个或更多个氨基酸取代、添加或缺失。
[0058]
本发明中使用的术语“载体”旨在指一种能够运输与之相连的另一核酸的核酸分子。一种载体类型是“质粒”，指可在其中连接其他dna片段的环状双链dna环。另一种载体类型是病毒载体，其中，其他dna片段可连入病毒基因组。某些载体能够在其引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和其他游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)可在引入到宿主细胞中之后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导与可操作连接的基因的表达。这类载体在本发明中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般情况下，重组dna技术中的实用表达载体通常以质粒的形式存在。在本说明书中，质粒是最常用的载体形式，因此“质粒”和“载体”可以互换使用。
[0059]
本发明中使用的术语“宿主细胞”(或“重组宿主细胞”)旨在指通过引入外源性多核苷酸(如重组质粒或载体)而已经发生基因改变或能够发生基因改变的细胞。应理解，这类术语不仅旨在指特定的受试者细胞，而且也指这类细胞的子代。由于突变或环境影响，某些修饰可能发生在后代，因此这类后代实际上可能与亲本细胞不完全相同，但仍纳入本发
明中使用的“宿主细胞”范围内。
[0060]“结合亲和力”通常指分子的单个结合位点(例如纳米抗体或其他结合分子)与其结合配偶体(例如抗原或受体)之间非共价相互作用总和的强度。分子x对其配偶体y的亲和力通常可以用解离常数(kd)表示。可以采用本领域已知的常用方法(包括本发明中所述的方法)测量亲和力。低亲和力抗体与抗原(或受体)的结合较弱，易于解离，而高亲和力抗体与抗原(或受体)的结合更紧密，并能保持更长时间的结合。
[0061]
在一个实施例中，通过表面等离子体共振(spr)测定亲和力，例如biacore系统所使用的spr。通过测量相互作用的结合动力学，即可确定(例如)在25℃下一个分子对另一个分子的亲和力。
[0062]
术语“活性剂”、“拮抗剂”、“抑制剂”、“药物”和“药理学活性剂”在本发明中可互换使用，以指代在向生物体(人或动物)给药时通过局部和/或全身作用诱导所需的药理学和/或生理学作用的化学材料或化合物。
[0063]
本发明中使用的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等系指获得所需的药理学和/或生理学作用，例如降低病毒滴度。所述作用在完全或部分预防疾病或其症状方面可以是预防性作用，并且/或者在部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的不良作用方面可以是治疗性作用。本发明中使用的“治疗”涵盖对哺乳动物(特别是人)疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病或疾病症状在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病(例如，包括可能与原发性疾病相关或由原发性疾病引起的疾病)的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；(c)缓解疾病，即使疾病消退。
[0064]
在本发明中，术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”可互换使用且系指动物，包括但不限于人和非人灵长类动物(包括猿猴和人类)；啮齿动物(包括大鼠和小鼠)；牛科动物；马科动物；绵羊；猫科动物；犬属动物；鸟类等。“哺乳动物”系指任何哺乳动物物种的一个或多个成员，例如包括犬属动物；猫科动物；马科动物；牛科动物；绵羊；啮齿动物等以及灵长类，例如非人灵长类和人。实验研究可采用非人动物模型，例如哺乳动物，例如非人灵长类、鼠类、兔类等。
[0065]
本发明中使用的术语“测定(determining)”、“测量(measuring)”、“评估(assessing)”和“测定(assaying)”可互换使用，并且同时包括定量和定性测定。
[0066]
在本发明中，可互换使用的术语“多肽”和“蛋白质”系指任何长度的氨基酸的聚合形式，可包括编码和非编码氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸以及具有经修饰肽骨架的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和天然前导序列的融合，具有或不具有n端甲硫氨酸残基；免疫标记蛋白；具有可检测融合配偶体的融合蛋白，例如包括作为融合配偶体的荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等的融合蛋白；等等。
[0067]
术语“核酸分子”和“多核苷酸”可互换使用，并且系指任何长度的核苷酸的聚合形式，可以是脱氧核糖核苷酸，也可以是核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可具有任何3d结构，并且可执行任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性示例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转移rna、核糖体rna、核酶、cdna、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离dna、控制区、任何序列的分离rna、核酸探针和引物。核酸分子可以是线型或环状分子。
[0068]“治疗有效量(therapeutically effective amount)”或“有效量(efficacious amount)”系指当向哺乳动物或其他受试者给药以治疗疾病、病症或紊乱时，足以实现对该疾病、病症或紊乱的治疗的化合物的用量。“治疗有效量”将根据化合物、疾病及其严重程度以及接受治疗的受试者的年龄、体重等而异。
[0069]
本发明中使用的术语“单位剂型”系指适合作为人类和动物受试者的一次剂量的物理离散单位，每个单位含有预定数量的化合物，该化合物按照足以与药学上可接受的稀释剂、载体或溶媒联合产生所需作用的量进行计算。单位剂型的规格取决于所采用的特定化合物和要实现的作用，以及与宿主中每种化合物相关的药效动力学。
[0070]“药学上可接受的辅料”、“药学上可接受的稀释剂”、“药学上可接受的载体”和“药学上可接受的佐剂”系指可用于制备药物组合物的辅料、稀释剂、载体和佐剂，这些材料一般安全无毒，无论从生物学上还是其他方面都能满足需要，并且包括可接受用于兽用用途以及人类药物用途的辅料、稀释剂、载体和佐剂。说明书和权利要求书中使用的“药学上可接受的辅料、稀释剂、载体和佐剂”同时包括一种或多种这类辅料、稀释剂、载体和佐剂。
[0071]
本文中使用的“药物组合物”旨在包含适合向受试者(如哺乳动物，特别是人类)给药的组合物。“药物组合物”一般是无菌的，优选地，药物组合物不含有能够在受试者体内引起不良反应的污染物(例如，药物组合物中的化合物是医药级化合物)。药物组合物可以旨在通过多种不同的给药途径(包括口服、口腔给药、直肠给药、胃肠外给药、腹腔给药、皮内给药、气管内给药、肌内给药、皮下给药等)向有需要的受试者或患者给药。
[0072]
使用方法
[0073]
纳米抗体可同时用于预防疾病和治疗目的。因此，本发明中使用的术语“治疗(treating)”用于指疾病的预防和对已有病症的治疗。在某些情况下，预防表示在确定为有疾病或病症发展风险的患者中抑制或延缓疾病或病症的发作。治疗持续性疾病，以稳定或改善患者的临床症状，这是本发明提供的特别重要的益处。最好是在受影响的组织出现功能丧失之前进行这种治疗；因此，本发明提供的预防性治疗益处也很重要。证明治疗效果的证据可以是疾病严重程度减轻。可根据临床结果衡量治疗效果，或者通过免疫学或生化检验确定治疗效果。接受治疗的患者可以是哺乳动物，例如灵长类动物(包括人类)，也可以是实验室动物，例如兔、大鼠、小鼠等，特别是用于疗法评估的实验室动物(马、狗、猫、农场动物等)。
[0074]
根据病症的性质、给药频率、给药方式、清除宿主中的药剂等，治疗制剂(例如药物组合物)的剂量将会有广泛的差异。在特定实施例中，初始剂量可以较大，后续维持剂量较小。在某些实施例中，可以每周或每两周偶尔给药一次，或者分成较小的剂量每天或每半周给药一次，或者根据需要保持有效的剂量水平。
[0075]
在本发明的一些实施例中，包含纳米抗体的组合物或制剂通过局部给药进行给药。本发明中使用的局部给药不仅指身体局部给药，而且指在治疗部位向体内注射或以其他方式引入体内。这种给药的示例包括肌肉注射、皮下注射、腹腔注射等。在其他实施例中，将包含纳米抗体的组合物或制剂进行全身给药，例如口服或静脉注射。在一个实施例中，包含纳米抗体的组合物或制剂通过输注进行给药，例如在一段时间内连续输注，例如10分钟、20分钟、3分钟、1小时、2小时、3小时、4小时或更长时间。此外，为了使味觉受体细胞再生，可以在舌头上局部使用味觉受体细胞(例如漱口水)，将味觉受体细胞掺入要放在舌头上的膜
中，等等。结肠炎治疗可以采用栓剂法。前列腺增生可以采用经尿道递送；前列腺组织注射；等等。
[0076]
在本发明的一些实施例中，组合物或制剂可短期给药，例如单次给药，或者在1天、2天、3天或更多天(最多1周或2周)内进行一系列给药，使活性快速显著增加。给药剂量的大小必须由医生决定，并且取决于许多因素，如疾病的性质和严重程度、患者年龄和健康状况以及患者对药物本身的耐受性。
[0077]
在本发明的某些方法中，向细胞提供有效量的包含纳米抗体的组合物，例如通过使细胞与有效量的组合物接触，从而达到预期效果。在特定实施例中，所述接触在体外、离体或体内发生。在特定实施例中，所述细胞来源于或存在于需要增加hedgehog信号的受试者体内。
[0078]
在其他实施例中，使用病毒载体、质粒载体、crispr靶向等，向细胞提供编码本发明中公开的纳米抗体的核酸组合物，从而在所需细胞中表达多核苷酸。
[0079]
在本发明的一些方法中，提供有效量的主题组合物，以增强细胞中的hedgehog信号。从生物化学角度来讲，纳米抗体的有效量或有效剂量是使细胞中hedgehog信号相对于没有纳米抗体情况下的信号增加至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的用量。可通过本领域普通技术人员已知的多种方式，确定细胞活性的调制量。
[0080]
从临床意义上讲，纳米抗体组合物的有效剂量是指，当在合适的时间段(例如至少约一周，并且可能约两周或更长时间，最多约4周、8周或更长时间)对受试者进行给药时，证明与缺少信号相关的症状发生改变的剂量。在一些实施例中，有效剂量不仅可以减缓或停止病情进展，还可以诱导病情的逆转。本领域技术人员应理解，初始剂量可以在这类时间段内给药，后续给予维持剂量，在某些情况下，维持剂量将处于降低的剂量水平。
[0081]
计算需要给药的纳米抗体组合物的有效量或有效剂量属于本领域普通技术人员的技术范畴，并将成为本领域技术人员的例行工作。毋庸置疑，最终给药量将取决于给药途径和需要治疗的紊乱或病症的性质。
[0082]
适用于本主题方法的细胞是包含一种或多种fzd受体的细胞。待接触的细胞可以在体外(即在培养物中)，或者可以在体内(即在受试者中)。细胞可来自/存在于任何生物体中，但优选来自哺乳动物，包括人类、家畜和农场动物，以及动物园动物、实验室动物或宠物，如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔、大鼠、小鼠、青蛙、斑马鱼、果蝇、蠕虫等。优选地，哺乳动物是人类。细胞可来自任何组织。细胞可以是冷冻细胞，或者也可以是新鲜细胞。它们可以是原代细胞，或者也可以是细胞系。细胞通常是体内使用的原代细胞，或在引入受体之前经过离体处理的原代细胞。
[0083]
体外细胞可通过本领域众所周知的各种方法中的任一种与包含纳米抗体的组合物接触。例如，可以在培养受试者细胞的培养基中将所述组合物提供给细胞。在本领域众所周知的促进细胞摄取的条件下(例如电穿孔、氯化钙转染和脂质转染)，编码纳米抗体的核酸可以提供给受试者细胞或在载体上与受试者细胞共培养的细胞。可替代地，编码纳米抗体的核酸可通过病毒提供给受试者细胞或与受试者细胞共培养的细胞，即细胞与包含编码多肽的核酸的病毒颗粒接触。逆转录病毒(例如慢病毒)之所以特别适用于本发明的方法，是因为它们可用于转染非分裂细胞(参见uchida等人(1998)《美国科学院院报》(p.n.a.s.)
