用于测序的核酸样品的制备的制作方法

用于测序的核酸样品的制备
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年12月18日提交的美国临时专利申请号63/127,566的优先权权益，其公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
3.本公开的主题涉及用于制备用于测序的核酸样品的组合物和方法。


背景技术：

4.dna中胞嘧啶的甲基化是多种疾病和病状的越来越重要的诊断标志物。例如，dna甲基化谱分析已被用作检测、诊断和/或表征癌症的诊断工具。这些分析通常使用来自体液的片段化dna(cfdna)。鉴定经甲基化的碱基的测序通常涉及转换步骤，其中未甲基化的胞嘧啶被转换为尿嘧啶，然后添加测序衔接子。添加测序衔接子通常涉及两个连接步骤，这会降低转换效率，并增加额外的清理步骤。这种方法降低了整体文库转换效率。
5.因此，本领域需要简化dna文库制备并提高效率的方法。


技术实现要素：

6.本公开的主题涉及一种制备环化模板的方法，该方法在不同的实施方案中包括：(a)提供单链核酸片段的样品；(b)将具有[ps]-[l]-[ps]结构的片段连接到或复制入核酸片段的每一个，其中ps是引物位点，l是接头；(c)循环和/或本文公开的此类方面或其他方面的任何一个或组合。
[0007]
在一些方面，所公开的主题包括具有[t]-[ps1]-[l]-[ps2]结构的环化核酸模板，其中：(a)t是靶核酸序列；(b)ps1和ps2各自是核酸引物位点；(c)l是包含终止引物延伸反应的有机分子的接头，例如，接头l连接ps1和ps2并且包含终止引物延伸反应中的聚合的有机分子；和(d)该结构通过将其5’端结合到其3’端而环化，和/或本文公开的这些方面或其他方面的任何一个或组合。
[0008]
在各种实施方案中，所公开的主题包括具有[ps1]-[l]-[ps2]-[t’]结构的环化核酸模板，其中：(a)t’是靶核酸序列的互补序列；(b)ps1和ps2各自是核酸引物位点；(c)l是包含终止引物延伸反应的有机分子的接头；和(d)该结构通过将其5’端结合到其3’端而环化，和/或本文公开的这些方面或其他方面的任何一个或组合。
[0009]
在一些方面，本公开涉及一种扩增靶序列的方法，该方法包括：(a)提供环化模板；(b)使与ps1互补的引物结合至ps1并且使与ps2互补的引物结合至ps2；(c)使用聚合酶通过引物延伸反应复制靶序列，和/或本文公开的这些步骤或其他方面的任何一个或组合。
[0010]
在各种情况下，本公开涉及制备具有[t]-[ps1]-[l]-[ps2]结构的环化模板的方法，该方法包括：(a)提供[ps1]-[l]-[ps2]链；(b)提供[t]链；(c)将[ps1]-[l]-[ps2]链连接到[t]链以产生[t]-[ps1]-[l]-[ps2]链；(d)环化[t]-[ps1]-[l]-[ps2]链以产生环化的[t]-[ps1]-[l]-[ps2]，和/或本文公开的这些步骤或其他方面的任何一个或组合(方法环
化模板途径#1-新)。在一些情况下，本公开涉及制备具有[ps1]-[l]-[ps2]-[t’]结构的环化模板的方法，该方法包括：(a)提供[t]链；(b)提供[ps1]-[l]-[ps2]链；(c)将与[ps1]-[l]-[ps2]链的[ps2]互补的[ps2’]链连接到[t]链的3’端；(d)将[ps1]-[l]-[ps2]链与连接的[t]-[ps2’]退火；(d)使用聚合酶通过引物延伸反应延伸[ps1]-[l]-[ps2]链以产生[ps1]-[l]-[ps2]-[t’]链，其中[t’]是[t]链的互补序列；和(e)环化[ps1]-[l]-[ps2]-[t’]链以产生环化的[ps1]-[l]-[ps2]-[t’]。
[0011]
在一些实施方案中，本公开涉及具有[ps1]-[l]-[ps2]结构的单链核酸，其中ps1和ps2各自是核酸引物位点，并且l是包含终止引物延伸反应的有机分子的接头。
[0012]
在一些方面，本公开涉及试剂盒，其包括：(a)具有封闭的3’端的5’磷酸化单链引物位点寡核苷酸；和(b)具有[ps1]-[l]-[ps2]结构的单链核酸，其中ps1和ps2各自是核酸引物位点，l是连接[ps1]和[ps2]并且包含终止引物延伸反应的有机分子的接头，并且[ps2]与具有封闭的3’端的引物位点寡核苷酸互补。
[0013]
在一些实施方案中，接头包括聚亚烷基二醇接头、聚乙二醇接头、以磷酸基团封端的聚亚烷基二醇接头或以磷酸基团封端的聚乙二醇接头。
[0014]
在各种实施方案中，靶核酸序列[t]包含其中胞嘧啶已经被修饰或转换的单链dna分子。在其他实施方案中，靶核酸序列[t]包含单链dna分子，其中胞嘧啶已转换为尿嘧啶。
附图说明
[0015]
图1a显示了具有以下结构的环化ssdna：[t]-[ps]-[l]-[ps]或[ps]-[l]-[ps]-[t’]，其中接头[l]连接两个引物位点[ps]组分并包含终止引物延伸反应的有机分子，其中[ps]组分连接到靶序列[t]或靶序列的互补序列[t’]。
[0016]
图1b的图说明所公开主题的[ps1]-[l]-[ps2]链，其包括第一衔接子[ps1]、第二衔接子[ps2]和接头[l]，所述接头[l]包含终止引物延伸反应的有机分子，并将第一个衔接子的3’端连接到第二衔接子的5’端。
[0017]
图1c的图说明所公开主题的线性[t]-[ps1]-[l]-[ps2]链，其包括5’端连接到靶链的3’端的图1b的[ps1]-[l]-[ps2]链。
[0018]
图1d的图说明所公开主题的线性[ps1]-[l]-[ps2]-[t]链，其包括3’端连接到靶链[t’]的互补序列的5’端的图1b的[ps1]-[l]-[ps2]链。
[0019]
图2a和图2b说明了所公开主题的方法，其包括引物位点连接、图1b的[ps1]-[l]-[ps2]102的引物延伸和扩增。
[0020]
图3说明了替代实施方案，其中图2a的步骤c、d和e中的引物位点连接和引物延伸反应被图1b的[ps1]-[l]-[ps2]102直接连接到靶链替代。
[0021]
图4是高灵敏度ngs片段分析仪运行的图，说明了使用[ps1]-[l]-[ps2]链102延伸引物(命名为“circ延伸引物”)或传统延伸引物(其中cfdna未被环化，命名为“grailmethylseq”)并且其中cfdna仅接受了两个清除步骤之一的扩增方法中制备的cfdna的比较。
[0022]
图5是使用circ延伸引物通过环化方法制备的甲基化文库的高灵敏度ngs片段分析仪运行的图。
具体实施方案
[0023]
如本文所用，以下术语具有给定的含义：
[0024]“扩增”是指复制dna链以产生互补链。扩增可以是热介导的或可以是等温的。扩增可例如通过在引物延伸反应中使用聚合酶来复制靶链来完成。
[0025]“体液”是指任何含有dna的体液，包括但不限于全血、循环血、血液部分、血清或血浆、房水、腹水、胆汁、脑脊髓液、乳糜、胃液、肠液、淋巴液、胰液、心包液、腹膜液、胸腔积液、唾液、脊髓液、痰、粪便或其他肠道废物、汗液、泪液和/或尿液。
[0026]“cfna”是指细胞外核酸，“cfdna”是指在体液中发现的细胞外dna。
