为个体化癌症疫苗选择新抗原的制作方法

为个体化癌症疫苗选择新抗原
1.本技术要求2020年11月6日提交的美国临时申请号63/110,711的权益，所述美国临时申请的全部内容以引用的方式并入本文。
2.序列表的引用
3.本技术含有计算机可读形式的序列表。所述计算机可读形式以引用的方式并入本文。所述ascii拷贝创建于2021年10月28日，命名为146401_091524_sl.txt并且大小为75,598字节。


背景技术：

4.癌症是全球死亡的主要病因，占全部死亡的四分之一。siegel等人，ca:a cancer journal for clinicians，68:7-30(2018)。2018年有1810万新的癌症病例和960万癌症相关死亡。bray等人，ca:a cancer journal for clinicians，68(6):394-424。有许多现有的癌症护理疗法标准，包括消融技术(例如，外科手术和辐射)和化学技术(例如，化疗剂)。遗憾的是，此类疗法往往伴随着严重的风险、毒副作用和极高成本以及不确定的疗效。
5.癌症免疫疗法(例如，癌症疫苗)已作为有前景的癌症治疗方式出现。癌症免疫疗法的目标是利用免疫系统来选择性地消灭癌症但不损害正常组织。传统的癌症疫苗通常靶向肿瘤相关抗原。正常组织中通常会存在肿瘤相关抗原，但在癌症中过度表达。然而，由于这些抗原经常存在于正常组织中，因此免疫耐受会阻止免疫激活。与标准护理治疗相比，针对肿瘤相关抗原的若干临床试验未能证明持久有益的效果。li等人，ann oncol.，28(增刊12):xii11
–
xii17(2017)。
6.新抗原代表了癌症免疫疗法的有吸引力的靶标。新抗原是具有个体特异性的非自体蛋白质。新抗原来源于肿瘤细胞基因组中的随机体细胞突变并且不在正常细胞的表面上表达。id.由于新抗原只在肿瘤细胞上表达并且因此不诱导中枢免疫耐受，靶向癌症新抗原的癌症疫苗具有潜在的优点，包括中枢免疫耐受减弱和安全性提高。id.
7.癌症的突变形势很复杂并且肿瘤突变对于每个个体受试者来说通常是独特的。通过测序检测到的大多数体细胞突变均不会产生有效的新抗原。只有肿瘤dna或肿瘤细胞中的一小部分的突变以足够的准确性转录、翻译并处理成肿瘤特异性新抗原以设计出可能有效的疫苗。此外，并不是所有的新抗原均是免疫原性的。事实上，t细胞自发辨识内源性新抗原的比例为约1％至2％。参见karpanen等人，front immunol.，8:1718(2017)。此外，与生产新抗原疫苗相关联的成本和时间是巨大的。
8.因此，对用于免疫原性组合物的新抗原候选物进行高效而准确地预测、优先排序和选择仍是一项挑战。因此，对表征肿瘤基因组物质以识别新抗原、识别免疫系统靶向哪种新抗原并选择哪种可能适合于有效的免疫原性组合物的新抗原的综合方法的重大需求并未得到满足。


技术实现要素：

9.本公开涉及一种从受试者的肿瘤选择一种或多种肿瘤特异性新抗原以用于受试
者特异性免疫原性组合物的新型方法。本公开还涉及通过施用包含使用用于选择肿瘤特异性新抗原的新型方法选择的肿瘤特异性新抗原的免疫原性组合物来治疗有需要的受试者的癌症的方法，以及配制包含所选择的肿瘤特异性新抗原的免疫原性组合物的方法。所述方法通过从肿瘤获得序列数据来进行。使用所述序列数据获得表示一种或多种肿瘤特异性新抗原的多肽序列的数据。所述序列数据可为核苷酸序列数据、多肽序列数据、外显子组序列数据、转录物组序列数据或全基因组核苷酸序列数据。所述序列数据可为全外显子组序列数据、rna序列数据、全基因组序列数据或其组合。所述序列数据可为全外显子组序列数据、rna序列数据和全基因组序列数据的组合。
10.接着，将所述受试者的多肽序列和mhc分子输入到机器学习平台中。使用所述机器学习平台来识别肿瘤特异性新抗原是否是免疫原性的(例如，所述一种或多种肿瘤特异性新抗原将引发所述受试者的免疫应答)。基于这些预测，所述机器学习平台产生一种或多种肿瘤特异性新抗原将引发受试者的免疫应答的数值概率评分。
11.所述受试者的所述mch分子可为mhc i类分子和/或mhc ii类分子。编码一种或多种肿瘤特异性新抗原的所述多肽序列可能来自短多肽。短多肽通常呈递在mch i类分子上。替代地，编码一种或多种肿瘤特异性新抗原的所述多肽序列可能来自长多肽。
12.所述受试者的所述免疫应答可包括将一种或多种肿瘤特异性新抗原呈递到肿瘤细胞表面、通过肿瘤细胞上的一种或多种mhc分子呈递一种或多种肿瘤特异性新抗原、或能够通过抗原呈递细胞将一种或多种肿瘤特异性新抗原呈递到t细胞。
13.所述受试者的所述免疫应答可为cd4+介导应答或cd8+介导应答。通常，所述免疫应答是cd4+介导应答或cd8+介导应答。
14.相对于较低的数值概率评分，肿瘤特异性新抗原具有较高的数值概率评分指示肿瘤特异性新抗原将在受试者体内引发更大的免疫应答。
15.还将一种或多种肿瘤特异性新抗原在肿瘤中的rna表达(优选地mrna表达)量化以进一步识别充分地表达以在受试者体内引发免疫应答的一种或多种肿瘤特异性新抗原。接着，可任选地表征肿瘤克隆以确保肿瘤特异性新抗原代表了整个肿瘤的足够的分数(例如，基因多样性)。在实施方案中，合适的肿瘤特异性新抗原可代表约1％的肿瘤。在其他情况下，合适的肿瘤特异性新抗原可代表约5％的肿瘤。