95(20)：11939-44)。常用的逆转录病毒载体是“有缺陷的”载体，即不能产生生产性感染所需的病毒蛋白。相反，载体复制需要在包装细胞系中生长。
[0084]
治疗剂量可以是至少约1μg/kg体重、至少约5μg/kg体重、至少约10μg/kg体重、至少约50μg/kg体重、至少约100μg/kg体重、至少约250μg/kg体重、至少约500μg/kg体重，不超过约10mg/kg体重。本领域技术人员应理解，这类指南将针对活性剂的分子量进行调整，例如在使用蛋白质偶联物(例如聚乙二醇化的蛋白质)时。对于局部给药(例如鼻内、吸入等)，或对于全身给药(例如肌肉注射、腹腔注射、静脉注射等)，剂量也可以变化。
[0085]
同样，采用本领域中用于向受试者施用肽、小分子或核酸的众所周知的各种方法中的任一种，可使体内细胞与主题纳米抗体组合物接触。可将纳米抗体组合物掺入多种制剂或药物组合物中，在一些实施例中，在没有洗涤剂、脂质体等的情况下配制这些制剂或药物组合物，而天然hedgehog蛋白的配制同样如此。
[0086]
在一些实施例中，本发明化合物经给药可用于治疗病变组织或受损组织、用于组织再生、用于细胞生长和增殖和/或用于组织工程。特别地，本发明提供了纳米抗体或编码纳米抗体的多核苷酸用于组织再生或修复或其他病理状态。
[0087]
采用本发明的组合物进行治疗时，目标条件包括但不限于需要再生细胞生长的多种条件。这种条件可以包括骨生长增强或再生，例如在骨再生、骨移植物、骨折愈合等方面；味觉受体再生、结肠炎或粘膜炎的治疗等。
[0088]
需要增强骨生长的条件可包括但不限于骨折、移植物、假体装置周围的向内生长等。可采用纳米抗体增强骨骼愈合。在很多临床情况下，由于骨形成细胞的活性降低(例如在老年人体内、受伤后、成骨不全等)，因此骨骼愈合条件不太理想。多种骨骼和软骨障碍都对老年个体产生了一定影响。这种组织通常由间充质干细胞再生。这种情况包括骨关节炎。在加快骨修复的方法中，例如在受伤后，向患有骨骼损伤的患者施用本发明的药物组合物。在发生需要骨再生的损伤之后，优选在损伤部位或损伤部位附近施用所述制剂。在备选方法中，向患有骨骼损伤的患者提供包含骨髓细胞的组合物，例如包含间充质干细胞、能够分化为成骨细胞的骨髓细胞等的组合物；等等。可采用足以增强再生的剂量的药物组合物或蛋白质，对骨髓细胞进行离体处理。
[0089]
在其他实施例中，本发明的组合物用于味觉受体组织的再生。本发明的组合物可用于输注；基质或其他储药系统；或其他旨在增强再生的舌头局部应用。
[0090]
各种表皮病症均受益于本发明化合物的治疗，例如当胃肠道中快速分裂的上皮细胞发生破裂时，会使组织更易发生溃疡和感染，导致结肠炎、粘膜炎等。粘膜组织(又称为粘膜或黏膜)排列在所有与空气相通的身体通道(如呼吸道和消化道)上，并具有分泌黏液的细胞和相关腺体。这个覆盖口腔的内衬部分称为口腔粘膜，它是身体最敏感的部位之一，特别易受化疗和放疗的影响。
[0091]
在一些实施例中，提供了一种用于脱发的治疗方法，所述方法通过通路激活来促进毛发再生(参见paladini等人《研究性皮肤病学杂志》125：638-646，2005)，在这类实施例中，可以通过透皮贴剂或微针递送来实现给药。
[0092]
对于非侵袭性高危膀胱癌症的治疗，已知的方法是向膀胱中滴注卡介苗(bcg，牛结核病)。在一些实施例中，将主题abd的编码序列引入到这些细菌中进行表达和分泌。hh信号通路激活可以抑制膀胱癌从非侵袭性形式发展到致命侵袭性形式(参见shin等人《癌症
细胞》14；roberts等人《癌症细胞》17)。
[0093]
患者可以是任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人类、非人灵长类动物、啮齿动物等。患者通常是人类。本发明的替代物或包含本发明替代物的化合物或组合物的治疗方法和医疗用途可促进组织再生。
[0094]
在一些实施例中，本发明提供了如前所述的治疗方法和医疗用途，其中，将两种或多种纳米抗体同时、按顺序或单独给予动物或患者。
[0095]
在一些实施例中，本发明提供了如前所述的治疗方法和医疗用途，其中，将本发明的一种或多种纳米抗体与一种或多种附加化合物或药物联合给予动物或患者，其中，所述纳米抗体和所述附加化合物或药物同时、按顺序或单独给药。
[0096]
在非治疗性方法(例如体外研究方法)中，本发明的纳米抗体也具有广泛的应用。
[0097]
表达构建体：在本方法中，可采用重组方法产生纳米抗体。通过向dna编码序列中引入适当的核苷酸变化，制备氨基酸序列变体。可包括信号序列进行纳米抗体的分泌。这种变体表示氨基酸序列一端或两端内或一端或两端处残基的插入、取代和/或指定的缺失。将插入、取代和/或指定缺失进行任意组合，以得到最终构建体，但是所述最终构建体需具有本发明中定义的预期生物活性。氨基酸变化也可改变多肽的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数量或位置、改变膜锚定特性和/或通过插入、缺失或以其他方式影响多肽的前导序列来改变细胞位置。
[0098]
可将编码所述纳米抗体的核酸插入到可复制型载体中进行表达。这样的可用载体有很多。载体组成部分通常包括但不限于以下一种或多种：复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
[0099]
表达载体将包含由宿主生物识别的启动子，所述启动子与纳米抗体编码序列可操作地连接。启动子是位于结构基因起始密码子上游(5
′
)的非翻译序列(通常在约100bp-1000bp范围内)，所述启动子可以控制与其可操作连接的特定核酸序列的转录和翻译。这种启动子通常分为诱导型启动子和组成型启动子两类。诱导型启动子系指为了应对培养条件的一些变化(例如存在或不存在营养素，或温度变化)，使dna转录水平在启动子控制下开始增加的启动子。
[0100]
适合与原核宿主搭配使用的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统以及杂合启动子(如tac启动子)。然而，其他已知的细菌启动子也适合与原核宿主搭配使用。现已公布这种核苷酸序列，从而使技术人员能够将它们可操作地连接到dna编码序列。用于细菌系统的启动子还将包含与所述编码序列可操作地连接的shine-dalgarno(s.d.)序列。
[0101]
对于真核生物，启动子序列是已知的。适合与酵母宿主搭配使用的启动序列示例包括用于3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶(例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶)的启动子。其他酵母启动子(即具有转录受生长条件控制这一额外优势的诱导型启动子)是以下物质的启动子区：乙醇脱氢酶2、异细胞色素c、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。ep 73，657进一步描述了适用于酵母表达的载体和启动子。在有利的情况下，酵母增强子也可与酵母启动子搭配使用。
[0102]
可以从病毒(如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒，以及最优选地，猿猴病毒40(sv40)的基因组获得、从异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子、pgk(磷酸甘油酸激酶)或免疫球蛋白启动子)获得、从热激启动子获得控制从哺乳动物宿主细胞中的载体进行转录的启动子，但是这种启动子需要与宿主细胞系统相容。可方便地作为sv40限制性片段获得sv40病毒的早期和晚期启动子，所述片段还包含sv40病毒复制起点。可以方便地作为hindiii e限制性片段获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。
[0103]
通常，通过将增强子序列插入到载体中来增加高等真核生物转录。增强子是dna的顺式作用元件，通常约为10bp-300bp，这些增强子作用于启动子，以增加启动子的转录。相对而言，增强子与定向和位置无关，已经发现位于内含子中以及编码序列中转录单元的5
′
端和3
′
端。目前已知的很多增强子序列来自于哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。然而，通常情况下，人们会使用来自真核细胞病毒的增强子。其示例包括位于复制起点晚期侧的sv40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子以及腺病毒增强子。可以在编码序列的5
′
或3
′
位置将增强子剪接至表达载体中，但是优选位于启动子的5
′
位点。
[0104]
真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类或来自其他多细胞生物体的有核细胞)中使用的表达载体也可以包含转录终止和使mrna稳定所需的序列。通常可从真核或病毒dna或cdna的5
′
非翻译区获得此类序列，偶尔从3
′
非翻译区获得。
[0105]
采用标准技术，构建含有一种或多种上述组成部分的合适载体。可以以产生所需质粒的预期形式，对分离的质粒或dna片段进行切除、剪裁和重新连接。分析时，为了证实所构建质粒中的序列正确，使用连接混合物对宿主细胞进行转化，在适当的情况下，通过氨苄青霉素或四环素抗药性选择成功的转化子。制备来自转化子的质粒，并利用限制性内切酶酶切技术进行分析和/或测序。
[0106]