[0027]“输入样品”是指经处理的片段化dna样品。术语“输入样品”被用于区别于“样品”，“样品”是指从受试者获得的生物样品。来自生物受试者的样品经过处理以制备输入样品，例如，通过从样品中纯化cfdna和/或将样品片段化(如果需要)。片段化的dna和cfdna在本文中称为“靶核酸”、“靶dna”、“靶链”或“靶标”。然而，应当注意，在所公开的主题的一个方面，输入样品和样品可以是相同的，即，该方法可以与“脏样品”或“未纯化样品”一起使用。
[0028]“目标疾病”是指正在对其进行测定或测试的疾病、病状或靶标，例如，目标疾病可以是一般的癌症、癌症的特定类别、特定的癌症类型、特定的癌症阶段、前述的组合、或甲基化分析可以产生信息性信息的任何其他疾病或病状或疾病或病状的组合。
[0029]
在整个说明书中，申请人使用式[x]-[y]-[z]-[...]描述各种结构，例如[t]-[ps]-[l]-[ps]和[ps]-[l]-[ps]-[t’]，其中包括引物位点[ps]、靶核酸[t]、靶核酸互补序列[t’]、接头[l]和衔接子[a]。应当理解，这些式并不旨在限制所述结构的组分—例如，可能包括一个或多个另外的组分。例如，在[t]-[ps]-[l]-[ps]或[ps]-[l]-[ps]-[t’]中，一个或多个另外的组分可以包括在该结构的任一端，或者在[ps]和[t/t’]之间，在[ps]和[l]之间，或者前述的任何组合。
[0030]
描述
[0031]
在各个方面，所公开的主题提供了用于制备用于测序的片段化dna文库的方法、组合物、试剂和试剂盒。该方法利用可用于扩增反应以产生线性拷贝的环化ssdna模板。线性拷贝可以继续进行文库制备工作流程中的其他步骤和/或进入分析步骤，例如确定靶标的序列的过程。所公开的主题的优势包括连接步骤的减少，这可以导致更少的清理步骤和提高的整体文库转换效率。
[0032]
图1a显示了具有以下结构的环化ssdna 100：[t]-[ps]-[l]-[ps]或[ps]-[l]-[ps]-[t’]，其中包含终止引物延伸反应的有机分子的接头120连接与靶序列[t]或靶序列[t’]的互补序列相连的两个[ps]组分。环化的ssdna 100包括靶标/靶标105的互补序列、靶标3’或5’端的第一引物位点110、靶标105另一端的第二引物位点115、和接头120。
[0033]
接头120可包含多种终止引物延伸反应的有机分子中的任一种，其将核酸链的3’端连接至另一核酸链的5’端。接头120终止引物延伸反应中的聚合。例如，在一个方面，接头包含以磷酸基团封端的聚亚烷基二醇分子。在一个实施方案中，接头包含以磷酸基团封端的聚乙二醇分子。聚乙二醇部分可例如具有2至20个聚乙二醇单元。在一个例子中，接头包含内部间隔子18(int spacer 18)(ispl8)，一种可从integrated dna technologies,inc.(coraville,ia)获得的六乙二醇接头：
[0034][0035]
在一个实施方案中，接头包含亚膦酰胺分子。亚膦酰胺分子可以例如具有二至二十个碳原子。在一个方面，接头包含可从integrated dna technologies,inc.(coraville,ia)获得的三碳亚磷酰胺分子：
[0036][0037]
在实施方案的一个版本中，接头包含乙二醇分子。乙二醇分子可以例如具有二至二十个碳原子。在一个例子中，接头包含可从integrated dna technologies,inc.(coraville,ia)获得的六碳乙二醇分子：
[0038][0039]
在一些版本中，接头包含一个或多个1’,2
’‑
双脱氧核糖分子或相似的无碱基分子(abasic molecules)。1’,2
’‑
双脱氧核糖分子可以例如具有2至20个1’,2
’‑
双脱氧核糖单元。在一个方面，接头包含可从integrated dna technologies,inc.(coraville,ia)获得的1’,2
’‑
双脱氧核糖分子：
[0040][0041]
在各种实施方案中，接头包含以磷酸基团封端的三甘醇分子。在一个例子中，接头包含可从integrated dna technologies,inc.(coraville,ia)获得的三甘醇分子：
[0042][0043]
在一个方面，接头120包含终止引物延伸反应的有机分子的多个插入。在一个例子中，接头120包含不同有机分子的组合的多个插入，这些有机分子将核酸链的3’端连接到另一条核酸链的5’端并终止引物延伸反应中的聚合。在非限制性实例中，接头120可包含以下
之一或以下的组合的多个插入：聚亚烷基二醇分子、以磷酸基团封端的聚亚烷基二醇分子、聚乙二醇分子、以磷酸基团封端的聚乙二醇分子、亚膦酰胺分子、乙二醇分子、1’,2
’‑
二脱氧核糖分子或以磷酸基团封端的三甘醇分子。
[0044]
在一些版本中，接头120进一步包含一个或多个间插的寡核苷酸，其连接有机分子的多个插入，这些有机分子将核酸链的3’端连接到另一核酸链的5’端并终止引物延伸反应中的聚合。作为非限制性实例，在一个方面，接头120是内部间隔子18分子，其3’端与间插寡核苷酸的5’端键合，间插寡核苷酸的3’端与第二内部间隔子18分子的5’端键合。一个或多个间插寡核苷酸的长度范围可以从2个核苷酸到100个核苷酸，从3个核苷酸到20个核苷酸，或者从4个核苷酸到10个核苷酸。在一个实例中，间插寡核苷酸的长度是六个核苷酸或更多。
[0045]
图1b的图说明所公开主题的[ps]-[l]-[ps]链102，其包括第一衔接子110、第二衔接子115和接头120，接头120将衔接子110的3’端连接到衔接子115的5’端。链102在本文中也可称为circ延伸引物或延伸引物。本文使用的术语衔接子是指可以连接到其他dna、cfdna或rna分子的末端的单链或双链寡核苷酸。衔接子可以在测序中提供引物位点。
[0046]
所公开主题的[ps]-[l]-[ps]链102可以使用本领域普通技术人员已知的任何方法产生。在一个非限制性实例中，5’dmt(二甲氧基三苯甲基)保护的目标寡核苷酸(n1)可以在3’位置连接到5微米受控孔玻璃珠(cpg)或聚苯乙烯(ps)珠。这种n1寡核苷酸的非限制性实例包括dmt-dt-cpg(sigma-aldrich,inc.,st.louis,mo)。然后可以使用三氯乙酸(tca)脱保护二甲氧基三苯甲基，留下5’反应性羟基。接下来，cpg结合的寡核苷酸可以用极性非质子溶剂例如乙腈洗涤30秒。
[0047]
接下来，5
’‑
dmt保护的内部间隔子18(internal spacer 18)分子可以与nl的5’暴露的羟基反应。在该反应中，n1暴露的5
’‑
羟基与内部间隔子18的3
’‑
磷酸基团发生缩合，形成共价键。随后，可以使用极性非质子溶剂例如乙腈将产物洗涤30秒。接下来，可以使用标准tca方法从内部间隔子18的5’端去除5
’‑
dmt基团，这可能会留下反应性5
’‑
羟基。
[0048]5’‑
dmt保护的核苷酸(n2)然后可以与cpg—3’
dt5’
—3’
内部间隔子18-oh5’
链反应，其中“oh”可以是暴露的反应性5
’‑
羟基。内部间隔子18的5
’‑
羟基可以与n2 5