16.使用这些参数来计算肿瘤特异性新抗原评分以得到一种或多种肿瘤特异性新抗原评分。使用所述肿瘤特异性新抗原评分来选择适合于配制受试者特异性免疫原性组合物的肿瘤特异性新抗原。相对于较低的肿瘤特异性新抗原评分来说，较高的肿瘤特异性新抗原评分指示新抗原具有更强的免疫原性，并且因此更有可能诱导强烈的免疫应答并引发稳定的治疗效果(即，更有可能适合于免疫原性组合物)。在实施方案中，选择至少约10种肿瘤特异性新抗原来配制受试者特异性免疫原性组合物。在实施方案中，选择至少约20种肿瘤特异性新抗原来配制受试者特异性免疫原性组合物。
17.本文公开的方法还可包括测量一种或多种肿瘤特异性新抗原诱导正常组织的自身免疫应答的能力。相对于不会诱导自身免疫应答的肿瘤特异性新抗原来说，诱导正常组织的自身免疫应答的肿瘤特异性新抗原将具有更低的肿瘤特异性新抗原评分。将不会选择诱导自身免疫应答的肿瘤特异性新抗原来用于免疫原性组合物。
18.配制的免疫原性组合物可包含至少约10种肿瘤特异性新抗原或至少约20种肿瘤
特异性新抗原。肿瘤特异性新抗原可由短多肽或长多肽编码。免疫原性组合物可包含核苷酸序列、多肽序列、rna、dna、细胞、质粒、载体、树突状细胞或合成长肽。免疫原性组合物还可包含佐剂。
19.本公开还涉及治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括施用个体化免疫原性组合物，所述个体化免疫原性组合物包含使用本文描述的方法选择的一种或多种肿瘤特异性新抗原。本文公开的方法可适于治疗任何数目种癌症。肿瘤可来自黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、结肠癌、睾丸癌、头颈癌、胰腺癌、脑癌、b细胞淋巴瘤、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、t细胞淋巴细胞白血病、膀胱癌或肺癌。优选地，所述癌症是黑色素瘤、乳腺癌、肺癌和膀胱癌。
附图说明
20.图1是绘示用于选择一种或多种肿瘤特异性新抗原的方法的示意图。
21.图2是绘示对新一代测序数据(输入和输出)进行生物信息分析的示意性流程图。
22.图3是用于克隆性反卷积的模块的流程图。
具体实施方式
23.本公开涉及一种以高准确性为强效的个体化癌症免疫原性组合物(例如，受试者特异性免疫原性组合物)选择肿瘤特异性新抗原的新型方法。本公开还涉及通过施用包含使用用于选择肿瘤特异性新抗原的新型方法选择的肿瘤特异性新抗原的免疫原性组合物来治疗有需要的受试者的癌症的方法，以及配制包含所选择的肿瘤特异性新抗原的免疫原性组合物的方法。发明人已开发出如下一种方法：1)对为一个或多个新抗原的多肽序列编码的dna和/或rna进行测序；2)确定肿瘤特异性新抗原是否是免疫原性的(例如，新抗原是否可引发受试者的免疫应答)；3)确定肿瘤是否表达了足以引发免疫应答的量的新抗原；以及4)任选地确定新抗原是否代表足够分数的肿瘤。当前可用方法依赖于mhc结合亲和力预测来对新抗原进行排名和选择或依赖于新抗原将被mhc分子呈递的概率。这些方法无法预测免疫原性。此外，当前方法不能够以高准确性评估所有这些因素。
24.所述方法开始于对从肿瘤活检获得的肿瘤特异性新抗原的多肽序列进行测序。接着，使用预测机器学习平台来识别受试者的mhc分子辨识了哪些新抗原。所述平台可确定肿瘤特异性新抗原是否是免疫原性的(例如，肿瘤特异性新抗原将引发受试者的免疫应答)。基于这些预测，机器学习平台产生肿瘤特异性新抗原将引发免疫应答的数值概率评分。还将肿瘤特异性新抗原的rna表达(优选地，mrna表达)量化以集中于大量表达以至于它们可能会引发免疫应答的肿瘤特异性新抗原。接着，任选地表征肿瘤克隆以确保肿瘤特异性新抗原代表了整个肿瘤的足够的基因多样性。使用这些参数来产生肿瘤特异性新抗原的肿瘤特异性新抗原评分。使用肿瘤特异性新抗原评分来选择适合于配制个体化疫苗的肿瘤特异性新抗原。相对于较低的肿瘤特异性新抗原评分来说，较高的肿瘤特异性新抗原评分指示新抗原具有更强的免疫原性，并且因此更有可能诱导强烈的免疫应答并引发稳定的治疗效果。
25.本公开中引用的所有公布和专利以引用的方式整体并入本文。在以引用的方式并入的材料与本说明书矛盾或不一致的程度上，本说明书将取代任何此类材料。本文中对任
何参考文献的引用并不是承认此类参考文献是本公开的现有技术。当表达值的范围时，它包括使用在所述范围内的任何特定值的实施方案。此外，对范围内的所陈述值的引用包括该范围内的每个值。所有范围均包括其端点并且是可组合的。当通过使用先行词“约”将值表达为近似值时，应当理解，特定值形成另一个实施方案。对特定数值的引用至少包括该特定值，除非上下文另有明确规定。“或”的使用将意指“和/或”，除非其使用的特定上下文另有规定。