用于克隆或表达本发明载体中dna的合适的宿主细胞是上述原核生物、酵母或高等真核细胞。为此，合适的原核生物包括真细菌(如革兰氏阴性或革兰氏阳性菌)，例如肠杆菌科(如埃希氏菌)，例如大肠杆菌、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属(例如鼠伤寒沙门氏菌)、沙雷氏菌属(例如粘质沙雷氏菌)、志贺氏菌属以及杆菌(如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)、假单胞菌属(如铜绿假单胞菌)和链霉菌属。以上为说明性示例，而非限制性示例。
[0107]
除原核生物以外，真核微生物(如丝状真菌或酵母)也是合适的表达宿主。酿酒酵母(又称普通面包酵母)是低等真核宿主微生物中最常用的酵母。然而，本发明中还有很多其他常见且有用的属、物种和菌株，如粟酒裂殖酵母；克鲁维酵母宿主(如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母等)；巴斯德毕赤酵母；假丝酵母；粗壮脉纹孢菌；施氏酵母属(如许旺酵母)；以及丝状真菌(如青霉属、弯颈霉属和曲霉菌宿主(如构巢曲霉和黑曲霉))。
[0108]
可以采用棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。通常，通过与某些根癌农杆菌菌株孵育转染植物细胞。在植物细胞培养物的孵育过程中，将dna编码序列转移到植物细胞宿主并转染，并将在适当条件下表达dna。此外，还有与植物细胞相容的调节和信号序列，例如胭脂碱合成酶启动子和聚腺苷酸化信号序列。
[0109]
有用的哺乳动物宿主细胞系的示例是小鼠l细胞(l-m[tk-]，atcc#crl-2648)、由
sv40转化的猴肾cv1系(cos-7，atcc crl 1651)；人胚肾系(经亚克隆以便在悬浮培养物中生长的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(bhk、atcc ccl 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-dhfr(cho)；小鼠睾丸支持细胞(tm4)；猴肾细胞(cv1atcc ccl 70)；非洲绿猴肾细胞(vero-76，atcc crl-1587)；人宫颈癌细胞(hela，atcc ccl 2)；犬肾细胞(mdck、atcc ccl 34)；水牛大鼠肝细胞(brl 3a，atcc crl 1442)；人肺细胞(w138，atcc ccl 75)；人肝细胞(hep g2，hb 8065)；小鼠乳腺肿瘤(mmt 060562，atcc ccl51)；tri细胞；mrc 5细胞；fs4细胞；以及人肝癌细胞系(hep g2)。
[0110]
用上文所述的用于纳米抗体产生的表达载体转化宿主细胞，并在适当时修饰的常规营养培养基中培养，用于诱导启动子，选择转化子或扩增编码所需序列的基因。可以在多种培养基中培养哺乳动物宿主细胞。市售培养基(如ham
′
s f10(sigma)、最低基础培养基((mem)，sigma)、rpmi 1640(sigma)和达尔伯克改良伊格尔培养基((dmem)，sigma)适于培养宿主细胞。这些培养基中的任一种都可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如hepes)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素、痕量元素和葡萄糖或等效能源。还可以适当浓度包括本领域技术人员将知晓的任何其他必要的补充物。培养条件(如温度、ph值等)是先前为了表达而选择的宿主细胞所使用的条件，对于普通技术人员来说，这些条件是显而易见的。
[0111]
现在对本发明进行全面说明，对于本领域普通技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可以做出各种改变和修改。
[0112]
实验性示例
[0113]
给出以下示例旨在向本领域普通技术人员提供关于如何制作和使用本发明的完整公开和说明，而非旨在限制发明人认定的发明范围，亦不旨在表示以下实验是所进行的全部或唯一实验。尽最大努力确保所使用数字(如数量、温度等)的准确性，但同时也要考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份数，分子量为重量平均分子量，温度单位为摄氏度，压力为大气压力或接近大气压力。
[0114]
本说明书引用的所有出版物和专利申请通过本发明的引用，成为本发明的一部分，就好像具体且单独地说明每个单独出版物或专利申请通过引用成为本发明的一部分。
[0115]
依据本发明人发现或提出的特定实施方案来描述本发明，以便包括本发明实践的优选方式。本领域技术人员应理解，按照本公开内容，在不偏离本发明预定范围的情况下，可以对示例性的特定实施方案进行很多修改和改变。例如，由于密码子冗余，在不影响蛋白质序列的情况下，可以对基本dna序列进行改变。另外，出于生物功能相当的考虑，在不影响生物作用的种类或数量的情况下，可以对蛋白质结构进行改变。所有修改均纳入所附权利要求的范围内。
[0116]
示例1
[0117]
通过纳米抗体介导的patched固醇导管构象阻断来激活hedgehog信号通路
[0118]
hedgehog信号通路激活具有改善骨骼愈合、味觉受体细胞再生和缓解结肠炎或其他病症的治疗价值。然而，全身通路激活可能会产生有害影响，且目前缺乏适用于组织靶向治疗的药剂。我们研制了一种新型激动剂，即一种针对hedgehog受体patched1的构象特异性纳米抗体。该纳米抗体通过稳定patched1“开关螺旋”的替代构象，在体外和体内激活hedgehog信号通路，如冷冻电镜结构所示。纳米抗体结合可能会在其运输周期的一个阶段
内捕获patched，从而阻止基底通过patched1固醇导管移动。与天然hedgehog配体不同，这种纳米抗体不需要脂质修饰即可具有活性，有利于hedgehog信号通路激活的机制研究和治疗用通路激活剂的工程化。我们的构象选择性纳米抗体法通常适用于其他ptch1同源物的研究。
[0119]
hedgehog的主要受体是patched1(ptch1)，它通过抑制下游g蛋白偶联受体(gpcr)样蛋白smoothened(smo)来维持通路的静止状态。当与hedgehog结合时，ptch1失活，使smo变得活跃起来，并触发下游信号事件。从机制上来看，smo的激活需要固醇的结合，固醇可能会从质膜的内叶进入7tm束。我们提出了ptch1通过从质膜的内叶转运固醇来防止smo激活，从而限制smo获得激活固醇。为了获得这种转运活性，需要使用穿过ptch1胞外结构域的疏水性导管，hedgehog通过插入其必需的氨基末端棕榈酰加合物来阻断该导管并使ptch1失活。在通常情况下，转运蛋白通过经历构象变化的重复循环来发挥作用。如果ptch1转运功能采用了这种构象循环，则与特异性ptch1构象优先结合并稳定该特异性ptch1构象的药剂预期将会打乱其构象循环和转运活性，从而允许smo激活。因此，这种药剂可作为通路调节剂，这种通路调节剂可能会使脂质修饰变得不那么重要，并可以揭示ptch1工作循环期间发生的构象变化。
[0120]
结果
[0121]
开发一种能够激活通路的构象特异性纳米抗体。纳米抗体是单链抗体片段，现已用于稳定特异性gpcr蛋白质构象，并且适用于基因工程。我们选择将合成酵母展示文库作为起点，以选择针对ptch1的构象特异性纳米抗体。为了选择构象特异性纳米抗体，我们首先通过改变埋在ptch1跨膜结构域内的三个酸性残基(d499n、d500n、e1081q，命名为ptch1-nnq)，在ptch1中引入构象偏置。rnd转运蛋白家族中的保守酸性残基是固醇转运和smo调节中获得ptch1活性所需的酸性残基，并且一般而言，提出此酸性残基的目的旨在驱动rnd转运蛋白响应阳离子内流而发生的构象变化(图1a)。因此，我们推断ptch1中这些残基的改变可能会影响其构象状态的相对值表示法。
[0122]
使用经纯化的ptch1-nnq变体蛋白，从酵母展示文库中选择纳米抗体克隆。经过几轮的ptch1-nnq结合酵母克隆富集，我们利用facs(荧光激活细胞分选)以及用与不同荧光团偶联的抗体标记的野生型和nnq ptch1蛋白，选择了与ptch1-nnq优先结合(与野生型ptch1相比)的纳米抗体(图1b)。表达优先结合纳米抗体的酵母细胞在facs图的对角线外形成一个群体(图1c)。在nnq偏好群体中选择纳米抗体表达酵母细胞后，通过测序鉴定了15个独特克隆，其中有3个已弃用，这是因为它们直接与选择过程中使用的抗体结合(图5a，b)。由于ptch1和ptch1-nnq的差别仅在于跨膜结构域中的酸性残基，因此在纳米抗体结合方面的差异很可能源于ptch1和ptch1-nnq之间的构象状态差异。
[0123]
特异性ptch1构象的稳定化预期将使其转运活性失活，并使hedgehog信号通路中出现下游反应。因此，我们利用gli依赖性荧光素酶检测，测试了经纯化的纳米抗体蛋白在3t3-light2细胞上的活性。克隆17、20和23表现出弱活化作用(图1d)。通过两轮亲和力成熟，增强了信号效力，首先从易错pcr文库中选择(图5c，d)，然后采用一锅诱变法，从靶向互补决定区(cdr)的文库中选择(图5e，f)。第一轮亲和力成熟产生了一系列源自克隆23(seq id no：10)(“nb23”)的纳米抗体克隆，cdr3中具有h105r、g106r取代，cdr2中的g50处具有几个变体残基。在这些变体中，仅表达g50t取代(命名为t23)，以便从大肠杆菌中纯化。在gli
