鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物的制作方法

1.本发明涉及一种鞘氨醇单胞菌(sphingomonas)属细菌的提取物和包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌的组合物，其用于预防和/或治疗由过敏反应引起的皮肤反应和用于调节免疫应答及可选地用于增强皮肤的屏障功能。


背景技术：

2.过敏是一种复杂的现象，其中生物体暴露于过敏原后发生过度的炎症反应。具体地，过敏依赖于两种效价：生物体和外部介质之间屏障的孔隙率和免疫系统的调节。
3.因此，过敏依赖于皮肤的渗透性，皮肤的渗透性是抵抗外部，特别是颗粒、化学品或化学侵蚀的屏障，但也是为了限制水和其他间质化合物的渗漏。皮肤的这种性质被称为屏障功能。具体地，屏障功能由紧密连接和相关蛋白来保证。通过刺激这些蛋白的表达和紧密连接的形成，toll 2(tlr2)型受体的激活允许增强屏障功能。
4.过敏还依赖于免疫系统的调节，具体是通过e型抗体(ige)、前列腺素e2(pge2)和各种白介素(il)。
5.ige参与可引起荨麻疹或血管性水肿的速发型过敏反应。
6.pge2和il-6/il-8也在嗜中性粒细胞的吸引中起作用。它们具有互补的作用模式，一方面，通过因pge2的血管渗透性的增加，另一方面，通过因il-6或il-8的趋化因子吸引嗜中性粒细胞的梯度。因此，这两种不同和组合的作用模式改善了免疫应答。


技术实现要素：

7.发明人已经发现鞘氨醇单胞菌的提取物允许在体外激活htlr2受体，和促进与增强皮肤的屏障功能相关的基因的表达。他们还证实了，这种提取物允许抑制促炎介质pge2的分泌和调节促进白介素il-10(抗炎细胞因子)的表达，而不显著影响其他促炎白介素如il-12、il-6和il-8。最后，发明人已经证实该提取物允许限制人b淋巴细胞的ige生产。
8.因此，鞘氨醇单胞菌属细菌及其提取物具有与增强皮肤的屏障功能相结合的多种抗炎活性，从而能够预防和/或治疗由过敏反应引起的皮肤反应(cutaneous reaction)。
9.因此，本发明涉及一种用于预防和/或治疗由过敏反应引起的皮肤反应的鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物。
10.本发明还涉及一种用于预防和/或治疗由过敏反应引起的皮肤反应的组合物，该组合物包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌。
11.本发明还涉及一种用于调节免疫应答和可选地用于增强皮肤的屏障功能的鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物。
12.此外，本发明涉及一种用于调节免疫应答和可选地用于增强皮肤的屏障功能的组合物，该组合物包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌。
13.一般定义
14.术语“细菌”是指活的、半活性的、灭活的或死亡的形式的原核微生物，优选变形菌
门的(proteobacterium)。
15.根据本发明使用的细菌或根据本发明使用的提取物的细菌属于鞘氨醇单胞菌属。在一种实施方式中，所述细菌是选自sphingomonas abaci、sphingomonas adhaesiva、sphingomonas aerolata、sphingomonas aquatilis、sphingomonas asaccharolytica、sphingomonas aurantiaca、sphingomonas azotifigens、sphingomonas dokdonensis、sphingomonas echinoides、sphingomonas faeni、sphingomonas fennica、sphingomonas haloaromaticamans、sphingomonas jaspsi、sphingomonas koreensis、sphingomonas mali、sphingomonas melonis、sphingomonas natatoria、sphingomonas oligophenolica、sphingomonas panni、sphingomonas parapaucimobilis、sphingomonas paucimobilis、sphingomonas phyllosphaerae、sphingomonas pituitosa、sphingomonas pruni、sphingomonas roseiflava、sphingomonas sanguinis、sphingomonas soli、鞘氨醇单胞菌sp(sphingomonas sp)、sphingomonas suberifaciens、sphingomonas trueperi、sphingomonas wittichii、sphingomonas xenophaga、sphingomonas yabuuchiae sphingomonas yunnanensis和sphingomonas yanoikuyae的种。在本发明的一种实施方式中，细菌是sphingomonas xenophaga。在优选实施方式中，该细菌是由l’or