26.贯穿说明书和权利要求，使用与描述的各方面相关的各种术语。将赋予此类术语在本领域中的一般含义，除非另有指示。其他特殊定义的术语应被解释为与本文中所提供的定义一致。本领域技术人员通常能很好地理解并且普遍使用常规方法来采用本文描述或引用的技术和程序，例如像sambrook等人的molecular cloning:a laboratory manual第4版(2012)cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，ny中所描述的广泛利用的分子克隆方法。在适当情况下，涉及使用可商购的套件和试剂的程序通常根据生产商定义的方案和条件来施行，除非另有指明。
27.如本文所用，单数形式“一(a/an)”和“所述”包括复数形式，除非上下文另有明确指示。术语“包括”、“诸如”等意图传达包含而非限制，除非另有特别指示。
28.除非另有指示，否则在一系列元素或范围前面的术语“至少”、“小于”和“约”或类似术语被理解为指代在该系列或范围内的每个元素。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验就确定本文描述的发明的特定实施方案的很多等效形式。所附权利要求意图囊括此类等效形式。
29.术语“癌症”指代受试者体内的细胞群体的特征在于不受控的增殖、永生、转移潜能、快速的生长和增殖速率和/或某些形态特征的生理状况。癌症经常可呈肿瘤或肿块的形式，但可单独存在于受试者体内，或者可作为独立细胞(诸如白血病或淋巴瘤细胞)在血流中循环。术语癌症包括所有类型的癌症和转移瘤，包括恶性血液肿瘤、实体肿瘤、肉瘤、癌以及其他实体和非实体肿瘤。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更特定的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌、激素受体阳性乳腺癌)、骨肉瘤、黑色素瘤、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜(例如，浆液)或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)以及各种类型的头颈癌。三阴性乳腺癌指代雌激素受体(er)、孕酮受体(pr)和her2/neu的基因表达为阴性的乳腺癌。激素受体阳性乳腺癌指代er或pr中的至少一者为阳性并且her2/neu(her2)为阴性的乳腺癌。
30.如本文所用的术语“新抗原”指代例如经由肿瘤细胞的突变或对肿瘤细胞具有特异性的翻译后修饰而具有至少一处使其不同于对应的亲代抗原的改变的抗原。突变可包括移码、插入缺失、错义或无义取代、剪接位点改变、基因组重排或基因融合或产生新抗原的任何基因组表达改变。突变可包括剪接突变。对肿瘤细胞具有特异性的翻译后修饰可包括异常磷酸化。对肿瘤细胞具有特异性的翻译后修饰还可包括蛋白酶体产生的剪接抗原。参见lipe等人，science，354(6310):354:358(2016)。一般来说，点突变占约95％的肿瘤突变并且插入缺失和移码突变占剩余部分。参见snyder等人，n engl j med.，371:2189
–
2199(2014)。
31.如本文所用，术语“肿瘤特异性新抗原”是存在于受试者的肿瘤细胞或组织中但不存在于受试者的正常细胞或组织中的新抗原。
32.如本文所用的术语“新一代测序”或“ngs”指代与传统方法(例如，sanger测序)相比具有增大的通量的测序技术，它能够一次产生成千上万个序列读段。
33.如本文所用的术语“神经网络”指代用于分类或回归的机器学习模型，所述机器学习模型由以下项组成：先是多层线性变换，之后是逐元素非线性变换，它们通常经由随机梯度下降和反向传播来训练。
34.如本文所用的术语“受试者”指代任何动物，诸如任何哺乳动物，包括但不限于人类、非人灵长类动物、啮齿类动物等。在一些实施方案中，所述哺乳动物是小鼠。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人类。
35.如本文所用的术语“肿瘤细胞”指代作为癌细胞或来源于癌细胞的任何细胞。术语“肿瘤细胞”还可指代表现出类似癌症的性质(例如，不受控的繁殖、抵抗抗生长信号、能够转移以及丧失经历程序性细胞死亡的能力)的细胞。
36.本文提供了对方法和所述方法的实践指南的附加描述。
[0037]ⅰ.用于选择肿瘤特异性新抗原的方法
[0038]
本文公开了从受试者的肿瘤选择适合于受试者特异性免疫原性组合物的肿瘤特异性新抗原的方法。合适的肿瘤特异性新抗原是可能呈递在肿瘤的细胞表面上、可能是免疫原性的、经预测以足以引发受试者的免疫应答的量表达并且任选地代表整个肿瘤的足够的多样性的肿瘤特异性新抗原。
[0039]
从受试者的肿瘤选择一种或多种肿瘤特异性新抗原的第一步骤包括从所述肿瘤获得序列数据。使用所述序列数据获得表示一种或多种肿瘤特异性新抗原的多肽序列的数据。通常，表示一种或多种肿瘤特异性新抗原的多肽序列的序列数据是通过对肿瘤样本进行序列分析来确定。
[0040]
所述序列数据可为外显子组序列数据、转录物组序列数据、全基因组核苷酸序列数据、核苷酸序列数据或多肽序列数据。所述序列数据可为全外显子组序列数据、rna序列数据、全基因组序列数据或其组合。所述序列数据可为全外显子组序列数据、rna序列数据和全基因组序列数据的组合。