依赖性荧光素酶检测中，t23的效力优于其nb23亲本(图1e)，并用作第二轮亲和力成熟的起始序列，其中所有cdr残基在一锅诱变法中均经过系统随机化处理。在做出基于ptch1结合的选择之后，cdr3中的y102i发生富集，t77n(一种非计划取代)也发生富集(图5g)。经纯化，该变体(命名为“ti23”(seq id no：23))可用于进一步特征化，与其t23亲本相比，该变体在通路激活中表现出了更大的效力(图1e)。表达这些变体的酵母细胞的双色染色表明，所有纳米抗体变体均表现出对ptch1-nnq的优先结合(图1f；图5h)。在来源于人胚胎腭间充质(hepm)的细胞系中测试时，ti23也在低纳摩尔浓度下强烈激活了人hedgehog信号通路靶标gli1和ptch1(图1g)。与shhnp相比，ti23表现出了相似的效力，但效力始终较低。由ti23诱导的最大反应约为shhnp的75％，这一结果表明ti23是一种部分激动剂(图1h)。
[0124]
ptch1：：ti23复合物的结构。为了测定ti23与ptch1结合的构象效应，我们制备了用于冷冻电镜结构测定的ptch1：：ti23复合物。所述复合物在冷冻电镜显微照片中清晰可见(图6a)，具有良好拟合的对比度传递函数参数(ctf；图6b)和2d类平均值(图6c)。通过冷冻电镜数据集的3d重建，得到分辨率为(图6f)的高质量图(图2a；图6d中的程序)。所有12个跨膜(tm)螺旋和两个主要胞外结构域(ecd)均进行了解析(图2a)，并基于该图和先前确定的鼠类ptch1结构(24)构建了ptch1：：ti23复合物的原子模型。除了先于tm1和tm7的两个横向螺旋，大多数细胞内序列未解析，也未建模(图2b)。
[0125]
在多个位点中鉴定出固醇样密度，其中一个位点位于ecd1远端的袋中(离膜最远，密度i)，一个位点位于作为转运导管一部分提出的空腔中(ii)，还有两个位点位于跨膜结构域的外围(iii和iv)(图2b)。位点ii中的密度经过特别良好的解析，其特别的“y”字形充分说明固醇样密度也极有可能是gdn，但仅对gdn的甾体部分(洋地黄毒甙)进行了解析和建模。
[0126]
纳米抗体仅与ptch1的ecd1相互作用，如示意图所示(图2c)。ti23的结合位点与shh的结合位点重叠，而shh与ecd1和ecd2同时相互作用(图2d)。ti23纳米抗体的cdr1和cdr3环从不同的角度与ptch1ecd1中的短螺旋相接触(图2c中突出显示的“开关螺旋”)。cdr1通过将疏水性残基i28和f29插入脂质位点i处的疏水袋与ptch1相互作用(图2e)，而cdr3主要与ptch1表面的其他残基形成氢键网络(图2f)。
[0127]
尽管ti23仅与ecd1相互作用，但是我们注意到跨膜结构域内侧链的分辨率有了显著提高。特别值得注意是，与大多数其他已公布的ptch1结构中的带电残基三元组相比，tm4和tm10中为了选择ti23而发生改变的带电残基三元组的解析效果更好。因此，我们注意到，ptch1：：ti23复合物中的tm4和tm10通过h1085与d499之间的盐桥互相联系，而在shh结合的ptch1结构中，这种相互作用受到了破坏(图7d)。这种与纳米抗体相关的跨膜结构域侧链相互作用变化表明，ecd与跨膜结构域之间存在潜在的变构现象。
[0128]
ptch1：：ti23复合物的整体结构类似于未结合的鼠类ptch1结构，在910个残基之上，ca碳原子的均方根偏差为0.955a。在所述复合物中，ecd1和ecd2均表现出一些构象差异。其中一处微小的差异在于，与单独的ptch1相比，ecd2围绕其与tm结构域的连接点向ecd1的方向旋转约5度(图3a)。更显著的差异在于，ecd1内“开关螺旋”的远端向膜的方向旋转约32度，其旋转方式让人联想到了翻转式开关(图3a，插图)。我们将单独ptch1和ptch1：：ti23复合物中的开关螺旋构象分别称为位姿1和位姿2(图3a，插图)。开关螺旋存在这两种交替位姿，但在各种条件下确定的其他ptch1结构中，这两种交替位姿基本上并不明显。例
如，在与两个人ptch1分子结合的单一天然shh配体的三元复合物中(23)，来自链a的ptch1(即由于固醇导管与shh配体的n端棕榈酰部分相互作用而使固醇导管发生阻断的分子)采用位姿2，而来自链b的ptch1采用位姿1。事实上，在所有已公布的ptch1结构中，开关螺旋采用了这两种位姿中的一种或另一种，这表明它们代表了ptch1活性循环内优先填充的离散替代构象(图3b)。值得注意的是，当跨膜结构域中h1085与d499之间的盐桥出现破损时，在经过最佳解析的shh-ptch1结构中，胞外结构域中的开关螺旋采用位姿1。相比之下，ptch1：：ti23复合物在这两个位点均采用替代构象(图7)。这些变化与跨膜结构域中的带电残基与胞外结构域中的开关螺旋之间的变构现象一致。对于tm4和tm10中的带电残基，其他ptch1结构中的任何一个ptch1结构都不具有经过清晰解析的侧链，从而排除了进一步比较。
[0129]
开关螺旋对固醇导管的影响。根据caver程序的评估，这些结构重排改变了转运导管的形状(图3c)。因此，在鼠类ptch1中，包含固醇i的导管区域在ptch1：：ti23复合物的导管中发生急剧收缩，ptch1：：ti23复合物中的导管也获得了通向外部的远端开口(图3d)。在发生这种导管形状变化的同时，经结合的固醇样密度从更近端的封闭腔转移到更远端的位置，该位置有一个通向外部的开口(图3e)。这种协调的近端收缩和远端扩张主要由开关螺旋的旋转引起。如果ptch1活性与其他rnd家族成员一样受化学渗透梯度驱动，则这里鉴定的构象变化可构成所定义序列的一部分，使底物在转运导管构象转变中做定向运动，构象转变会影响底物导管，虽然细节上与ptch1不同，但是原理上与ptch1类似。借助caver程序进行分析可知，acrb中的下部和上部位点交替打开和关闭，迫使底物做定向移动(图8a)(34)，而从ptch1结构中仅鉴定出单个上部位点(图8b)。
[0130]
ti23纳米抗体似乎稳定了ptch1开关螺旋的位姿2。如果固醇离开内叶进行ptch1介导的转运确实取决于与开关螺旋运动相关的导管形状的动态变化，则ti23结合可将ptch1锁定在与固醇移动不相容的状态。为了检验这一构思，我们利用溶剂变色荧光固醇传感器，将其显微注射到细胞中，以便对膜内小叶中可用于传感器结合的固醇进行比率测量(35)。该传感器先前的显示结果表明，可用固醇随着ptch1活性而急剧减少，并且通过shh配体进行的ptch1失活使固醇的可用性恢复正常(24)。与shh配体添加时的效果类似，我们注意到，ti23的添加逆转了ptch1介导的胆固醇活性降低(图3f)。
[0131]
hedgehog信号通路的体内激活。小蛋白质(如纳米抗体(约12kda)预期可能会表现出优异的组织外显率，并且易接近大多数组织中的细胞。我们通过向小鼠静脉注射腺相关病毒(aav)，测试了ti23的活性，aav经工程化可表达ti23。由于aav感染将持续数周，因此这项实验应允许观察由持续纳米抗体暴露引起的生物效应。我们监测了舌上皮和皮肤，因为这些组织对hedgehog信号通路激活表现出了良好表征的反应。
[0132]
gli1 rna水平增加了6倍，这表明ti23纳米抗体增强了背部皮肤中的hedgehog信号通路活性(图4a)。与ti23在体外作为部分激动剂这一观察结果一致的是，相对于shhn或sag21k，ti23的作用较弱。在对感染了编码ti23或shhn的aav但未感染对照纳米抗体(nb4)的小鼠进行背部皮肤组织学检查后，我们还注意到，毛囊已扩张到真皮脂肪层中，这表明毛囊进入了毛发周期的生长期(图4b)。与加快进入生长期一致的是，我们注意到刮毛后背部皮肤上的毛发再生速度加快(图4c)。
[0133]
我们还通过荧光原位杂交(fish)对gli1 mrna进行了检查，以此作为舌上皮通路
激活的指标。hedgehog信号通路活性局限于未经治疗的动物中ck8
+
味觉受体细胞周围的细胞(图4d)。与接受对照病毒的动物相比，在注射shhn或ti23病毒的小鼠中，如gli1表达所示，hedgehog信号通路活性的范围显著扩展(图4e，f)。在给予sag21k(一种激活smo的小分子hedgehog激动剂)的小鼠中也观察到gli1表达的类似扩展(图4e，f)。
[0134]
hedgehog信号通路调节的治疗应用主要侧重于通路拮抗剂，事实证明，hedgehog信号通路的抑制在治疗肿瘤原代细胞中hedgehog信号通路活性过高直接导致的癌症方面有效。然而，与促进肿瘤生长相比，最近的研究发现，在基质细胞(而非原代细胞)中，通路活性会抑制癌症的生长和进展，特别是对于内胚层器官的癌症，如膀胱癌、结肠和胰腺癌。通路激活在舌头味觉受体细胞的再生(化疗患者的味觉受体细胞通常会丧失或减少)、预防或恢复结肠炎等疾病、减少前列腺肥大组织增生或加快糖尿病骨骼愈合方面也可具有治疗益处。
[0135]
尽管具有这些潜在益处，但由于缺乏靶向特定组织的手段，在临床环境中，通路激活会受到阻碍。可用的hedgehog信号通路激动剂均为疏水性激动剂，包括sag家族的小分子成员、某些氧化甾醇和嘌呤胺(这些物质均靶向smo)以及脂质修饰的hedgehog蛋白或其衍生物(靶向ptch1)。我们的构象选择性ptch1导向的纳米抗体ti23(seq id no：23)代表了一类新型强效、亲水性更强的激动剂，与天然hedgehog蛋白不同，该纳米抗体ti23无需疏水修饰即可发挥活性。此外，ti23经工程化可通过与具有组织或细胞类型特异性的抗体或其他试剂融合进行靶向。这些工程化的变体可避免多效性作用发生系统通路激活，更适合临床应用。
[0136]
