从异丁香酚生物合成香草醛的制作方法

从异丁香酚生物合成香草醛
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年12月18日提交的美国临时专利申请第63/127,487号的权益，其通过引用整体引入本文。
3.序列表
4.本技术包含序列表，其已按ascii格式以电子方式提交，并且在此通过引用整体并入本文。所述ascii副本创建于2021年12月17日，命名为074008_2041_wo_000323_sl.txt，大小为26,382字节。
技术领域
5.本公开总体涉及使用异丁香酚作为底物通过生物转化生产天然香草醛。


背景技术：

6.香草香料是世界上最常用的香料之一。它们被用于多种食品如冰淇淋、乳制品、甜点、糖果、烘焙产品和烈酒的调味剂。它们也被用于香水、药品和个人卫生用品。
7.传统上，天然香草香料是从香草兰的发酵豆荚中获得的。其主要是在收获后经过数周的干燥和发酵过程经豆类中存在的香草醛葡萄糖苷水解而成。香草香料的主要芳香物质是香草醛(4-羟基3-甲氧基苯甲醛)。
8.香草醛是最常见的香料化学品之一，广泛应用于食品饮料、香水、制药和医疗行业。每年消耗约12,000吨香草醛，其中只有20至50吨是从香草豆中提取的；其余是合成生产的，主要来自愈创木酚和木质素等石化产品。近年来，对天然香料的需求不断增加，促使香料行业通过生物转化来生产香草醛，因为这种生物转化的产品在从活细胞或其酶等生物来源生产时被各种监管和立法机构(例如，欧洲共同体立法)视为天然的，并可作为“天然产品”销售。
9.天然异丁香酚可以从精油中提取，并且通过酶促转化或微生物生物转化用于生产香草醛是经济的。通过异丁香酚转化生产香草醛已在许多微生物中被广泛报道，包括黑曲霉(aspergillus niger)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)和恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)。然而，这些微生物产生的报告的滴度非常低(低于2g/l)，极大地限制了这种方法在行业中的实际应用。此外，报告的生物转化过程复杂，进一步增加了香草醛的生产成本。
10.因此，本领域需要更具成本效益的方法来生产具有更高滴度和转化率的香草醛。


技术实现要素：

11.发明人通过鉴定真菌异丁香酚单加氧酶解决了上述问题，该酶与先前报告的已用于生产香草醛的异丁香酚单加氧酶具有非常低的序列同一性。从沼泽紫菌(violaceomyces paulstris)(vpiem)鉴定的真菌异丁香酚单加氧酶显示出惊人的高活性，可将异丁香酚转化为香草醛。构建了包含所述vpiem基因的表达质粒，并开发了工程微生物宿主菌株并用于
以高滴度和转化率从异丁香酚生产香草醛。由所述vpiem基因表达的重组蛋白也可分离纯化，并用于在体外将异丁香酚转化为香草醛。
12.因此，一方面，本公开涉及一种生产香草醛的生物转化方法。该方法可以包括在混合物中表达vpiem基因，将异丁香酚添加到混合物中，以及将异丁香酚转化为香草醛。在一些实施例中，所表达的vpiem基因可以具有与seq id no:2具有至少60％同一性、与seq id no:2具有至少65％同一性、与seq id no:2具有至少70％同一性、与seq id no:2具有至少75％同一性、与seq id no:2具有至少80％同一性、与seq id no:2具有至少85％同一性、与seq id no:2具有至少90％同一性、与seq id no:2具有至少95％同一性或与seq id no:2具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所表达的vpiem基因可以具有与seq id no:2相同的氨基酸序列。
13.在各种实施例中，生物转化方法可以包括通过体外翻译表达vpiem基因。在备选实施例中，生物转化方法可以包括在细胞系统中表达vpiem基因。在某些实施例中，生物转化方法可以包括在细菌或酵母细胞中表达vpiem基因。生物转化方法可以包括纯化来自将vpiem基因表达为重组蛋白的步骤的产物。在一些实施例中，可以将纯化的重组蛋白作为生物催化剂添加到含有异丁香酚的反应混合物中。在一些实施例中，可以将异丁香酚直接供给到表达vpiem基因的混合物中。
14.本文所述的生物转化方法可以包括从混合物中回收香草醛。香草醛的回收可以根据本领域已知的任何常规分离或纯化方法进行。在回收香草醛之前，该方法还可以包括从混合物中去除生物质(酶、细胞材料等)。
15.在一个方面，本公开涉及一种使用分离的重组宿主细胞生产香草醛的方法，其中该分离的重组宿主细胞已经用核酸构建体转变，该核酸构建体包括能够编码异丁香酚单加氧酶的多核苷酸序列。例如，异丁香酚单加氧酶可以具有与seq id no:2具有至少60％同一性、与seq id no:2具有至少65％同一性、与seq id no:2具有至少70％同一性、与seq id no:2具有至少75％同一性、与seq id no:2具有至少80％同一性、与seq id no:2具有至少85％同一性、与seq id no:2具有至少90％同一性、与seq id no:2具有至少95％同一性或与seq id no:2具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，异丁香酚单加氧酶可以具有与seq id no:2相同的氨基酸序列。在一些实施例中，该方法可以包括(i)在培养基中培养分离的重组宿主细胞；(ii)向培养基中加入异丁香酚以开始异丁香酚到香草醛的生物转化；以及(iii)从培养基中提取香草醛。在其他实施例中，该方法可以包括(i)在培养基中培养分离的重组宿主细胞以允许异丁香酚单加氧酶表达；(ii)分离异丁香酚单加氧酶；(iii)将分离的异丁香酚单加氧酶添加到包含异丁香酚的反应混合物中；以及(iv)从反应介质中提取香草醛。
16.在一个方面，本公开涉及一种用包含编码异丁香酚单加氧酶的多核苷酸序列的核酸构建体转变的分离的重组宿主细胞，其中该异丁香酚单加氧酶具有与seq id no:2具有至少60％同一性、与seq id no:2具有至少65％同一性、与seq id no:2具有至少70％同一性、与seq id no:2具有至少75％同一性、与seq id no:2具有至少80％同一性、与seq id no:2具有至少85％同一性、与seq id no:2具有至少90％同一性、与seq id no:2具有至少95％同一性或与seq id no:2具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，异丁香酚单加氧酶可以具有与seq id no:2相同的氨基酸序列。在一些实施例中，核酸构建体可以
含有多核苷酸序列，该多核苷酸序列包括与seq id no:1的核酸序列至少70％同一、与seq id no:1的核酸序列至少75％同一、与seq id no:1的核酸序列80％同一、与seq id no:1的核酸序列85％同一、与seq id no:1的核酸序列90％同一或与seq id no:1的核酸序列95％同一。在一些实施例中，核酸构建体可以含有与seq id no:1相同的多核苷酸序列。在一些实施例中，分离的重组宿主细胞可以包括载体。在各种实施例中，宿主细胞可以选自由以下组成的群组：细菌、酵母、非沼泽紫菌的真菌、蓝细菌、藻类和植物细胞。例如，宿主细胞可以选自由以下组成的微生物组：埃希氏菌(escherichia)；沙门氏菌(salmonella)；芽孢杆菌(bacillus)；不动杆菌(acinetobacter)；链霉菌(streptomyces)；棒状杆菌(corynebacterium)；甲基弯曲菌(methylosinus)；甲基单胞菌(methylomonas)；红球菌(rhodococcus)；假单胞菌(pseudomonas)；红细菌(rhodobacter)；集胞藻(synechocystis)；酵母菌(saccharomyces)；接合酵母菌(zygosaccharomyces)；克鲁维酵母菌(kluyveromyces)；念珠菌(candida)；汉逊酵母(hansenula)；德巴利氏酵母(debaryomyces)；毛霉菌(mucor)；毕赤酵母(pichia)；球拟酵母(torulopsis)；曲霉菌(aspergillus)；节丛孢菌(arthrobotlys)；短杆菌(brevibacteria)；微杆菌(microbacterium)；节杆菌(arthrobacter)；柠檬酸杆菌(citrobacter)；克雷伯菌(klebsiella)；泛生菌(pantoea)；以及梭菌(clostridium)。
17.使用本文所述的方法和/或分离的重组宿主细胞生产的香草醛可以被收集并掺入消耗品中。例如，香草醛可以与消耗品掺和。在一些实施例中，香草醛可以以足以在消耗品中赋予、改变、促进或增强所期望的味道、风味或感觉或隐藏、改变或最小化不期望的味道、风味或感觉的量掺入该消耗品。消耗品例如可以选自由以下组成的群组：食品、食品配料、食品添加剂、饮料、药品和烟草。在一些实施例中，香草醛可以以足以在消耗品中赋予、改变、增强或增强所期望的香味或气味或隐藏、改变或最小化不期望的香味或气味的量掺入该消耗品中。消耗品例如可以选自由以下组成的群组：香水、化妆品、洗漱用品、家庭和身体护理品、洗涤剂、驱虫剂、肥料、空气清新剂和肥皂。
18.第一实施例是一种生产香草醛的生物转化方法，其包括：在混合物中表达vpiem基因，其中该vpiem基因的所表达的蛋白具有与混合物中的seq id no:2具有至少70％同一性的氨基酸序列；向混合物中供给异丁香酚；以及将异丁香酚转化为香草醛。
19.第二实施例是第一实施例的方法，其中所表达的vpiem蛋白具有与seq id no:2具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中该蛋白将异丁香酚转化为香草醛。