[0041]
本文描述的方法中可使用获得序列数据的各种方法。测序方法在本领域中是众所周知的并且包括但不限于基于pcr的方法，包括实时pc、全外显子组测序、深度测序、高通量测序或其组合。在一些实施方案中，根据例如sambrook等人的molecular cloning:alaboratory manual第4版(2012)cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，ny中所描述的方法执行前述技术和程序。还参见austell等人的current protocols in molecular biology，编著者greene publishing and wiley-interscience new york(1992)(定期更新)。
[0042]
测序方法还可包括但不限于高通量测序、单细胞rna测序、rna测序、焦磷酸测序、合成法测序、单分子测序、纳米孔测序、半导体测序、合成法测序、连接法测序、杂交法测序、rna-sew(illumina)、数字基因表达(helicos)、新一代测序、单分子合成法测序(smss)(helicos)、大规模并行测序、克隆单分子阵列(solexa)、鸟枪法测序、maxam-hilbery或sanger测序、全基因组测序、全外显子组测序、引物步移、使用pacbio、solid、ion torrent
或纳米孔平台的测序和本领域已知的任何其他测序方法。本文采用的获得序列数据的测序方法优选地是高通量测序。高通量测序技术能够并行地对多个核酸分子进行测序，从而使得能够一次对数百万个核酸分子进行测序。参见churko等人的circ.res.112(12):1613-1623(2013)。
[0043]
在一些情况下，可执行全外显子组测序、rna测序、全基因组测序或其组合。在一些情况下，可执行全外显子组测序、rna测序、全基因组测序的组合。
[0044]
在一些情况下，高通量测序可为新一代测序。存在使用不同测序技术(例如，使用可从illumina(圣地亚哥，加利福尼亚州)获得的hiseq或miseq仪器)的许多不同的新一代平台。可采用这些平台中的任一者来对本文公开的基因材料进行测序。新一代测序是基于对大量独立读段进行测序，每个读段表示核酸的10至1000个碱基之间的任意个碱基。合成法测序是新一代测序中使用的常见技术。一般来说，测序涉及将引物与模板杂交以形成模板/引物双链体，从而在存在带可检测标记的核苷酸的情况下在准许聚合酶以模板依赖性方式将核苷酸添加到引物的条件下使所述双链体与聚合酶接触。接着使用来自可检测标记的信号识别掺入的碱基，并依序重复所述步骤以确定模板中的核苷酸的线性次序。示例性可检测标记包括放射性标记、荧光标记、酶标记等。已知许多技术用于检测序列，诸如利用循环端测序的illumina nextseq平台。
[0045]
一旦获得表示一种或多种肿瘤特异性新抗原的多肽序列的序列数据，就将所述序列数据连同受试者的mhc分子一起输入到机器学习平台中。所述机器学习平台产生数值概率评分，所述数值概率评分预测一种或多种肿瘤特异性新抗原是否是免疫原性的(例如，将引发受试者的免疫应答)。
[0046]
mhc分子将肽转运并呈递在细胞表面上。所述mhc分子被分类为mhc i类分子和ii类分子。mhc i类存在于身体的几乎所有细胞的表面上，包括大多数肿瘤细胞。mhc i类的蛋白质装载有通常来自于内源性蛋白质或细胞内存在的病原体的抗原，然后呈递到细胞毒性t淋巴细胞(即，cd8+)。mhc i类分子可包括hla-a、hla-b或hla-c。mhc ii类分子仅存在于树突状细胞、b淋巴细胞、巨噬细胞及其他抗原呈递细胞上。所述mhc ii类分子主要将从外部抗原来源(即细胞之外)处理的肽呈递到辅助性t(th)细胞(即，cd4+)。mhc ii类分子可包括hla-dpa1、hla-dpb1、hla-dqa1、hla-dqb1、hla-dra及hla-drb1。在一些时候，mhc ii类分子还可在癌细胞上表达。
[0047]
可将mhc i类分子和/或mhc ii类分子输入到机器学习平台中。通常，将mhc i类分子或mhc ii类分子输入到机器学习平台中。在一些实施方案中，将mhc i类分子输入到机器学习平台中。在其他实施方案中，将mhc ii类分子输入到机器学习平台中。
[0048]
mhc i类分子结合到短肽。mhc i类分子可适应通常为约8个氨基酸至约10个氨基酸长度的肽。在实施方案中，编码一种或多种肿瘤特异性新抗原的序列数据是长度为约8个氨基酸至约10个氨基酸的短肽。mhc ii类分子结合到长度更长的肽。mhc ii类可适应通常为约13个氨基酸的长度至约25个氨基酸的长度的肽。在实施方案中，编码一种或多种肿瘤特异性新抗原的序列数据是长度为约13至25个氨基酸的长肽。
[0049]
编码一种或多种肿瘤特异性新抗原的序列数据可为约5个氨基酸的长度、约6个氨基酸的长度、约7个氨基酸的长度、约8个氨基酸的长度、约9个氨基酸的长度、约10个氨基酸的长度、约11个氨基酸的长度、约12个氨基酸的长度、约13个氨基酸的长度、约14个氨基酸