é
al,101avenue gustave eiffel,37390notre dame d’o
é
根据布达佩斯条约于2019年11月21日在国家微生物保藏中心((cncm)，巴黎，法国)以cncm i-5455号提交的sphingomonas xenophaga。
16.如本文所用，术语“预防”(“prevent”或“prevention”)是指旨在防止病症发生或与该病症相关的一种或多种症状的任何作用。因此，这个术语也涉及症状的减缓、停止或限制。
17.如本文所用，术语“治疗”(“treat”或“treatment”)是指旨在抑制、减轻或防止病症(该病症相关的一种或多种症状)进展任何行为。因此，这个术语覆盖了症状的减轻、缓解或抑制。
[0018]“预防和/或治疗由过敏反应引起的皮肤反应”应该理解为由过敏反应引起的受试者的皮肤症状的减缓、停止、限制、减轻、缓解或抑制。一般来说，这些症状包括荨麻疹、皮疹和/或出现发红。
[0019]“受试者”，这里应该理解为人，优选患有过敏症的人。在本发明的实施方式中，受试者已经有已引起皮肤反应的过敏反应。
[0020]“皮肤(cutaneous)”应该在皮肤(skin)的水平下，且更具体在暴露于或有可能暴露于过敏原的皮肤(skin)区域的水平下进行理解。根据本发明的实施方式，由过敏反应引起的皮肤反应包括荨麻疹、皮疹和/或出现发红。
[0021]
在优选的实施方式中，本发明上下文中使用的提取物和组合物被局部地使用。在优选的实施方式中，本发明上下文中使用的提取物和组合物旨在应用于皮肤上。
[0022]
在本发明的上下文中，术语“皮肤(skin)”是指身体的任何皮肤表面，优选面部的皮肤、颈部的皮肤、乳沟的皮肤，更特别地是面部的皮肤。
[0023]“过敏反应”应该理解为本领域技术人员通常使用的含义，即在生物体暴露于过敏原后发生的过度的炎症反应。这种反应是生物体对环境中通常无害且存在的物质(过敏原)过敏的迹象。这些物质可能存在于空气、化妆品等中。
[0024]
所谓的速发过敏反应的特征是最常在接触过敏原后几分钟(不到两小时)出现症
状。在这种情况下，这有可以扩散和涉及ige的荨麻疹组成。所谓的迟发性过敏反应的特征是通常在接触过敏原48小时后出现症状。在这种情况下，它由接触部位的涉及化学分子的局部湿疹组成。
[0025]
在优选的实施方式中，在本发明的上下文中应用的提取物和组合物用于预防和/或治疗由速发型过敏反应引起的皮肤反应。
[0026]“调节免疫应答”，本文中应该理解为减缓、停止或减轻免疫应答。具体地，根据本发明调节免疫应答是降低促炎细胞因子的活性和/或提高抗炎细胞因子的活性。
[0027]
在本发明的优选实施方式中，通过提高il-10的活性，而不显著影响促炎性白介素il-12、il-6和/或il-8来实现调节免疫应答。
[0028]“增强皮肤的屏障功能”，本文中应理解为改善皮肤的屏障功能，具体是在皮肤水平上通过增加紧密连接的数量和/或通过增加相关蛋白诸如紧密连接蛋白-1(claudin-1)、角化蛋白和/或闭塞小带1(zonula occludens 1)。
[0029]
鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物
[0030]
本发明涉及一种用于预防和/或治疗由过敏反应引起的皮肤反应的鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物。
[0031]
在本发明的上下文中，术语“细菌(的)提取物”是指：由细菌生产和/或分泌并因此存在于细菌培养物的培养基(也称为细胞外培养基)中的一系列化合物；和/或包含在细菌中并因此存在于离心后的细菌培养物的细菌沉淀物的一系列化合物，如细胞内基质和/或细胞壁和/或膜的成分。
[0032]
本发明的提取物可以通过本领域技术人员公知的任何常规方法制备。通常，这些方法包括发酵、分离和纯化步骤。
[0033]
