每个单细胞的特定核酸的拷贝数的检测方法与流程

1.本发明涉及每个单细胞的特定核酸的拷贝数的检测方法。


背景技术：

2.非专利文献1虽然不是单细胞分析，但公开了将从细胞提取的基因组dna封入微滴中并通过pcr扩增。非专利文献1中，在同一微滴内分别独立地定量作为目标的样品与作为基准的样品。这通过区分嵌入剂的荧光信号，区分扩增子的长度得以实现。
3.非专利文献2公开了以特定的基因的mrna作为目标的单细胞rt-pcr(逆转录pcr)。非专利文献3中，通过逆转录反应与单细胞液滴(single-cell-in-droplet，scd)pcr检测以高通量检测了cd4
+
t细胞中的hiv-1的存在。
4.非专利文献4公开了单细胞-微滴数字pcr(sc-ddpcr)法。该方法中，将单细胞封入微滴中，使用对基因特异性的引物与探针在微滴内进行pcr。在细胞中人工导入一个基因。
5.非专利文献5公开了将单细胞在微滴内溶解的同时，整合单细胞溶解的微滴与rt-pct反应液的微滴。
6.专利文献1虽然不是单细胞分析，但公开了分析由从母血富集的胎儿细胞获得的dna的特性，来判定其基因状态。专利文献1公开了扩增富集的胎儿细胞的dna，并通过数字pcr分析扩增的dna。此外，专利文献1公开了检测21号染色体。
7.专利文献2公开了在单细胞水平上分别分离包含潜在的胎儿细胞的血细胞，同时对分离出来的各个血细胞独立地进行染色体dna的提取处理，事后确定含有源自胎儿的染色体dna的级分。
8.非专利文献6公开了通过上述的sc-ddpcr法检测母血中循环的胎儿细胞的基因组dna上的sry基因。
9.非专利文献7公开了以利用压电效应称量并取出的1、2、4、
···
拷贝的酵母基因组作为模板的定量pcr。
10.对于非专利文献8、9将后述。
11.现有技术文献
12.专利文献
13.专利文献1：日本特表2014-533509号公报
14.专利文献2：日本特开2018-102242号公报
15.非专利文献
16.非专利文献1：laura miotke,et al.,"high sensitivity detection and quantitation of dna copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital pcr",analytical chemistry,86,5,2618-2624.
17.非专利文献2：dennis j.eastburn,et al.,"identification and genetic analysis of cancer cells with pcr-activated cell sorting",nucleic acids research,42,16,e128.
18.非专利文献3：robert w.yucha,et al.,"high-throughput characterization of hiv-1reservoir reactivation using a single-cell-in-droplet pcr assay",ebiomedicine,20,217-229.
19.非专利文献4：yuka igarashi,et al.,"single cell-based vector tracing in patients with ada-scid treated with stem cell gene therapy",molecular therapy,methods&clinical development,6,8-16.
20.非专利文献5：samuel c.kim,et al.,"single-cell rt-pcr in microfluidic droplets with integrated chemical lysis",analytical chemistry,90,2,1273-1279.
21.非专利文献6：taisuke sato,et al.,"direct assessment of single-cell dna using crudely purified live cells:a proof of concept for noninvasive prenatal definitive diagnosis",the journal of molecular diagnostics,22,2,2,132-140.
22.非专利文献7：unoh ki,et al.,"a novel bioprinting application for the production of reference material containing a defined copy number of target dna",ricoh technical report,2020,44,14-26.retrieved from《https://jp.ricoh.com/technology/techreport/44/》
23.非专利文献8：ichiro hanamura,et al.,"frequent gain of chromosome band 1q21 in plasma-cell dyscrasias detected by fluorescence in situ hybridization:incidence increases from mgus to relapsed myeloma and is related to prognosis and disease progression following tandem stem-cell transplantation",blood,108,5,1724-1732.
24.非专利文献9：石田祯夫,《多发性骨髓瘤：染色体异常与临床病型
·
预后》,[online],2013-09-21,临床血液,54,10,2,1856-1866.检索自《https://doi.org/10.11406/rinketsu.54.1856》


技术实现要素：

[0025]
发明要解决的问题
[0026]
数字pcr定性地提示微小分区(例如微滴)内是否有模板。因此，数字pcr不适合检测关于微小分区内的特定核酸的离散的拷贝数变异(copy number variation，cnv)。
[0027]
本发明的目的在于提供能够检测细胞群中的每个单细胞的特定核酸的拷贝数的方法。
[0028]
解决问题的方案
[0029]
本发明涉及下面的每个单细胞的特定核酸的拷贝数的检测方法。
[0030]
[1]一种检测方法，其是检测细胞群中的每个单细胞的特定核酸的拷贝数的方法，其包括：在包含源自单细胞内的核酸的样品dna与pcr反应体系的反应分区内通过pcr将所述样品dna中包含的目标扩增的工序；以及在指数扩增期按每个所述反应分区定量所述pcr的扩增子的工序。
[0031]
[2]根据[1]所述的检测方法，其中，所述样品dna是单细胞内的整套基因组dna、单细胞内的rna的逆转录产物或单细胞内的线粒体dna。
[0032]
[3]根据[1]或[2]所述的检测方法，其中，用荧光探针法定量所述扩增子。
[0033]
[4]根据[3]所述的检测方法，其中，所述pcr反应体系包含按所述样品dna上的每个不同区域分配的分别具有不同荧光波长的荧光物质的多个探针，该多个探针分别具有不同荧光波长的荧光物质，所述区域包含一个或多个所述目标，在所述定量扩增子的工序中，通过从一个所述反应分区检测多个波长的荧光，来将所述样品dna中包含的所述目标扩增了的所述反应分区、与仅混入的无细胞的核酸扩增了的反应分区相区分。
[0034]
[5]根据[3]或[4]所述的检测方法，其中，所述区域包含多个目标，该多个目标分别分配有具有荧光物质的多个探针，该多个探针所具有的荧光物质的荧光波长彼此相同，在所述定量扩增子的工序中，不管这些目标的不同，通过按每个所述区域一并测定来自所述多个探针的荧光，来定量所述扩增子。
[0035]
[6]根据[3]所述的检测方法，其中，所述样品dna包含所述单细胞内的整套基因组dna和所述单细胞内的线粒体dna，所述pcr反应体系包含分配在基因组dna上的区域上的具有第一荧光波长的荧光物质的探针、和分配在线粒体dna上的具有第二荧光波长的荧光物质的探针，所述区域包含一个或多个所述目标，在所述将样品dna中包含的目标通过pcr扩增的工序中，在所述反应分区内，将所述整套基因组dna中包含的目标和所述线粒体dna中包含的目标通过pcr扩增，在所述定量扩增子的工序中，在所述线粒体dna中包含的目标的扩增到达平台期而所述基因组dna中包含的目标的扩增变为所述指数扩增期的循环中，按每个所述反应分区定量所述基因组dna和所述线粒体dna的扩增子，在所述定量扩增子的工序中，通过从一个所述反应分区检测所述第一荧光波长和所述第二荧光波长的荧光，来将所述基因组dna中包含的目标和所述线粒体dna中包含的目标扩增了的所述反应分区、与仅混入的无细胞的核酸扩增了的反应分区相区分。
[0036]
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的检测方法，其进一步包括如下工序，即，通过在包含单细胞、细胞溶解试剂和pcr的预混试剂的分区内溶解所述单细胞，来生成所述反应分区的工序。
[0037]
[8]根据[1]～[6]中任一项所述的检测方法，其进一步包括如下工序：在包含单细胞的分区内溶解所述单细胞的工序；以及通过整合包含溶解的所述单细胞的分区与包含pcr的预混试剂的分区，来生成所述反应分区的工序。
[0038]
[9]根据[1]～[6]中任一项所述的检测方法，其进一步包括如下工序：将细胞核群与pcr的预混试剂进行大批混合的工序；以及通过将所述细胞核群中的各个细胞核与所述预混试剂一起个体化，来生成所述反应分区的工序。
[0039]
[10]根据[1]～9中任一项所述的检测方法，其中，所述反应分区是含有所述样品dna与所述pcr反应体系的微滴，即反应微滴。
[0040]
[11]根据[1]～10中任一项所述的检测方法，其中，所述样品dna包含所述单细胞内的整套基因组dna，所述检测方法进一步具有如下工序，即，从所述扩增子的定量结果，检测具有选自由染色体总长上的异倍性、染色体的部分异倍性、基因扩增和基因缺失组成的组中的至少一种染色体突变的单细胞的存在的工序。