’‑
dmt保护的核苷酸的3
’‑
羟基在缩合反应中反应，这可以与n2核苷酸3’碳上的接头形成共价键。该缩合反应可以产生cpg—3’
nl5’
—3’
接头5’
—n2链。随后可以重复上述步骤，从n2核苷酸的5
’‑
dmt脱保护开始，直到获得所需的[ps]-l-[ps]链102。
[0049]
所公开主题的方法利用[ps]-[l]-[ps]链102来产生环化的[t]-[ps]-[l]-[ps]。[ps]-[l]-[ps]链102将5’和3’引物位点110和115引入靶核酸105。[ps]-[l]-[ps]链102包括连接[ps]组分的接头分子。[ps]-[l]-[ps]链102可以连接到靶核酸105的3’或5’端。例如，[ps]-[l]-[ps]链102可以通过连接或通过使用聚合酶的引物链延伸连接至靶标105。
[0050]
图1c的图说明所公开主题的线性[t]-[ps]-[l]-[ps]链103，其包括所公开主题的5’端连接到靶标105的3’端的[ps]-[l]-[ps]链102。[t]-[ps]-[l]-[ps]链103可被环化以形成如图1a所示的环化ssdna 100。
[0051]
图1d的图说明所公开主题的线性[ps]-[l]-[ps]-[t’]链104，其包括所公开主题的3’端连接到靶标105[t’]的互补序列的5’端的[ps]-[l]-[ps]链102。[ps]-[l]-[ps]-[t’]链104可以环化以形成图1a所示的环化ssdna 100。
[0052]
方法
[0053]
图2a和2b说明了所公开主题的方法。
[0054]
在步骤a中，双链输入核酸片段205经历转换，其中链变性并且未修饰的胞嘧啶转换为尿嘧啶。步骤a产生变性的、转换的单链dna片段210。
[0055]
在步骤b中，片段210的两端被准备用于连接，例如使用t4多核苷酸激酶(t4 pnk)，其催化atp的γ-磷酸转移到5’末端并从单链片段210除去3’磷酸，产生片段215。
[0056]
在步骤c中，将引物位点链220连接到片段215的3’端，产生[t]-[ps]链225。引物位点链220可以作为具有封闭的3’端的5’磷酸化单链引入。多种修饰剂可用于封闭引物位点链220的3’端。几种这类修饰剂可从integrated dna technologies,inc.,coraville,ia获得。在一个方面，封闭剂是3ammo，一种3’氨基修饰剂，可从integrated dna technologies,inc.(coraville,ia)获得，其具有以下结构：
[0057][0058]
在某些实施方案中，连接可以是酶促介导的，例如，使用circligase(在下面更详细地讨论)。可以包括清理步骤以为步骤d制备[t]-[ps]链225。
[0059]
在步骤d中，引入[ps]-[l]-[ps]链102(在图2a中显示为230)。[ps]-[l]-[ps]链230包括由接头120分开的引物位点232a和232b。引物位点232a在此步骤中用作引物，与[t]-[ps]链225上的互补引物位点退火。一旦退火，[ps]-[l]-[ps]链230可以使用聚合酶通过引物延伸反应进行延伸，以产生[ps]-[l]-[ps]-[t’]链235(参见图2b)。
[0060]
在步骤e中，可以进行清理步骤，其任选地包括亚硫酸氢盐处理的模板的降解，其中已经使用亚硫酸氢盐转换方法将未甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，例如，使用user(尿嘧啶特异性切除试剂)酶(可从new england biolabs,inc.,ipswich,ma获得)。在所公开的主题的一个方面，步骤e中的引物延伸是使用线性扩增进行的，可以预期这会稀释原始模板，从而使原始模板的降解变得不必要。
[0061]
在步骤f中，[ps]-[l]-[ps]-[t’]链235被环化，产生环化的[ps]-[l]-[ps]-[t’]模板240。环化可以使用多种技术来完成。在一个方面，环化是使用ssdna连接酶完成的，例如circligase ssdna连接酶或circligase ii ssdna连接酶(下文更详细讨论)。使用circligase ssdna连接酶或circligase ii ssdna连接酶的环化反应利用ssdna 5
’‑
磷酸和3
’‑
羟基使dna环化。
[0062]
在步骤g中，正向引物245和反向引物250与环化[ps]-[l]-[ps]-[t’]模板240退火，并且使用引物延伸反应产生线性化[a]-[t]-[a]扩增子255。正向引物245和反向引物250可包括对下游工作流程步骤例如测序步骤有用的各种衔接子元件。
[0063]
引物优选地是测序引物，例如用于illumina测序仪的引物。
[0064]
在一个实例中，正向引物245具有以下结构，5’至3’：
[0065]
[adapt]-[ind]-[seq-primer]-[targ-primer]
[0066]
[adapt]为衔接子，如illumina p5衔接子，5’aat gat acg gcg acc acc ga 3’(seq id no:1)；
[0067]
[ind]是独特的样品标识符序列，例如illumina i7索引；
[0068]
[seq-primer]是测序引物，例如illumina sbs12引物aca ctc ttt ccc tac acg acg ctc ttc cga tct(seq id no:2)；
[0069]
[targ-primer]是与环化的[ps]-[l]-[ps]-[t’]模板240中的靶核酸序列互补的靶引物。
[0070]
在一个实例中，反向引物250具有以下结构，5’至3’：
[0071]
[adapt]-[ind]-[seq-primer]-[targ-primer]
[0072]
[adapt]为衔接子，如illumina p7衔接子，5’caa gca gaa gac ggc ata cga 3(seq id no:3)；
[0073]
[ind]是独特的样品标识符序列，例如illumina i5索引；
[0074]
[seq-primer]为测序引物，如illumina sbs3引物，gtg act gga gtt cag acg tgt gct ctt ccg atc t(seq id no:4)；
[0075]
[targ-primer]是与环化的[ps]-[l]-[ps]-[t’]模板240中的靶序列互补的靶引物。
[0076]
在步骤h中，线性化的[a]-[t]-[a]扩增子255被清理并准备用于分析，例如用于测序。
[0077]
图3说明了替代实施方案，其中步骤c、d和e中的引物位点连接和引物延伸反应被连接过程所取代，所述连接过程中[ps1]-l-[ps2]链102被直接连接到靶链，在图3中显示为步骤c’和d’。因此，图3中描述的方法在一个方面可以按以下顺序进行：步骤a、b、c’、d’、f、g、h，其中步骤a、b、f、g和h如上所述，步骤c’和d’如下。
[0078]
在步骤c’中，[ps]-[l]-[ps]102(在图3中显示为310)被引入并连接到靶片段215的3’端以产生[t]-[ps]-[l]-[ps]链315。单链连接可以由酶介导，例如circligase酶(下文更详细地讨论)。