20.第三实施例是第一实施例的方法，其中所表达的vpiem蛋白具有与seq id no:2具有至少90％同一性的氨基酸序列。
21.第四实施例是第一实施例的方法，其中所表达的vpiem蛋白具有与seq id no:2具有至少95％同一性的氨基酸序列。
22.第五实施例是第一实施例至第四实施例中任一项的方法，其中该表达vpiem基因的步骤选自由以下组成的群组：通过体外翻译表达基因；在细胞系统中表达该基因；以及在细菌或酵母细胞中表达该基因。
23.第六实施例是第五实施例的方法，其还包括纯化来自将vpiem基因表达为重组蛋白的步骤的产物的步骤。
24.第七实施例是第一实施例至第六实施例中任一项的方法，其还包括收集香草醛的
步骤。
25.第八实施例是第七实施例的方法，其中从异丁香酚到香草醛的转化率高于80％。
26.第九个实施例是第七个实施例的方法，其中从异丁香酚到香草醛的转化率高于85％。
27.第十实施例是第七实施例的方法，其中从异丁香酚到香草醛的转化率高于90％。
28.第十一实施例是使用分离的重组宿主细胞生产香草醛的方法包括以下步骤：(i)在培养基中培养分离的重组宿主细胞；(ii)将异丁香酚添加到(i)的培养基以开始异丁香酚到香草醛的生物转化；(iii)从培养基中提取香草醛，其中该分离的重组宿主细胞已经用包含编码异丁香酚单加氧酶的多核苷酸序列的核酸构建体转变，其中该异丁香酚单加氧酶具有与seq id no:2具有至少70％同一性的氨基酸序列。
29.第十二实施例是第十一实施例的方法，其中该异丁香酚单加氧酶具有与seq id no:2至少80％同一性的氨基酸序列。
30.第十三实施例是第十一实施例的方法，其中该异丁香酚单加氧酶具有与seq id no:2具有至少90％同一性的氨基酸序列。
31.第十四实施例是第十一实施例的方法，其中该异丁香酚单加氧酶具有与seq id no:2具有至少95％同一性的氨基酸序列。
32.第十五实施例是一种制作消耗品的方法，其包括以下步骤：根据第一实施例至第十四实施例的方法生产香草醛；收集香草醛；以及将香草醛掺入消耗品中。
33.第十六实施例是第十五实施例的方法，其包括将香草醛与消耗品掺和的步骤。
34.第十七实施例是第十五实施例或第十六实施例的方法，其中该香草醛以足以赋予风味口味的量掺入消耗品中。
35.第十八实施例是第十五实施例至第十七实施例的方法，其中消耗品选自由以下组成的群组：风味产品、食品、食品前体产品、食品生产中采用的添加剂、药物组合物、膳食补充剂、营养品和化妆品。
36.第十九实施例是第十五实施例或第十六实施例的方法，其中该香草醛以足以赋予香味的量掺入消耗品中。
37.第二十实施例是第十五、第十六或第十九实施例中任一项的方法，其中消耗品选自由以下组成的群组：芳香产品、化妆品、洗漱产品和家居清洁产品。
38.第二十一实施例是用包含编码异丁香酚单加氧酶的多核苷酸序列的核酸构建体转变的重组宿主细胞，其中该异丁香酚单加氧酶具有与seq id no:2具有至少70％同一性的氨基酸序列。
39.第二十二实施例是第二十一实施例的分离的重组宿主细胞，其中该多核苷酸序列包含与seq id no:1的核酸序列至少90％相同的序列。
40.第二十三实施例是第二十一实施例或第二十二实施例的分离的重组宿主细胞，其进一步包含含有分离的核酸序列seq id no:4的载体。
41.第二十四实施例是权利要求第二十一至第二十三实施例中任一项的分离的重组宿主细胞，其中该宿主细胞选自由以下组成的群组：细菌、酵母、非紫菌的真菌、蓝细菌、藻类和植物细胞。
42.第二十五实施例是第二十一实施例至二十四实施例的分离的重组宿主细胞，其中
宿主细胞选自由以下组成的微生物组：埃希氏菌；沙门氏菌；芽孢杆菌；不动杆菌；链霉菌；棒状杆菌；甲基弯曲菌；甲基单胞菌；红球菌；假单胞菌；红细菌；集胞藻；酵母菌；接合酵母菌；克鲁维酵母菌；念珠菌；汉逊酵母；德巴利氏酵母；毛霉菌；毕赤酵母；球拟酵母；曲霉菌；节丛孢菌；短杆菌；微杆菌；节杆菌；柠檬酸杆菌；克雷伯菌；泛生菌；以及梭菌。
43.本发明的其他特征和优点将在以下参考附图的详细描述中变得显而易见。
附图说明
44.图1绘示了从异丁香酚到香草醛的酶促途径。
45.图2提供了根据本公开的vpiem-pet28a质粒构建体的示意图。
46.图3为sds-page图像，示出了vpiem的所表达的重组蛋白的纯化。
47.图4为显示异丁香酚通过vpiem的基因产物生物转化为香草醛的hplc色谱图。上图片是用vpiem的纯化的基因产物获得的。下图片是用热变性vpiem酶作为阴性对照获得的。
48.图5示出了根据本教导在5升发酵罐中通过转变的大肠杆菌(e.coli)菌株iseg-v290以异丁香酚作为底物生产香草醛(fv)。
49.序列说明
50.表1简要描述了本文和所附序列表中公开的序列。如本领域技术人员所知，注意到原核生物使用交替的起始密码子，主要是gug和uug，其均被翻译为甲酰甲硫氨酸。
51.具体实施方式
52.如本文所应用，除非内容另有明确规定，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数指代。
53.就说明书或权利要求中使用的术语“包括”、“具有”等而言，此类术语旨在以类似于术语“包含”的方式具有包容性，因为“包含”在以下情况下被解释为在权利要求中用作过渡词。
54.如本文所用的词语“示例性”是指用作实例、例子或说明。本文中被描述为“示例性”的任何实施例未必应解释为比其它实施例优选或有利。
[0055]“生物转化”在本文中用于指在细胞培养物中的宿主细胞(如微生物宿主细胞)中例如通过体内生产而进行的产物的细胞式生产，该细胞式生产可以任选地与进一步的生物合成的生产步骤(例如，在不同于之前的宿主细胞中)和/或与化学合成反应(例如，通过体
外反应)相结合。在整个说明书中，术语“生物转化”可以与术语“生物转变”和/或“生物合成”或“生物合成的”互换使用。
[0056]“细胞系统”是提供异位蛋白表达的任何细胞。它包含细菌、酵母、植物细胞和动物细胞。它包含原核和真核细胞。它还包含基于细胞组分(如核糖体)的蛋白的体外表达。
[0057]“编码序列”将被给予本领域普通技术人员其普通和惯用的含义，并且不受限制地用于指编码特定氨基酸序列的dna序列。
[0058]“培养”或“培育”细胞系统包括提供适当的培养基以允许细胞繁殖和分裂。它还包含提供资源，以便细胞或细胞组分可以翻译并制造重组蛋白。
[0059]“酵母”是真核单细胞微生物，被归类为真菌界的成员。酵母是由多细胞祖先进化而来的单细胞生物，但本发明中有用的一些物种是那些有能力通过形成连接的出芽细胞串而形成多细胞特性的物种，这些出芽细胞被称为伪菌丝或假菌丝。
[0060]
术语“互补”将被给予本领域普通技术人员其普通和惯用的含义，并且不受限制地用于描述能够相互杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，关于dna，腺苷与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本主题技术还包括分离的核酸片段，其与随附序列表中报道的完整序列以及那些基本相似的核酸序列互补。
[0061]
术语“核酸”和“核苷酸”将被给予本领域普通技术人员各自的普通和惯用的含义，并且不受限制地用于指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非具体限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述已知类似物具有与参考核酸类似的结合性质并且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含涵盖其保守修饰或简并的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。
[0062]
术语“分离的”应给予本领域普通技术人员其普通和常规的含义，并且当用于分离的核酸或分离的多肽的上下文中时，使用但不局限于指核酸或通过人手在天然环境之外存在并因此不是自然产物的多肽。分离的核酸或多肽可以纯化形式存在或可以存在于非天然环境中，如例如在转基因宿主细胞中。
[0063]
如本文所用的术语“温育(incubating/incubation)”是指混合两种或更多种化学或生物实体(诸如化合物和酶)以及允许它们在有利于生产香草醛的条件下相互作用的过程。
[0064]
术语“简并变体”是指具有残基序列的核酸序列，该核酸序列与参考核酸序列相差一个或多个简并密码子取代。简并密码子取代可以通过生产序列来实现，其中一个或多个选定的(或全部)密码子的第三位置被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基取代。核酸序列及其所有简并变体将表达相同的氨基酸或多肽。
[0065]
术语“多肽”、“蛋白”和“肽”将被给予本领域普通技术人员各自的普通和惯用的含义；这三个术语有时可以互换使用，并且不受限制地用于指氨基酸的聚合物或氨基酸类似物，无论其大小或功能如何。尽管“蛋白
””
经常用于指代相对较大的多肽，而“肽”经常用于指代小的多肽，但是这些术语在本领域中的使用是重叠和变化的。除非另有说明，本文所用的术语“多肽”是指肽、多肽和蛋白。当提及多核苷酸产物时，术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。因此，示例性多肽包含多核苷酸产物、天然存在的蛋白、同系物、直系同源物、旁系同源物、片段和前述的其它等同物、变体和类似物。
[0066]
术语“多肽片段”和“片段”当用于指代多肽时，将被给予本领域普通技术人员其普通和惯用的含义，并且不受限制地用于指与参考多肽本身相比氨基酸残基缺失，但剩余的氨基酸序列通常与参考多肽中的相应位置相同的多肽。此类缺失可发生在参考多肽的氨基末端或羧基末端，或二者皆有。
[0067]