ti23不但可用于进一步的药物研发，而且有助于深入了解ptch1转运机制。虽然底物通过转运蛋白进行定向运动意味着构象变化，但在鉴定转运蛋白的这种构象转变方面面临着非同寻常的挑战。我们的构象特异性纳米抗体方法使我们能够鉴定与ptch1开关螺旋位姿1和位姿2相关的两种不同的构象。与这些位姿相关的转运导管形状变化表明，蠕动运动是底物定向运动的潜在机制。由于ptch1在优选底物及其胞外结构域结构方面与表征良好的rnd转运蛋白acrb均不同，因此这些蛋白质在构象转变方面存在差异就不足为奇。实际上，鉴于这些差异，底物导管在两种蛋白质中蠕动的明显相似性似乎相当显著。
[0137]
ti23与ptch1的结合预期会诱导类似于ptch1-nnq的构象变化。由于nnq中已经改变的残基埋在跨膜结构域中，而ti23与胞外结构域结合，因此最简单的解释是两个结构域之间存在变构现象。在细菌转运蛋白中，tm4和tm10中的带电三元组进行穿膜质子传导，从化学渗透梯度中提取能量。在ptch1中，目前已观察到这种带电残基三元组以两种不同的状态存在。在shh结合的结构中，d513和e1095相互接近，通过已结合的阳离子可使d513和e1095的负电荷保持稳定，而在ti23结合的结构中，这两个残基相隔较远，很有可能不会与任何阳离子相互作用。ptch1-nnq中缺少电荷中和作用预期将大大削弱阳离子相互作用，所以这种差异与nnq改变对阳离子结合的潜在影响一致。
[0138]
ti23纳米抗体值得关注的方面在于，该纳米抗体起到部分激动剂的作用，而ptch1-nnq变体在细胞中并未表现出明显活性。针对这种差异，有一种可能的解释是，纳米抗体可以耐受较低程度的构象柔性，因此允许存在低水平的ptch1转运活性。事实上，在局部分辨率图中，纳米抗体区的分辨率比蛋白质的其他部分低得多，这表明存在显著的结构异质性。
[0139]
为提高纳米抗体的结构稳定性而进行的进一步体外演化可能会增强其激活通路的效力。我们的构象选择性纳米抗体方法可概括地适用于其他转运蛋白(特别是rnd家族的其他成员)的研究。在哺乳动物中，该家族包括npc1胆固醇转运蛋白，以及其他ptch样蛋白，如ptchd1，这些蛋白质的破坏与自闭症密切相关。对于其他转运蛋白，对功能产生破坏的突变可通过使正常的构象景观出现偏差实现，而不会唯一地使任何一种构象保持稳定。选择优先与这种突变体结合的纳米抗体可以捕获数量稀少但关键的构象，扩大实验可进入状态的范围，以便进行结构和功能研究，提供具有靶向特定细胞类型或组织室潜力的药物制剂。
[0140]
材料和方法
[0141]
细胞培养。根据先前公布的条件，将sf9和293t细胞保存在培养物中。使用补充有1％胎牛血清(gemini bio)的freestyle 293表达培养基(life technologies)，将293-freestyle细胞保存在8％二氧化碳培养箱(装有振动平台)的悬浮培养物中。如前所述，在sf9细胞中产生杆状病毒，并用重组杆状病毒(bacmam表达)感染悬浮293培养物。
[0142]
分子克隆。通过gibson组装，对所有构建体进行克隆。对于bacmam表达，将ptch1变体克隆到pvlad6载体中。酵母选择采用pteh1-c和ptch1-c-nnq变体。ptch1-c是在氨基酸1173处截短、在619-711处缺失并在c1167y处改变的小鼠ptch1。由于细胞内序列的大量缺失，使用ptch1-c进行选择，最大程度地降低获得与ptch1胞内结构域结合的纳米抗体的可能性。结构测定和细胞生物学实验采用早期报道的ptch1-b。对于荧光素酶检测和细胞表面结合实验，将ptch1变体克隆到pcdna-h(pcdna3载体，已去除新霉素抗性盒)中。
[0143]
酵母展示选择。合成纳米抗体文库在30℃的sdcaa培养基中生长，直至细胞密度达到约1
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108/ml。将覆盖约10倍初始多样性(5
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108多样性，5
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109个细胞)的细胞移入20℃的sgcaa培养基中，以诱导纳米抗体在细胞表面的表达。选择时，将7.5
×
109个细胞离心成团，并在选择缓冲液(20mm hepes ph 7.5，150mm nacl，0.5mg/ml bsa，0.1％ddm，0.02％chs)中重悬。然后，将细胞与100nm 1d4标记的ptch1-c nnq一起孵育，向下旋转细胞，并分别用选择缓冲液、fitc标记的1d4抗体和100μl抗fitc macs微球进行洗涤。将微球结合的细胞装载到磁性歧管上并用选择缓冲液充分洗涤后，将结合的细胞洗提，在sdcaa培养基中培养，并在sgcaa培养基中诱导进行纳米抗体表达。然后对这些细胞进行第二轮选择，首先单独使用alexa647标记的1d4抗体，反选抗体结合细胞，然后使用100nm 1d4标记的ptch1-c nnq进行选择。所选细胞在sdcaa中生长，并再次使用sgcaa进行诱导，然后使用100nm myc标记的ptch1-c和100nm 1d4标记的ptch 1-c-nnq进行孵育，并使用抗myc alexa 647和抗1d4-fitc进行染色，选择facs上显示fitc信号较强的细胞。重复相同的facs选择，使所选细胞生长并平板稀释。使用单菌落制备质粒，并在滚环扩增(rca)后进行质粒测序。从24个菌落中检索到15个唯一序列。然后，测试携带这些纳米抗体序列的酵母细胞是否与抗1d4抗体和ptch1-c-nnq结合。在15个克隆中，有3个克隆#4、#9和#15与1d4抗体直接结合。在活性表征中，将克隆4作为对照纳米抗体。将其余序列克隆到pet26b载体中，以便从大肠杆菌中表达和纯化。
[0144]
纳米抗体纯化。将含有纳米抗体序列的pet26b载体转化到大肠杆菌bl21(de3)菌株中。细菌在37℃的特级肉汤培养基中生长至od600达到0.8，然后使用0.2mm iptg进行诱导，并将温度调整为20℃。表达过夜后，在8,000g离心收获细胞。以5m1缓冲液/1g团块的比例，将细胞团块放入set缓冲液(500mm蔗糖，0.5mm edta ph 8.0，200mm氨基丁三醇ph 8.0)
中重悬。在室温下搅拌30分钟后，加入两倍体积的水。再搅拌45分钟后，添加mgcl2至2mm，按1∶100,000的比例添加核酸酶。孵育5分钟后，nacl添加至150mm，咪唑添加至20mm，并将整个混合物在4℃下20,000g离心15分钟。然后将上清液加载到ni-nta镍柱上，用冰冷的缓冲液(20mm hepes ph 7.5，500mm nacl，20mm咪唑)洗涤，然后在20mm hepes ph 7.5、150mm nacl和250mm咪唑中洗脱。然后，将洗脱的蛋白质置于4℃的20mm hepes ph 7.5和150mm nacl中透析过夜。除了克隆13以外，所有初始靶物均可表达和纯化。然后，从分析中排除克隆13。
[0145]
亲和力成熟。经过易错pcr建立第一轮亲和力成熟文库。选取纳米抗体克隆17、20和23作为本次选择的起点。将含有纳米抗体序列的10ng质粒作为模板(相当于约1ng的纳米抗体序列dna)，并使用mutazyme试剂盒进行pcr扩增。对pcr产物进行凝胶纯化，然后使用10ng作为下一轮pcr的模板。共进行4轮pcr。然后用phusion聚合酶对最终产物进行扩增，以获得足够量的最终产物进行酵母转化。使用约2μg易错pcr产物，每个亲本序列共纯化约100μg的dna。然后将dna片段与pyds2.0质粒骨架一起转化到酵母中。将来自3种不同亲本序列的dna和这3种序列的混合物分别电穿孔到酵母细胞中，但细胞汇集在ypd中，以便在电穿孔后回收。通过连续稀释和铺板，估算出该文库有1x109个独立转化子。然后，转化的酵母细胞在含有100μg/ml硫酸新苏霉素的ypd培养基中生长，然后在含有相同抗生素的ypg培养基中诱导。使用浓度为100nm、5nm、0.8nm的1i4标记的ptch1-c nnq，富集酵母细胞，通过macs选择进行ptch1结合。然后将表达纳米抗体的细胞以0.6nm与ptch1-c nnq一起孵育。在选择缓冲液中洗涤后，将细胞与亲本17、20、23纳米抗体蛋白在室温下分别以1μm孵育170分钟。然后使用fitc标记的ha抗体对细胞进行染色，以标记纳米抗体表达水平，并使用alexa 647标记的抗1d4抗体对细胞进行染色，以标记ptch1结合。从facs中选择保持高度ptch1结合的细胞。对64个克隆进行测序，以鉴定重复发生的变化。
[0146]
采用一锅诱变法，通过靶向互补决定区(cdr)的文库进行第二轮亲和力成熟。采用dna寡核苷酸库(其中nnk取代cdr区中的每个密码子)进行cdr一锅诱变，使得理论上每个位置的所有20个氨基酸都能在该库中表示。然后采用q5聚合酶对一锅诱变的dna产物进行扩增，并通过凝胶萃取进行纯化。将最终产物(约5μg dna)用于酵母转化。转化的细胞在含有100μg/ml硫酸新苏霉素的ypd培养基中生长，并在含有相同抗生素的ypg培养基中诱导。然后，将细胞与10nm蛋白c标记的ptch1-c一起孵育，在选择缓冲液中洗涤，然后与1μm 23t(与第一轮亲和力成熟具有共有序列的纯化纳米抗体蛋白)一起孵育一天。然后用fitc标记的ha和alexa 647标记的抗蛋白c抗体对细胞进行染色，并在facs中选择高ptch1细胞。细胞在ypd中生长并再次诱导。重复相同的facs选择程序，使群体进一步纯化。然后采用q5聚合酶，对来自质粒(使用初始酵母文库和最终选择的文库制备而成)的纳米抗体序列进行扩增并发送，在mgh sequencing core处进行扩增子测序。