[0041]
[12]根据[11]所述的检测方法，其中，所述具有染色体突变的单细胞包含如下基因组dna，该基因组dna至少具有以下染色体突变中的一种染色体突变：
[0042]-21号染色体的异倍性；
[0043]-18号染色体的异倍性；
[0044]-13号染色体的异倍性；
[0045]-y染色体的异倍性；
[0046]-x染色体的异倍性；
[0047]-22号染色体长臂22q11.2区域的缺失；
[0048]-5号染色体短臂5q区域的缺失；
[0049]-15号染色体长臂15q11-q13区域的缺失；
[0050]-1号染色体长臂的扩增；
[0051]-17号染色体短臂的缺失；
[0052]-13号染色体长臂的缺失；
[0053]-4号染色体长臂的缺失；
[0054]-5号染色体长臂的缺失；
[0055]-7号染色体长臂的缺失；
[0056]-8号染色体的扩增；
[0057]-11号染色体的缺失；
[0058]-12号染色体的异倍性；
[0059]-20号染色体长臂的缺失；
[0060]-19号染色体长臂的缺失；
[0061]-1号染色体的缺失；
[0062]-18号染色体长臂的缺失；
[0063]-8号染色体短臂的缺失；
[0064]-4号染色体的缺失；
[0065]-8号染色体长臂的扩增；
[0066]-16号染色体长臂的缺失；
[0067]-5号染色体短臂的扩增；
[0068]-3号染色体长臂的扩增；
[0069]-3号染色体短臂的缺失；
[0070]-9号染色体短臂的缺失；
[0071]-mycn基因的基因扩增；
[0072]-her2基因的基因扩增；
[0073]-met基因的基因扩增。
[0074]
[13]根据[11]所述的检测方法，其进一步包括如下工序，即，生成包含是否检测到所述具有染色体突变的单细胞的信息的数据的工序，所述细胞群是以包含胎儿细胞的方式从羊水或母血分离出来的细胞群，所述数据用于13三体性、18三体性、21三体性、特纳综合征、三x综合征、xyy综合征、克兰费尔特综合征、迪格奥尔格综合征、安格曼综合征、普拉德-威利综合征、或猫叫综合征的诊断。
[0075]
[14]根据[11]所述的检测方法，其进一步包括：生成如下数据的工序，该数据包含是否检测到所述具有染色体突变的单细胞的信息，所述细胞群是从患者分离出来的细胞群，所述数据、所述数据用于骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、特发性嗜酸性粒细胞增多症、慢性嗜酸性粒细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、骨髄增殖性肿瘤、慢性淋巴细胞
白血病、急性骨髓性白血病、脑肿瘤、成神经细胞瘤、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、食道癌、甲状腺癌或头颈癌的诊断。
[0076]
发明效果
[0077]
根据本发明，能够检测细胞群中的每个单细胞的特定核酸的拷贝数。例如，根据本发明，能够检测每个单细胞的特定核酸的拷贝数变异(cnv)。
附图说明
[0078]
图1是检测的概念图。
[0079]
图2是表示检测的一个例子的流程图。
[0080]
图3是表示微滴制备概要的图。
[0081]
图4是表示探针分配的图。
[0082]
图5是检测事件的散点图。
[0083]
图6是表示多个探针分配的图。
[0084]
图7是荧光增强的检测事件的散点图。
[0085]
图8是平台期的微滴的散点图。
[0086]
图9是指数扩增期的微滴的散点图。
[0087]
图10是荧光增强的微滴的散点图。
[0088]
图11是异质细胞群的微滴的散点图。
[0089]
图12是异质细胞群的微滴的散点图。
[0090]
图13是区分二倍性与单倍性的散点图。
[0091]
图14是区分二倍性与单倍性的散点图。
[0092]
图15是区分二倍性与单倍性的散点图。
[0093]
图16是荧光增强的、区分二倍性与单倍性的散点图。
[0094]
图17是荧光增强的、区分二倍性与单倍性的散点图。
[0095]
图18是荧光增强的、区分二倍性与单倍性的散点图。
[0096]
图19是对应各散点图的盒须图。
[0097]
图20是使用23种探针情况下的roc曲线。
[0098]
图21是包含表示截断值的直线的散点图。
[0099]
图22是表示每次测定的簇的位置偏移的图。
[0100]
图23是表示补正后的测定值的偏差的图表。
[0101]
图24是说明使用补正后的测定值计算截断值的图。
[0102]
图25是包含源自人血液的基因组dna的微滴的散点图。
[0103]
图26是包含cd45细胞的微滴的散点图。
[0104]
图27是同质细胞群的微滴的散点图。
[0105]
图28是异质细胞群的微滴的散点图。
[0106]
图29表示各细胞群的微滴的散点图。
[0107]
图30是表示关于各细胞群的异常微滴的检测结果的盒须图。
[0108]
图31是包含rna的逆转录产物的微滴的散点图。
[0109]
图32是包含线粒体dna的微滴的散点图。
具体实施方式
[0110]
《概要》
[0111]
图1是概念性地表示检测细胞群中的每个单细胞的特定核酸的拷贝数，例如基因组dna上的特定位置的cnv，的情形的图。一个方式中，细胞是人细胞。
[0112]
下面，在说明cnv时，“单倍性”这一术语包括特定染色体的整体单倍化(即单体性)与由缺失导致的部分单倍性的状态。二倍性的染色体的整体或部分变为单倍性包括在cnv中。
[0113]“三倍性”这一术语包括特定染色体的整体三倍化(即三体性)与由重复导致的部分三倍性的状态。二倍性的染色体的整体或部分变为三倍性包括在cnv中。二倍性的染色体的整体或部分变为比三倍性更大的倍数性包括在cnv中。
[0114]
单倍性正常的男子的性染色体的整体或部分由重复导致的倍数性的变化也包括在cnv中。下面，有时将单倍性、二倍性、三倍性和其它倍数性统称为“倍数性”。
[0115]
倍数性的染色体的整体或部分完全消失的变化(双等位基因缺失)也包括在cnv中。此外，产生通常不存在的染色体的整体或一部分的变化也包括在cnv中。
[0116]
本发明中，检测具有异倍性的染色体的细胞的情形包括如下情形，即，检测包含具有整倍性的染色体的细胞的细胞群还包含具有异倍性的染色体的细胞的情形。本发明中，检测具有异倍性的染色体的细胞的情形包括如下情形，即，检测包含具有整倍性的染色体的细胞的细胞群为不包含具有异倍性的染色体的细胞的细胞群的情形或者仅包含检测限以下的异倍性的细胞的情形。本发明中，检测具有异倍性的染色体的细胞的情形包括如下情形，即，检测细胞群为不包含具有整倍性的染色体的细胞的、具有异倍性的染色体的细胞群的情形。
[0117]
《整体的流程》
[0118]
如图1的左侧所示，准备细胞群17。细胞群17是单细胞18的集合体。细胞为真核细胞或原核细胞。一个方式中，细胞为具有一个细胞核的真核细胞。
[0119]
如图1的中央所示，准备包含源自单细胞18内的核酸的样品dna与pcr反应体系的反应分区。图1中，在油19中形成微滴20作为反应分区。图中所示的是微滴的一个方式。微滴20是油包水乳剂型微滴。一个方式中，反应分区(微滴20)的体积为1pl(皮升)～1μl(微升)或1pl(皮升)～10nl(纳升)。其一个方式中，反应分区(微滴20)的体积为10pl、100pl、1nl、10nl或100nl。反应分区的结构只要是包含样品dna与pcr反应体系的微小分区就没有特别限制，例如也可为微孔(microwell)。
[0120]
样品dna例如为单细胞内的整套基因组dna、单细胞内的rna的逆转录产物或单细胞内的线粒体基因组的dna(下面称为“线粒体dna”)。图1中，微滴20包含单细胞18内的整套基因组dna21作为样品dna。微滴20还含有pcr反应体系。下面，有时将微滴20称作反应微滴。
[0121]
一个方式中，样品dna为单细胞内的整套基因组dna。“整套基因组dna”也可解释为直接提取的基因组dna。一个方式中，不对整套基因组dna进行全基因组扩增。由此，可避免起因于全基因组扩增的等位基因脱扣(allele dropout)。“整套基因组dna”也包括在细胞溶解或其它提取操作时无意中失去了其一部分的基因组dna。一个方式中，“整套基因组
dna”不包含线粒体dna。但使用整套基因组dna作为样品dna的情况下，可在反应分区中混入线粒体dna。
[0122]
一个方式中，样品dna是单细胞内的rna的逆转录产物。
[0123]
一个方式中，样品dna是单细胞内的线粒体dna。
[0124]
一个方式中，样品dna是单细胞内的整套基因组dna和同一单细胞内的线粒体dna。该情况下，可将线粒体dna作为检测染色体基因组dna的拷贝数时的对照。
[0125]
此外，另一个方式中，样品dna是侵入细胞内的微生物或病毒的核酸或者导入到细胞内的核酸。
[0126]
如图1的右侧所示，将反应分区供于热循环。即，在包含源自单细胞内的核酸的样品dna和pcr反应体系的反应分区内，将样品dna中包含的目标(target)通过pcr扩增。图1中，在微滴20内，将整套基因组dna21中包含的目标通过pcr扩增。pcr中，样品dna(例如基因组dna)用作模板。图1中，微滴22a和22b是指数扩增期的反应微滴。在该阶段，按每个反应微滴定量其扩增子。即，在指数扩增期，按每个反应分区(例如反应微滴)定量pcr的扩增子。一个方式中，扩增子的定量通过荧光探针法进行。
[0127]
图1中，微滴22b呈现出比微滴22a更强的信号。因此，对应于微滴22b的单细胞的对象基因组区域的拷贝数多于对应于微滴22a的单细胞的对象基因组区域的拷贝数。因此，能够检测关于基因组上的特定位置(目标位置)的基因组dna的拷贝数和cnv。
[0128]
《检测的流程》
[0129]
图2是表示检测核酸拷贝数的一个例子的流程图。在此，对使用微滴作为反应分区并且使用单细胞内的整套基因组dna作为样品dna的例子进行说明。
[0130]