[0079]
在步骤d’中，[t]-[ps]-[l]-[ps]链315的衔接子部分可以被去磷酸化，例如，使用酶如t4 pnk(new england biolabs,inc.,ipswich,massachusetts)，从而产生去磷酸化的链320。t4 pnk通过留下亚硫酸氢盐转换的ssdna片段的3
’‑
oh端，在步骤f中通过连接制备用于环化的片段末端。步骤d’还可以包括去磷酸化酶的热灭活，然后再进行步骤f中的环化。如上所述，对于在步骤f中[ps]-[l]-[ps]-[t’]235链的环化，[t]-[ps]-[l]-[ps]链315在步骤f中类似地环化，产生环化的[t]-[ps]-[l]-[ps]模板240。模板240代表环化的[ps]-[l]-[ps]-[t’]235链和[t]-[ps]-[l]-[ps]链315。
[0080]
所公开主题的各种实施方案的实验结果在实施例1中描述并在图4和图5中说明。图4是高灵敏度ngs片段分析仪运行的图，说明了使用[ps1]-[l]-[ps2]链102作为延伸引物(命名为“circ延伸引物”)或传统延伸引物(其中cfdna未被环化，命名为“grailmethylseq”)并且其中cfdna仅接受了两个清除步骤之一，根据图2a和2b的扩增方法中制备的cfdna的比较。图5是甲基化文库的高灵敏度ngs片段分析仪运行的图，该甲基化文库是使用circ延伸引物[ps1]-[l]-[ps2]链102通过根据图2a和2b的环化方法制备的。
[0081]
输入样品
[0082]
在所公开主题的方法中，输入样品包括片段化的dna。可以使用各种实验室技术将片段化的dna片段化。片段化的dna可以是天然片段化的，例如cfdna。片段化的dna可以代表基因组(包括整个基因组)的任何子集，甚至多个基因组或多个基因组的子集。
[0083]
样品的来源可以是任何dna来源。例如，样品源可以是生物有机体或环境样品。如果来源是生物有机体，则来源可以是组织、细胞、体液或其他物质。样品可以是新鲜的或可以保存。优选地，受试者是人或其他动物。在所公开主题的一个方面，样品或输入样品可以从多个来源和/或多个受试者汇集。
[0084]
在所公开主题的一个方面，样品来自已知患有或疑似患有某种疾病的受试者。在所公开主题的在一个方面，样品来自未知患有或疑似患有某种疾病的受试者(例如，研究中的对照受试者或正在接受疾病筛查的受试者)。
[0085]
在所公开主题的一个版本中，样品来自已知患有或疑似患有癌症的受试者。在所公开主题的一个方面，样品来自未知患有或疑似患有癌症的受试者(例如，研究中的对照受试者或正在接受癌症筛查的受试者)。
[0086]
在所公开主题的一些实施方案中，样品来自肿瘤或疑似肿瘤。在所公开主题的一个方面，样品是组织样品，其可以是癌组织或被疑似是癌组织。在所公开主题的一个方面，样品是组织样品，其可以是i、ii、iii或iv期癌症。
[0087]
在所公开主题的一个方面，样品是体液或细胞外身体物质。在所公开主题的一些版本中，体液或细胞外身体物质选自由以下组成的组：全血、血液部分、血清和血浆。在所公开主题的在一个方面，体液或细胞外物质选自房水、腹水、胆汁、脑脊髓液、乳糜、胃液、肠液、淋巴液、胰液、心包液、腹膜液、胸腔积液、唾液、脊髓液、痰、粪便或其他肠道废物、汗液、泪液和/或尿液。
[0088]
根据所公开主题的一个版本，输入样品是从体液或其他身体物质获得的cfna或cfdna。在所公开主题的在一个方面，cfna或cfdna源自健康细胞。在所公开主题的在一个方面，cfna或cfdna源自病变细胞，例如癌细胞。
[0089]
环化和ssdna连接
[0090]
如上所述，在所公开主题的方法的某些步骤中，核酸链被环化(参见步骤f，如图2b所示)。在所公开主题的方法的某些步骤中，单链核酸链被环化。在其他步骤中，ssdna分子被连接。
[0091]
在一个实施方案中，t4 dna连接酶可用于环化单链dna。连接反应可以是，例如，“标准”t4 dna连接酶反应或标准反应的修改版本，旨在防止分子间聚合并促进分子内环化，如an,r.,等人,nucleic acids research(2017)45(15):el39所述，其通过引用以其整体并入本文。可以使用例如可从thermo scientific(pittsburgh,pa)获得的t4 dna连接酶和t4 dna连接酶缓冲液进行连接反应。
[0092]
在一个实例中，标准t4 dna连接酶反应(20ul)可以使用1μm线性单链dna、1x t4 dna连接酶缓冲液(10mm mg2+、500μm atp、10mm二硫苏糖醇(dtt)、和40mm tris-hcl)、“夹板”dna(2μm；长度为12个核苷酸)和5u t4 dna连接酶进行。连接反应可以在20℃下进行12小时，并且通过在65℃下加热反应混合物10分钟来终止反应。
[0093]
在一个实例中，可以使用稀释至0.05x的t4 dna连接酶缓冲液(0.5mm mg2+、25μm atp、0.5mm dtt和2mm tris-hcl)来对标准反应进行修饰。
[0094]
在另一个实例中，可以使用稀释至0.05x的t4 dna连接酶缓冲液(0.5mm mg2+、25μm atp、0.5mm dtt和2mm tris-hcl)并以预定的时间间隔向连接反应中逐步添加线性单链dna来对标准反应进行修改。
[0095]
在一个方面，可以通过用磷酸基团修饰dna链的5’端使其能够环化到同一链的3’端来环化dna。支架链可以折叠以通过夹板链将其两端连接在一起，夹板链通过退火将两端连接在一起，例如，在95℃至25℃下4小时，然后在te缓冲液(包含66mm tris-hcl(ph 7.6)、6.6mm mgcl2、10mm二硫苏糖醇(dtt)、0.1mm atp和3.3μm na432p2o7)中使用t4 dna连接酶(10μl，350u/μl)连接两端，随后在酒精浴机器中在16℃下孵育16小时。t4-dna/连接酶可在65℃下热变性10分钟，然后在冰浴中突然冷却5分钟。
[0096]
在一个实施方案中，t4 rna连接酶可用于环化单链dna。在一个实例中，单链dna可以使用从thermo scientific(thermo fisher scientific,waltham,ma)获得的t4 rna连接酶、反应缓冲液和牛血清白蛋白(bsa)，遵循制造商推荐的方案(通过引用以其整体并入本文)在连接反应中环化。
[0097]
在另一个实例中，ts2126 rna连接酶1可用于以atp依赖性方式催化分子内单链dna连接(环化)，如blondal等人,nucleic acids res.(2005)33(1):135-142(其通过引用以其整体并入本文)所述。
[0098]
circligase ssdna连接酶是一种热稳定的atp依赖性连接酶，它催化具有5
’‑
单磷酸和3
’‑