术语多肽或蛋白质的“功能片段”是指作为全长多肽或蛋白质的一部分的肽片段，并且具有与全长多肽或蛋白质基本相同的生物学活性或执行与全长多肽或蛋白质基本相同的功能(例如进行相同的酶促反应)。
[0068]
可互换使用的术语“变体多肽”、“修饰的氨基酸序列”或“修饰的多肽”是指与参考多肽相差一个或多个氨基酸的氨基酸序列，例如一个或更多个氨基酸取代、缺失和/或添加。在一方面，变体是保留参考多肽的部分或全部能力的“功能变体”。
[0069]
术语“功能变体”还包括保守取代的变体。术语“保守取代的变体”是指具有与参考肽相差一个或多个保守氨基酸取代并保持参考肽的部分或全部活性的氨基酸序列的肽。“保守氨基酸取代”是用功能相似的残基取代氨基酸残基。保守取代的实例包括一个非极性(疏水性)残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个残基；一个带电或极性(亲水性)残基诸如在精氨酸和赖氨酸之间、在谷氨酰胺和天冬酰胺之间、在苏氨酸和丝氨酸之间取代另一个残基；一个碱性残基诸如赖氨酸或精氨酸取代另一个残基；或一个酸性残基诸如天冬氨酸或谷氨酸取代另一个残基；或一个芳香族残基诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸取代另一个残基。预期这种取代对蛋白质或多肽的表观分子量或等电点几乎没有影响。短语“保守取代的变体”还包括残基被化学衍生的残基替代的肽，条件是所得肽保持如本文所述的参考肽的部分或全部活性。
[0070]
与本主题技术的多肽相关的术语“变体”还包括功能活性多肽，该功能活性多肽具有与参考多肽的氨基酸序列至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％甚至100％相同的氨基酸序列。
[0071]
术语“同源”在其所有语法形式和拼写变体中是指具有“共同进化起源”的多核苷酸或多肽之间的关系，包括来自超家族的多核苷酸或多肽和来自不同物种的同源多核苷酸或蛋白(reeck等人,《细胞细胞》50:667,1987)。这种多核苷酸或多肽具有序列同源性，如其序列相似性所反映的，无论是在同一性百分比方面，还是在保守位置上存在特定氨基酸或基序方面。例如，两种同源多肽可以具有至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、，至少98％、至少99％、甚至100％相同的氨基酸序列。
[0072]“合适的调控序列”将被赋予本领域普通技术人员其普通和惯用的含义，并且不受限制地用于指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)的核苷酸序列，并且其影响相关编码序列的转录、rna加工或稳定性或翻译。调控序列可以包含启动子、翻译前导序列、内含子和聚腺苷酸化识别序列。
[0073]“启动子”将被赋予本领域普通技术人员其普通和惯用的含义，并且不受限制地用于指能够控制编码序列或功能性rna的表达的dna序列。通常，编码序列位于启动子序列的
3'处。启动子可完全来源于原生基因，或由来源于自然界中所发现的不同启动子的不同元件构成，或甚至包括合成dna区段。本领域的技术人员应理解，不同启动子可引导基因在不同组织或细胞类型中或在不同的发育阶段或响应于不同的环境条件来表达。大多数时候导致基因在大多数细胞类型中表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切界限尚未完全确定，因此不同长度的dna片段可能具有相同的启动子活性。
[0074]
术语“可操作地连接”是指核酸序列在单个核酸片段上的缔合，使得一个的功能受另一个的影响。例如，当启动子能够影响所述编码序列的表达时(即，所编码序列在所述启动子的转录控制之下)，则所述启动子与所述编码序列可操作地连接。编码序列可以在有义或反义方向上可操作地连接至调控序列。
[0075]
本文所用的术语“表达”应给予本领域普通技术人员其常规和惯常的含义，并且在使用时不局限于指源于本主题技术的核酸片段的有义(mrna)或反义rna的转录和稳定积累。“过表达”是指转基因或重组有机体中基因产物的生产量超过正常或非转变有机体中的生产水平。
[0076]“转变”将被赋予本领域普通技术人员其普通和惯用的含义，并且不受限制地用于指将多核苷酸转移到靶细胞中。可以将转移的多核苷酸掺入靶细胞的基因组或染色体dna中，从而产生遗传稳定的遗传，或者可以独立于宿主染色体进行复制。含有转变核酸片段的宿主有机体被称为“转基因的”或“转变的”或“重组的”。
[0077]
术语“转变的”、“转基因的”和“重组的”，当在本文中与宿主细胞结合使用时，将别赋予本领域普通技术人员各自的普通和惯用的含义，并且不受限制地用于指已经引入异源核酸分子的宿主有机体的细胞，诸如植物或微生物细胞。所述核酸分子可以稳定地整合到宿主细胞的基因组中，或者所述核酸分子可以作为染色体外的分子存在。这种染色体外的分子可以自动复制。转变的细胞、组织或受试者被理解为不仅包含转变过程的终产物，而且还包含其转基因子代。
[0078]
术语“重组的”、“异源的”和“外源的”，当在本文中与多核苷酸结合使用时，将被赋予本领域普通技术人员其普通和惯用的含义，并且不受限制地用于指源自对特定宿主细胞来说是外源的来源的多核苷酸(例如，dna序列或基因)，或如果来自相同来源，则从其原始形式进行修饰。因此，宿主细胞中的异源基因包含特定宿主细胞内源的基因，但是已经通过例如使用定点诱变或其它重组技术进行修饰。所述术语还包含天然存在的dna序列的非天然存在的多个拷贝。因此，所述术语指与细胞外源或异源，或与细胞同源，但在宿主细胞内通常不存在所述元件的位置或形式的dna片段。
[0079]
类似地，术语“重组的”、“异源的”和“外源的”，当在本文中与多肽或氨基酸序列结合使用时，是指源自对特定宿主细胞来说是外源的来源的多肽或氨基酸序列，或如果来自相同来源，则从其原始形式进行修饰。因此，重组dna片段可以在宿主细胞中表达以生产重组多肽。
[0080]“蛋白表达”是指基因表达后发生的蛋白生产。它由dna转录成信使rna(mrna)之后的阶段组成。然后将mrna翻译成多肽链，最终将其折叠成蛋白。dna通过转染存在于细胞中——转染是一种有意将核酸引入细胞的过程。所述术语通常用于真核细胞中的非病毒方法。它也可以指其他方法和细胞类型，尽管其他术语是优选的：“转变”更常用于描述细菌、
非动物真核细胞(包括植物细胞)中的非病毒dna 转移。在动物细胞中，转染是优选的术语，因为转变也用于指这些细胞中进展为癌态(致癌作用)。转导通常用于描述病毒介导的dna转移。对于本技术，转变、转导和病毒感染包含在转染的定义下。
[0081]
术语“质粒”、“载体”和“盒”将被赋予本领域普通技术人员各自的普通和惯用的含义，并且不受限制地用于指通常携带不是细胞的中心代谢的一部分的基因并且通常以环状双链dna分子的形式存在的额外染色体元件。此类元件可以是来自任何来源的单链或双链dna或rna的线性或环状自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列已经连接或重组成一个独特的构造，该构造能够将所选的基因产物的启动子片段和dna序列连同适当的3'非翻译序列引入细胞中。“转变盒”是指含有外源基因并除外源基因外还具有促进特定宿主细胞转变的元件的特定载体。“表达盒”是指含有外源基因并除外源基因外还具有允许该基因在外源宿主中增强表达的元件的特定载体。
[0082]
如本文所用，“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸或肽序列在整个比对窗口的组分(例如，核苷酸或氨基酸)中不变的程度。测试序列和参考序列的比对片段的“同一性部分”是两个比对序列所共有的相同组分的数量除以参考序列片段中的组分总数，即整个参考序列或参考序列的较小定义部分。
[0083]
如本文所用，术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指当两个序列最佳比对时，与测试(“主题”)多核苷酸分子(或其互补链)相比参考(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列中同一核苷酸的百分比(适当的核苷酸插入、缺失或间隙在比较窗口中总计小于参考序列的20％)。用于比对比较窗口的序列的最佳比对是本领域技术人员所熟知的并且可以通过诸如smith和waterman的局部同源算法、needleman和wunsch的同源比对算法、pearson和lipman的相似性搜索方法等工具来进行，并且优选通过这些算法的计算机化实现，诸如作为wisconsin(材料科学软件公司(accelrys inc.)，(马萨诸塞州伯灵顿(burlington,ma))的一部分提供的gap、bestfit、fasta和tfasta。测试序列和参考序列的比对片段的“同一性分数”是两个比对序列共享的同一组分的数量除以参考序列片段中的组分总数量，即整个参考序列或参考序列的较小定义部分。序列同一性百分比表示为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列的比较可以是与全长多核苷酸序列或其部分的比较或者与更长的多核苷酸序列的比较。为了本发明的目的，“同一性百分比”也可以使用针对所翻译的核苷酸序列的blastx 2.0版本和针对多核苷酸序列的blastn 2.0版本来测定。
[0084]
序列同一性百分比优选使用序列分析软件包
tm
(sequence analysis software package
tm