通常，鞘氨醇单胞菌属的细菌在合适的培养基中培养并以期望的密度培养。优选地，细菌本身被通过任何已知的方法(诸如离心)浓缩。之后，浓缩的细菌可以直接用作原始制剂，或者可以进行本领域技术人员公知的其它处理步骤诸如冻干、脱水、过滤、纯化、冷冻(可能随后解冻)、灭菌、柱层析、压碎、裂解等。
[0034]
优选地，细菌提取物是细菌裂解物。这样的裂解物具体包括包含在细菌中并因此存在于离心后的细菌培养物的细菌沉淀物的化合物。优选地，细菌提取物是包括细胞内基质和/或细胞壁和/或膜的成分的细菌裂解物。
[0035]
裂解物通常表示通过称为细胞裂解的现象来完成生物细胞的破坏或分解后获得的物质，从而导致天然包含在所考虑的微生物的细胞中的细胞内生物成分的释放。
[0036]
在本发明的上下文中，术语“裂解物”不加区别地用于指通过裂解所考虑的微生物获得的全部裂解物或仅其一部分。
[0037]
因此，所实施的裂解物全部地或部分地由细胞内生物成分以及由细胞壁和膜的成分形成。
[0038]
因此，优选地，所实施的裂解物基本上全部地或部分地由细胞内生物成分和由细胞壁和膜的成分形成。
[0039]
在优选的实施方式中，裂解物包括小于1％干重的细胞外培养基，更好的是裂解物包括0.5％至1％干重的细胞外培养基，更优选的是裂解物包括0.7％至0.8％干重的细胞外培养基。
至10
15
ufc/g，特别是从105至10
15
ufc/g，更特别是从107至10
12
ufc/g变化。
[0063]
优选地，根据本发明的组合物包括水相。
[0064]
优选地，根据本发明的组合物具有相对于组合物总重量按重量计20％至95％，优选按重量计30％至70％的范围内的水含量。
[0065]
根据本发明的组合物可以进一步以以下浓度包括一种或几种水混溶性有机溶剂：相对于组合物的总重量，按重量计在0.5％至25％，优选按重量计5％至20％，更优地按重量计10％至15％的范围内的浓度。
[0066]
如前所述，在本发明上下文中使用的组合物优选被局部地应用。
[0067]
如本领域技术人员所公知的，用于局部应用的组合物还可以含有常见的添加剂，诸如亲水性或亲脂性胶凝剂、不同于根据本发明的提取物的亲水性或亲脂性活性物质、防腐剂、抗氧化剂、不混溶于水的溶剂、香味剂、气味吸收剂、着色剂。这些不同添加剂的量是在所考虑的领域中通常使用的量，例如为组合物总重量的0.01至20％。
[0068]
当然，本领域技术人员会选择这些可选的附加成分和/或活性物质，和/或它们的量，例如根据本发明的提取物的有利性质没有或基本上没有被考虑的添加物所改变。
[0069]
在一种实施方式中，鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或鞘氨醇单胞菌属细菌是组合物的唯一活性物质。
[0070]
在另一种实施方式中，本发明的组合物可以进一步含有不同于本发明的细菌或提取物的其他活性物质。这些活性物质可能对皮肤有作用，特别是舒缓作用。
[0071]
在本发明的一种具体实施方式中，根据本发明的组合物进一步包括选自以下项的至少一种活性物质：乙酰基二肽-1鲸蜡酯；丹参根提取物；活泉水(thermal water)，诸如理肤泉水(la roche posay water)；及它们的混合物。
[0072]
根据本发明的组合物可以是通常用于局部应用的任何盖伦制剂，特别是以水状物、水-醇溶液、水包油(o/w)或油包水(w/o)或多重(三重：w/o/w或o/w/o)乳液、水凝胶或使用小球的脂肪相在水相中的分散体的形式，这些小球可以由离子型和/或非离子型脂质囊泡(脂质体、囊泡、油质体)组成。这些组合物是用常规方法制备的。
[0073]
有利地，根据本发明的组合物是凝胶、乳液(emulsion)或糊剂的形式。此外，根据本发明的组合物可以或多或少是流体，并具有白色或有色霜剂、软膏、乳剂(milk)、洗液、精华液、糊剂、发泡或不发泡凝胶、去角质剂、面膜、护理剂、爽肤水(tonic)或泡沫的外观。它可能以喷雾的形式应用皮肤上。它也可以是固体形式，例如是棒或皂的形式。
[0074]
根据本发明的组合物可以包括脂肪相，特别是油相。
[0075]
作为适用于根据本发明的组合物的油，可以提及例如：
[0076]-烃油，
[0077]-合成的酯和醚，特别是脂肪酸的酯和醚，如式r’coor2和r’cor2的油，其中r’表示包括8至29个碳原子的脂肪酸残基，r2表示含有3至30个碳原子的支链或非支链的烃链；
[0078]-矿物或合成来源的直链或支链碳氢化合物；
[0079]-具有8至26个碳原子的脂肪醇；
[0080]-部分烃化和/或硅化氟化油；
[0081]-硅油；
[0082]-它们的混合物。
[0083]
上面引用的油列表中的烃油，应该理解为主要包括碳原子和氢原子的任何油。
[0084]