开始后的步骤25中，制备pcr预混试剂(premix)。预混试剂包含引物、dna聚合酶、脱氧核苷三磷酸(dntp)、缓冲液和所需的辅因子。一个方式中，辅因子包括镁离子。一个方式中，向预混试剂预先混合细胞溶解试剂。细胞溶解试剂的例子中包括：十二烷基硫酸钠、triton x-100(triton为注册商标)、np-40(商标)。预混试剂包含所需的探针。
[0131]
图2所示的步骤26中，如图3的上侧所示，将细胞群17混悬在预混试剂31中。迅速施行从混悬到微滴化的工序，以免细胞溶解试剂与细胞发生反应。
[0132]
图2所示的步骤27中，如图3的下侧所示，将各个单细胞18与预混试剂31一起微滴化。由此，生成含有单细胞18的微滴33a。
[0133]
作为用于将单细胞与预混试剂一起微滴化的体系，例如可利用qx200droplet generator(biorad公司)。单细胞化的体系并不限定于此。
[0134]
图3所示的一个方式中，微滴33a中含有细胞溶解试剂。一个方式中，将微滴33a中的单细胞18用上述的细胞溶解试剂在微滴33a内溶解。通过细胞溶解得到反应微滴。即，通过在包含单细胞18、细胞溶解试剂和pcr预混试剂的分区(微滴33a)内溶解单细胞18，来形成反应分区(反应微滴)。细胞溶解试剂的反应可通过加热来有效地进行。
[0135]
图2所示的步骤27的另一个方式中，在与预混试剂混合之前，在含有单细胞的分区(微滴)内溶解单细胞。进一步，将含有溶解的单细胞的分区(微滴)与包含pcr预混试剂的分区(微滴)整合。可通过整合得到反应分区(反应微滴)。
[0136]
图2所示的步骤27的另一个方式中，在将单细胞与预混试剂混合之前，将大批(bulk)的细胞溶解得到大批的细胞核群。将大批的细胞核群与pcr预混试剂混合。通过将细
胞核群中的各个细胞核与预混试剂一起个体化来生成反应分区(反应微滴)。
[0137]
图2所示的步骤28中，通过热循环在反应微滴中进行pcr。热循环在pcr的指数扩增期停止。一个方式中，“指数扩增期”是指由于dntp、引物组(primer set)、探针的组和有活性的酶没有达到枯竭，因此模板依赖性的dna合成不受限制的情形。一个方式中，“指数扩增期”是指未达到链式反应的平台期的情形。
[0138]
图2所示的步骤29中，通过分析来自反应分区(反应微滴)的信号，定量反应微滴中的目标的拷贝数。到此结束。
[0139]
图2所示的步骤25的一个方式中，预混试剂还包含与目标或从目标获得的扩增子杂交的荧光探针。另一个方式中，预混试剂还包含与dna结合的荧光嵌入剂。
[0140]
一个方式中，扩增子内包含的探针的目标为一个。另一个方式中，扩增子内包含的探针的目标为两个以上。通过使这些与一个扩增子结合的多个探针具有发出彼此相同的颜色的荧光的荧光物质，能够增强从扩增子发出的荧光。
[0141]
《双色探针法》
[0142]
图4表示双色探针分配的例子。在21号染色体上的任一目标上分配具有第一荧光波长的荧光物质的探针35a(第一色，1st color)。在18号染色体上的任一目标上分配具有第二荧光波长的探针35b(第二色，2nd color)。这些染色体的种类仅仅是示例。反应分区(反应微滴)中，这些探针相互混合。
[0143]
本例中，将分配有第一荧光波长的探针的目标或包含该目标的区域作为拷贝数(cnv)的检测对象。本例中，将分配有第二荧光波长的探针的目标或包含该目标的区域作为对照。一个方式中，对照是cnv相对较小的区域。
[0144]
即，如图4所示，pcr反应体系包含按样品dna上的每个不同区域分配的分别具有不同荧光波长的荧光物质的多个探针。本例中所说的区域是各染色体的总长。区域可为各染色体的部分，也可跨染色体。
[0145]
图4所示的方式中，各区域中包含的目标为一个。与图不同的方式中，区域中包含的目标也可为两个以上。不管怎样，从一个反应分区(反应微滴)中检测分配在各区域的各荧光波长的荧光。
[0146]
在图4所示的方式的理想的反应条件中，如果21号染色体在整体或作为检测对象的部分上为三倍性的话，第一荧光波长的强度是21号染色体在整体或作为检测对象的部分上为二倍性的情况下的第一荧光波长的强度的1.5倍。如果21号染色体在整体或作为检测对象的部分上为单倍性的话，第一荧光波长的强度是21号染色体在整体或作为检测对象的部分上为二倍性的情况下的第一荧光波长的强度的0.5倍。其情形如图5所示。
[0147]
图5表示从反应分区(反应微滴)发出的荧光的检测事件(detection event)的散点图(scatter plot)。纵轴表示分配在21号染色体上的第一荧光波长，横轴表示分配在18号染色体上的第二荧光波长。各圆表示图上的检测事件的荧光强度分布的中心附近。该圆内聚集大部分的事件，因此下面将聚集的事件称为“簇(cluster)”。簇39表示在任一个荧光波长下荧光强度都与背景没有差的簇。簇40a～40c表示在任一个荧光波长下荧光强度都与背景有差的簇。
[0148]
关于图5所示的簇40a，第一荧光波长的强度表示21号染色体在整体或作为检测对象的部分上为二倍性。此外，第二荧光波长的强度表示18号染色体在整体或作为检测对象
的部分上为二倍性。
[0149]
关于图5所示的簇40b，第一荧光波长的强度表示21号染色体在整体或作为检测对象的部分上为三倍性。此外，第二荧光波长的强度表示18号染色体在整体或作为检测对象的部分上为二倍性。
[0150]
关于图5所示的簇40c，第一荧光波长的强度表示21号染色体在整体或作为检测对象的部分上为单倍性。此外，第二荧光波长的强度表示18号染色体在整体或作为检测对象的部分上为二倍性。
[0151]
图5所示的一个方式中，检测到各点从簇40a的位置移位到簇40b的位置。通过该移位，第一荧光波长的强度增大。该移位中，第二荧光波长的强度没有变化。该移位表示细胞群中存在21号染色体在整体或作为检测对象的部分上为三倍性的单细胞。
[0152]
图5所示的另一个方式中，检测到各点从簇40a的位置移位到簇40c的位置。通过该移位，第一荧光波长的强度减少。该移位中，第二荧光波长的强度没有变化。该移位表示细胞群中存在21号染色体在整体或作为检测对象的部分上为单倍性的单细胞。
[0153]
这些散点图上的移位的大小也可通过预实验估算。这些散点图上的各簇的细胞的倍数性也可通过预实验估算。
[0154]
为了说明图5所示的簇44a和44b，返回图3。生成微滴33a时，有时将无细胞的核酸卷入微滴内。无细胞的核酸例如为从破坏的细胞释放的基因组dna的片段。有时也从含有这样的无细胞的基因组dna的微滴33b通过pcr产生扩增子。
[0155]
图5所示的散点图中，源自这样的无细胞分子的扩增子产生簇44a和簇44b。源自无细胞分子的扩增子的信号不易与簇40a重叠。这是因为发生不同区域上的两个以上的目标在源自无细胞分子的微滴内同时被扩增的可能性小。此外，通常，包含无细胞分子的微滴所具有的目标的拷贝数为1。
[0156]
返回图4。如图4所示，在各不同区域中使用不同荧光波长的荧光物质。换言之，第二荧光波长的探针用作对照。由此，如图5所示，能够将基因组dna扩增了的反应微滴与仅混入的无细胞的核酸扩增了的微滴相区分。
[0157]
即，图4的例子中，pcr反应体系包含按样品dna上的每个不同区域分配的分别具有不同荧光波长的荧光物质的多个探针。此外，区域包含一个或多个所述目标。进而，在定量扩增子的工序中，通过从一个反应分区中检测多个波长的荧光，来将样品dna中包含的目标扩增了的反应分区、与仅混入的无细胞的核酸扩增了的反应分区相区分。
[0158]
对附加在探针上的荧光物质(荧光色素)和淬灭剂的种类没有特别限制。例如，第一荧光波长的荧光物质为fam(商标，fluorescein amidite)，第二荧光波长的荧光物质为hex(商标，hexachloro-fluorescein)。
[0159]
《目标的增加与信号的增强》
[0160]
图6表示对各色分配了多种探针的例子。下面，说明与图4不同之处。将具有第一荧光波长的荧光物质的3种探针(第一色，1st color)分别分配在21号染色体上的3种目标上。将具有第二荧光波长的荧光物质的3种探针(第二色，2nd color)分别分配在18号染色体上的3种目标上。这些染色体的种类仅仅为示例。pcr反应体系包含按样品dna上的每个不同区域分配的分别具有不同荧光波长的荧光物质的多个探针。这些具有不同的目标序列。微滴中这些探针相互混合。
[0161]
图7表示从反应分区(反应微滴)发出的荧光的检测事件的散点图。簇41a～41c表示在任一个荧光波长下荧光强度都与背景有差的簇。可看到与图5同样的移位。
[0162]
关于图7所示的簇41a，第一荧光波长的强度表示21号染色体在整体或作为检测对象的部分上为二倍性。此外，第二荧光波长的强度表示18号染色体在整体或作为检测对象的部分上为二倍性。
[0163]
关于图7所示的簇41b，第一荧光波长的强度表示21号染色体在整体或作为检测对象的部分上为三倍性。此外，第二荧光波长的强度表示18号染色体在整体或作为检测对象的部分上为二倍性。
[0164]
关于图7所示的簇41c，第一荧光波长的强度表示21号染色体在整体或作为检测对象的部分上为单倍性。此外，第二荧光波长的强度表示18号染色体在整体或作为检测对象的部分上为二倍性。
[0165]
图7所示的一个方式中，检测到各点从簇41a的位置移位到簇41b的位置。通过该移位，第一荧光波长的强度增大。该移位中，第二荧光波长的强度没有变化。该移位表示细胞群中存在21号染色体在整体或作为检测对象的部分上为三倍性的单细胞。
[0166]
图7所示的另一个方式中，检测到各点从簇41a的位置移位到簇41c的位置。通过该移位，第一荧光波长的强度增大。该移位中，第二荧光波长的强度没有变化。该移位表示细胞群中存在21号染色体在整体或作为检测对象的部分上为单倍性的单细胞。
[0167]
这些散点图上的移位的大小也可通过预实验估算。
[0168]
图7所示的簇44a和44b与图5所示的同样。通过使用在同一微滴内检测不同荧光波长的探针的方法，能够将这些簇与簇41a～41c相区分。这一点也与图5同样。
[0169]
返回图6。每根21号染色体上分配有三个具有第一荧光波长的荧光物质的探针。同样地，每根18号染色体上分配有三个具有第二荧光波长的荧光物质的探针。因此，理想的反应条件中，反应微滴中的各色的荧光强度与区域内的目标数目成比例地提高。此外，通过增加一个反应微滴中的目标数目，pcr的效率的偏差被平均化，反应微滴间的荧光强度的偏差降低。