[0147]
ptch1纯化。如前所述，进行ptch1纯化，但步骤稍有改动。悬浮293细胞生长至密度1.2-1.6
×
106/ml，补充10mm丁酸钠，并用高滴度ptch1-sbp杆状病毒感染40-48小时。在-80℃下储存细胞团块。将团块解冻到补充有蛋白酶抑制剂和核酸酶的低渗缓冲液(20mm hepes ph 7.5，10mm mgcl2，10mm kcl，0.25m蔗糖)中。粗膜离心成团(100,000
×
g，30分钟，4℃)。将团块重悬于含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(300mm nacl，20mm hepes ph 7.5，2mg/ml碘乙酰胺，1％ddm/0.2％chs)中，并在4℃下溶解1小时，同时轻轻旋转。离心(100,
000
×
g，30分钟，4℃)后，将上清液与链霉亲和素-琼脂糖亲和树脂在4℃下分批培养2-3小时，同时轻轻旋转。将树脂装入一次性柱中，并用20-30倍柱体积的缓冲液(20mm hepes ph 7.5，300mm nacl，0.03％ddm/0.006％chs)进行洗涤。在补充有2.5mm生物素的相同缓冲液中洗脱蛋白质。
[0148]
冷冻电镜数据获取。将洗脱的ptch1-b蛋白与ti23以1∶1.1的比例混合，然后加载到经sec缓冲液(20mm hepes ph 8，150mm nacl，0.02％gdn)预平衡的superdex 200柱上。收集波峰部分并用amicon过滤器(截留分子量为100kda)进行浓缩至a280，约4.5。将2.5μl样品应用于快速冷冻仪(vitrobot)上的辉光放电quantifoil网格。样品室保持100％相对湿度。将网格上的液体吸干10秒，并放入液氮冷却的液态乙烷浴中。在操作电压为300kv的titan krios 2电子显微镜上进行冷冻网格成像。在预加载gif k2相机上，以剂量分割的模式拍摄图像，标称放大倍数为22.5k，与的像素大小对应(每个超分辨率像素的像素大小对应(每个超分辨率像素)。剂量率约为8e/像素/秒，总暴露时间为12秒，帧速率为0.2秒/帧。利用serialem进行全自动数据收集，散焦范围为-1μm至-3μm。在数据收集开始时获取增益基准，并在随后的数据处理中应用此增益基准。
[0149]
图像处理。共收集到7046个栈图。按增益基准收集栈图，弃用2个栈图，并使用motioncor2校正光束引起的运动。使用cryosparc2中提供的包装法(wrapper)，在没有剂量加权的情况下，利用ctffind4根据运动校正和确定ctf。以下所有处理步骤均采用剂量加权和。cryosparc2自动拾取粒子。从2d分类中选择与蛋白质分子对应的粒子。然后，从头开始逐步重建这些粒子，然后以从最后一步中生成的图的两个副本加上一个junk图作为初始模型，通过异质细化将这些粒子分为3类。选出最佳类别进行同质细化，然后进行非均匀细化，以获得的图。然后利用3d变异性分析工具进行粒子分析，并以第一特征向量的两个极值作为进一步3d分类的基础。通过非均匀细化，将最终的3d类别细化到分辨率然后，使用pyem中的脚本，将粒子堆导出至cistem。在使用排除了去污剂胶粒的掩模进行一次局部细化迭代之后，在的分辨率下报告图。将锐化后的最终图用于模型构建。
[0150]
蛋白质模型构建。以4mqtb和5m30f为模板结构，采用rosettacm生成纳米抗体ti23结构。将已生成的结构和先前确定的ptch1结构(6mg8)对接到冷冻电镜图中，并在phenix.real_space_refine中通过变形对这两种结构进行细化。然后在coot中手动编辑细化后的模型，加入当前新结构中解析的残基和小分子。在prodrg服务器上生成小分子的抑制条件。然后，在phenix.real_space_refine中对整个结构进行细化。
[0151]
基于facs的shhn结合测定。采用gfp标记的ptch1构建体，对293细胞进行瞬时转染。经过24小时，使用10mm edta解离细胞，用hpbs 0.5mm ca
2+
洗涤细胞，并通过离心成团。然后将细胞重悬于结合缓冲液(hpbs，0.5mm ca
2+
，0.5mg/ml bsa)中，并与纯化的shhn-生物素(1∶400稀释)在4℃下孵育30分钟。然后通过离心将细胞用结合缓冲液洗涤三次，随后与alexa fluor 647链霉亲和素偶联物(invitrogen)在4℃下孵育15分钟。然后通过在洗涤缓冲液(结合缓冲液+1mm生物素)中离心洗涤细胞三次，并在ptch1-gfp表达门控后，采用流式细胞术，将shhn结合的细胞的百分比量化(bd facsaria ii，斯坦福干细胞研究所facs core)。
[0152]
gli依赖性荧光素酶检测。如前所述，在ptch1-/-mef中进行荧光素酶检测。将ptch1-/-mef接种到24孔板中，然后采用各种质粒以及一种含有8
×
gli萤火虫荧光素酶和
sv40海肾荧光素酶质粒的混合物进行转染。每个孔采用2ng(0.4％)编码ptch1-b变体的质粒，或5ng(1％)编码全长ptch1的质粒。细胞汇合时，将细胞转移到具有含0.5％血清的shhn条件培养基或对照培养基的dmem中孵育48小时。然后使用berthold centro xs3光度计测量荧光素酶活性。由采用表达shh氨基信号结构域的质粒进行转染的293细胞制备shhn条件培养基。简言之，采用含有lipofectamine 2000的shhn表达质粒，对293细胞进行转染。转染后12小时，将培养基更换成2％的fbs低血清培养基。然后，在更换培养基后48小时，收集条件培养基，并以1∶10比例用于荧光素酶检测。
[0153]
细胞胆固醇测量。perfringolysin o d4结构域(a.a.391-500)和突变体在大肠杆菌bl21ril密码子加(stratagene)细胞中作为his6标记的蛋白进行表达，并使用his6亲和树脂(genscript)进行纯化。在单个cys位点(c459)，采用溶剂致变色荧光团标记这些蛋白，以生成比率传感器。将ptch1-/-mef接种到50mm圆形玻璃底板(mattek)中，并在补充有10％(体积比)胎牛血清(fbs)、100u/ml青霉素g和100mg/ml硫酸链霉素(life technologies)的达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem)(life technologies)中，在37℃温度下以及95％空气和5％二氧化碳的增湿气氛中生长。在附着到培养瓶之后(约24小时)，根据制造商的方案，使用jetprime转染试剂(polyplus transfection)，采用编码ptch1-b变体的质粒进行细胞的瞬时转染。每次转染使用1μg质粒。如前所述，使用胆固醇传感器对质膜内(ipm)小叶中的胆固醇进行量化，并做出一些修改。具体而言，通过显微注射将用(2z，3e)-3-((丙烯酰氧基)亚氨基)-2-((7-(二乙基氨基)-9，9-二甲基-9h-芴-2-基)亚甲基)-2，3-二氢-1h-茚-1-酮(wcr)标记的d4结构域的y415a/d434w/a463w(yda)突变体递送到细胞中，以量化ipm胆固醇([chol]i)。根据描述，进行所有传感器校准、显微镜测量和比率测量成像数据分析。
[0154]
小鼠。根据斯坦福大学机构动物管理及使用委员会(iacuc)批准的方案执行所有程序。野生型fvb/ncrl(207)小鼠购自charles river。将7周龄的雄性小鼠随机分配到预定样本量的组中。所有直接比较实验均并行进行，以最大限度地减少变异性。通过渗透泵(alzet)，以2mg/kg/天的剂量，在两周内递送hedgehog激动剂sag21k。
[0155]
腺相关病毒(aav)的产生。所有aav质粒的主链均基于paav-ef1a-cre(addgene，55636)，用bgh代替poly(a)信号。将纳米抗体序列克隆到载体中，以便在受感染的细胞中进行表达。根据描述，在hek 293t细胞中生成aav，并通过碘克沙醇(optiprep，sigma；d1556)分级梯度进行纯化。使用线性化的病毒基因组质粒作为标准，通过用qpcr对dnase i抗性病毒基因组进行量化来测量病毒滴度。将纯化病毒以每只小鼠1
×
10
11
μg或其他特别指示的滴度通过眶后窦静脉注射到麻醉小鼠中。
[0156]
组织学。对动物实施安乐死，切除背部皮肤进行rna提取。然后用pbs和pbs中的4％多聚甲醛(pfa)灌注小鼠，并将舌头和背部皮肤用4％pfa固定24小时。根据描述，根据rnascope多重荧光试剂盒(acd systems)，使用小鼠gli1探针(311001)对舌头进行原位杂交处理，然后进行免疫染色。在激光扫描共聚焦显微镜(zeiss lsm 800)上进行免疫荧光成像。在斯坦福大学动物组织学服务中心，对皮肤进行标准h&e染色处理。
[0157]
rna提取和qrt-pcr。将皮肤样品经过均质处理，使用trizol提取rna，然后使用rneasy mini试剂盒(qiagen)和dna酶套装(qiagn)提取rnase。在abi 7900ht仪上，使用superscript iii platinum一步法系统和taqman基因表达检测(gli1，mm00494654_m1；hprt，mm00446968_m1；thermo fisher)，通过一步法定量逆转录酶pcr(qrt-pcr)测定gli1