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[0056]
根据所采用的机器学习平台，可应用附加的过滤器来对肿瘤特异性新抗原候选物进行优先排序，包括：消除假定(riken)蛋白质；使用抗原处理算法来消除不可能通过组成性蛋白酶体或免疫蛋白酶体以蛋白水解方式产生的表位以及在新抗原具有比对应的野生型序列更高的预测结合亲和力的情况下对所述新抗原进行优先排序。
[0057]
所述数值概率评分可为0与1之间的数字。在实施方案中，所述数值概率评分可为数字0、0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90或1。相对于较低的数值概率评分来说，具有较高的数值概率评分的肿瘤特异性新抗原指示肿瘤特异性新抗原将在受试者体内引发更大的免疫应答，并且因此有可能是适合于免疫原性组合物的候选物。举例来说，数值概率评分为1的肿瘤特异性新抗原可能会在受试者体内引发比数值概率评分为0.05的肿瘤特异性新抗原更大的免疫应答。类似地，数值概率评分为0.5的肿瘤特异性新抗原可能会在受试者体内引发比数值概率评分为0.1的肿瘤特异性新抗原更大的免疫应答。
[0058]
相对于较低的数值概率评分来说，优选较高的数值概率评分。优选地，肿瘤特异性新抗原具有至少0.8、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.9、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1的数值概率评分指示可能会在受试者体内引发免疫应答。
[0059]
虽然较高的数值概率评分是优选的，但较低的数值概率评分仍可能指示肿瘤特异性新抗原能够引发足够的免疫应答，使得所述肿瘤特异性新抗原有可能是合适的候选物。
[0060]
在各情况下，本文描述的机器学习平台还可预测一种或多种肿瘤特异性新抗原将由肿瘤细胞上的mhc分子呈递的可能性。机器学习平台可预测一种或多种肿瘤特异性新抗
原将由mhc i类分子或mhc ii类分子呈递的可能性。
[0061]
用于选择一种或多种肿瘤特异性新抗原的方法还可包括以下步骤：经由计算机模拟测量一种或多种肿瘤特异性新抗原结合到受试者体内mhc分子的亲和力。肿瘤特异性新抗原与mhc分子的结合亲和力小于约1000nm指示一种或多种肿瘤特异性新抗原可适合于免疫原性组合物。肿瘤特异性新抗原与mhc分子的结合亲和力小于约500nm、小于约400nm、小于约300nm、小于约200nm、小于约100nm、小于约50nm可指示一种或多种肿瘤特异性新抗原可适合于免疫原性组合物。一种或多种肿瘤特异性新抗原结合到受试者体内mhc分子的亲和力可预测肿瘤特异性新抗原的免疫原性。替代地，中位数亲和力可为预测肿瘤特异性新抗原的免疫原性的有效方式。可使用表位预测算法(诸如netmhcpan、ann、smm和smmpmbec)计算中位数亲和力。
[0062]
一种或多种肿瘤特异性新抗原的rna表达也被量化。将一种或多种肿瘤特异性新抗原的rna表达量化以识别将引发受试者的免疫应答的一种或多种新抗原。存在用于测量rna表达的各种方法。已知的可测量rna表达的技术包括rna-seq和原位杂交(例如，fish)、northern印迹法、dna微阵列、叠瓦式阵列和定量聚合酶链反应(qpcr)。可使用本领域已知的其他技术来将rna表达量化。rna可为信使rna(mrna)、短干扰rna(sirna)、微rna(mirna)、环状rna(circrna)、转移rna(trna)、核糖体rna(rrna)、小核仁rna(snrna)、piwi相互作用rna(pirna)、长非编码rna(长ncrna)、次基因组rna(sgrna)、来自整合病毒或非整合病毒的rna或任何其他rna。优选地，测量mrna表达。
[0063]
本文公开的方法可任选地包括对肿瘤克隆进行测序。对肿瘤克隆进行测序以识别代表足够分数的肿瘤的一种或多种肿瘤特异性新抗原。可例如使用本文公开的测序技术并且使用本领域技术人员已知的其他已知测序技术来对肿瘤克隆进行测序。
[0064]
在实施方案中，肿瘤特异性新抗原在整个肿瘤中具有至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％或至少约30％的肿瘤克隆分数指示肿瘤特异性新抗原代表了足够分数的肿瘤。肿瘤的足够分数指示肿瘤特异性新抗原提供了整个肿瘤的足够的基因多样性。
[0065]
所述方法还可包括测量一种或多种肿瘤特异性新抗原诱导正常组织的自身免疫应答的能力。可预期的是，具有与正常抗原类似的序列的肿瘤特异性新抗原可诱导正常组织的自身免疫应答。举例来说，至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％类似于正常抗原的肿瘤特异性新抗原可诱导自身免疫应答。经预测会诱导自身免疫应答的肿瘤特异性新抗原不会被优先考虑用于免疫原性组合物。通常不会选择经预测会诱导自身免疫应答的肿瘤特异性新抗原来用于免疫原性组合物。所述方法还可包括测量一种或多种肿瘤特异性新抗原激起免疫耐受的能力。经预测会激起免疫耐受的肿瘤特异性新抗原不会被优先考虑用于免疫原性组合物。经预测会激起免疫耐受的肿瘤特异性新抗原不会被优先考虑用于免疫原性组合物。