[0170]
根据图7说明的话，簇41a～41c更容易从簇39、簇44a和簇44b中分离。
[0171]
本实施方式中，各区域包含多个目标，该多个目标分别分配有具有荧光物质的多个探针，该多个探针所具有的荧光物质的荧光波长彼此相同。此外，定量扩增子时，不管这些目标的不同，按每个区域按每种颜色一并测定来自多个探针的荧光，由此定量扩增子。通过以上方法，增强来自分配有这些目标的区域的荧光。因此，容易将目标的信号与背景噪音分离。
[0172]
一个方式中，一个区域内的目标数目为1～1,000个。一个方式中，一个区域内的目标数目为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100。目标数目在区域间可一致，也可不同。各区域中，使用与目标数目相同数目的种类的探针。这些探针上分配相同的荧光波长。
[0173]
一个方式中，一个引物对(primer pair)和探针的组合所确定的目标在基因组dna
上仅有一个。通过在各区域中使用n种探针，在该区域中检测n个目标。
[0174]
《向三个以上的区域的三色以上的分配》
[0175]
上述实施方式中，使用了两个荧光波长。还可在增加区域的数目的同时，在追加的区域上分配其它荧光波长。一个方式中，也可在18号染色体和21号染色体以外的染色体上分配第三荧光波长。
[0176]
一个方式中，区域与荧光波长的组的数目为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。另一个方式中，区域与荧光波长的组为一个。
[0177]
对付加在探针上的荧光物质(荧光色素)和淬灭剂的种类没有特别限制。荧光物质的例子中包括：fam、hex、vic、tamra、rox、cy5和cy5.5(均为商标)。
[0178]
《试验例1.平台期的定量》
[0179]
图8表示平台期的微滴的散点图。在21号染色体上的一个目标上分配了一种具有第一荧光波长的荧光物质(fam)的探针。此外，在18号染色体上的一个目标上分配了一种具有第二荧光波长的荧光物质(hex)的探针。这些探针在一个微滴中相互混合。
[0180]
pcr的循环数设为40。pcr的反应在过了指数扩增期后到达平台期。反应饱和。图8表示单细胞-微滴pcr后的散点图。
[0181]
图8的上段中，表示对人培养细胞gm22948株进行单细胞-微滴pcr的结果。人培养细胞gm22948株中，21号染色体和18号染色体为整倍性，即二倍性(diploidy，实线的箭形符号)。实线的箭形符号表示簇的中心。箭头是无细胞dna的簇。下面的图中也同样。
[0182]
图8的中段中，表示对人培养细胞ag17487株进行单细胞-微滴pcr的结果。人培养细胞ag17487株中，21号染色体为三倍性(triploidy，虚线的箭形符号)，18号染色体为整倍性。
[0183]
图8的下段中，表示将两株的散点相加的结果。21号染色体的二倍性与三倍性在微滴的信号强度上没有不同。
[0184]
《试验例2.指数扩增期的定量》
[0185]
图9表示指数扩增期的微滴的散点图。与试验例1不同，pcr的循环数设为24。pcr的反应处于指数扩增期。除此之外与试验例1相同。
[0186]
图9的上段中，表示对人培养细胞gm22948株进行单细胞-微滴pcr的结果。
[0187]
图9的中段中，表示对人培养细胞ag17487株进行单细胞-微滴pcr的结果。
[0188]
图9的下段中，表示将两株的散点相加的结果。21号染色体的二倍性与三倍性在微滴的信号强度上有不同。通过在指数扩增期定量微滴的荧光，能够区分二倍性与三倍性。因此，下面的试验例中，在指数扩增期测定了微滴的荧光强度。
[0189]
予以说明，图9的各散点图中，21号染色体为二倍性且21号染色体为二倍性或三倍性的簇的右上存在的多个事件被认为表示包含多个细胞的微滴的信号。
[0190]
《试验例3.荧光的增强》
[0191]
图10表示荧光增强的微滴的散点图。与试验例2不同，21号染色体上分配了8种具有第一荧光波长的荧光物质的探针。21号染色体上的8个目标上分别分配了1种具有第一荧光波长的荧光物质的探针。此外，18号染色体上分配了8种具有第二荧光波长的荧光物质的探针。18号染色体上的8个目标上分别分配了1种具有第二荧光波长的荧光物质的探针。除此之外与试验例2相同。
[0192]
图10的上段中，表示对人培养细胞gm22948株进行单细胞-微滴pcr的结果。
[0193]
图10的中段中，表示对人培养细胞ag17487株进行单细胞-微滴pcr的结果。
[0194]
图10的下段中，表示将两株的散点相加的结果。21号染色体为二倍性的簇与三倍性的簇更明显地分开了。因此，更容易检测簇的移位本身。这是由于通过增加对应于相同荧光波长的探针的一个区域内的目标数目，在微滴的荧光增强的同时，荧光强度的偏差降低。下面的试验例中，通过在一个区域分配多个目标来增强了荧光。
[0195]
予以说明，图10的各散点图中，21号染色体为二倍性且21号染色体为二倍性或三倍性的簇的右上存在的多个事件被认为表示包含多个细胞的微滴的信号。
[0196]
《试验例4.异质细胞群的cnv的检测》
[0197]
图11和图12表示异质细胞群的微滴的散点图。混合人培养细胞gm22948株(diploidy)与人培养细胞ag17487株(triploidy)得到异质细胞群。混合比设为从99/1至75/25。对这些细胞群进行单细胞-微滴pcr。除此之外与试验例3相同。从二倍性向三倍性的簇的移位反应了细胞的数目比。
[0198]
《试验例5.从二倍性向单倍性的簇的移位》
[0199]
图13表示同质细胞群的微滴的散点图。纵轴的chr13-8p表示8种探针分别分配在13号染色体的8处目标上。横轴的chr18-8p表示8种探针的每一个分别分配在18号染色体的8处目标中的某一个上。这些探针在一个微滴中相互混合。
[0200]
图13的上段中，表示对人培养细胞gm22948株进行单细胞-微滴pcr的结果。人培养细胞gm22948株中，13号染色体和18号染色体为整倍性，即二倍性(diploidy，实线的箭形符号)。
[0201]
图13的下段中，表示对人培养细胞nci-h929株进行单细胞-微滴pcr的结果。人培养细胞nci-h929株中，13号染色体为单倍性(monoploidy，虚线的箭形符号)，18号染色体为整倍性。
[0202]
图14的上段中，表示将两株的散点相加的结果。13号染色体的二倍性与单倍性在微滴的信号强度上有不同。通过在指数扩增期定量微滴的荧光，能够区分二倍性与单倍性。
[0203]
图14的下段表示异质细胞群的微滴的散点图。混合人培养细胞gm22948株(diploidy)与人培养细胞nci-h929株(monoploidy)得到异质细胞群。混合比设为50/50。对这些细胞群进行单细胞-微滴pcr。从二倍性向单倍性的簇的移位反映了细胞的数目比。
[0204]
《试验例6.荧光的增强》
[0205]
将包含10000个细胞(gm22948株或gm13721株)和pbs的细胞混悬液2μl添加到包含十二烷基硫酸钠的pcr预混试剂中，来制备pcr反应液。pcr反应液中的引物或探针等的浓度如下。
[0206]
·
1x ddpcr multiplex super mix(biorad公司)
[0207]
·
500nm/575nm 13号染色体-fam探针
[0208]
·
1μm 13号染色体引物
[0209]
·
1000nm/1250nm 18号染色体-hex探针
[0210]
·
1μm 18号染色体引物
[0211]
·
蒸馏水(用于添加至刻度)
[0212]
使用qx200 droplet generator(biorad公司)将上述pcr反应液微滴化，进一步在
各微滴内使细胞溶解。然后，在各微滴内以通常的条件进行pcr。pcr的循环数设为23。pcr的反应处于指数扩增期。
[0213]
本试验例中，13号染色体上分配了1、5、10或23种具有第一荧光波长的荧光物质(fam)的探针。13号染色体上的1、5、10或23的目标上分别分配了1种具有第一荧光波长的荧光物质的探针。使用多种探针的情况下，各探针的浓度相同，上述探针的浓度(1、5或10种：500nm，23种：575nm)为多种探针的总计浓度。此外，18号染色体上分配了1、5、10或25种具有第二荧光波长的荧光物质(hex)的探针。18号染色体上的1、5、10或25的目标上分别分配了1种具有第二荧光波长的荧光物质的探针。使用多种探针的情况下，各探针的浓度相同，上述探针的浓度(1、5或10种：1000nm，25种：1250nm)为多种探针的总计浓度。这些探针在一个微滴中相互混合。
[0214]
图15～图18表示指数扩增期的微滴的散点图。
[0215]
图15～图18的上段中，表示对人培养细胞gm22948株进行单细胞-微滴pcr的结果。人培养细胞gm22948株中，13号染色体和18号染色体为整倍性，即二倍性(diploidy，实线的箭形符号)。实线的箭形符号表示簇的中心。
[0216]
图15～图18的下段中，表示对人培养细胞gm13721株进行单细胞-微滴pcr的结果。人培养细胞gm13721株中，13号染色体的单个长臂的一部分区域为单倍性(monoploidy，虚线的箭形符号)，18号染色体为整倍性。上述具有第一荧光波长的荧光物质(fam)的探针都分配在13号染色体的上述缺失区域。
[0217]
图15表示在13号染色体和18号染色体上分别分配了1种探针的情况下的结果。图16表示在13号染色体和18号染色体上分别分配了5种探针的情况下的结果。图17表示在13号染色体和18号染色体上分别分配了10种探针的情况下的结果。图18表示在13号染色体上分配了23种探针且在18号染色体上分配了25种探针的情况下的结果。
[0218]
予以说明，图15～图18的各散点图中，18号染色体为二倍性且13号染色体为单倍性或二倍性的簇的右上存在的多个事件被认为表示包含多个细胞的微滴的信号。
[0219]