和hprt1水平。利用普通单因素方差分析和dunnett多重比较校正法，比较相对于对照组的标准化表达水平。
[0158]
表s1.冷冻电镜数据收集和模型细化汇总表
[0159]
[0160][0161]
参考文献
[0162]
1.c.m.rudin等人，采用hedgehog信号通路抑制剂gdc-0449治疗髓母细胞瘤。《新英格兰医学杂志》361，1173-1178(2009)。
[0163]
2.d.d.von hoff等人，hedgehog信号通路在晚期基底细胞癌中的抑制作用。《新英格兰医学杂志》361，1164-1172(2009)。
[0164]
3.s.a.brunton等人，hedgehog信号通路的强效激动剂。《生物有机化学与医药化学通讯》19，4308-4311(2009)。
[0165]
4.j.j.lee等人，对hedgehog信号的基质反应抑制了胰脏癌进展。《美国国家科学研究院学报》111，e3091-3100(2014)。
[0166]
5.a.horn等人，hedgehog信号控制系统性硬化症中的成纤维细胞活化和组织纤维化。《关节炎与风湿病杂志》64，2724-2733(2012)。
[0167]
6.f.r.taylor等人，通过疏水修饰增强人sonic hedgehog的效力。《生物化学》40，4359-4371(2001)。
[0168]
7.r.k.mann，p.a.beachy，分泌蛋白信号的新型脂质修饰。《生物化学年评》73，891-923(2004)。
[0169]
8.j.a.porter，k.e.young，p.a.beachy，动物发育中hedgehog信号蛋白的胆固醇修饰。《科学》274，255-259(1996)。
[0170]
9.z.chamoun等人，skinny hedgehog，一种棕榈酰化和hedgehog信号活性所需的酰基转移酶。《科学》293，2080-2084(2001)。
[0171]
10.d.m.stone等人，肿瘤抑制基因patched编码sonic hedgehog的候选受体。《自然》384，129-134(1996)。
[0172]
11.p.w.ingham，a.m.taylor，y.nakano，果蝇patched基因在位置信号中的作用。《自然》353，184-187(1991)。
[0173]
12.y.chen，g.struhl，patched具有隔离和转导hedgehog的双重作用。《细胞》87，553-563(1996)。
[0174]
13.l.v.goodrich，l.milenkovic，k.m.higgins，m.p.scott，小鼠patched突变体中改变的神经细胞命运和髓母细胞瘤。《科学》277，1109-1113(1997)。
[0175]
14.n.fuse等人，sonic hedgehog蛋白信号不作为水解酶，而作为patched的明显配体。《美国国家科学研究院学报》96，10992-10999(1999)。
[0176]
15.p.w.ingham，a.p.mcmahon，动物发育中的hedgehog信号：范式和原则。《基因与生长》15，3059-3087(2001)。
[0177]
16.m.k.cooper等人，胆固醇生物合成障碍中对hedgehog信号的缺陷反应。《自然遗传学》33，508-513(2003)。
[0178]
17.b.r.myers，l.neahring，y.zhang，k.j.roberts，p.a.beachy，smoothened的快速直接活性测定揭示了膜胆固醇和细胞外钠对hedgehog信号通路的调节。《美国国家科学研究院学报》114，e11141-e11150(2017)。
[0179]
18.g.luchetti等人，胆固醇可激活g蛋白偶联受体smoothened，以促进hedgehog信号传导。《elife》5(2016)。
[0180]
19.i.deshpande等人，膜固醇刺激smoothened驱动hedgehog信号通路活性。《自然》571，284-288(2019)。
[0181]
20.x.qi等人，氧化甾醇结合的人smoothened冷冻电镜结构与异源三聚体gi偶联。《自然》571，279-283(2019)。
[0182]
21.p.huang等人，hedgehog信号中smoothened激活的结构基础。《细胞》174，312-324e316(2018)。
[0183]
22.x.gong等人，人patched1 sonic hedgehog识别的结构基础。《科学》361(2018)。
[0184]
23.x.qi，p.schmiege，e.coutavas，x.li，两个patched分子与hedgehog上不同的位点接合，产生一种具有信号传导能力的复合物。《科学》10.1126/science.aas8843(2018)。
[0185]
24.y.zhang等人，hedgehog受体patched的胆固醇转运样活性的结构基础。《细胞》175，1352-1364e1314(2018)。
[0186]
25.h.qian等人，sonic hedgehog通过不对称范式抑制四聚体patched1。《自然
·
通讯》10，2320(2019)。
[0187]
26.x.qi，p.schmiege，e.coutavas，j.wang，x.li，人patched的结构及其与天然棕榈酰化sonic hedgehog的复合物。《自然》560，128-132(2018)。
[0188]
27.c.hamers-casterman等人，缺乏轻链的天然存在抗体。《自然》363，446-448(1993)。
[0189]
28.s.muyldermans，纳米抗体：天然单域抗体。《生物化学年评》82，775-797(2013)。
[0190]
29.c.mcmahon等人，用于快速发现构象选择性纳米抗体的酵母表面展示平台。《自然-结构和分子生物学》25，289-296(2018)。
[0191]
30.j.taipale，m.k.cooper，t.maiti，p.a.beachy，patched起到催化作用，以抑制smoothened的活性。《自然》418，892-897(2002)。
[0192]
31.e.e.wrenbeck等人，基于质粒的一锅饱和诱变法。《自然-方法学》13，928-930(2016)。
[0193]
32.r.f.hwang等人，hedgehog信号通路抑制靶向胰脏癌中的肿瘤相关基质。《分子癌症研究》10，1147-1157(2012)。
[0194]
33.c.qi，g.di minin，i.vercellino，a.wutz，v.m.korkhov，人hedgehog受体ptch1识别甾醇的结构基础。《走近科学》5(2019)。
[0195]
34.m.a.seeger等人，acrb三聚体的结构不对称表明存在蠕动泵机制。《科学》313，1295-1298(2006)。
[0196]
35.s.l.liu等人，正交脂质传感器识别质膜胆固醇的跨界不对称。《自然化学生物学》13，268-274(2017)。
[0197]
36.r.d.paladini，j.saleh，c.qian，g.x.xu，l.l.rubin，利用hedgehog信号通路的小分子激动剂调节毛发生长。《研究性皮肤病学杂志》125，638-646(2005)。
[0198]
37.w.j.lu等人，hedgehog的神经元传递指导味觉器官再生的空间模式。《美国国家科学研究院学报》115，e200-e209(2018)。
[0199]
38.d.castillo-azofeifa等人，来自神经和上皮的sonic hedgehog是味蕾维持的关键营养因子。《发育》144，3054-3065(2017)。
[0200]
39.k.j.roberts，a.m.kershner，p.a.beachy，上皮干细胞的基质生态位：再生模板和恶性肿瘤制动。《癌细胞》32，404-410(2017)。
[0201]
40.m.gerling等人，结肠癌中基质hedgehog信号下调，其恢复可抑制肿瘤生长。《自然
·
通讯》7，12321(2016)。
[0202]
41.a.d.rhim等人，基质元素的作用是抑制而非支持胰腺导管腺癌。《癌细胞》25，735-747(2014)。
[0203]
42.k.shin等人，hedgehog信号通过诱导尿路上皮分化因子的基质产生来抑制膀胱癌进展。《癌细胞》26，521-533(2014)。
[0204]
43.j.j.lee等人，通过基质hedgehog信号通路激活控制炎症，从而抑制结肠炎。《美国国家科学研究院学报》113，e7545-e7553(2016)。
[0205]
44.a.lim，k.shin，c.zhao，s.kawano，p.a.beachy，空间受限的hedgehog信号可调节hgf诱导的成人前列腺分支。《自然-细胞生物学》16，1135-1145(2014)。
[0206]
45.r.tevlin等人，糖尿病骨骼干细胞生态位的药物拯救。《科学转化医学》9(2017)。
[0207]
46.t.j.carney，p.w.ingham，drugging hedgehog：翻译通路的信号传导。《bmc生物学》11，37(2013)。
[0208]
47.m.zwama，a.yamaguchi，acrb介导的多药物外输的分子机制。《微生物学研究》169，372-383(2018)。
[0209]
48.e.d.carstea等人，尼曼-匹克c1病基因：与胆固醇稳态介质的同源性。《科学》277，228-231(1997)。