[0066]
基于通过获得一种或多种肿瘤特异性新抗原将引发受试者的免疫应答的数值概率评分和一种或多种肿瘤特异性新抗原的rna表达水平来产生的数据而计算肿瘤特异性评分。除了用于计算肿瘤特异性评分的以上计算之外，可任选地包括整个肿瘤的肿瘤克隆分数。具有高的数值概率评分(例如，肿瘤特异性新抗原是免疫原性的)并具有高水平的rna表
达的肿瘤特异性新抗原将被优先考虑。相比之下，经预测会诱导自身免疫应答的肿瘤特异性抗原相对于不会诱导免疫应答的肿瘤特异性新抗原来说将具有更低的肿瘤特异性新抗原评分并且不会被选择来包含在免疫原性组合物中。具有高的数值概率评分(例如，肿瘤特异性新抗原是免疫原性的)、具有高的rna表达水平并提供整个肿瘤的足够的肿瘤克隆分数的肿瘤特异性新抗原将被优先考虑。
[0067]
与具有高的数值概率评分、高的rna表达水平并任选地提供整个肿瘤的足够的肿瘤克隆分数的肿瘤特异性新抗原相比，具有高的数值概率评分(例如，肿瘤特异性新抗原是免疫原性的)并任选地提供整个肿瘤的足够的肿瘤克隆分数但具有低的rna表达水平的肿瘤特异性新抗原将具有更低的肿瘤特异性评分。在此实例中，具有较低的肿瘤特异性评分的肿瘤特异性新抗原不会优先于具有较高的肿瘤特异性评分的肿瘤特异性新抗原。与具有高的数值概率评分、高的rna表达水平并提供整个肿瘤的足够的肿瘤克隆分数的肿瘤特异性新抗原相比，具有高的数值概率评分(例如，肿瘤特异性新抗原是免疫原性的)并具有足以引发免疫应答的rna表达水平但不提供整个肿瘤的足够的肿瘤克隆分数的肿瘤特异性新抗原将具有更低的肿瘤特异性评分。与具有高的数值概率评分、高的rna表达水平并提供整个肿瘤的足够的肿瘤分数的肿瘤特异性新抗原相比，具有足以引发免疫应答的rna表达水平、提供整个肿瘤的足够的肿瘤分数但具有低的数值概率评分的肿瘤特异性新抗原将具有更低的肿瘤特异性评分。
[0068]
最后，基于肿瘤特异性评分而选择一种或多种肿瘤特异性新抗原来用于配制受试者特异性免疫原性组合物。在实施方案中，选择至少约1、至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约50种或更多种肿瘤特异性新抗原来用于免疫原性组合物。通常，选择至少约10种肿瘤特异性新抗原。在其他情况下，选择至少约20种肿瘤特异性新抗原。
[0069]ⅱ.治疗方法
[0070]
本公开还涉及治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括施用个体化免疫原性组合物，所述个体化免疫原性组合物包含使用本文描述的方法选择的一种或多种肿瘤特异性新抗原。
[0071]
癌症可为任何实体肿瘤或任何血液肿瘤。本文公开的方法优选地适合于实体肿瘤。肿瘤可为原发性肿瘤(例如，位于肿瘤首次出现的最初部位处的肿瘤)。实体肿瘤可包括但不限于乳腺癌肿瘤、卵巢癌肿瘤、前列腺癌肿瘤、肺癌肿瘤、肾癌肿瘤、胃癌肿瘤、睾丸癌肿瘤、头颈癌肿瘤、胰腺癌肿瘤、脑癌肿瘤和黑色素瘤肿瘤。血液肿瘤可包括但不限于来自淋巴瘤(例如，b细胞淋巴瘤)和白血病(例如，急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病和t细胞淋巴细胞白血病)的肿瘤。
[0072]
本文公开的方法可用于任何合适的癌性肿瘤，包括恶性血液肿瘤、实体肿瘤、肉瘤、癌以及其他实体和非实体肿瘤。说明性的合适的癌症包括例如急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓系白血病(aml)、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、脑肿瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、支气管肿瘤、原发灶不明癌、心脏肿瘤、宫颈癌、脊索瘤、结肠癌、结直肠癌症、颅咽管瘤、导管癌、胚胎瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、嗅神经