羟基的单链dna(ssdna)底物的分子内连接(即环化)。circligase ii ssdna连接酶是一种不依赖于atp的非催化热稳定连接酶，可催化ssdna模板的分子内连接(即环化)。两种酶均可从lucigen corp.(middleton,wi)获得。circligase ssdna连接酶试剂盒或circligase ii ssdna连接酶试剂盒(epicentre biotechnologies,madison,wi；可从lucigen corp.,middleton,wi获得)可用于按照制造商推荐的方案环化单链dna，该方案通过引用以其整体并入本文。将circligase ssdna连接酶(ma222e-circligase ssdna连接酶，2019年3月)和circligase ii ssdna连接酶(ma298e-circligase ii ssdna连接酶，2019年7月)的lucigen corp手册以其整体并入本文。
[0099]
在一个实施方案中，circligase可用于环化单链dna。在一个实例中，circligase ssdna连接酶试剂盒(epicentre biotechnologies,madison,wi；可从lucigen corp.,middleton,wi获得)可用于按照制造商推荐的方案环化单链dna，该方案通过引用以其整体并入本文。在一个实例中，可以使用10pmol单链dna、2μl circligase 10x反应缓冲液、1μl 1mm atp、1μl 50mm mnc12、1μl circligase ssdna连接酶(100u)进行连接反应产生20μl总反应体积。可将连接反应在60℃下孵育1小时，并通过将反应混合物在80℃下加热10分钟以使连接酶失活来终止反应。
[0100]
在另一个实例中，circligase ii ssdna连接酶试剂盒(epicentre biotechnologies,madison,wi；可从lucigen corp.,middleton,wi获得)可用于按照制造商推荐的方案环化单链dna，该方案通过引用以其整体并入本文。在一个实例中，可以使用10pmol单链dna、2μl of circligase ii 10x反应缓冲液、1μl的50mm mnc12、4μl 5m甜菜碱(任选)、1μl circligase ii ssdna连接酶(100u)进行连接反应以产生20pl总反应体积。可将连接反应在60℃下孵育1小时，并通过将反应混合物在80℃下加热10分钟以使连接酶失活来终止反应。
[0101]
在另一个实例中，可以通过在4.5μl的环化混合物(最终体积为5μl：1x circligase缓冲液、50μm atp和2.5mm mncl)中重悬dna并添加0.5μl circligase来环化dna。环化可在60℃下进行1小时，持续1小时，然后通过将反应混合物在80℃下加热10分钟
以使连接酶失活来终止反应。
[0102]
circligase ssdna连接酶和circligase ii ssdna连接酶也可用于连接线性ssdna分子，例如，如图2a的步骤c和图3的步骤c’所示。可以使用任何已知的方案。示例性的实例提供于gansauge,et al.,single-stranded dna library preparation from highly degraded dna using t4 dna ligase,nucleic acids res.2017jun 2；45(10):e79，对于其关于ssdna连接方法的教导，其公开内容通过引用并入本文。
[0103]
尿嘧啶的转换
[0104]
如上所述，在本公开主题的方法的某些步骤中，未甲基化的胞嘧啶可以转换为尿嘧啶。
[0105]
多种试剂盒可商购用于此目的。实例包括epimark亚硫酸氢盐转换试剂盒(epimark bisulfite conversion kit)(new england biolabs ltd.,ipswich,massachusetts)；activemotif亚硫酸氢盐转换试剂盒(activemotif bisulfite conversion kit)(active motif,inc.,carlsbad,california)；epitect亚硫酸氢盐试剂盒(epitect bisulfite kits)(qiagen ltd.,hilden,germany)；ezdna甲基化闪电试剂盒(ez dna methylation-lightning kit)(zymo research corp.,irvine,california)；nebnext酶法甲基-seq(em-seq)(new england biolabs,inc.,ipswich,massachusetts)。这些试剂盒的产品文献通过引用并入本文。
[0106]
在一个方面，dna片段变性并用亚硫酸氢盐处理。变性和亚硫酸氢盐处理步骤可以在单一反应中或可以在连续反应中进行。亚硫酸氢盐处理用亚硫酸盐修饰未甲基化的胞嘧啶。转换后，dna可脱氨基转换为尿嘧啶。例如，可将dna脱盐并在碱性ph下孵育，从而导致脱氨并转换为尿嘧啶。
[0107]
在所公开的主题的一个方面，可以使用终浓度为约0.3m的naoh使dna片段变性，并用终浓度为约2m的亚硫酸氢钠或偏亚硫酸氢钠(ph在约5和6之间)在55℃下处理4-16小时。转换后，dna可以脱盐，然后通过在室温下在碱性ph条件下孵育dna来脱磺酸基。
[0108]
在所公开主题的另一个方面，未甲基化的胞嘧啶向尿嘧啶的转换利用酶促技术。例如，已知某些胞嘧啶脱氨酶可将单链dna中的胞嘧啶碱基脱氨为尿嘧啶。
[0109]
在所公开主题的另一个方面，胞嘧啶脱氨酶是apobec。apobec还会使5mc和5hmc脱氨基，因此为了检测5mc和5hmc，这些方法使用技术来阻止5mc和/或5hmc的脱氨基。例如，使用em-seq(new england biolabs,ipswich,massachusetts)tet2和氧化增强剂可用于将5mc和5hmc修饰为不是apobec底物的形式。tet2酶将5mc转换为5cac，氧化增强剂将5hmc转换为5ghmc。nebnext酶法甲基-seq(em-seq)产品文献通过引用并入本文。
[0110]
在所公开主题的另一个方面，5hmc被选择性地转换，使得它可以与5mc分开识别。例如，apobec偶联的表观遗传测序(ace-seq)依赖于酶促转换来检测5hmc。使用这种方法，t4-bgt将5hmc葡萄糖基化为5ghmc，并保护它免于被apobec3a脱氨。胞嘧啶和5mc被apobec3a脱氨基并被测序为胸腺嘧啶。
[0111]
在所公开主题的另一个方面，氧化亚硫酸氢盐测序(oxbs)用于区分5mc和5hmc。氧化试剂高钌酸钾将5hmc转换为5-甲酰基胞嘧啶(5fc)，随后亚硫酸氢钠处理将5fc脱氨为尿嘧啶。5mc保持不变，因此可以使用此方法进行识别。
[0112]
在所公开主题的另一个方面，片段化的dna用通过糖基化保护5hmc的t4-bgt处理。
然后使用酶mtetl将5mc氧化为5hmc，t4-bgt使用经修饰的葡萄糖部分(6-n3-葡萄糖)标记新形成的5hmc。
[0113]
链变性
[0114]
在所公开主题的一个方面，在进行转换反应之前使链变性。变性可以例如通过在升高的温度例如约98℃下孵育和/或暴露于碱例如氢氧化钠来完成。
[0115]