油相可以包括：可存在于该油相中的其它脂肪体，例如包括8至30个碳原子的脂肪酸；蜡、硅树脂；和硅弹性体。这些脂肪可由本领域技术人员以各种方式选择，以制备具有所寻求的性质(例如，黏稠度性质或质地性质)的组合物。
[0085]
根据本发明的具体实施方式，根据本发明的组合物是油包水(w/o)或水包油(o/w)乳液。相对于组合物的总重量，乳液中油相的比例可以按重量计在5至80％，优选30至70％的范围内。乳液通常含有：至少一种乳化剂，该乳化剂选自单独使用或混合使用的两性型、阴离子型、阳离子型或非离子型乳化剂；以及可选的助乳化剂。乳化剂根据要获得的乳液(w/o或o/w)来适当选择。一般而言，相对于组合物的总重量，乳化剂和助乳化剂在组合物中以按重量计0.3％至30％，优选按重量计0.5％至20％的范围内的比例存在。
[0086]
对于w/o乳液，作为乳化剂，可以提及例如二甲硅烷共聚多元醇(dimethicone copolyols)和烷基二甲硅烷共聚多元醇(alkyl-dimethicone copolyols)。作为w/o乳液的表面活性剂，也可以使用包括至少一个氧化烯基团的交联弹性固体有机聚硅氧烷。
[0087]
对于o/w乳液，作为乳化剂，可以提及例如非离子型乳化剂。
[0088]
组合物在已经施用到皮肤上之后，可以冲洗或不冲洗。
[0089]
方法
[0090]
本发明还涉及一种用于预防或治疗由过敏反应引起的皮肤反应的方法，该方法包括施用，优选在皮肤的表面局部地施用：鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物；或组合物，该组合物包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌。
[0091]
还提出了以下提取物或组合物在生产用于预防或治疗由过敏反应引起的皮肤反应的药物中的用途：鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物，该组合物包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌。
[0092]
本发明还涉及一种调节免疫应答和可选地增强皮肤屏障功能的方法，该方法包括施用，优选在皮肤的表面局部地施用：鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物；或组合物，该组合物包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌。
[0093]
还提出了以下提取物或组合物在生产用于调节免疫应答和可选地增强皮肤屏障功能的药物中的用途：鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物，该组合物包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌。
[0094]
在具体实施方式中，包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌的组合物如上文组合物部分所描述。
[0095]
在具体实施方式中，鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物如下文鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物部分所描述。
[0096]
优选地，在有需要的受试者上以有效量应用至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种组合物，该组合包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌。
[0097]
如本文所用，术语“有效量”是指这样的鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物的量：其作为整体允许预防和/或减少由过敏反应引起的皮肤反应；或指鞘氨醇单胞菌属细菌的量，其作为整体允许预防和/或减少由过敏反应引起的皮肤反应。
[0098]
有效量自然取决于所考虑的活性物质、施用方式、治疗适应症、患者年龄和他/她
的状况。
[0099]
有利地，该组合物或该提取物具体以皮肤病学组合物的形式使用，可能进一步包括生理上可接受的赋形剂。
[0100]“生理上可接受的”，在本文中应理解为当施用于受试者时不产生不希望的继发反应、过敏反应或其他反应的组合物和分子实体。因此，生理上可接受的赋形剂或载体是封装材料、稀释剂、支持物或任何其它液体、半固体或固体的无毒制剂助剂。