)(10版本；遗传学电脑集团公司(genetics computer group,inc.),威斯康星州麦迪逊(madison,wi))的“best fit”或“gap”程序来测定。“gap”利用needleman和wunsch的算法(needleman和wunsch，《分子生物学杂志(journal of molecular biology)》48:443-453,1970)找到两个序列的比对，从而使匹配数量最大化并使间隙数量最小化。“best fit”使用smith和waterman的局部同源算法(smith和waterman，《应用数学进展(advances in applied mathematics)》,2:482-489,1981,smith等人,《核酸研究(nucleic acids research)》11:2205-2220,1983)对两个序列之间的最佳相似性片段进行最佳比对，并插入间隙以最大化匹配数量。同一性百分比最优选使用“best fit”程序来测定。
[0085]
确定序列同一性的有用方法还公开在基本局部比对搜索工具(blast)程序中，所
述程序可从马里兰州(20894)贝塞斯达市国立卫生研究院国家医学图书馆的国家生物技术信息中心(ncbi)公开获得；20894；参见《blast手册(blast manual)》，altschul等人，美国国家生物技术信息中心(ncbi)、美国国立医学图书馆(nlm)、美国国立卫生研究院(nih)；altschul等人，《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》215:403-410(1990)；2.0版本或更高版本的blast程序允许在比对中引入间隙(缺失和插入)；对于肽序列，blastx可用于测定序列同一性；并且对于多核苷酸序列，blastn可用于测定序列同一性。
[0086]
如本文所用，术语“基本序列同一性百分比”是指至少约70％序列同一性、至少约80％序列同一性、至少约85％序列同一性、至少约90％序列同一性或甚至更大的序列同一性，诸如约98％或约99％序列同一性的序列同一性百分比。因此，本发明的一个实施例是一种多核苷酸分子，其具有与本文所述的多核苷酸序列具有至少约70％的序列同一性、至少约80％的序列同一性、至少约85％的序列同一性、至少约90％的序列同一性或甚至更高的序列同一性，诸如约98％或约99％的序列同一性。具有本发明的活性基因的多核苷酸分子能够指导香草醛的生产并且与本文提供的多核苷酸序列具有基本百分比序列同一性并且包括在本发明的范围内。
[0087]
同一性是指序列比对后一对序列之间相同的氨基酸部分(可以仅使用序列信息或结构信息或其它信息来完成，但通常仅基于序列信息即可)，相似性是基于使用一些相似性矩阵的比对分配的分数。相似性指数可以是以下中的任意一者：blosum62、pam250或gonnet，或本领域技术人员用于蛋白序列比对的任何基质。
[0088]
同一性是两个子序列之间的对应程度(序列之间没有间隔)。25％或更高的同一性意味着功能的相似性，而18至25％意味着结构或功能的相似性。请记住，两个完全不相关或随机的序列(大于100个残基)可以具有高于20％的同一性。相似性是两个序列之间对比时的相似程度。这取决于它们的同一性。
[0089]
编码核酸序列
[0090]
本发明涉及编码如本文所述的异丁香酚单加氧酶的核酸序列，这些核酸序列可以用于进行所需的遗传工程操纵。本发明还涉及与本文具体公开的序列具有一定程度“同一性”的核酸。例如，本发明的方面涵盖与seq id no:1具有至少60％同一性、与seq id no:1具有至少65％同一性、与seq id no:1具有至少70％同一性、与seq id no:1具有至少75％同一性、与seq id no:1具有至少80％同一性、与seq id no:1具有至少85％同一性、与seq id no:1具有至少90％同一性、与seq id no:1具有至少95％同一性或与seq id no:1具有至少99％同一性的核酸序列。在一些实施例中，用于编码可用于本发明的异丁香酚单加氧酶的核酸序列可以具有与seq id no:1相同的核酸序列。
[0091]
本发明还涉及编码异丁香酚单加氧酶的核酸序列，该异丁香酚单加氧酶具有与seq id no:2具有至少60％同一性、与seq id no:2具有至少65％同一性、与seq id no:2具有至少70％同一性、与seq id no:2具有至少75％同一性、与seq id no:2具有至少80％同一性、与seq id no:2具有至少85％同一性、与seq id no:2具有至少90％同一性、与seq id no:2具有至少95％同一性或与seq id no:2具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，异丁香酚单加氧酶可以具有与seq id no:2相同的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明可以涉及编码任何前述的功能性等同物的核酸序列。
[0092]
根据本发明的构建体
[0093]
在一些方面，本发明涉及用于表达异丁香酚单加氧酶的表达载体等构建体。
[0094]
在一个实施例中，表达载体包括用于在各种宿主细胞中表达本文所述的重组多肽(即，vpiem)的那些遗传元件。宿主细胞中用于转录和翻译元件可以包括启动子、用于蛋白复合物的编码区和转录终止子。
[0095]
本领域普通技术人员将知道可用于制备表达载体的分子生物学技术。如上所述，用于并入本主题技术的表达载体中的多核苷酸可以通过诸如聚合酶链反应(pcr)的常规技术来制备。在分子克隆中，载体是用作媒介物的dna分子，将外来遗传物质人工携带到另一细胞中，在那里其可以被复制且/或表达(例如，质粒、粘粒、λ噬菌体)。含有外源dna的载体被认为是重组dna。四种主要类型的载体是质粒、病毒载体、粘粒和人工染色体。其中最常用的载体是质粒。所有工程载体的共同点是复制起点、多克隆位点和选择标记物。
[0096]
已经开发了许多分子生物学技术以经由互补的粘性末端将dna与载体有效连接。在一实施例中，互补均聚物束可以添加到核酸分子中，以插入到载体dna中。然后，载体和核酸分子通过互补均聚物尾部之间的氢键结合而形成重组dna分子。
[0097]
在备选实施例中，含有所提供的一个或多个限制性位点的合成接头用于将本主题技术的多核苷酸可操作地连接到表达载体。在一个实施例中，通过限制性核酸内切酶消化产生多核苷酸。在一个实施例中，核酸分子用噬菌体t4 dna聚合酶或大肠杆菌dna聚合酶i进行处理，这些酶以其3'-5'-外切核酸酶活性去除突出的3'-单链末端，并以其聚合活性填充凹陷的3'端，从而产生平端dna片段。然后在能够催化钝末端dna分子(诸如噬菌体t4 dna连接酶)连接的酶的存在下，将钝末端片段与大量摩尔过量的连接子分子一起温育。因此，反应产物是在其末端带有聚合物连接子序列的多核苷酸。然后将这些多核苷酸用适当的限制酶切割，并连接至已经用产生与所述多核苷酸的末端相容的末端的酶切割的表达载体。
[0098]
或者，可以使用具有连接非依赖性克隆(lic)位点的载体。然后可以将所需的pcr扩增多核苷酸克隆到lic载体中，而无需限制性消化或连接(aslanidis和de jong，《核酸研究(nucl.acid res》.18 6069-74,(1990)；haun等人，《生物技术(biotechniques)13,515-18(1992))，每一篇都通过引用并入本文)。
[0099]
在一个实施例中，为了分离和/或修饰目的多核苷酸以插入选择的质粒中，使用pcr是合适的。可以设计用于pcr制备序列的适当引物，以分离核酸分子的所需编码区，添加限制性核酸内切酶或lic位点，并将编码区置于所需的阅读框中。
[0100]
在一个实施例中，使用pcr适当的寡核苷酸引物制备用于掺入本主题技术的表达载体的多核苷酸。扩增编码区，而引物本身被掺入扩增的序列产物中。在一个实施例中，扩增引物含有限制性核酸内切酶识别位点，其允许将扩增的序列产物克隆到适当的载体中。
[0101]
可以通过常规转变或转染技术将表达载体导入植物或微生物宿主细胞。用本主题技术的表达载体转变适当的细胞是通过本领域已知的方法完成的，并且通常取决于载体和细胞的类型。合适的技术包含磷酸钙或氯化钙共沉淀，deae-葡聚糖介导的转染、脂质转染、化学穿孔或电穿孔。
[0102]
可以通过本领域众所周知的技术鉴定成功转变的细胞，即含有表达载体的那些细胞。例如，可以培养用本主题技术的表达载体转染的细胞以产生本文所述的多肽。可以通过本领域众所周知的技术检查细胞中表达载体dna的存在。
[0103]
宿主细胞可以含有先前描述的表达载体的单个拷贝，或者替换地，表达载体的多
个拷贝。
[0104]
在一些实施例中，转变的细胞是细菌细胞、植物细胞、藻类细胞、不是黑粉菌(ustilago)的真菌细胞或酵母细胞。在优选的实施例中，转变的细胞可以选自由以下组成的群组：埃希氏菌；沙门氏菌；芽孢杆菌；不动杆菌；链霉菌；棒状杆菌；甲基弯曲菌；甲基单胞菌；红球菌；假单胞菌；红细菌；集胞藻；酵母菌；接合酵母菌；克鲁维酵母菌；念珠菌；汉逊酵母；德巴利氏酵母；毛霉菌；毕赤酵母；球拟酵母；曲霉菌；节丛孢菌；短杆菌；微杆菌；节杆菌；柠檬酸杆菌；克雷伯菌；泛生菌；以及梭菌。在一些实施例中，细胞是选自由以下组成的群组中的植物细胞：菜籽油植物细胞、油菜籽植物细胞、棕榈植物细胞、向日葵植物细胞、棉花植物细胞、玉米植物细胞、花生植物细胞、亚麻植物细胞、芝麻植物细胞、大豆植物细胞和矮牵牛植物细胞。
[0105]
微生物宿主细胞表达系统和表达载体，其含有指导外源蛋白高水平表达的调控序列，这是本领域技术人员众所周知的。这些中的任何一种都可以用于构建载体以在微生物宿主细胞中表达本主题技术的重组多肽。然后可以经由转变将这些载体引入合适的微生物中以允许本主题技术的重组多肽的高水平表达。
[0106]
可用于转变合适的微生物宿主细胞的载体或盒是本领域众所周知的。通常，载体或盒含有指导相关多核苷酸的转录和翻译的序列，选择标记物以及允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含包含转录起始控制的多核苷酸的区域5'和控制转录终止的dna片段的区域3'。优选的是，两个控制区均源自与转变的宿主细胞同源的基因，尽管应理解的是，此类控制区不一定源自被选作宿主的特定物种的天然基因。