从这些散点图中实线的箭形符号和虚线的箭形符号的位置的不同可以看出，通过增加对应于相同荧光波长的探针的一个区域内的目标数目，能够更容易地判定拷贝数的不同。
[0220]
接着，关于各散点图，对装入一个细胞的微滴计算第一荧光波长的荧光强度相对于第二荧光波长的荧光强度的比例“fam/hex”并归总在盒须图中。图19是关于各散点图的盒须图。
[0221]
图19中，任一个图表中，13号染色体为单倍性的细胞与二倍性的细胞的、表示第三四分位数和第一四分位数的箱都没有重叠，由此可知能够区分单倍性的细胞与二倍性的细胞。尤其是在13号染色体上使用了23种探针且在18号染色体上使用了25种探针的情况下，须也没有重叠。
[0222]
图20表示以使用了23种探针的情况下的“fam/hex”为说明变量，对能够从包含gm22948株(13号染色体为二倍性的细胞)和gm13728株(13号染色体为单倍性的细胞)的细胞群中检测gm13728株(13号染色体为单倍性的细胞)的性能进行roc分析的结果。约登指数(yoden index)为0.743。用约登指数截断(cutoff)时的灵敏度为0.997(99.7％)，特异度为0.994(99.4％)。此外，auc为0.997(95％ci：0.996～0.999)，为极高的值。
[0223]
《内标法》
[0224]
一个方式中，倍数性的测定用内标法进行。一个方式中，在作为检测对象的区域为整倍性的细胞是cnv的内部标准。例如，在试验例4和试验例5的后半部分测定了异质细胞群中的作为检测对象的区域的拷贝数。此外，针对整倍性的簇，根据是否存在具有cnv的簇来判断它们是三倍性还是单倍性。
[0225]
异质细胞群中，在分配有目标的区域为整倍性的细胞的构成比为大于0％且小于100％。异质细胞群中的整倍性的细胞的比，例如为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9、99.95、99.96、99.97、99.98或99.99％。
[0226]
异质细胞群中，在分配有目标的区域中作为对象的具有cnv的细胞的构成比为大于0％且小于100％。异质细胞群中具有cnv的细胞的比，例如为99.99、99.98、99.97、99.96、99.95、99.9、99.8、99.7、99.6、99.5、99、98、97、96、95、90、85、80、75、70、60、50、40、30、25、20、15、10、5、4、3、2、1、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.04、0.03、0.02或0.01％。
[0227]
《外标法》
[0228]
在试验例1～3和试验例5的前半部分，关于倍数性，测定了同质细胞群中的检测对象区域的拷贝数。对于这些细胞事先判断清楚了cnv。通过下面的方法，能够对事先未判断清楚cnv的细胞提供检测对象区域的拷贝数的标准。
[0229]
即，一个方式中，倍数性的测定用外标法进行。例如，在未与样品混合的其它乳状液中，以预先知道倍数性的细胞的基因组dna为模板，在同时或其前后进行pcr，测定其扩增子的荧光强度。将通过其荧光强度求出的簇的坐标与样品的簇的坐标进行比较。
[0230]
这样的外部标准的试验例表示在图9的上段(二倍数性)和中段(三倍数性)、图10的上段(二倍数性)和中段(三倍数性)以及图13的上段(二倍数性)和下段(一倍数性)中。
[0231]
以测定癌患者肿瘤细胞的任一种染色体的倍数性的情况为例。治疗进展顺利，在作为测定对象的所有细胞中，发生原本存在的染色体突变消失。该情况下，作为测定对象的染色体上的区域变为整倍性。因此，根据上述的测定方法的话，散点图上的异倍性的簇的移位会消失。换言之，各种簇之中仅存整倍性的簇。
[0232]
另一方面，设想如果癌患者病情显著恶化，则作为测定对象的所有细胞中存在染色体突变。或者设想与整倍性的细胞相比，异倍性的细胞显著增多而检测不到整倍性的细胞。根据上述的测定方法的话，散点图上的整倍性的簇会消失。换言之，各种簇之中仅检测到异倍性的簇。
[0233]
在该异倍性的簇中，成为具有测定对象区域的特定倍数性的细胞的同质群。或者成为具有各种倍数性的细胞的异质群。
[0234]
一个方式中，用倍数性的外部标准测定癌患者肿瘤细胞的基因组的倍数性。通过使用外部标准，能够不依据以细胞群中原本一定包含的整倍性的细胞(未癌化的正常细胞)为内部标准来测定细胞的倍数性。在判断癌治疗的治疗必要性或诊断完全缓解时，这些倍数性的更准确的信息发挥作用。
[0235]
接着，以作为产前诊断的一个环节以羊水中的胎儿细胞为测定对象的情况为例。在羊水中的胎儿细胞中未混入源自母体的细胞的情况下，通常的该细胞群中仅包含胎儿细胞。该细胞群关于基因组的倍数性为同质群。
[0236]
一个方式中，用倍数性的外部标准测定胎儿细胞的基因组的倍数性。通过使用外部标准，能够不依据以细胞群中原本一定包含的整倍性的细胞(该情况下为源自母体的细胞)为内部标准来测定细胞的倍数性。
[0237]
予以说明，在事先能够确认到从羊水中以100％的纯度获得了胎儿细胞的情况下，通过使用上述测定方法，能够考察该胎儿细胞群关于基因组的倍数性是异质的还是同质的。即，能够确认是否有胎儿细胞的染色体的倍数性的嵌合体(mosaic)。
[0238]
本实施方式中，测定对象的基因组区域的拷贝数与簇的荧光强度的中心具有非常清晰的线性关系。因此，可无需在每次进行样品测定时获得来自外部标准的细胞的荧光强度。即，通过将预先求出的外部标准的荧光强度信息与样品的荧光强度信息进行比较，就能够确定样品的基因组的测定对象区域的倍数性。
[0239]
《试验例7.作为外部标准的截断值(cutoff value)的设定》
[0240]
图21表示包含对应于本试验例中要设定的截断值的直线的散点图。本试验例中，如该图所示，将13号染色体的单个长臂的一部分区域为单倍性的细胞(monoploidy)与13号染色体为二倍性的细胞(diploidy)分开的截断值设为外部标准。
[0241]
将包含10000个细胞(gm22948株)和pbs的细胞混悬液2μl添加到包含十二烷基硫酸钠的pcr预混试剂中，制备pcr反应液。pcr反应液中的引物和探针等的浓度如下。
[0242]
·
1x ddpcr multiplex super mix(biorad公司)
[0243]
·
25nm 13号染色体-fam探针
×
23种(总计浓度：575nm)
[0244]
·
1μm 13号染色体引物
×
23种
[0245]
·
50nm 18号染色体-hex探针
×
25种(总计浓度：1250nm)
[0246]
·
1μm 18号染色体引物
×
25种
[0247]
·
蒸馏水(用于添加至刻度)
[0248]
使用qx200 droplet generator(biorad公司)将上述pcr反应液微滴化，进一步在各微滴内使细胞溶解。然后，在各微滴内以通常的条件进行pcr。pcr的循环数设为23。pcr的反应处于指数扩增期。分别使用单独制备的23个上述pcr反应液，分别单独进行pcr。
[0249]
图22表示每次测定的簇的位置偏移。图22的上段和中段表示对人培养细胞gm22948株进行单细胞-微滴pcr的结果。人培养细胞gm22948株中，13号染色体和18号染色体为整倍性，即二倍性(diploidy，实线的箭形符号)。如这些图所示，对相同细胞株使用相同探针多次测定的情况下，不同测定间有时簇的位置偏移。在此，每次测定中各簇偏移的方向相同。
[0250]
图22的下段是表示进行23次测定时的测定值偏差的图表。该图表中，使用fam/hex作为测定值。从该图表可知，即使对相同细胞株使用相同探针测定，测定结果也产生偏差。为了设定合适的截断值，优选在补正该偏差的基础上设定截断值。
[0251]
因此，本试验例中，分别计算出23次测定结果的每一个中阴性簇(散点图中位于左下的簇)的第一荧光波长(fam)的荧光强度的中央值(下面也称为“fam测定值”)和第二荧光波长(hex)的荧光强度的中央值(下面也称为“hex测定值”)。以23个fam测定值的平均值作为阴性簇的fam基准值，并以23个hex测定值的平均值作为阴性簇的hex基准值。进而，关于23次测定结果的每一个，作为用于补正簇的移位(测定结果的偏差)的补正值，计算出“(fam基准值+α)/(fam测定值+α)”和“(hex基准值+α)/(hex测定值+α)”。α是考虑到测定装置的荧
光强度检测限，为了使“fam基准值/fam测定值”和“hex基准值/hex测定值”接近于真正的荧光强度比而任意设定的数值。在此，α设为2000。在所有的测定值上乘以得到的fam的补正值和hex的补正值，补正了测定结果的偏差。
[0252]
图23是表示补正后的测定值偏差的图表。测定编号对应于图22的下段的图表。可以看出，测定结果的偏差(簇的移位)显著降低。使用这些补正后的测定值设定了截断值。
[0253]
图24是说明使用补正后的测定值计算截断值的图。图24的上段是表示95341个补正后的测定值的散点图。以标准主轴回归方程求出对所有测定值的分布进行近似的一次函数方程(y＝ax+b)，结果求出方程y＝0.84511x-404.24。进而，为了整合各测定值的第一荧光波长(fam)的荧光强度和第二荧光波长(hex)的荧光强度，在变换上述一次方程得到的方程b＝y-0.84511x的x(第二荧光波长(hex)的荧光强度)和y(第一荧光波长(fam)的荧光强度)中代入各测定值，求出关于各测定值的b值。图24的中段的图表表示计算出的95341个b值的分布。本次重视特异度，将相当于该图表所示的分布的-3sd(标准偏差)的值作为分开13号染色体为单倍性的细胞与13号染色体为二倍性的细胞的截断值。图24的下段的图表是包含表示截断值的直线(y＝0.84511x-2121.17)的散点图。关于13号染色体为二倍性的细胞的95341个测定值中99.85％的测定值位于该直线的上方。
[0254]
表1中示出了使用求出的截断值判定测定结果的结果。从包含gm22948株(13号染色体为二倍性的细胞)和gm13721株(13号染色体为单倍性的细胞)的细胞群中检测gm13721株(13号染色体的单个长臂的一部分区域为单倍性的细胞)的情况下的灵敏度为84.1％，特异度为99.3％。如上所述，本次设定的截断值是重视特异度的截断值，当然也可以重视灵敏度来设定截断值。