母细胞瘤、纤维组织细胞瘤、尤因肉瘤、眼癌、生殖细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、胶质瘤、头颈癌、肝细胞癌、组织细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌、唇癌和口腔癌、肝癌、小叶原位癌、肺癌、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、隐匿原发的转移性鳞状颈癌、牵涉nut基因的中线道癌、口癌、多发性内分泌瘤病综合征、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非小细胞肺癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头瘤病、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽喉癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌样肿瘤、唾液腺癌、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、骨髓瘤、胃癌、t细胞淋巴瘤、畸胎瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌、外阴癌和肾母细胞瘤。优选地，癌症是黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、结肠癌、睾丸癌、头颈癌、胰腺癌、脑癌、b细胞淋巴瘤、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、t细胞淋巴细胞白血病、膀胱癌或肺癌。特别关注黑色素瘤。还特别关注乳腺癌、肺癌和膀胱癌。
[0073]
免疫原性组合物刺激受试者的免疫系统，尤其是特异性cd8+t细胞或cd4+t细胞的应答。由cd8+细胞和辅助性t cd4+细胞产生的干扰素γ调节pd-l1的表达。当受到t细胞攻击时，肿瘤细胞中的pd-l1表达上调。因此，肿瘤疫苗可诱导特异性t细胞的产生并且同时上调pd-l1的表达，这可限制疫原性组合物的疗效。此外，虽然激活了免疫系统，但t细胞表面报道基因ctla-4的表达对应地增加，其与抗原呈递细胞上的配体b7
–
1/b7
–
2结合并且发挥免疫抑制效果。因此，在一些情况下，还可对受试者施用抗免疫抑制或免疫刺激物，诸如检查点抑制剂。检查点抑制剂可包括但不限于抗ctl4-a抗体、抗pd-1抗体和抗pd-l1抗体。这些检查点抑制剂结合到t细胞的免疫检查点蛋白以消除肿瘤细胞对t细胞功能的抑制。抗体对ctla-4或pd-l1的阻断可增强患者体内对癌细胞的免疫应答。已经显示，ctla-4在遵循疫苗接种方案时是有效的。
[0074]
可对已被诊断出癌症、已患有癌症、患有复发性癌症(即，复发症)或有患癌风险的受试者施用包含一种或多种肿瘤特异性新抗原的免疫原性组合物。可向对其他形式的癌症治疗(例如，化疗、免疫疗法或辐射)具有抗性的受试者施用包含一种或多种肿瘤特异性新抗原的免疫原性组合物。可在其他标准的癌症护理疗法(例如，化疗、免疫疗法或辐射)之前对受试者施用包含一种或多种肿瘤特异性新抗原的免疫原性组合物。可与其他标准的癌症护理疗法(例如，化疗、免疫疗法或辐射)同时地、在其他标准的癌症护理疗法之后或与其他标准的癌症护理疗法组合地对受试者施用包含一种或多种肿瘤特异性新抗原的免疫原性组合物。
[0075]
受试者可为人类、狗、猫、马或需要肿瘤特异性应答的任何动物。
[0076]
以足以引发对肿瘤特异性新抗原的免疫应答并消灭或至少部分地遏制症状和/或并发症的量对受试者施用免疫原性组合物。在实施方案中，免疫原性组合物可提供长效免疫应答。可通过对受试者施用加强剂量的免疫原性组合物来建立长效免疫应答。可通过对受试者施用加强剂量来延长对免疫原性组合物的免疫应答。在实施方案中，可施用至少一个、至少两个、至少三个或更多个加强剂量以减轻癌症。第一加强剂量可将免疫应答增加至
少50％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％或至少1000％。第二加强剂量可将免疫应答增加至少50％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％或至少1000％。第三加强剂量可将免疫应答增加至少50％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％或至少1000％。
[0077]
足以引发免疫应答的量被定义为“治疗有效剂量”。有效用于这种用途的量将取决于例如组合物、施用方式、正在治疗的疾病的阶段和严重性、患者的体重和一般健康状况以及处方医生的判断。应牢记，通常可在严重疾病状态下(即威胁生命或可能威胁生命的情况，尤其是当癌症已转移时)采用免疫原性组合物。在此类情况下，鉴于外来物质最少化以及新抗原的相对无毒性质，治疗医生可能并且可能感到需要施用明显超量的这些免疫原性组合物。
[0078]