[0107]
终止控制区也可以源自微生物宿主天然的各种基因。对于本文所述的微生物宿主，可以任选地包含终止位点。
[0108]
优选的宿主细胞包括那些已知具有从异丁香酚生产香草醛的能力的细胞。例如，优选的宿主细胞可以包括埃希氏菌属和假单胞菌属的细菌。
[0109]
香草醛的发酵生产
[0110]
异丁香酚通过涉及丙烯基苯侧链氧化的环氧化物-二醇途径代谢成香草醛(图1)。发明人意外地发现，与先前报道的细菌iem(例如，来自恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)和硝基还原假单胞菌(pseudomonas nitroreducens)相比，来自沼泽紫菌(vpiem)的假定异丁香酚单加氧酶在异丁香酚到香草醛的生物转化中显示出惊人的高活性。更具体地，通过工程化包含vpiem基因的宿主菌株以及在包含异丁香酚的混合物中培育工程化的宿主菌株，发明人能够以20g/l以上的滴度实现香草醛生产，转化率为90％以上。在不使用其他粗制酶和/或亚因子的情况下获得了高滴度和高转化率。
[0111]
宿主细胞的培育可以在常用营养物质的存在下在水性介质中进行。合适的培养基，例如，可以含有碳源、有机或无机氮源、无机盐和生长因子。对于培养基，葡萄糖可以是优选的碳源。酵母提取物可以是有用的氮源。可以添加磷酸盐、生长因子和微量元素。
[0112]
培养液可以在生物反应器中进行制备和灭菌。然后可以将根据本发明的工程化的宿主菌株接种到培养液中以启动生长阶段。生长阶段的适当持续时间可以为约5至40小时，优选约10至35小时，最优选约10至20小时。
[0113]
生长阶段终止后，可将发酵液的ph值变换为8.0或更高的ph值，并将底物异丁香酚供给到培养物。合适的底物供给量可以为0.1至40g/l发酵液，优选约0.3至30g/l。底物可以
作为固体材料或作为水溶液或悬浮液供给。底物的总量可以在一个步骤中、在两个或更多个供给步骤中或连续地供给。
[0114]
生物转化阶段从底物供给开始并持续约5至50小时，优选10至40小时，最优选15至30小时，即直到所有底物转化为产物和副产物为止。
[0115]
在终止的生物转化阶段之后，生物质可以通过诸如离心或膜过滤等任何众所周知的方法从发酵液中分离出来以获得无细胞发酵液。
[0116]
可以使用例如与水不混溶的有机溶剂、植物油或任何固体提取剂，例如，树脂，优选中性树脂将提取相添加到发酵液中。发酵液可以被进一步灭菌或巴氏杀菌。在一些实施例中，发酵液可以被浓缩。从发酵液中，香草醛可以使用例如连续液-液提取工艺或分批提取工艺进行选择性提取。
[0117]
本发明的优点包括在同一培养基中进行生长阶段和随后的生物转化阶段的能力等。这极大地简化了生产过程，使过程高效且经济，从而允许扩大到工业生产水平。
[0118]
本领域技术人员将认识到，通过本文所述方法生产的香草醛组合物可以被进一步纯化并与如上所述的芳香和/或调味的消费品、以及用于营养的膳食补充剂、医疗组合物和化妆品以及医药产品混合。
[0119]
通过考虑以下非限制性实例，将更充分地理解本公开。应当理解，这些实例虽然指示了本主题技术的优选实施例，但是仅以说明的方式给出。根据以上讨论和这些实例，本领域技术人员可以确定本主题技术的本质特征，并且在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对本主题技术进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。
[0120]
实例
[0121]
细菌菌株、质粒和培养条件
[0122]
dh5a和bl21(de3)的大肠杆菌菌株购自英杰公司(invitrogen)加利福尼亚州卡尔斯巴德(carlsbad,ca)。大肠杆菌菌株w3110获自耶鲁大学大肠杆菌遗传资源大肠杆菌遗传储藏中心(coli genetic stock center,e.coli genetic resources at yale university)(http://cgsc2.biology.yale.edu/)。质粒pet28a购自默克密理博(emd millipore)(马萨诸塞州比勒里卡(billerica,ma))。质粒puvap如国际申请公开号wo2020077367中所述。
[0123]
dna操纵
[0124]
所有dna操作均根据标准程序执行。限制酶和t4 dna连接酶购自新英格兰生物实验室(new england biolabs)(马萨诸塞州伊普斯维奇(ipswich,ma))。根据制造商的指导，所有pcr反应均使用新英格兰生物实验室的phusion pcr系统执行。
[0125]
实例1：靶基因的识别
[0126]
从沼泽紫菌的基因组(ncbi参考序列号kz819699.1)中鉴定出编码异丁香酚单加氧酶的假定基因，其开放阅读框为1656bp，并在此被命名为vpiem(表1，seq id no:1)。其推导的蛋白序列的genbank id号为pwn54046.1(表1，seq id no:2)。vpiem基因由基因通用生物公司(geneuniversal inc.)(新泽西州纽瓦克(newark,nj))在大肠杆菌中进行密码子优化表达后合成(表1，seq id no:3)。
[0127]
实例2：质粒的构建
[0128]
vpiem的开放阅读框(orf)针对在大肠杆菌细胞中的表达进行了密码子优化，并被
克隆到pet28a的nde i/xho i限制性位点，使重组蛋白在n末端具有his标签，这便于提取和纯化。vpiem的orf通过在5'端引入nde i限制性位点和在3'端引入xho i位点通过一对引物vpiem01和vpiem02(表1，seq id no:6和seq id no:7)进行扩增。用nde i和xho i消化后，将pcr片段连接到表达载体pet28a中nde i和xho i的限制性位点中。所得质粒vpiem-pet28a(seq id no:4)用于转变感受态dh5-α细胞以产生表达vpiem蛋白的大肠杆菌菌株。测序确认后，使用标准化学转变方案将质粒转变到大肠杆菌菌株bl21(de3)中，生成被命名为vpiem-bl21的大肠杆菌菌株。
[0129]
为了使用大肠杆菌w3110细胞作为用于表达vpiem蛋白的宿主细胞，使用gibson组装方法将质粒vpiem-pet28a中密码子优化的vpiem orf克隆到puvap中。使用vpiem-pet28a作为模板，用vpiem03和vpiem04(表1，seq id no:8和seq id no:9)的引物扩增包括his标签的vpiem编码序列。使用puvap质粒载体作为模板，载体主链用vpiem05和vpiem06(表1，seq id no:10和seq id no:11)的引物进行扩增。这两个pcr片段从琼脂糖凝胶中回收并通过gibson组装方案(新英格兰生物实验室，美国马萨诸塞州伊普斯维奇)组合以产生vpiem-puvap的质粒(表1，seq id no:5)。用标准化学转变方案将vpiem-puvap质粒引入大肠杆菌w3110感受态细胞以产生iseg-v290菌株。
[0130]
实例3：vpiem在大肠杆菌中的异源表达和重组蛋白的纯化
[0131]
大肠杆菌菌株vpiem-bl21的单个菌落在5ml含有100mg/l卡那霉素的lb培养基中于37℃下培养过夜。将该种子培养物转移到含有100mg/l氨苄青霉素的200ml lb培养基中。细胞在37℃下以250rpm培养至od600为0.6至0.8，然后添加异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度为0.5mm，并将生长温度更改为16℃。在iptg诱导16小时后，通过在4℃下以4000g离心15分钟来收获大肠杆菌细胞。将所得颗粒重新悬浮在5ml的100mm tris-hcl(ph 7.4)、100mm naoh、10％甘油(v/v)中，并在冰上超声处理2分钟。将混合物在4℃下以4000g离心20分钟。上清液中的重组蛋白按照制造商的协议使用美国宝生物工程株式会社(takara bio usa,inc.)(加利福尼亚州山景城(mountain view,ca))的his60 ni superflow树脂进行纯化。重组蛋白的纯化通过sds-page(图3)进行检查。
[0132]
实例4：体外酶测定
[0133]
假定异丁香酚单加氧酶的酶活性通过测量以异丁香酚为底物的香草醛的形成来测定。反应混合物含有10mm异丁香酚、100mm磷酸钾缓冲液(ph 7.0)、10％(v/v)乙醇和适量的酶，总体积为1ml。通过添加作为乙醇溶液的异丁香酚开始反应，在30℃下进行10分钟，同时往复振荡(160次冲程min-1
)，并通过添加1ml甲醇停止。在21,500离心后，上清液通过hplc进行分析以测定异丁香酚和香草醛和香草醇。在沸水中处理5分钟的vpiem酶用作阴性对照。
[0134]
用vanquish ultimate 3000系统进行异丁香酚和香草醛的hplc分析。中间体在dionex acclaim 120c18柱(粒径3μm；150
×
2.1mm)上通过反相色谱法以0.15％(体积/体积)乙酸(洗脱液a)和甲醇(洗脱液b)的梯度和0.4ml/分钟的流速进行分离，洗脱液b的范围为60至100％(体积/体积)。为了定量，所有中间体都用外部标准进行校准。通过它们的保留时间以及相应的光谱来鉴定所述化合物，这些光谱是用系统中的二极管阵列检测器鉴定的。
[0135]
参考图4，上图片确认vpiem的纯化基因产物能够催化异丁香酚转化为香草醛。相
比之下，下图片(用阴性对照获得)显示，当vpiem酶变性时没有产生香草醛。
[0136]
实例5：发酵罐中异丁香酚到香草醛的生物转化
[0137]