[0255]
[表1]
[0256][0257]
予以说明，截断值的设定方法并不限定于上述的例子。例如，也可使用roc分析计算出灵敏度和特异度变为最大的截断值。
[0258]
《突变的检测》
[0259]
一个方式中，通过检测cnv，从细胞群中检测具有突变的单细胞的存在。一个方式中，突变是体细胞突变或生殖细胞突变。一个方式中，突变是染色体突变或基因突变。
[0260]
《染色体突变的检测》
[0261]
一个方式中，在样品dna包含单细胞内的整套基因组dna的情况下，通过从pcr的扩增子的定量结果检测cnv，从细胞群中检测具有染色体突变的单细胞的存在。一个方式中，染色体突变是染色体总长上的异倍性、染色体的部分异倍性、基因扩增和基因缺失中的至少一种。上面说明的图4～图7是检测染色体总长上的异倍性的一个方式。
[0262]
基因扩增是由染色体的部分重复导致的基因增殖。一个方式中，对重复发生的次
数没有限制。基因缺失是由染色体的部分缺失导致的基因丢失。一个方式中，基因缺失为haplo或null。一个方式中，基因扩增和基因缺失为多态性。
[0263]
如上所述，细胞群只要没有被基因组异倍性的细胞所占据，细胞群中就混入有整倍性的细胞。细胞群包含在目标的基因组上的位置上不具有染色体突变的正常单细胞。分配在上述的各反应分区(反应微滴)中的任一个单细胞在作为异倍性检测对象的区域具有整倍性的染色体。散点图上，具有染色体突变的单细胞的簇从正常单细胞作出的簇的位置移位。上面说明的图5所示的簇40a和图7所示的簇41a就是其移位的例子。簇40a作为一种内部标准发挥作用。
[0264]
此外，即使细胞群被基因组异倍性的细胞所占据，也能够使用上述的外部标准，对其簇的倍数性进行绝对定量。此外，也能够对由整倍性的细胞与异倍性的细胞构成的异质细胞群应用外部标准。
[0265]
对具有与在目标的基因组上的位置不具有染色体突变的单细胞的反应微滴的扩增子量不同的扩增子量的反应微滴进行检测。下面，将其称为异倍性微滴。上面说明的图5所示的簇40b和40c以及图7所示的簇41b和41c就为其检测例。
[0266]
生成异倍性微滴的染色体突变的例子如下。即，可检测的具有染色体突变的单细胞例如包含如下基因组dna，该基因组dna具有以下染色体突变中的一种染色体突变。
[0267]-21号染色体的异倍性；
[0268]-18号染色体的异倍性；
[0269]-13号染色体的异倍性；
[0270]-y染色体的异倍性；
[0271]-x染色体的异倍性；
[0272]-22号染色体长臂22q11.2区域的缺失；
[0273]-5号染色体短臂5q区域的缺失；
[0274]-15号染色体长臂15q11-q13区域的缺失；
[0275]-1号染色体长臂的扩增；
[0276]-17号染色体短臂的缺失；
[0277]-13号染色体长臂的缺失；
[0278]-4号染色体长臂的缺失；
[0279]-5号染色体长臂的缺失；
[0280]-7号染色体长臂的缺失；
[0281]-8号染色体的扩增；
[0282]-11号染色体的缺失；
[0283]-12号染色体的异倍性；
[0284]-20号染色体长臂的缺失；
[0285]-19号染色体长臂的缺失；
[0286]-1号染色体的缺失；
[0287]-18号染色体长臂的缺失；
[0288]-8号染色体短臂的缺失；
[0289]-4号染色体的缺失；
[0290]-8号染色体长臂的扩增；
[0291]-16号染色体长臂的缺失；
[0292]-5号染色体短臂的扩增；
[0293]-3号染色体长臂的扩增；
[0294]-3号染色体短臂的缺失；
[0295]-9号染色体短臂的缺失；
[0296]-mycn基因的基因扩增；
[0297]-her2基因的基因扩增；
[0298]-met基因的基因扩增。
[0299]
一个方式中，缺失不包括双等位基因缺失即所谓的null。一个方式中，其一部分缺失的染色体与该部分正常的染色体的对则是检测对象。
[0300]
一个方式中，进一步生成包含是否检测到异倍性微滴的信息的数据。即，生成包含是否检测到具有染色体突变的单细胞的信息的数据。通过选择产生单细胞的细胞群，可生成对如下所述的特异性诊断领域有益的数据。
[0301]
《对产前诊断的应用》
[0302]
一个方式中，从羊水或母血中的一者获得单细胞。具体而言，从羊水或母血获得大批的细胞群。细胞群包含胎儿细胞。一个方式中，富集细胞群中的胎儿细胞。细胞群包含母体细胞。一个方式中，母体细胞在作为检测对象的基因组dna上的区域为整倍性。一个方式中，胎儿细胞为在母血中循环的胎儿有核红细胞(胎儿有核红血球，fnrbc)，母体细胞为在母血中循环的白细胞。一个方式中，胎儿细胞是浮游在羊水中的胎儿细胞，母体细胞是浮游在羊水中的母体细胞。
[0303]
一个方式中，数据用于13三体性、18三体性、21三体性、特纳综合征、三x综合征、xyy综合征、克兰费尔特综合征、迪格奥尔格综合征、安格曼综合征、普拉德-威利综合征或猫叫综合征的诊断。
[0304]
《对癌诊断的应用》
[0305]
一个方式中，从癌患者的血液获得单细胞。具体而言，从癌患者的血液分离大批的细胞群。细胞群包含由末梢循环肿瘤细胞(ctc)和癌化的血细胞中的至少一者组成的癌细胞。另一个方式中，细胞群是通过对实体癌进行活体组织检查并进一步通过规定的化学和/或物理处理分散得到的细胞。一个方式中，癌化的血细胞是癌化的浆细胞。一个方式中，富集细胞群中的这些癌细胞。细胞群进一步包含不是癌细胞的细胞。一个方式中，不是癌细胞的细胞在作为检测对象的基因组dna上的区域为整倍性。一个方式中，不是癌细胞的细胞为在癌患者的血液中循环的正常白细胞。一个方式中，正常白细胞为正常浆细胞。
[0306]
一个方式中，数据用于骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、特发性嗜酸性粒细胞增多症、慢性嗜酸性粒细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、骨髄增殖性肿瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、脑肿瘤、成神经细胞瘤、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、食道癌、甲状腺癌或头颈癌的诊断。
[0307]
《对多发性骨髓瘤的应用例》
[0308]
如非专利文献8和非专利文献9所记载的那样，多发性骨髓瘤(mm)是造血器官肿瘤
的一种，是浆细胞肿瘤化的疾病。在mm的大多数病例中发现染色体异常。3、5、7、9、11、15和19号染色体中高频率报道三体性。13、14、16和22号染色体中高频率发现单体性。其中，13号染色体的单体性和13号染色体长臂的缺失(13q缺失)是频率最高的染色体突变的例子。这些染色体突变在约50％的新患者中被发现。这些之中，85％在整体或作为检测对象的部分为单倍性，15％为包含13q14缺失的臂内缺失。予以说明，罕见双等位基因的缺失。此外，17号染色体短臂的17p13的缺失被发现约为10％。这些是mm的不良预后因素的一种。作为其它的不良预后因素，可举出1号染色体长臂的1q21的扩增。报道在43％的未治疗的mm患者中被发现。
[0309]
本实施方式中，监控残留在具有这些染色体异常的患者中的肿瘤量。具体而言，在治疗后的期间定期测定具有这些染色体突变的浆细胞(癌化的浆细胞)在体内残留多少程度。
[0310]
本实施方式中，测定由具有上述染色体突变的细胞组成的微小残留病变(minimal residual disease：mrd)。mrd在残留病变之中尤其难以用已知技术测定。能够通过mrd的测定深入评价治疗效果。基于该评价，医生判断治疗药的增量、减量、中止和重新开始。
[0311]
下面给出实际检查方法的一个例子。一个例子中，将从患者采集的骨髄液或血液作为样品。从这些液体去除红细胞。红细胞的去除可使用溶血、离心和水动力学分级芯片。
[0312]
在将规定的探针-引物组和pcr预混试剂与样品混合的同时，将细胞可溶化。作为检测对象的探针-引物组，选择在13q的区域内具有目标的探针-引物组。一个方式中，作为对照的探针-引物组，选择在18号染色体整体的任一位置具有目标的探针-引物组。
[0313]
通过如图5和图7所示的簇的移位检测13号染色体的13q缺失即部分单倍化。簇内的事件具有荧光强度的分布。通过并用所需的统计分析，检测样品的细胞群中以0～100％的范围存在的13号染色体的13q缺失的细胞。一个方式中，被检测到的13号染色体的13q缺失的细胞的存在比为如下比率中的某一个：样品的细胞群中10、1、0.1、0.05、0.04、0.03、0.02和0.01％。如上所述，13号染色体的13q缺失的细胞预想为癌化的浆细胞。另一个方式中，目标被分配在能够检测到13q缺失和13号染色体的单体性中的任一种的区域上。
[0314]
一个方式中，用于测定前，使用针对浆细胞特异性抗原的抗体，来富集包含循环肿瘤细胞在内的浆细胞。由此，以更高灵敏度检测骨髄液或血液中存在的癌化的浆细胞即形成肿瘤的浆细胞。
[0315]
另一个方式中，从簇的移位获得样品中的细胞是否具有17p13的缺失和1q21的扩增中的至少一者的信息。这些信息对预测mm的预后发挥作用。
[0316]
《对骨髓增生异常综合征和其它造血器官肿瘤的应用例》
[0317]
骨髓增生异常综合征(mds)是造血器官肿瘤的一种。至少50％的mds由于产生于造血干细胞的染色体突变(具体而言，染色体总长上的异倍性、染色体的部分异倍性、基因扩增和基因缺失)而发病。作为mds的染色体突变，代表性的是5号染色体长臂(5q)的缺失、7号染色体的单体性和20号染色体长臂(20q)的缺失。通过检测样品中存在的具有染色体突变的细胞，来定期测定mrd。
[0318]
伴有5q缺失的疾病被独立定义为称作5q-综合征的mds的一种。根据欧洲和美国的研究，约10％的mds为5q-综合征。通用名来那度胺对5q-综合征有效。来那度胺的治疗效果的监控通过上述簇的移位来进行。
[0319]
另一个方式中，伴有染色体异倍性尤其是染色体缺失和扩增的其它造血器官肿瘤的检测通过上述簇的移位来进行。
[0320]
《基因突变的检测》
[0321]