[0210]
49.a.noor等人，位于自闭症谱系障碍和智力残疾患者xp22.11位点的ptchd1基因座的破坏。《科学转化医学》2，49ra68(2010)。
[0211]
50.c.r.marshall等人，自闭症谱系障碍染色体的结构变异。《美国人类遗传学杂志》82，477-488(2008)。
[0212]
示例2
[0213]
hedgehog信号通路的系统性通路激活可能具有不良影响，并且由于缺乏适用于组织靶向的通路激活剂，在治疗应用方面一直存在难度。作为一种单结构域蛋白，本发明公开的纳米抗体适合工程化，并可靶向特定的组织室，以便精确控制hedgehog信号通路活性。
[0214]
最近的工作带来了新的曙光，以间充质生态位作为基质模板，通过同时产生增殖和分化线索，在上皮器官维持和再生中发挥作用。为了在间充质室中实现hedgehog信号通路的优先激活，我们将i型胶原结合肽(seq id no：26，lrelhlnnn)附加到ti23序列上，并将该变体命名为ti23
i型胶原
或ti23
col1
(图9a)。成熟蛋白如seq id no：25所示。由于i型胶原在间充质室(而非上皮)中广泛表达，因此我们预期ti23
col1
会集中于并有效地激活间充质中的hedgehog信号通路。中性蛋白酶治疗后，可以很容易地从间充质中分离舌上皮，我们使用舌头来证明组织靶向(图9b)。在接受ti23
col1
病毒的动物中，观察到间充质gli1的表达水平类似于接受ti23病毒的动物，滴度高出约11.7倍(图9c)。因此，对于相似的间充质表达水平，与ti23病毒相比，只需约8.5％的ti23
col1
病毒滴度。请注意，相比之下，在接受ti23
col1
的动物中，上皮中的gli1表达水平最低(图9d)，且与对照动物的水平类似，这表明ti23
col1
优先激活了间充质中的hedgehog信号通路。
[0215]
可采用融合肽或纳米抗体或其他靶向序列的类似策略将hedgehog信号通路激活限制在其他特定区室。
[0216]
示例3
[0217]
ti23是一种完全可遗传编码的hedgehog蛋白模拟物，也允许对具有前所未有的特性的各种通路激动剂进行蛋白质工程。例如，目前没有任何天然或合成分子能够以细胞自主或细胞类型特异性的方式抑制patched1并刺激hedgehog信号通路活性。通过纤毛膜拴系
ti23(图a和b)的工程化即可实现该目标，特别是在表达纳米抗体的细胞内，使纤毛膜上的patched1失活，如seq id no：27所示。
[0218]
这种工程化ti23的效用分为几个方面：1.如果与细胞或组织类型特异性启动子相结合，则这种构建体将提供一种有前景的模式来激活遗传限定的细胞亚群体中的hh信号通路。2.这种纤毛膜拴系ti23的表达也可受到诱导型启动子的控制，该启动子对特定的化学或物理(光学、磁性、声音、温度等)刺激做出反应，实现通路激活受控。3.此外，由于ti23的表达水平和纳米抗体与patched1之间的亲和力均可微调，因此可以使用这种方法精确调节hh信号通路激活的程度。
[0219]
序列
[0220]
＞10(seq id no：1)
[0221][0222]
＞12(seq id no：2)
[0223][0224]
＞13(seq id no：3)
[0225][0226]
＞15(seq id no：4)
[0227][0228]
＞17(seq id no：5)
[0229][0230]
＞19(seq id no：6)
[0231][0232]
＞1(seq id no：7)
[0233][0234]
＞20(seq id no：8)
[0235][0236]
＞22(seq id no：9)
[0237][0238]
＞23(seq id no：10)
[0239][0240]
＞2(seq id no：11)
[0241][0242]
＞3(seq id no：12)
[0243][0244]
＞6(seq id no：13)
[0245][0246]
＞10(seq id no：14)
[0247][0248]
＞12(seq id no：15)
[0249][0250]
＞13(seq id no：16)
[0251][0252]
＞17(seq id no：17)
[0253][0254]
seq id no.10的已知序列变异
[0255]
已经观察到seq no.10的变异，其在活性上维持或优于seq no：10。序列中影响活性的一些关键位置汇总如下。
[0256]
(seq id no：24)
[0257][0258]
纳米抗体序列包括：
[0259]
＞10-1(seq id no.18)
[0260][0261][0262]
＞10-2(seq id no.19)
[0263][0264]
＞10-3(seq id no.20)
[0265][0266]
＞10-4(seq id no.21)
[0267][0268]
＞10-5(seq id no.22)
[0269][0270]
＞10-6(seq id no.23)
[0271][0272]
seq id no：25，ti23
col1
蛋白质，包括通过连接子与末端融合的col1结合序列(seq id no：25)。
[0273][0274]
seq id no：26
[0275][0276]
seq id no：27，成熟的ti23纳米抗体与cd8的跨膜结构域(seq id no：27)和纤毛定位序列(seq id no：28)融合：
[0277][0278]
seq id no：28cd8a跨膜结构域
[0279][0280]
seq id no：29纤毛定位序列，sstr3 cls(来自原始蛋白质的aa 325-428)
[0281]

技术特征：
1.一种多肽，包括一个抗原结合结构域(abd)，所述抗原结合结构域与特异性人ptch1构象优先结合并稳定所述特异性人ptch1构象，这会激活hedgehog信号通路。2.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述abd是单个可变区序列。3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中，所述abd是纳米抗体。4.根据权利要求1-3中任一项所述的多肽，其中，所述abd包括seq id no：10的氨基酸序列，或其变体。5.根据权利要求3所述的多肽，包括seq id no：24(qvqlqesggglvqaggslrlscaasgnifayyimgwyrqapgkerelva[g/a/s/t/d]idiggntnyadsvkgrftisrdnakn[t/n]vylqmnslkpedtavyycavqavp[y/i]ry[h/r][g/r]ywgqgtqvtvss)的氨基酸序列。6.根据权利要求3所述的多肽，包括seq id no：23(qvqlqesggglvqaggslrlscaasgnifayyimgwyrqapgkerelvatidiggntnyadsvkgrftisrdnaknnvylqmnslkpedtavyycavqavpiryrrywgqgtqvtvss)的氨基酸序列。7.根据权利要求1-6中任一项所述的多肽，与人fc序列连接。8.根据权利要求1-7中任一项所述的多肽，与靶向部分连接。9.根据权利要求8所述的多肽，其中，所述靶向部分包括一个胶原结合序列，可选通过连接子序列连接。10.根据权利要求9所述的多肽，其中，所述胶原结合序列包括seq id no：26lrelhlnnn。11.根据权利要求8所述的多肽，其中，所述靶向部分包括一个纤毛定位序列和一个跨膜结构域，可选通过连接子序列连接。12.根据权利要求11所述的多肽，其中，所述纤毛定位序列包括seq id no：29lsyrfkqgfrrillrpsrrirsqepgsgppekteeeedeeeeerreeeerrmqrg qemngrlsqiaqagtsgqqprpctgtakeqqllpqeatagdkastlshl。13.一种核酸，编码根据权利要求1-12中任一项所述的多肽。14.一种核酸载体，包括权利要求13所述的核酸。15.一种细胞，包括权利要求14所述的载体或权利要求13所述的核酸。16.一种药物制剂，包括权利要求1-12中任一项所述的多肽、权利要求14所述的载体或权利要求13所述的核酸。17.根据权利要求16所述的单位剂量配方中的药物制剂。18.一种治疗hedgehog信号缺陷的方法，所述方法包括：向有需要的个体施用有效剂量的权利要求16或17所述的制剂。19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述治疗可使舌头味觉受体细胞再生。20.根据权利要求18所述的方法，其中，所述治疗可治疗结肠炎。21.根据权利要求18所述的方法，其中，所述治疗可减少前列腺肥大组织增生。22.根据权利要求18所述的方法，其中，所述治疗可加快糖尿病骨骼愈合。23.一种用于权利要求18-22中任一项所述的方法的试剂盒。

技术总结
本发明提供了一种针对Hedgehog受体Patched1的构象特异性抗原结合结构域(ABD)，所述抗原结合结构域可以以纳米抗体的形式提供。所述纳米抗体通过稳定Patched1“开关螺旋”的替代构象，在体外和体内激活Hedgehog信号通路。所述ABD或纳米抗体可溶于水，即，其活性发挥并不需要脂质修饰，以便于对Hedgehog信号通路激活和治疗用途进行机理研究。路激活和治疗用途进行机理研究。


技术研发人员：菲利普
受保护的技术使用者：小利兰
技术研发日：2021.09.27
技术公布日：2023/9/23