开发了一种发酵工艺用于在5升发酵罐中用iseg-v290菌株将异丁香酚生物转化为香草醛。将1ml iseg-v290的甘油原液接种到于500ml烧瓶中的100ml种子培养基(含5g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白胨、10g/l nacl和50mg/l氨苄青霉素的luria-bertani培养基)中。将种子在37℃下在摇床中以200rpm的摇床转速培育8小时，然后转移到于5升发酵罐中的2l luria-bertani培养基加6g/l初始葡萄糖和50mg/l氨苄青霉素的发酵培养基中。
[0138]
5升香草醛发酵工艺分为两个阶段，即细胞生长阶段和生物转化阶段。细胞生长阶段是从0小时的经过发酵时间(eft)至约17小时的eft。发酵参数设置如下：气流：0.6vvm；ph值不低于7.1，使用4n naoh控制。生长温度设置为30℃，搅拌设置为300至500rpm。溶解氧(do)的水平级联到搅拌，以将其维持在30％以上。在eft 6.5小时，添加iptg至最终浓度为0.5mm，并以0.4g/l/小时的速率供应葡萄糖17小时。
[0139]
生物转化阶段为17小时至46.5小时的eft。发酵参数设置如下：气流：0.4vvm。用4n naoh将ph值控制在不低于8.0，并且温度为30℃。搅拌设置为250至500rpm，并且do通过级联搅拌保持在30％以上。异丁香酚在eft 17小时以1.5g/l的供给速率供给4小时，然后在接下来的两个小时内将速率降低至1g/l，然后再降低至0.6g/l/小时，再持续8小时.hplc试样的制备如上述实例4所述。
[0140]
参考图5，使用5升发酵罐，用vpiem基因转变的大肠杆菌菌株iseg-v290能够以超过20g/l的滴度使用异丁香酚作为底物生产香草醛。还值得注意的是，异丁香酚到香草醛的摩尔转化率达到90％以上。
[0141]
从前述描述中显而易见的是，本公开的某些方面不受本文提供的实例的特定细节的限制，并且因此可以预期，本领域技术人员将想到其它修改和应用或其等同形式。因此，意图是权利要求将覆盖不脱离本公开的精神和范围的所有这样的修改和应用。
[0142]
此外，除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的方法或材料的任何方法和材料都可以用于本公开的实践或测试，但是优选的方法和材料如上所述。
[0143]
尽管为了理解的目的已经通过图示和实例的方式详细地描述了前述发明，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可以进行某些改变和修改。因此，说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求限定。
[0144]
目标序列
[0145]
seq id no:1
–
vpiem的核酸序列
[0146]
atggctcccgcacctacagtccaagatgcggcaccggtcgccgtcgccgtgccgagcaaggccactaacaagggatcgttcgtccaccccaccgacatccttccaagcggatggcctactgcgaccgacctctctggaggagctcagccacgtcgtttcgaaggaaccatttacgacgtcatggttcgagggaccatccccaaggagctccacgggaccttttaccgcatcatgccagactacgccgaagcaccaacctactacaaaggaggagagctcaacgctcccattgacggtgatggtaccgtcgccgctttccgcttcaaggacggcaacgtcgactaccgccagcgcttcgtagagaccgaccgcttcaaggtggagaggagggcgaggaagagcatgtatggcctctaccgcaatccttacacccaccacccttgcgtccgacagacggtcgactcgaccgccaacaccaacgtcgtcatgcacgccggccgcttcctcgccatgaaggagaatggcaacgcctacgagctggaccctcacacgctcaagacgctcggctacaacccattcaagctgccctccaagaccatgaccgccca
tccaaagcaggatgccgtcactggtaacctcgtcggcttcggttacgaggccaaaggactggcgaccaaggacgtctactacttcgaggtcgacacccagggcaacatcgttcacgacctctggctcgaggccccctggtgcgccttcatccacgactgtgccctcacccccaactatctcgtcttgatgctctggccgttcgaggccgacatcgagcgcatgaaggccggtggacaccattgggcctacgactacgacaagcccatcacctggatcaccatcccgcgtggagccaagagcaaggacgaggtaaagtactggtactggaagaacggaatgccgatccacacggcggcggggtacgaggacgagaagggacgcatcatcatcgacagctcgctcgtccacggcaacgccttcccattcttcccacccgactcggaggagcagcgaaagcgtcaggaggcggatggaactccgatcgcccagttcgtccgatggacgatcgacccgagcaaggaccccaacgagaggctccccgatccagaggtggtcctcgacactccctccgagttcccccagatcgacaaccgattcatgggcaaggaatactcgagcgccttcatcaatgtcttcatgcccgatcgatccgacacgggcaagaacgtcttccaaggcctcaacggcctgtgtcactaccgtcggaaggagggcactgccgatttctactatgcaggtgacaactgcctgatccaggagcccgtcttcagtccaaggtccaaggacgcccccgagggcgatggcttcgtcttggccatcgtcgatcggctcgacgccaaccgaagcgaagtagtcatcattgacacgcgagacttcaccaaagcggtcgctgccgttcaacttccgttcgccatccgatccggcattcacggccagtggatccagggcaacacgatccccgatttcgacacccgcggcctcgtcgaccttcccaaggaggagcactgggcgcctccagaagcaagtgcctacgatccaaacatgtga
[0147]
seq id no:2
–
vpiem的氨基酸序列
[0148]
mapaptvqdaapvavavpskatnkgsfvhptdilpsgwptatdlsggaqprrfegtiydvmvrgtipkelhgtfyrimpdyaeaptyykggelnapidgdgtvaafrfkdgnvdyrqrfvetdrfkverrarksmyglyrnpythhpcvrqtvdstantnvvmhagrflamkengnayeldphtlktlgynpfklpsktmtahpkqdavtgnlvgfgyeakglatkdvyyfevdtqgnivhdlwleapwcafihdcaltpnylvlmlwpfeadiermkagghhwaydydkpitwitiprgakskdevkywywkngmpihtaagyedekgriiidsslvhgnafpffppdseeqrkrqeadgtpiaqfvrwtidpskdpnerlpdpevvldtpsefpqidnrfmgkeyssafinvfmpdrsdtgknvfqglnglchyrrkegtadfyyagdncliqepvfsprskdapegdgfvlaivdrldanrsevviidtrdftkavaavqlpfairsgihgqwiqgntipdfdtrglvdlpkeehwappeasaydpnm
[0149]
seq id no:3
–
针对在大肠杆菌中表达而优化的vpiem密码子的核酸序列
[0150]
atggcaccggcccctaccgttcaggatgcagcaccggttgcagtggccgttccgagtaaagccaccaataaaggcagctttgtgcatccgaccgatattctgccgagtggctggccgaccgccaccgatctgagtggtggcgcccagccgcgtcgctttgaaggcaccatttatgatgtgatggtgcgtggtacaattccgaaagaactgcatggcaccttttatcgtattatgccggattatgccgaagcaccgacctattataaaggtggcgaactgaatgccccgattgatggcgatggcaccgttgccgcatttcgttttaaagatggtaatgtggattaccgccagcgctttgttgaaaccgatcgttttaaagttgaacgtcgcgcccgcaaaagtatgtatggtctgtatcgtaatccgtatacccatcatccgtgcgtgcgtcagaccgttgatagtaccgcaaataccaatgttgtgatgcatgcaggccgctttctggccatgaaagaaaatggtaatgcatacgaactggaccctcataccctgaaaaccctgggctataatccgtttaaattaccgagtaaaaccatgaccgcccatccgaaacaggatgccgtgaccggtaatctggttggctttggctatgaagccaaaggcttagccaccaaagatgtttattattttgaggtggatacccagggcaatattgttcatgatctgtggctggaagcaccgtggtgtgcatttattcatgattgcgcactgaccccgaattatctggttctgatgctgtggccgtttgaagcagatattgaacgcatgaaagcaggcggtcatcattgggcatacgattatgataaaccgattacctggattaccattccgcgtggtgcaaaaagcaaagatgaagtgaaatattggtactggaaaaatggcatgccgattcataccgcagccggctatgaagatgaaaaaggccgcattattattgatagcagcctggttcatggcaatgcctttccgttttttccgccggatagcgaagaacagcgtaaacgtcaggaagcagatggcaccccgattgcacagtttgttcgctggaccattgatccgagcaaagatccgaatgaacgcctgc