一个方式中，通过检测cnv来检测具有基因突变的单细胞的存在。基因突变是碱基替换、碱基插入和碱基缺失中的至少一者。
[0322]
一个方式中，分配在上述的各个反应分区(反应微滴)的单细胞中的某一个为至少在目标的基因组上的位置不具有作为检测对象的基因突变的内部标准。具有与这样的反应微滴的扩增子量不同扩增子量的反应微滴的簇从没有基因突变的簇的位置移位。将这些作为突变性微滴检测。
[0323]
另一个方式中，在其它孔或其它时间预先测定外部标准的荧光强度。比较该荧光强度的信息与各簇的中心的荧光强度的信息。基于该比较，测定各簇的基因突变的拷贝数。即使在细胞群被产生了基因突变的细胞所占据而不能将仅具有野生型基因的细胞用作内部标准的情况下，也能够测定基因突变的拷贝数。
[0324]
一个方式中，基因突变是通过慢病毒载体或其它载体导入到基因组上的不特定区域上的基因突变。具有通过载体产生的基因突变的细胞的例子是car-t细胞(嵌合抗原受体t细胞，chimeric antigen receptor t cell)、tcr-t细胞。本实施方式的检测中，目标也可为通过载体导入的dna。例如，也可检测通过载体导入的dna的拷贝数。
[0325]
《试验例8.人检体的拷贝数的检测》
[0326]
将健康人的末梢血溶血，添加到pcr预混试剂中，制备pcr反应液。使用qx200 droplet generator(biorad公司)将上述pcr反应液微滴化，进一步在各微滴内使细胞溶解。然后，在各微滴内以通常的条件进行pcr。pcr的循环数设为23。pcr的反应处于指数扩增期。
[0327]
本试验例中，在13号染色体上分配了23种具有第一荧光波长的荧光物质(fam)的探针。此外，在18号染色体上分配了25种具有第二荧光波长的荧光物质(hex)的探针。这些探针在一个微滴中相互混合。
[0328]
图25表示对人血液进行单细胞-微滴pcr的结果。位于中央的簇是对应于包含一个细胞的微滴的测定结果。位于其右上的簇是对应于包含两个细胞的微滴的测定结果。这样，由于能够明确区分簇，因此暗示了以人的血液作为检体的情况下也能够检测核酸拷贝数。
[0329]
接着，将健康人的末梢血溶血，进一步使用easysep human cd45depletion kit ii(stemcell technologies公司)分离cd45阳性细胞。将得到的cd45细胞添加到pcr预混试剂中，制备pcr反应液。使用qx200 droplet generator(biorad公司)将上述pcr反应液微滴化，进一步在各微滴内使细胞溶解。然后，在各微滴内以通常的条件进行pcr。pcr的循环数设为23。pcr的反应处于指数扩增期。
[0330]
本试验例中，也在13号染色体上分配了23种具有第一荧光波长的荧光物质(fam)的探针。此外，在18号染色体上分配了25种具有第二荧光波长的荧光物质(hex)的探针。这些探针在一个微滴中相互混合。
[0331]
图26表示对源自人血液的cd45细胞进行单细胞-微滴pcr的结果。位于中央的簇是对应于包含一个细胞的微滴的测定结果。位于其右上的簇是对应于包含两个细胞的微滴的测定结果。这样，由于能够明确区分簇，因此暗示了使用以特定的抗原为目标富集的细胞的
情况下也能够检测核酸拷贝数。
[0332]
接着，将按规定的比例混合了上述cd45阳性细胞与人培养细胞gm13721株细胞的细胞群添加到pcr预混试剂中，制备pcr反应液。使用qx200 droplet generator(biorad公司)将上述pcr反应液微滴化，进一步在各微滴内使细胞溶解。然后，在各微滴内以通常的条件进行pcr。pcr的循环数设为23。pcr的反应处于指数扩增期。cd45阳性细胞中，13号染色体和18号染色体为整倍性，即二倍性(diploidy)。人培养细胞gm13721株中，关于13号染色体的单个长臂的一部分区域为单倍性(monoploidy)，18号染色体为整倍性。
[0333]
本试验例中，也在13号染色体的上述缺失区域上分配了23种具有第一荧光波长的荧光物质(fam)的探针。此外，在18号染色体上分配了25种具有第二荧光波长的荧光物质(hex)的探针。这些探针在一个微滴中相互混合。
[0334]
图27表示同质细胞群的微滴的散点图。图27的上段中，表示对cd45阳性细胞进行单细胞-微滴pcr的结果。图27的下段中，表示对人培养细胞gm13721株进行单细胞-微滴pcr的结果。
[0335]
图28表示异质细胞群的微滴的散点图。图28的上段中，表示对cd45阳性细胞与人培养细胞gm13721株的混合比为75/25的细胞群进行单细胞-微滴pcr的结果。图28的下段中，表示对cd45阳性细胞与人培养细胞gm13721株的混合比为95/5的细胞群进行单细胞-微滴pcr的结果。
[0336]
从这些结果可知，cd45阳性细胞与人培养细胞gm13721株被明确区分。由此暗示了从源自人血液的细胞群也能够检测拷贝数异常的细胞。
[0337]
《试验例9.使用人检体情况下的检测灵敏度的评价》
[0338]
以与上述试验例8同样的步骤，准备了按规定的比例混合了cd45阳性细胞与人培养细胞gm13721株细胞的细胞群。细胞群中的gm13721株细胞的比例设为0％、0.1％或3％。将各细胞群添加到pcr预混试剂中，制备pcr反应液。使用qx200 droplet generator(biorad公司)将上述pcr反应液微滴化，进一步在各微滴内使细胞溶解。然后，在各微滴内以通常的条件进行pcr。pcr的循环数设为23。pcr的反应处于指数扩增期。cd45阳性细胞中，13号染色体和18号染色体为整倍性，即二倍性(diploidy)。人培养细胞gm13721株中，关于13号染色体的单个长臂的一部分区域为单倍性(monoploidy)，18号染色体为整倍性。
[0339]
本试验例中，也在13号染色体的上述缺失区域上分配了23种具有第一荧光波长的荧光物质(fam)的探针。此外，在18号染色体上分配了25种具有第二荧光波长的荧光物质(hex)的探针。这些探针在一个微滴中相互混合。
[0340]
图29表示各细胞群的微滴的散点图。图29的上段中，表示对gm13721株细胞的比例为0％的细胞群进行单细胞-微滴pcr的结果。图29的中段中，表示对gm13721株细胞的比例为0.1％的细胞群进行单细胞-微滴pcr的结果。图29的下段中，表示对gm13721株细胞的比例为3％的细胞群进行单细胞-微滴pcr的结果。
[0341]
本试验例中，将第一荧光波长(fam)的荧光强度为5000以上或第二荧光波长(hex)的荧光强度为9000以上的点(dot)作为评价对象的阳性微滴。此外，使用以与试验例7同样的步骤求出的截断值(y＝0.84806x-1044)，计算出异常微滴(13号染色体被认为是单倍性的微滴)相对于阳性微滴的比例。
[0342]
图30是表示关于各细胞群的异常微滴的检测结果的盒须图。星号表示p《0.05(在
确认到kruskal-wallis检验的结果有显著性后的、分别与对照(0％)比较的steel检验的结果)。从该图可知，gm13721株细胞的比例为3％或0.1％的细胞群的检测结果与gm13721株细胞的比例为0％的细胞群的检测结果显著性不同。因此，可知至少能够检测到0.1％。
[0343]
《试验例10.rna的逆转录产物的拷贝数的检测》
[0344]
使用单细胞内的rna的逆转录产物作为样品dna，检测了b2m基因的mrna的拷贝数和gapdh基因的mrna的拷贝数。
[0345]
本试验例中，对人培养细胞gm22948株进行单细胞-微滴rt-pcr。预混试剂包含针对b2m基因的引物、针对gapdh基因的引物、针对b2m基因的探针(fam标记)、针对gapdh基因的探针(hex标记)、逆转录酶(superscriptiv)等。为了通过pcr扩增基因组dna中的基因的mrna而非该基因，两基因的引物以隔着内含子设置的方式设计。
[0346]
具体而言，将包含10000个细胞(gm22948株)和pbs的细胞混悬液2μl添加到包含十二烷基硫酸钠的pcr预混试剂中，来制备pcr反应液。pcr反应液中的引物或探针等的浓度如下。
[0347]
·
1x superscriptiv(thermo fisher scientific公司)
[0348]
·
1x ddpcr multiplex super mix(biorad公司)
[0349]
·
200nm b2m-fam探针
[0350]
·
400nm b2m引物
[0351]
·
200nm gapdh-hex探针
[0352]
·
400nm gapdh引物
[0353]
·
蒸馏水(用于添加至刻度)
[0354]
使用qx200 droplet generator(biorad公司)将上述pcr反应液微滴化，进一步在各微滴内使细胞溶解，50℃下静置10分钟进行逆转录，95℃下使dna变性10分钟后，以通常的条件进行pcr。pcr的循环数设为23。pcr的反应处于指数扩增期。
[0355]
图31表示对人培养细胞gm22948株进行单细胞-微滴rt-pcr的结果。从该结果可知，即使使用rna的逆转录产物作为样品dna，也能够检测rna的拷贝数。
[0356]
予以说明，预混试剂不包含逆转录酶的情况下，未检测到阳性微滴。即，如上所述，由于以隔着内含子的方式设计了引物，因此基因组dna中的两基因几乎不被扩增。
[0357]
《试验例11.线粒体dna的拷贝数的检测》
[0358]
使用线粒体dna作为样品dna，来检测了nd1基因的拷贝数。
[0359]
本试验例中，对人培养细胞gm22948株进行单细胞-微滴pcr。各微滴中，不仅包含单细胞内的线粒体dna，还包含基因组dna。预混试剂包含针对13号染色体的引物(23种)、针对线粒体dna的nd1基因的引物、针对13号染色体的探针(23种，fam标记)、针对nd1基因的探针(hex标记)等。
[0360]
具体而言，将包含10000个细胞(gm22948株)和pbs的细胞混悬液2μl添加到包含十二烷基硫酸钠的pcr预混试剂中，来制备pcr反应液。pcr反应液中的引物或探针等的浓度如下。
[0361]
·
1x ddpcr multiplex super mix(biorad公司)