[0101]
通常制备本发明上下文中使用的皮肤病学组合物以适合施用方式。生理上可接受的赋形剂通常部分地由施用的组合物以及用于施用组合物的具体技术决定。
[0102]
要施用的化合物的剂量(dosage)取决于个体情况，并且如本领域技术人员所熟知的，应该适合于个体情况，以便获得有效量和最佳效果。有效剂量水平对每个受试者都是特定的，并且具体取决于各种因素，这些因素包括所治疗的疾病和疾病的严重性、所用具体化合物的活性；所用的具体组合。例如，本领域技术人员公知的是，从低于达到所需效果所需水平的化合物的剂量(dose)开始，并逐渐增加剂量，直到获得所需效果。
[0103]
优选地，根据本发明的方法包括局部应用至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌或至少一种鞘氨醇单胞菌属的提取物，或包括其的组合物。
[0104]
在优选实施方式中，本发明上下文中的局部应用是皮肤上的应用。
[0105]
本发明的方法可以包括一次施用。在另一种实施方式中，施用每天重复例如2至3次，持续一天或更长时间，或者连续几天的或不连续的几天的每天应用，并且通常持续至少4周或4至15周的延长的持续时间，或者根据需要尽可能长时间，其中在需要时可能中断。
[0106]
在另一种实施方式中，本发明的方法可以包括在皮肤区域暴露于过敏原之前和/或之后在该区域上施用。
[0107]
在说明书和以下实施例中，除非另有说明，百分比是按重量计算的百分比，值范围表述为“在
……
和
……
之间”包括指定的上限和下限。在包装之前，在本领域技术人员容易确定的条件下，按顺序混合这些成分。
[0108]
下面将通过实施例进一步说明本发明。
附图说明
[0109]
图1示出了鞘氨醇单胞菌提取物对单核细胞分泌细胞因子的作用。
具体实施方式
[0110]
实施例：
[0111]
实施例1：根据本发明的提取物的制备
[0112]
在3000有效升的生物反应器中以分批方式在完全培养基中制备sphingomonas xenophaga菌株cncm-i 5455的培养物。在此步骤中，不调节ph，温度保持在26℃，氧气溶解度为30％。
[0113]
初始培养基的组成在下面的表1中描述。
[0114]
[表1]
[0115][0116]
一旦达到平台水平，通过离心(10000g，连续地)进行细胞的提取和分离。然后，回收含有细胞的沉淀物(也称为生物质)，以便随后在-20℃下冷冻，然后解冻，从而能够使细胞爆裂，进而获得裂解物。然后，将裂解物包装在小袋中，最后通过在121℃下灭菌30分钟来稳定。
[0117]
相对于裂解物的总重量，完成根据实施例1所述的方法后获得的裂解物按重量计含有4.5％的干物质。
[0118]
实施例2：体外测试-tlr(invivogen公司)的剂量反应分析。
[0119]
hek293-tlr细胞系：
[0120]
针对重组hek-293细胞系一式两份地测试提取物和对照。这些细胞系在功能上过表达人tlr蛋白以及为分泌型碱性磷酸酶(seap)的报告基因。这种报告基因的生产由nfkb可诱导型启动子控制。tlr报告子的激活结果以光密度(od)值的形式给出。
[0121]
阳性对照：
[0122]
在表达htlr2的细胞上使用cu-t12-9和fsl-1分别评价tlr1/tlr2和tlr2/tlr6的活性。
[0123]
fsl-1以10pg/ml和30pg/ml进行测试。cu-t12-9以200nm和300nm进行测试。
[0124]
阴性对照：
[0125]
仅针对该报告基因的hek-293细胞系重组体用作表达htlr的细胞系的阴性对照。为了证实可诱导型报告基因nfkb(seap)的有效性，用以下浓度的tnfα刺激这种hek-293tlr细胞系：100ng/ml、30ng/ml、10ng/ml、3ng/ml、1ng/ml、0.3ng/ml和0.1ng/ml等。
[0126]
该阴性对照细胞系也用不同浓度的测试提取物刺激。
[0127]
提取物的测试：
[0128]
用20μl的提取物在200μl反应体积下刺激该报告子htlr细胞系。对于hek-blue-htlr5细胞系的剂量反应，在以下浓度下一式两份地测试根据实施例1获得的液体提取物：1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.5μg/ml。
[0129]
对于tlr1/2和/或tlr2/6特异性，根据实施例1获得的液体提取物在以下浓度下进行一式两份地测试：100μg/ml、30μg/ml和10μg/ml。
[0130]
结果：
[0131]
[表2]具有htlr2的细胞系的结果
[0132][0133]
[表3]具有htlr2-1的细胞系的结果