cggaccctgaagttgttctggataccccgagcgaatttccgcagattgataatcgctttatgggcaaagaatatagtagcgcctttattaatgtgtttatgccggatcgcagtgataccggcaaaaatgtttttcagggcctgaatggcctgtgtcattatcgtcgcaaagaaggcaccgcagatttttattatgccggtgataattgcctgattcaggaaccggtttttagtccgcgtagtaaagatgcaccggaaggcgatggctttgtgctggcaattgttgatcgtctggatgccaatcgtagtgaagtggtgattattgatacccgcgattttaccaaagccgtggccgcagtgcagctgccgtttgccattcgtagtggcattcatggccagtggattcagggcaataccattcctgattttgatacccgtggcctggtggatctgccgaaagaagaacattgggcaccgccggaagccagtgcctatgatccgaatatgtaa
[0151]
seq id no:4
–
vpiem-pet28a的核酸序列
[0152]
tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacac
tccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgccatgccggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctacgagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatggcaccggcccctaccgttcaggatgcagcaccggttgcagtggccgttccgagtaaagccaccaataaaggcagctttgtgcatccgaccgatattctgccgagtggctggccgaccgccaccgatctgagtggtggcgcccagccgcgtcgctttgaaggcaccatttatgatgtgatggtgcgtggtacaattccgaaagaactgcatggcaccttttatcgtattatgccggattatgccgaagca
ccgacctattataaaggtggcgaactgaatgccccgattgatggcgatggcaccgttgccgcatttcgttttaaagatggtaatgtggattaccgccagcgctttgttgaaaccgatcgttttaaagttgaacgtcgcgcccgcaaaagtatgtatggtctgtatcgtaatccgtatacccatcatccgtgcgtgcgtcagaccgttgatagtaccgcaaataccaatgttgtgatgcatgcaggccgctttctggccatgaaagaaaatggtaatgcatacgaactggaccctcataccctgaaaaccctgggctataatccgtttaaattaccgagtaaaaccatgaccgcccatccgaaacaggatgccgtgaccggtaatctggttggctttggctatgaagccaaaggcttagccaccaaagatgtttattattttgaggtggatacccagggcaatattgttcatgatctgtggctggaagcaccgtggtgtgcatttattcatgattgcgcactgaccccgaattatctggttctgatgctgtggccgtttgaagcagatattgaacgcatgaaagcaggcggtcatcattgggcatacgattatgataaaccgattacctggattaccattccgcgtggtgcaaaaagcaaagatgaagtgaaatattggtactggaaaaatggcatgccgattcataccgcagccggctatgaagatgaaaaaggccgcattattattgatagcagcctggttcatggcaatgcctttccgttttttccgccggatagcgaagaacagcgtaaacgtcaggaagcagatggcaccccgattgcacagtttgttcgctggaccattgatccgagcaaagatccgaatgaacgcctgccggaccctgaagttgttctggataccccgagcgaatttccgcagattgataatcgctttatgggcaaagaatatagtagcgcctttattaatgtgtttatgccggatcgcagtgataccggcaaaaatgtttttcagggcctgaatggcctgtgtcattatcgtcgcaaagaaggcaccgcagatttttattatgccggtgataattgcctgattcaggaaccggtttttagtccgcgtagtaaagatgcaccggaaggcgatggctttgtgctggcaattgttgatcgtctggatgccaatcgtagtgaagtggtgattattgatacccgcgattttaccaaagccgtggccgcagtgcagctgccgtttgccattcgtagtggcattcatggccagtggattcagggcaataccattcctgattttgatacccgtggcctggtggatctgccgaaagaagaacattgggcaccgccggaagccagtgcctatgatccgaatatgtaactcgagcaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggat
[0153]
seq id no:5
–
vpiem-puvap的核酸序列
[0154]
ggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccatcgtttaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcaactataagaaggagatatacatatgtccaagacacaggagttcaggcctttgacactgccacccaagctgtcgttaagtgacttcaatgagttcatccaggatattattcgaatcgttggctctgaaaatgttgaagtcattagctcgaaggaccagattgttgacggttcttatatgaaacctacgcacacgcacgatccccatcatgtcatggaccaggactacttccttgcctcagcaattgttgctcctcgcaatgtcgccgatgtgcagtcgattgtcggacttgccaataagttctcatttcccctctggcccatctctattggaagaaattccggatatggcggtgctgcgccacgggttagtggcagtgtcgtgctggacatgggaaagaatatgaacagagttctggaagtgaacgtggaaggcgcatattgcgtggtggagcccggtgtaacttaccacgacttgcataattaccttgaggcgaacaatcttcgagacaaattatggcttgatgtaccggatcttggtggcggttctgttctcggcaatgccgttgagagaggtgtgggctatacgccttacggagatcattggatgatgcacagtgggatggaagtcgtccttgcgaatggcgagcttcttaggactggcatgggggctctacctgatcctaaacgtcccgaaacgatggggctaaagccagaagaccagccatggagcaaaatcgctcatctgtttccttatggcttcggtccctatatagatgggctattcagccaatcgaatatgggaattgttaccaagatcgggatctggttaatgcccaatccagggggttatcaatcctacttgatcacactacccaaagatggtgatttaaaacaagccgtcgatattattcgtccccttcgtctaggcatggcccttcaaaatgttcccactattcgccacattcttttggatgcagcggtgctcggtgacaagcgatcttattcatccaagaccgaacccctctccgacgaggaattagacaagatcgcgaaacagctcaacttgggacgatggaacttttacggggcgctctatggacctgagccgattcgaagggttctctgggaaacgattaaagacgcattctcggcgatcccaggcgtcaagttt