[0362]
·
25nm 13号染色体-fam探针
[0363]
·
1μm 13号染色体引物
[0364]
·
500nm nd1-hex探针
[0365]
·
1μm nd1引物
[0366]
·
蒸馏水(用于添加至刻度)
[0367]
使用qx200 droplet generator(biorad公司)将上述pcr反应液微滴化，进一步在各微滴内使细胞溶解，95℃下使dna变性10分钟后，以通常的条件进行pcr。pcr的循环数设为23。pcr的反应处于指数扩增期。
[0368]
图32表示对人培养细胞gm22948株进行单细胞-微滴pcr的结果。位于中央稍右的簇是对应于包含一个细胞(包含约1x个线粒体dna)的微滴的测定结果。位于其右上的簇是对应于包含两个细胞(包含约2x个线粒体dna)的微滴的测定结果。如这样，线粒体dna的拷贝数增大的话，则簇向右偏移。从该结果可知，即使使用线粒体dna作为样品dna，也能够检测线粒体dna中的基因的拷贝数。
[0369]
《作为对照的线粒体dna的利用》
[0370]
为了检测分配有目标的区域的cnv，将对照分配在被认为cnv较小而为整倍性的区域。频发染色体异常的细胞例如癌细胞中，可能找不出合适的染色体作为对照。这样的情况下，可将线粒体dna作为对照。即，选择某一种荧光波长，将具有选择的荧光波长的荧光物质的探针分配在线粒体dna上。
[0371]
例如，样品dna包含单细胞内的整套基因组dna和单细胞内的线粒体dna。pcr反应体系包含分配在基因组dna上的区域上的具有第一荧光波长的荧光物质的探针、和分配在线粒体dna上的具有第二荧光波长的荧光物质的探针。区域包含一个或多个目标。在反应分区内，通过pcr扩增整套基因组dna中包含的目标和线粒体dna中包含的目标。在线粒体dna中包含的目标的扩增到达平台期且基因组dna中包含的目标的扩增变为指数扩增期的循环中，按每个反应分区定量基因组dna和线粒体dna的扩增子。此时，通过从一个反应分区中检测第一荧光波长和第二荧光波长的荧光，能够将基因组dna中包含的目标和线粒体dna中包含的目标扩增了的反应分区、与仅混入的无细胞的核酸扩增了的反应分区相区分。
[0372]
微滴pcr时，以线粒体dna为模板的扩增提前进展。因此，引物或探针提前枯竭。这是因为每个线粒体dna的细胞的拷贝数比每个基因组dna的细胞的拷贝数大。因此，在关于线粒体dna到达平台期的循环数下停止pcr。但在该循环数下，以染色体的基因组dna为模板的扩增处于指数扩增期。
[0373]
例如，图4～图7中，在将第二荧光波长(第二色，2nd color)的探针分配在cnv大的染色体上的情况下，关于第二荧光波长的强度，簇不易收敛。或者，关于第二荧光波长的强度，簇不收敛到与整倍性相当的强度。
[0374]
例如，图4～图7中，在将第二荧光波长分配在线粒体dna上的情况下，在第二荧光波长的pcr中，荧光强度到达平台期。因此，关于第二荧光波长的强度，簇收敛到平台期的强度。
[0375]
本技术要求基于2020年12月25日申请的日本专利申请特愿2020-216149号的优先权。该申请的说明书和附图中记载的内容全部引用到本技术的说明书中。
[0376]
工业实用性
[0377]
本发明的检测方法例如在产前诊断或癌诊断等方面有用。
[0378]
附图标记说明
[0379]
17细胞群
[0380]
19油
[0381]
20微滴
[0382]
21整套基因组dna
[0383]
22a、22b微滴
[0384]
31预混试剂
[0385]
33a、33b微滴
[0386]
35a、35b探针
[0387]
39簇
[0388]
40a、40b、40c簇
[0389]
41a、41b、41c簇
[0390]
44a、44b簇。

技术特征：
1.一种检测方法，其是检测细胞群中的每个单细胞的特定核酸的拷贝数的方法，其包括：在包含源自单细胞内的核酸的样品dna与pcr反应体系的反应分区内通过pcr将所述样品dna中包含的目标扩增的工序；以及在指数扩增期按每个所述反应分区定量所述pcr的扩增子的工序。2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述样品dna是单细胞内的整套基因组dna、单细胞内的rna的逆转录产物或单细胞内的线粒体dna。3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其中，用荧光探针法定量所述扩增子。4.根据权利要求3所述的检测方法，其中，所述pcr反应体系包含按所述样品dna上的每个不同区域分配的分别具有不同荧光波长的荧光物质的多个探针，所述区域包含一个或多个所述目标，在所述定量扩增子的工序中，通过从一个所述反应分区中检测多个波长的荧光，来将所述样品dna中包含的所述目标扩增了的所述反应分区、与仅混入的无细胞的核酸扩增了的反应分区相区分。5.根据权利要求3或4所述的检测方法，其中，所述区域包含多个目标，该多个目标分别分配有具有荧光物质的多个探针，该多个探针所具有的荧光物质的荧光波长彼此相同，在所述定量扩增子的工序中，不管这些目标的不同，通过按每个所述区域一并测定来自所述多个探针的荧光，来定量所述扩增子。6.如权利要求3所述的检测方法，其中，所述样品dna包含所述单细胞内的整套基因组dna和所述单细胞内的线粒体dna，所述pcr反应体系包含分配在基因组dna上的区域上的具有第一荧光波长的荧光物质的探针、与分配在线粒体dna上的具有第二荧光波长的荧光物质的探针，所述区域包含一个或多个所述目标，在所述将样品dna中包含的目标通过pcr扩增的工序中，在所述反应分区内，将所述整套基因组dna中包含的目标和所述线粒体dna中包含的目标通过pcr扩增，在所述定量扩增子的工序中，在所述线粒体dna中包含的目标的扩增到达平台期而所述基因组dna中包含的目标的扩增变为所述指数扩增期的循环中，按每个所述反应分区定量所述基因组dna和所述线粒体dna的扩增子，在所述定量扩增子的工序中，通过从一个所述反应分区中检测所述第一荧光波长和所述第二荧光波长的荧光，来将所述基因组dna中包含的目标和所述线粒体dna中包含的目标扩增了的所述反应分区、与仅混入的无细胞的核酸扩增了的反应分区相区分。7.根据权利要求1～6中任一项所述的检测方法，其进一步包括：通过在包含单细胞、细胞溶解试剂和pcr的预混试剂的分区内溶解所述单细胞，来生成所述反应分区的工序。8.根据权利要求1～6中任一项所述的检测方法，其进一步包括：在包含单细胞的分区内溶解所述单细胞的工序；以及通过整合包含溶解的所述单细胞的分区与包含pcr的预混试剂的分区，来生成所述反应分区的工序。9.根据权利要求1～6中任一项所述的检测方法，其进一步包括：
将细胞核群与pcr的预混试剂进行大批混合的工序；以及通过将所述细胞核群中的各个细胞核与所述预混试剂一起个体化，来生成所述反应分区的工序。10.根据权利要求1～9中任一项所述的检测方法，其中，所述反应分区是含有所述样品dna与所述pcr反应体系的微滴，即反应微滴。11.根据权利要求1～10中任一项所述的检测方法，其中，所述样品dna包含所述单细胞内的整套基因组dna，所述检测方法进一步具有：根据所述扩增子的定量结果，检测具有选自由染色体总长上的异倍性、染色体的部分异倍性、基因扩增和基因缺失组成的组中的至少一种染色体突变的单细胞的存在的工序。12.根据权利要求11所述的检测方法，其中，所述具有染色体突变的单细胞包含如下基因组dna，该基因组dna至少具有以下染色体突变中的一种染色体突变：-21号染色体的异倍性；-18号染色体的异倍性；-13号染色体的异倍性；-y染色体的异倍性；-x染色体的异倍性；-22号染色体长臂22q11.2区域的缺失；-5号染色体短臂5q区域的缺失；-15号染色体长臂15q11-q13区域的缺失；-1号染色体长臂的扩增；-17号染色体短臂的缺失；-13号染色体长臂的缺失；-4号染色体长臂的缺失；-5号染色体长臂的缺失；-7号染色体长臂的缺失；-8号染色体的扩增；-11号染色体的缺失；-12号染色体的异倍性；-20号染色体长臂的缺失；-19号染色体长臂的缺失；-1号染色体的缺失；-18号染色体长臂的缺失；-8号染色体短臂的缺失；-4号染色体的缺失；-8号染色体长臂的扩增；-16号染色体长臂的缺失；-5号染色体短臂的扩增；-3号染色体长臂的扩增；
‑
3号染色体短臂的缺失；-9号染色体短臂的缺失；-mycn基因的基因扩增；-her2基因的基因扩增；-met基因的基因扩增。13.根据权利要求11所述的检测方法，其进一步包括：生成如下数据的工序，该数据包含是否检测到所述具有染色体突变的单细胞的信息，所述细胞群是以包含胎儿细胞的方式从羊水或母血分离出来的细胞群，所述数据用于13三体性、18三体性、21三体性、特纳综合征、三x综合征、xyy综合征、克兰费尔特综合征、迪格奥尔格综合征、安格曼综合征、普拉德-威利综合征、或猫叫综合征的诊断。14.根据权利要求11所述的检测方法，其进一步包括：生成如下数据的工序，该数据包含是否检测到所述具有染色体突变的单细胞的信息，所述细胞群是从患者分离出来的细胞群，所述数据用于骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、特发性嗜酸性粒细胞增多症、慢性嗜酸性粒细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、骨髄增殖性肿瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、脑肿瘤、成神经细胞瘤、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、食道癌、甲状腺癌或头颈癌的诊断。

技术总结
检测细胞群中的每个单细胞的特定核酸的拷贝数。在包含源自单细胞内的核酸的样品DNA与PCR反应体系的反应分区内将样品DNA中包含的目标通过PCR扩增。在指数扩增期按每个反应分区定量PCR的扩增子。分区定量PCR的扩增子。分区定量PCR的扩增子。


技术研发人员：高桥启太 久保知大 土屋纯一
受保护的技术使用者：TL基因体科技株式会社
技术研发日：2021.12.22
技术公布日：2023/9/23