[0134][0135]
[表4]具有htlr2-6的细胞系的结果
[0136][0137][0138]
结论：
[0139]
该提取物不激活阴性对照细胞系，但强烈激活报告子细胞系htlr2(1/6)，即使在10μg/ml时也是如此。它以非特异性方式激活htlr1/2和htlr2/6。
[0140]
实施例3：体外测试-正常人角质细胞中基因表达的调节
[0141]
材料和方法
[0142]
细胞毒性：
[0143]
将正常人表皮角质细胞接种在96孔培养板中，然后在培养基中于37℃和5％的co2下培养24小时。之后，用含有或不含(对照)待测试化合物(8个测试浓度)的培养基替换介质，之后将细胞孵育24小时。所有条件以一式两份地进行。在孵育结束时，通过线粒体活性测量的标准测试来测量细胞活力。
[0144]
通过rt-qpct分析与屏障功能/水合作用相关的基因的表达：
[0145]
将正常人表皮角质细胞(nhek)接种在48孔培养板中，然后在培养基中于37℃和5％co2下培养3天，其中，培养第一个24小时后更新培养基。在孵育结束时，用不含(对照)或含有待测试化合物的测试培养基(补充有1.5mm的cacl2)替换培养基，然后将细胞孵育24小时。所有条件以一式两份地进行。
[0146]
在处理结束时，除去培养基，并用pbs(不含cacl2，不含mgcl2)冲洗细胞两次。然后，使用提取试剂盒分离总rna。通过labchip gx(perkin elmer)的方式分析rna的定量及其质量控制。
[0147]
通过定量pcr分两步分析了所选转录物的表达。首先，以与rna相反的方向转录cdna。然后，使用实时pcr系统进行定量pcr实验。
[0148]
实验方案
[0149]
培养和扩增正常人表皮角质细胞，以生产足够的细胞来评价每次活动中多达72个的样品。在48孔微孔板中接种细胞(每孔50000个细胞)，并在受控的温度、湿度和co2的环境中孵育48小时。在更新培养基时将待测试的样品添加到细胞上，然后将细胞孵育24小时。
[0150]
洗涤细胞并在-80℃干燥冷冻以保存rna。在rna逆转录成cdna之前，将rna提取、定量并检查质量。最后，对每个实验条件进行rt-qpcr，以定量所选该系列基因的表达。
[0151]
[表5]结果
[0152][0153]
在这个实施例中，测试的鞘氨醇单胞菌批次物对应于根据实施例1获得的液体提取物(4.5％ms)的冻干物(100％ms)。
[0154]
总之，考虑到1g/l对应于0.1％的浓度这一事实，根据实施例1获得的液体提取物允许以0.0009(计算：0.2
×
0.1
×
0.045)和以0.0045％(计算：1
×
0.1
×
0.045)的浓度对nhek中紧密连接蛋白-1、角化蛋白和闭锁小带1的基因的表达进行显著调节。
[0155]
实施例4：体外测试“人骨髓细胞释放的pge2的调节的评价”[0156]
u937人骨髓细胞系(来源于瑞典乌普萨拉大学免疫学、遗传学和病理学系的细胞病理学教授肯尼思
·
纳尔逊博士，瑞典，乌普萨拉75653，拉普丰斯韦根11)的抗炎有效性测试。
[0157]
测试的原理
[0158]
该方案中使用细胞系来模拟体外单核细胞/巨噬细胞的免疫应答。使用pma和lps的处理诱导促炎介质和细胞因子的分泌。与抗炎剂的联合处理能够在体外鉴定促炎反应的内在调节活性。
[0159]
细胞处理
[0160]
在补充有l-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、10％热处理的胎牛血清、10μg/ml佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(pma)和60μg/ml大肠杆菌脂多糖(lps)的rpmi 1640培养基中，用sphingomonas xenophaga提取物处理人骨髓细胞系。测试七种浓度的sphingomonas xenophaga的提取物：1、3、10、30、100、300和1000μg/ml。
[0161]
在37℃和5％的co2的潮湿气氛中处理24小时后，测量每种条件下的细胞活力。
[0162]
之后，收集上清液用于pge2分析。
[0163]
细胞因子试验
[0164]
通过elisa测试确定pge2水平。
[0165]
活力计算-cv75
[0166]
cv75＝c1+((v1-75)/(v1-v2))
×
(c2-c1)
[0167]
其中
[0168]
c1＝活力》75％的最低浓度
[0169]
c2＝活力《75％的最高浓度
[0170]
v1＝最低活力百分比》75％
[0171]
v2＝最高活力百分比《75％
[0172]
反应活性指数-ri的计算