清理步骤
[0116]
所公开主题的方法可受益于各个阶段的清理步骤以制备用于后续步骤的反应物。在一个实例中，执行基于珠的清理方案，例如spri清理方案。
[0117]
提供以下实施例是为了说明，而不是为了限制。
[0118]
实施例
[0119]
实施例1
[0120]
设计并测试了包含有机接头的单链核酸分子(也称为“circ延伸引物”)以用于制备甲基化文库的环化和延伸方法。以下实验程序描述了一种从cfdna构建下一代测序(ngs)靶向甲基化文库的方法，其中dna在扩增前被环化。这种环化甲基-seq文库制备工作流程设计如图2a和2b所示。
[0121]
circ_延伸引物设计
[0122]
使用以下circ延伸引物(图1b中的链102)：/5phos/cgacaggttcagagttcctacaggtccgacgatc/isp18/cactca/isp18/gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgat ct-3’oh。在该延伸引物中，分子的isp18/cactca/isp18部分是如图1b中所示的接头120。术语“isp18”表示int spacer 18，一种可从integrated dna technologies,inc.(coraville,ia)获得的六乙二醇分子：
[0123]
输入样品
[0124]
无细胞dna(cfdna)存在于全血的血浆部分中。
[0125]
尿嘧啶的转换
[0126]
使用ez dna甲基化-闪电试剂盒手册版本1.0.4(zymo research corp.,irvine,california)将cfdna中未甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶。使用用于dnf-474-0500和dnf-474-1000的高级分析技术高灵敏度ngs片段分析试剂盒(1bp-6000bp)用户指南通过毛细管电泳分析片段。
[0127]
ngs文库的纯化
[0128]
在文库构建期间和在测序之前使用固相可逆固定化(spri)纯化ngs文库。该方法依赖于在聚乙二醇(peg)和盐的存在下可逆地结合dna的羧基包被的磁性颗粒/珠。
[0129]
试剂和材料
[0130]
所用试剂及材料如下表所示：
[0131]
[0132][0133]
聚乙二醇(peg)制备
[0134]
通过将1000μl peg(50％)与190.5μl无dna酶/rna酶的超纯水混合来制备42％(终浓度)的peg制剂。
[0135]
文库制备寡核苷酸试剂
[0136]
实验中使用的寡核苷酸被溶解于低edta te缓冲液中并且如下表所示：
[0137][0138]
[0139]
*＝硫代磷酸酯连接
[0140]
ddt＝双脱氧胸腺嘧啶
[0141]
3ammo＝3’氨基修饰剂，可从integrated dna technologies,inc.(coraville,ia)获得
[0142]
ispl8＝内部间隔子18(int spacer 18)，可从integrated dna technologies,inc.(coraville,ia)获得的六乙二醇分子
[0143]
通用程序
[0144]
在添加酶之前通过脉冲涡旋混合所有反应混合物。添加酶后的混合仅通过轻弹试管然后快速旋转来进行，除了在第一衔接子的连接部分中(其中反应包含20％ peg-4000并且涡旋是正确混合所必需的)。在整个方案中使用了低结合移液器吸头(low-bind pipette tips)。
[0145]
亚硫酸氢盐转换准备
[0146]
在使用前，将96ml的100％乙醇添加到24ml m-洗涤缓冲液浓缩物(d5031)中。zymo-spin ic柱在使用前经过检查以确保柱或基质没有可见损坏。闪电转换试剂(lightning conversion reagent)通过涡旋混合并快速离心。
[0147]
亚硫酸氢盐转换
[0148]
将总共25ng输入cfdna置于0.2ml pcr联排试管中。根据需要用无核酸酶水将样品体积调整为20μl。将130μl闪电转换试剂添加到dna样品中。通过涡旋混合，然后短暂离心以确保试管盖或试管壁中没有液滴。在热循环仪上启动ez闪电程序。当温度达到90℃时，将试管小心地放入热循环仪中。循环程序如下：98℃8分钟；54℃60分钟；和4℃保持。
[0149]
柱清理
[0150]
zymo-spin ic柱被设置到提供的收集试管中。将600μl m-结合缓冲液添加到柱中。小心地将dna试管从热循环仪中取出。将样品加载到包含m-结合缓冲液的zymo-spin ic柱中。通过上下吹打混合。全速(》10,000x g)离心30秒。流过液被丢弃。向柱中加入100μl m-洗涤缓冲液，并全速离心30秒。流过液被丢弃。向柱中加入200μl l-脱磺化缓冲液，并在室温下静置20分钟。然后全速离心30秒。流过液被丢弃并更换至新的收集试管。将200μl m-洗涤缓冲液添加到柱中。将柱全速离心30秒。向柱中加入另外的200μl m-洗涤缓冲液，并全速离心30秒。将柱放入新的收集试管中并全速离心30秒。将柱置于1.5ml eppendorf lo-结合试管中，将2μl m-洗脱缓冲液直接加入柱基质中，然后在室温下孵育5分钟。全速离心30秒以洗脱dna。
[0151]
去磷酸化和热变性
[0152]
将11μl经亚硫酸氢盐处理的dna转移到0.2ml联排试管中，并在冰上的试管中设置以下反应试剂混合物：
[0153]
试剂体积(μl)/样品ssligase反应缓冲液(10x)3mncl2(50mm)2fastap(1u/μl)1
[0154]
将6μl试剂混合物添加到经亚硫酸氢盐处理的dna中，并通过轻弹然后快速旋转来混合。试管在具有预热盖(105℃)的热循环仪中孵育：37℃10分钟；95℃2分钟；然后立即转
移到冰水浴中并且静置1分钟。快速旋转后，进行至第一衔接子的连接。
[0155]
第一衔接子的连接
[0156]
将纯化的gms衔接子1在冰上解冻。设置下列反应试剂，通过涡旋进行混合：
[0157]
试剂体积(μl)/样品peg-4000(42％)20gms衔接子1(l0μm)1ts2126ssligase(100u/μl)2
[0158]
将23μl试剂混合物添加到17μl去磷酸化的dna中。通过短暂的涡旋和快速旋转混合。试管在具有预热盖(105℃)的热循环仪中孵育：58℃1小时。
[0159]
ssdna spri纯化：(spri 1)
[0160]
进行了以下程序：
[0161]
1.稀释的spri制剂：
[0162]
试剂体积(μl)/样品低edta te缓冲液11spri珠72
[0163]
2.将83μl稀释的spri珠添加到40μl连接的dna中。通过上下吹打混合。
[0164]
3.在室温下孵育20分钟。
[0165]
4.快速旋转后，将试管放在磁力架上5分钟。丢弃上清液而不接触珠。
[0166]
5.用200μl 80％新鲜制备的乙醇清洗2次。
[0167]
6.快速旋转后，使用20μl移液器去除残留乙醇。在磁力架上风干沉淀3分钟。
[0168]
7.从磁力架上取下试管。添加24μl rsb，混合，然后在室温下孵育2分钟。快速旋转后，将试管放在磁力架上5分钟。