tattttccggaggacactcctgaaaactccgttctccgcgtgcgtgataagactatgcaaggcattccaacttacgacgagctaaagtggatcgactggctccctaatggtgcgcatctgttcttctctcctattgcgaaggtatctggtgaagatgcaatgatgcaatacgcagtcaccaagaaaaggtgtcaggaggctgggttagattttatcggcactttcacagtcggtatgagagagatgcatcatatcgtttgtattgtgttcaacaagaaggacctaatacaaaagagaaaagtacagtggctgatgagaacccttattgatgactgtgctgcaaatggatggggcgaatatcgaacccatctggccttcatggaccaaattatggaaacctacaactggaacaacagcagcttcctaaggttcaatgaggtcctcaagaatgcggtggaccctaatggcatcattgccccgggaaagtctggtgtttggccgagtcaatacagtcatgttacttggaaactgtaagcggccgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccgggtaacgaattcaagcttgatatcattcaggacgagcctcagactccagcgtaactggactgcaatcaactcactggctcaccttcacgggtgggcctttcttcggtagaaaatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcatcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcagaaaggcccacccgaaggtgagccaggtgattacatttgggccctcatcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcatttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatagctcctgaaaatctcgataactcaaaaaatacgcccggtagtgatcttatttcattatggtgaaagttggaacctcttacgtgccgatcaagtcaaaagcctccggtcggaggcttttgactttctgctatggaggtcaggtatgatttaaatggtcagtattgagcgatatctagagaattcgtcaaacccc
[0155]
seq id no:6
–
引物vpiem01的核酸序列
[0156]
catatggcaccggcccctaccgttcagg
[0157]
seq id no:7
–
引物vpiem02的核酸序列
[0158]
ctcgagttacatattcggatcataggcactgg
[0159]
seq id no:8
–
引物vpiem03的核酸序列
[0160]
actataagaaggagatatacatatgggcagcagccatcatcatcatcatc
[0161]
seq id no:9
–
引物vpiem04的核酸序列
[0162]
cagcggtggcggccgcttacatattcggatcataggcactggct
[0163]
seq id no:10
–
引物vpiem05的核酸序列
[0164]
taagcggccgccaccgctgagcaataactagc
[0165]
seq id no:11
–
引物vpiem06的核酸序列
[0166]
catatgtatatctccttcttatagttgaaattgttatccg

技术特征：
1.一种生产香草醛的生物转化方法，其包括：a.在混合物中表达vpiem基因，其中所述vpiem基因的所表达的蛋白具有与所述混合物中的seq id no:2具有至少70％同一性的氨基酸序列；b.向所述混合物中供给异丁香酚；以及c.将所述异丁香酚转化为所述香草醛。2.根据权利要求1所述的方法，其中所表达的vpiem蛋白具有与seq id no:2具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述蛋白将所述异丁香酚转化为所述香草醛。3.根据权利要求1所述的方法，其中所表达的vpiem蛋白具有与seq id no:2具有至少90％同一性的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的方法，其中所表达的vpiem蛋白具有与seq id no:2具有至少95％同一性的氨基酸序列。5.根据权利要求1所述的方法，其中表达所述vpiem基因的步骤选自由以下组成的群组：通过体外翻译表达所述基因；在细胞系统中表达所述基因；以及在细菌或酵母细胞中表达所述基因。6.根据权利要求5所述的方法，其还包括：纯化来自将所述vpiem基因表达为重组蛋白的步骤的所述产物。7.根据权利要求1所述的方法，其还包括：收集所述香草醛。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述异丁香酚到所述香草醛的转化率高于80％。9.根据权利要求7所述的方法，其中所述异丁香酚到所述香草醛的转化率高于85％。10.根据权利要求7所述的方法，其中所述异丁香酚到所述香草醛的转化率高于90％。11.一种使用分离的重组宿主细胞生产香草醛的方法，其包括：(i)在培养基中培养分离的重组宿主细胞；(ii)向(i)的所述培养基添加异丁香酚以开始所述异丁香酚到所述香草醛的生物转化；以及(iii)从所述培养基中提取所述香草醛，其中所述分离的重组宿主细胞已经用包含编码异丁香酚单加氧酶的多核苷酸序列的核酸构建体转变，其中所述异丁香酚单加氧酶具有与seq id no:2具有至少70％同一性的氨基酸序列。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述异丁香酚单加氧酶具有与seq id no:2具有至少80％同一性的氨基酸序列。13.根据权利要求11所述的方法，其中所述异丁香酚单加氧酶具有与seq id no:2具有至少90％同一性的氨基酸序列。14.根据权利要求11所述的方法，其中所述异丁香酚单加氧酶具有与seq id no:2具有至少95％同一性的氨基酸序列。15.一种制作消耗品的方法，其包括以下步骤：根据权利要求1所述的方法生产香草醛；收集所述香草醛；以及将所述香草醛掺入消耗品中。16.根据权利要求15所述的方法，其包括：将所述香草醛与所述消耗品掺和的步骤。17.根据权利要求15所述的方法，其中所述香草醛以足以赋予风味口味的量掺入到所述消耗品中。18.根据权利要求15所述的方法，其中所述消耗品选自由以下组成的群组：风味产品、食品、食品前体产品、食品生产中采用的添加剂、药物组合物、膳食补充剂、营养品和化妆品。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述香草醛以足以赋予香味的量掺入所述消耗品中。20.根据权利要求15所述的方法，其中所述消耗品选自由以下组成的群组：芳香产品、化妆品、洗漱产品和家居清洁产品。21.一种用核酸构建体转变的分离的重组宿主细胞，其包含：编码异丁香酚单加氧酶的多核苷酸序列，其中所述异丁香酚单加氧酶具有与seq id no:2具有至少70％同一性的氨基酸序列。22.根据权利要求21所述的分离的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸序列包含与seq id no:1的核酸序列至少90％相同的序列。23.根据权利要求21所述的分离的重组宿主细胞，其还包含：含有所述分离的核酸序列seq id no:4的载体。24.根据权利要求21所述的分离的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞选自由以下组成的群组：细菌、酵母、非紫菌的真菌、蓝细菌、藻类和植物细胞。25.根据权利要求21所述的分离的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞选自由以下组成的群组：埃希氏菌(escherichia)；沙门氏菌(salmonella)；芽孢杆菌(bacillus)；不动杆菌(acinetobacter)；链霉菌(streptomyces)；棒状杆菌(corynebacterium)；甲基弯曲菌(methylosinus)；甲基单胞菌(methylomonas)；红球菌(rhodococcus)；假单胞菌(pseudomonas)；红细菌(rhodobacter)；集胞藻(synechocystis)；酵母菌(saccharomyces)；接合酵母菌(zygosaccharomyces)；克鲁维酵母菌(kluyveromyces)；念珠菌(candida)；汉逊酵母(hansenula)；德巴利氏酵母(debaryomyces)；毛霉菌(mucor)；毕赤酵母(pichia)；球拟酵母(torulopsis)；曲霉菌(aspergillus)；节丛孢菌(arthrobotlys)；短杆菌(brevibacteria)；微杆菌(microbacterium)；节杆菌(arthrobacter)；柠檬酸杆菌(citrobacter)；克雷伯菌(klebsiella)；泛生菌(pantoea)；以及梭菌(clostridium)。

技术总结
本公开总体涉及使用异丁香酚作为底物通过生物转化生产天然香草醛。更具体地，本公开方法利用真菌异丁香酚单加氧酶催化异丁香酚到香草醛的生物转化，这可以在细胞系统(例如，细菌或酵母)中或在没有细胞系统的酶促反应混合物中进行。合物中进行。


技术研发人员：R
受保护的技术使用者：巴斯夫欧洲公司
技术研发日：2021.12.17
技术公布日：2023/9/23