[0173]
ri＝经处理的上清液的标记物量(pg/ml)
×
100/未经处理的上清液中的分析物量(pg/ml)。
[0174]
50％抑制浓度-ic50的计算
[0175]
ic
50
＝c1+((50-ri1)/(ri2-ri1))
×
(c2-c1)
[0176]
其中
[0177]
c1＝ri《50的最高浓度
[0178]
c2＝ri》50时的最低浓度
[0179]
ri1＝最高ri《50
[0180]
ri2＝最低ri》50
[0181]
[表6]结果
[0182][0183]
鞘氨醇单胞菌提取物抑制促炎介质部分，其中ic50等于199μg/ml。
[0184]
实施例5：提取物对单核细胞分泌细胞因子(il-6、il-8、il-10和il-12p40)的作用的体外测试。
[0185]
本实验的目的是研究36h后提取物对单核细胞分泌细胞因子的作用。
[0186]
材料和方法：
[0187]
细胞分离和培养：
[0188]
通过标准的ficoll-hypaque梯度法从健康献血者的白细胞层中获得单核细胞。在37℃下于含5％的co2的潮湿气氛中，通过在针对巨噬细胞培养优化的无血清培养基(m-sfm)中粘附于塑料2小时，单核细胞被从单核细胞中分离出来。高度富集单核细胞的贴壁细胞，与测试的化合物一起孵育36小时。
[0189]
细胞毒性测试：
[0190]
在最后6小时内，阿尔玛蓝(alamar blue)被引入细胞培养物中。试卤灵(一种通过转化阿尔玛蓝的成分获得的荧光分子)被作为细胞死亡的指标来测量。借助tecan infinite f500荧光分光光度计进行测量。
[0191]
细胞因子的分析：
[0192]
36小时后，收集上清液并在-80℃下冷冻，直至试验。在luminex lx100仪器上借助多因子(il-6；il-8；il-10和il-12p40)检测试剂盒进行测量。
[0193]
用于评价结果的计算方法：
[0194]
由于不同细胞因子的值范围不同，并且为了获得易于在化合物之间比较的值，与il-10相比，倍增因数因细胞因子而异。
[0195]
il-10与il-6的比较：比值是il-10
×
100/il-6
[0196]
il-10与il-12p40的比较：比值是il-10/il-12p40
[0197]
il-10与il-8的比较：比值是il-10
×
100 000/il-8
[0198]
结果如图1所示。产物2对应于根据实施例1获得的液体提取物。
[0199]
提取物对单核细胞具有免疫调节作用：il10》il-6/il-8/il-12(p40)。
[0200]
与il-6和il-8(促炎细胞因子)相比，该提取物在剂量反应方面诱导高产量的il-10(抗炎细胞因子)。
[0201]
实施例6：提取物对由抗cd40和il-4的组合刺激的人b淋巴细胞生产ige的作用的体外测试
[0202]
在该研究中，评估了提取物对纯化的人b淋巴细胞(从外周血单核细胞中分离cd19
+
淋巴细胞)ige生产的作用。更具体地，ige生产是通过用抗cd40抗体和il-4的组合刺激b淋巴细胞来诱导的。孵育14天后，使用特异性elisa试剂盒定量释放在培养上清液中的ige的量。在测试提取物的同时，在该试验中还评价了3种其他分子。参考标准物cpg-odn 2006(一种tlr9配体)以及ifn-γ和pge2作为参考化合物进行了测试。
[0203]
[表7]所研究的化合物
[0204]
[0205][0206]
培养和处理
[0207]
分离b淋巴细胞cd19
+
，接种在24孔板中，并在培养基中孵育一夜。之后，加入待测化合物(单独测试或组合测试的)和参考化合物，或不加入化合物(对照)，并将细胞预孵育2小时。之后，加入诱导物(cd40+il-4的组合)，或不加入(未刺激的对照)，并重复测试化合物或参考化合物的处理。之后，细胞以1.7
×
106细胞/ml的终密度孵育14天)。
[0208]
所有实验条件都是在n＝3的情况下进行的。
[0209]
酶联免疫吸附试验(elisa)
[0210]
根据供应商的说明，使用特定的elisa试剂盒测量释放在培养上清液中的ige的量。
[0211]
统计
[0212]
通过非配对学生的t检验进行组间比较。如果n≥5，可以解释统计分析，但是对于n《5，给出统计值以供参考。
[0213]
本报告中使用的公式：
[0214]
平均标准误差：
[0215]
mse＝sd/√n
[0216]
平均标准误差(mse)是样本平均值和总体实际平均值之间偏差的度量。mse的计算方法是样品的标准偏差(sd)除以样品大小(n)的平方根。
[0217]
结果和结论
[0218]