[0169]
8.将24μl转移到“线性扩增”反应中。
[0170]
线性扩增
[0171]
如下设置和执行线性扩增反应：
[0172]
试剂体积(μl)/样品连接的dna24veraseq ultra readymix(2x)25circ_延伸(100μm)1
[0173]
在具有预热盖(105℃)的热循环仪中孵育试管：
[0174]
1个循环：98℃30秒
[0175]
20个循环：
[0176]
98℃10秒
[0177]
62℃30秒
[0178]
72℃30秒
[0179]
1个循环：72℃10分钟
[0180]
2 4℃保持。
[0181]
ssdna双spri纯化：(spri 2)
[0182]
遵循以下方案：
[0183]
1.为1x spri纯化制备spri peg混合物：
[0184]
试剂体积(μl)/样品peg(50％)27spri50
[0185]
2.添加77μl至50μl扩增的dna。通过上下吹打混合。在rt孵育20分钟。
[0186]
3.快速旋转后，将试管放在磁力架上5分钟。丢弃上清液。
[0187]
4.用200μl 80％乙醇洗涤2次。
[0188]
5.快速旋转后，使用20μl移液器去除残留乙醇。在磁力架上风干沉淀3分钟。
[0189]
6.从磁力架上取下试管。添加50μl rsb混合物。在rt孵育2分钟。
[0190]
7.快速旋转后，将试管放在磁力架上5分钟。
[0191]
8.将50μl转移到新试管中以进行0.9x spri纯化。
[0192]
9.为0.9x spri纯化制备spri peg混合物
[0193]
试剂体积(μl)/样品peg(50％)25spri45
[0194]
10.添加70μl至50μl扩增的dna。通过上下吹打混合。在rt孵育20分钟。
[0195]
11.快速旋转后，将试管放在磁力架上5分钟。丢弃上清液。
[0196]
12.用200μl 80％乙醇洗涤2次。
[0197]
13.快速旋转后，使用20μl移液器去除残留乙醇。在磁力架上风干沉淀3分钟。
[0198]
14.从磁力架上取下试管。添加26μl rsb混合物。在rt孵育2分钟。
[0199]
15.快速旋转后，将试管放在磁力架上5分钟。
[0200]
16.将25μl转移到“变性和环化”反应中。
[0201]
变性和环化
[0202]
遵循以下程序：
[0203]
1.在具有预热盖(105℃)的热循环仪中，在95℃下加热2分钟，使ssdna变性
[0204]
2.立即转移到冰水浴中并静置1分钟
[0205]
3.在冰上设置以下反应：
[0206][0207][0208]
4.轻轻混合，然后快速旋转。最终体积为31μl。
[0209]
5.在具有预热盖(105℃)的热循环仪中，按照以下条件孵育试管：
[0210]
60℃60分钟。
[0211]
80℃10分钟。
[0212]
4℃。
[0213]
文库扩增和索引
[0214]
遵循以下程序：在冰上设置以下反应：
[0215]
试剂体积(μl)/样品环化连接的dna31kapa hifi hotstart readymix(2x)40p7_g001i7_circpcr(50μm)5p5_g001i5_circpcr(50μm)5
[0216]
1.轻轻混合，然后快速旋转。最终体积为81μl。
[0217]
2.在具有预热盖(105℃)的热循环仪中，按照以下条件孵育：
[0218]
1个循环：98℃45秒。
[0219]
14个循环：
[0220]
98℃15秒。
[0221]
60℃30秒。
[0222]
72℃30秒。
[0223]
1个循环：72℃1分钟。
[0224]
4℃。
[0225]
扩增文库spri珠清理(spri 4)
[0226]
遵循以下程序：
[0227]
1.添加114μl spri珠。(1.4x)。通过上下吹打混合。
[0228]
2.在rt孵育10分钟。快速旋转后，将试管放在磁性支架上5分钟。取出并丢弃上清液。
[0229]
3.用200μl 80％乙醇洗涤2次。
[0230]
4.快速旋转后，使用20μl移液器去除残留乙醇。在磁力架上风干沉淀3分钟。
[0231]
5.在试管中添加23μl rsb。混合并在室温下孵育2分钟。快速旋转，将试管放在磁力架上5分钟，
[0232]
6.将20μl转移到新试管中。这是甲基化文库。
[0233]
文库qc
[0234]
遵循以下程序：
[0235]
1.准备1:100文库稀释，然后使用高灵敏度ngs试剂盒在片段分析仪上添加2μl的文库。
[0236]
2.选择175-5,000bp范围来定量文库的数量。
[0237]
结果
[0238]
图4是说明在上述扩增实验中使用circ延伸引物的结果的图。使用circ延伸引物代替在扩增方法中dna未被环化的传统延伸引物(称为“grailmethylseq”)。在第一次1x spri清理后，dna在高灵敏度ngs片段分析仪上运行，与使用grailmethylseq延伸引物制备的dna进行比较。
[0239]
图5是说明使用circ延伸引物通过本文所述的环化方法制备的甲基化文库dna的
图。文库dna按1:100稀释并在高灵敏度ngs片段分析仪上运行，结果如图5所示。

技术特征：
1.一种具有[t]-[ps1]-[l]-[ps2]结构的环化核酸模板，其中：(a)t是靶核酸序列；(b)ps1和ps2各自是核酸引物位点；(c)l是包含终止引物延伸反应的有机分子的接头；以及(d)所述结构通过将其5’端结合到其3’端而环化。2.一种具有[ps1]-[l]-[ps2]-[t’]结构的环化核酸模板，其中：(a)t’是靶核酸序列的互补序列；(b)ps1和ps2各自是核酸引物位点；(c)l是包含终止引物延伸反应的有机分子的接头；以及(d)所述结构通过将其5’端结合到其3’端而环化。3.一种扩增靶序列的方法，所述方法包括：(a)提供根据权利要求1或2中任一项所述的环化模板；(b)使与ps1互补的引物结合至ps1并且使与ps2互补的引物结合至ps2；以及(c)使用聚合酶通过引物延伸反应复制所述靶序列。4.一种制备环化模板的方法，所述方法包括：(a)提供单链靶核酸片段的样品；(b)将具有[ps]-[l]-[ps]结构的片段连接到或复制入所述靶核酸片段的每一个，其中ps是核酸引物位点，并且l是包含终止引物延伸反应的有机分子的接头；以及(c)环化。5.一种制备具有[t]-[ps1]-[l]-[ps2]结构的环化模板的方法，所述方法包括：(a)提供[ps1]-[l]-[ps2]链，其中ps1和ps2各自是核酸引物位点，并且l是包含终止引物延伸反应的有机分子的接头；(b)提供[t]核酸；(c)将[ps1]-[l]-[ps2]链连接到[t]链以产生[t]-[ps1]-[l]-[ps2]链；(d)环化[t]-[ps1]-[l]-[ps2]链以产生环化的[t]-[ps1]-[l]-[ps2]。6.