在未刺激条件下，b淋巴细胞释放ige的基线非常低(《199pg/ml，接近检测限)。通过抗d40+il-4的组合刺激14天，导致高水平(3657pg/ml)的ige生产。tlr9 cpg-odn2006激动剂作为参考化合物以3μm的浓度进行测试，完全抑制了由抗cd40+il-4联合体诱导的ige生产(《受刺激对照的3％)。这些结果是预期的，并验证了测试。
[0219]
其他两种潜在的参考化合物也显示出对ige生产的抑制作用，但与cpg-odn2006相比程度较低。以10ng/ml测试的ifn-γ也显示出相当强且显著的抑制作用(受刺激对照的20％)。然而，以1μm测试的pge2的作用要有限得多，且无统计学意义(受刺激对照的58％)。
[0220]
以0.2％和0.4％测试的实施例1的提取物显示出对由抗cd40+il-4的组合刺激的b淋巴细胞生产ige的几乎完全的抑制作用(分别为受刺激对照的《3％和《11％)。
[0221]
在本研究的实验条件下，不同浓度的实施例1的提取物对由抗cd40+il-4组合刺激的细胞b的ige生产显示出非常强的抑制作用。
[0222]
[表8]结果概要
[0223][0224][0225]
ns：》0.05不显著
[0226]
*：0.01至0.05显著
[0227]
**：0.001至0.01非常显著
[0228]
《或》：低于或高于检测限
[0229]
未稀释样品《123.457或》90000 pg/ml
[0230]
在值低于或高于检测限的情况下，外推进行以下计算。
[0231]
实施例7
[0232]
制备具有以下组成的凝胶：
[0233]
[表9]凝胶的组成
[0234][0235]
将所获得的组合物应用在具有易过敏皮肤的面部。
[0236]
pct
[0237][0238]
仅用于接收局
[0239][0240]
仅用于国际局
[0241]

技术特征：
1.一种用于预防和/或治疗由过敏反应引起的皮肤反应的用途的鞘氨醇单胞菌(sphingomonas)属细菌的提取物。2.一种用于预防和/或治疗由过敏反应引起的皮肤反应的用途的组合物，所述组合物包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌。3.根据权利要求1所述的用于所述用途的提取物或根据权利要求2所述的用于所述用途的组合物，其中所述鞘氨醇单胞菌属细菌是sphingomonas xenophaga种。4.根据权利要求3所述的用于所述用途的提取物或用于所述用途的组合物，其中所述sphingomonas xenophaga种的细菌是以保藏编号cncm i-5455提交的菌株。5.根据权利要求1、3和4中任一项所述的用于所述用途的提取物或根据权利要求2至4中任一项所述的用于所述用途的组合物，用于局部使用，优选用在皮肤表面。6.根据权利要求2至5中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中相对于所述组合物的总重量，按重量计，所述提取物的浓度介于0.0001％和30％之间。7.根据权利要求2至6中任一项所述的组合物，进一步包括选自由以下项组成的组的至少一种活性物质：乙酰基二肽-1鲸蜡酯；丹参根提取物；活泉水，如理肤泉水；及它们的混合物。8.根据权利要求1、3至5中任一项所述的用于所述用途的提取物或根据权利要求2至7中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中所述过敏反应是速发型过敏反应。9.根据权利要求1、3至5和8中任一项所述的用于所述用途的提取物，或根据权利要求2至8中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中所述反应包括荨麻疹、皮疹和/或出现发红。10.一种用于调节免疫应答和可选地用于增强皮肤的屏障功能的鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物。11.一种用于调节免疫应答和可选地用于增强皮肤的屏障功能的组合物，所述组合物包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌。

技术总结
本发明涉及一种鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物，以及用于预防和/或治疗由过敏反应引起的皮肤反应和用于调节免疫应答及可选地用于增强皮肤的屏障功能的组合物，该组合物包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌。单胞菌属细菌。


技术研发人员：卡里玛
受保护的技术使用者：欧莱雅
技术研发日：2021.12.17
技术公布日：2023/9/23