一种制备具有[ps1]-[l]-[ps2]-[t’]结构的环化模板的方法，所述方法包括：(a)提供[t]链；(b)提供[ps1]-[l]-[ps2]链，其中ps1和ps2各自是核酸引物位点，并且l是包含终止引物延伸反应的有机分子的接头；(c)将与所述[ps1]-[l]-[ps2]链的[ps2]互补的引物位点[ps2’]链连接到所述[t]链的3’端；(d)将所述[ps1]-[l]-[ps2]链与连接的[t]-[ps2’]退火；(d)使用聚合酶通过引物延伸反应延伸所述[ps1]-[l]-[ps2]链以产生[ps1]-[l]-[ps2]-[t’]链，其中[t’]是所述[t]链的互补序列；以及(e)环化所述[ps1]-[l]-[ps2]-[t’]链以产生环化的[ps1]-[l]-[ps2]-[t’]。7.一种具有[ps1]-[l]-[ps2]结构的单链核酸，其中ps1和ps2各自是核酸引物位点，并且l是包含终止引物延伸反应的有机分子的接头。8.一种试剂盒，其包括：(a)具有封闭的3’端的5’磷酸化单链引物位点寡核苷酸；和(b)具有[ps1]-[l]-[ps2]结构的单链核酸，其中ps1和ps2各自是核酸引物位点，l是包含终止引物延伸反应的有机分子的接头，并且[ps2]与具有封闭的3’端的所述引物位点寡核苷酸互补。9.根据权利要求1-8中任一项所述的环化模板、方法、核酸或试剂盒，其中l包含聚亚烷基二醇。10.根据权利要求1-8中任一项所述的环化模板、方法、核酸或试剂盒，其中l包含聚乙二醇。11.根据权利要求1-8中任一项所述的环化模板、方法、核酸或试剂盒，其中l包含以磷酸基团封端的聚亚烷基二醇。12.根据权利要求1-8中任一项所述的环化模板、方法、核酸或试剂盒，其中l包含以磷酸基团封端的聚乙二醇。
13.根据权利要求1-8中任一项所述的环化模板、方法、核酸或试剂盒，其中l包含以下的一个或多个插入：聚亚烷基二醇、以磷酸基团封端的聚亚烷基二醇、聚乙二醇、以磷酸基团封端的聚乙二醇、亚膦酰胺、乙二醇、1’,2
’‑
双脱氧核糖、或以磷酸基团封端的三甘醇或其任何组合。14.根据权利要求13所述的环化模板、方法、核酸或试剂盒，其中所述多个插入通过一个或多个间插寡核苷酸连接。15.根据权利要求14所述的环化模板、方法、核酸或试剂盒，其中所述一个或多个间插寡核苷酸的长度范围从2个核苷酸到100个核苷酸。16.根据权利要求14所述的环化模板、方法、核酸或试剂盒，其中l包含通过所述间插寡核苷酸连接的以磷酸基团封端的聚乙二醇的两个插入。17.根据权利要求16所述的环化模板、方法、核酸或试剂盒，其中所述间插寡核苷酸的长度是六个或更多个核苷酸。18.根据权利要求1-6和9-17中任一项所述的环化模板或方法，其中所述靶标包含其中胞嘧啶已被修饰或转换的单链dna分子。19.根据权利要求18所述的环化模板或方法，其中所述胞嘧啶已转换为尿嘧啶。20.根据权利要求3所述的方法，其中与ps1互补的引物包含5’至3’的[adapt]-[ind]-[seq-primer]-[targ-primer]结构，其中[adapt]是衔接子，[ind]是独特的样品标识符序列，[seq-primer]是测序引物，[targ-primer]是与环化的[t]-[ps]-[l]-[ps]或[ps]-[l]-[ps]-[t’]模板中的靶核酸序列互补的靶引物；并且其中与ps2互补的引物包含5’至3’的[adapt]-[ind]-[seq-primer]-[targ-primer]结构，其中[adapt]是衔接子，[ind]是独特的样品标识符序列，[seq-primer]是测序引物，并且[targ-primer]是与环化的[t]-[ps]-[l]-[ps]或[ps]-[l]-[ps]-[t’]模板中的靶序列互补的靶引物。21.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述靶标包含片段化的dna。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述片段化的dna是无细胞核酸(cfna)。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述cfna是无细胞dna(cfdna)。24.根据权利要求22所述的方法，其中所述cfna获取自体液或其他身体物质。25.根据权利要求22所述的方法，其中所述cfna源自健康细胞。26.根据权利要求22所述的方法，其中所述cfna源自病变细胞。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述病变细胞是癌细胞。28.根据权利要求21所述的方法，其中所述片段化的dna代表基因组的一个或多个子集、整个基因组、多个基因组、或多个基因组的一个或多个子集。29.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述靶核酸或所述靶链的来源是来自生物有机体的样品或环境样品。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述样品包括从多个来源、多个受试者、或多个来源和多个受试者汇集的多个样品。31.根据权利要求29所述的方法，其中所述生物有机体是人或其他动物。32.根据权利要求31所述的方法，其中来自所述生物有机体的所述样品是组织、细胞、体液或细胞外身体物质。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述体液或细胞外身体物质包括全血、血液部
分、血清、血浆或其任何组合。34.根据权利要求32所述的方法，其中所述体液或细胞外身体物质包括房水、腹水、胆汁、脑脊髓液、乳糜、胃液、肠液、淋巴液、胰液、心包液、腹膜液、胸腔积液、唾液、脊髓液、痰、粪便或其他肠道废物液、汗液、泪液、尿液、或其任何组合。35.根据权利要求31所述的方法，其中所述生物有机体是已知患有或疑似患有疾病的受试者。36.根据权利要求35所述的方法，其中所述疾病是癌症。37.根据权利要求31所述的方法，其中所述生物有机体是未知患有或疑似患有疾病的受试者。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述疾病是癌症。39.根据权利要求29所述的方法，其中来自所述生物有机体的所述样品来自肿瘤或疑似肿瘤。40.根据权利要求29所述的方法，其中来自所述生物有机体的所述样品是组织样品，所述组织样品是癌组织或疑似是癌组织。41.根据权利要求40所述的方法，其中所述组织样品是i、ii、iii或iv期癌症。

技术总结
提供了用于扩增核酸，包括无细胞核酸片段，以准备进行测序的组合物和方法。提供了制备具有[T]-[PS1]-[L]-[PS2]或[PS1]-[L]-[PS2]-[T’]结构的环化核酸模板的方法，其中(a)T是靶核酸并且T’是靶核酸的互补序列；(b)PS1和PS2各自是核酸引物位点；(c)L是具有终止引物延伸反应的有机分子的接头；以及所述结构通过将其5’端结合到其3’端而环化。所述环化模板中的靶序列通过使与PS1互补的引物结合至PS1并且使与PS2互补的引物结合至PS2以及通过引物延伸反应复制所述靶序列来进行扩增。优势包括连接步骤的减少，这可以导致更少的清理步骤和提高的文库转换效率。骤和提高的文库转换效率。骤和提高的文库转换效率。


技术研发人员：M
受保护的技术使用者：格瑞尔有限责任公司
技术研发日：2021.12.18
技术公布日：2023/9/23