可对受试者单独施用或与其他治疗剂组合地施用包含一种或多种肿瘤特异性新抗原的免疫原性组合物。治疗剂可为例如化疗剂、辐射或免疫疗法。可针对特定癌症施用任何合适的治疗处理。示例性化疗剂包括但不限于：阿地白介素、六甲蜜胺、氨磷汀、天冬酰胺酶、博来霉素、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、克拉屈滨、西沙必利、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪(dtic)、更生霉素、多西他赛、阿霉素、屈大麻酚、α促红细胞生成素、依托泊苷、非格司亭、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、格拉司琼、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、干扰素α、伊立替康、兰索拉唑、左旋咪唑、亚叶酸、甲地孕酮、美司钠、甲氨蝶呤、胃复安、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、奥美拉唑、昂丹司琼、紫杉醇毛果芸香碱、丙氯拉嗪、利妥昔单抗、它莫西芬、他克唑、盐酸拓扑替康、曲妥珠单抗、长春花碱、长春新碱和酒石酸长春瑞滨。可对受试者施用小分子或靶向疗法(例如，激酶抑制剂)。还可对受试者施用抗ctla抗体或抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体。抗体对ctla-4或pd-l1的阻断可增强患者体内对癌细胞的免疫应答。
[0079]ⅲ.免疫原性组合物
[0080]
本发明还涉及包含使用本文描述的方法选择的一种或多种肿瘤特异性抗原的个体化(即，受试者特异性)免疫原性组合物(例如，癌症疫苗)。此类免疫原性组合物可根据本领域中的标准程序来配制。所述免疫原性组合物能够提高特异性免疫应答。
[0081]
免疫原性组合物可被配制成使得肿瘤特异性新抗原的选择和数目根据受试者的特定癌症进行调整。举例来说，肿瘤特异性新抗原的选择可取决于特定癌症类型、癌症状态、受试者的免疫状态和受试者的mhc类型。
[0082]
免疫原性组合物可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、37、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50种或更多种肿瘤特异性新抗原。免疫原性组合物可含有约10至20种肿瘤特异性新抗原、约10至30种肿瘤特异性新抗原，约10至40种肿瘤特异性新抗原、约10至50种肿瘤特异性新抗原、约10至60种肿瘤特异性新抗原、约10至70种肿瘤特异性新抗原、约10至80种肿瘤特异性新抗原、约10至90种肿瘤特异性新抗原或约10至100种肿瘤特异性新抗原。优选地，免疫原性组合物包含至少约10种肿瘤特异性新抗原。还优选的是包含至少约20种肿瘤特异性新抗原的免疫原性组合物。
[0083]
免疫原性组合物还可包含天然抗原或合成抗原。所述天然抗原或合成抗原可增加免疫应答。示例性天然抗原或合成抗原包括但不限于泛dr表位(padre)和破伤风毒素抗原。
[0084]
免疫原性组合物可呈任何形式，例如合成长肽、rna、dna、细胞、树突状细胞、核苷酸序列、多肽序列、质粒或载体。
[0085]
肿瘤特异性新抗原还可包含在基于病毒载体的疫苗平台中，诸如牛痘、鸡痘、自我复制α病毒(alphavim)、马拉巴病毒(marabavirus)、腺病毒(参见例如tatsis等人，molecular therapy，10:616-629(2004))或慢病毒，包括但不限于第二代、第三代或混合的第二代/第三代慢病毒和被设计成靶向特定细胞类型或受体的任一代重组慢病毒(参见例如hu等人，immunol rev.，239(1):45-61(2011)；sakma等人，biochem j.，443(3):603-18(2012))。根据对上述基于病毒载体的疫苗平台的封装能力，这种方法可递送编码一种或多种肿瘤特异性新抗原肽的一种或多种核苷酸序列。序列可由非突变序列侧接，可被接头分开或可在前面具有靶向亚细胞区室的一个或多个序列(参见例如gros等人，nat med.，22(4):433-8(2016)；stronen等人，science.，352(6291):1337-1341(2016)；lu等人，clin cancer res.，20(13):3401-3410(2014))。在被引入宿主之后，被感染的细胞表达一种或多种肿瘤特异性新抗原，并且由此引发宿主对一种或多种肿瘤特异性新抗原的免疫(例如，cd8+或cd4+)应答。例如美国专利号4,722,848中描述了可用于免疫方案的牛痘载体和方法。另一种载体是bcg(卡介苗)。stover等人(nature 351:456-460(1991))中描述了bcg载体。还可使用可用于治疗性施用或免疫接种新抗原的各种各样的其他疫苗载体，根据本文的描述，这对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
[0086]
根据特定受试者的个人需求，免疫原性组合物可含有个体化组分。
[0087]
本文描述的免疫原性组合物还可包含佐剂。佐剂是混合到免疫原性组合物中会增加或者另外增强和/或加强对肿瘤特异性新抗原的免疫应答，但当它单独施用时不会产生对肿瘤特异性新抗原的免疫应答的任何物质。佐剂优选地产生对新抗原的免疫应答，而不会产生过敏反应或其他不良反应。本文中预期，可在施用免疫原性组合物之前、与之一起、同时地或之后施用免疫原性组合物。
[0088]
佐剂可通过几种机制来增强免疫应答，包括例如淋巴细胞募集、刺激b和/或t细胞以及刺激巨噬细胞。当本发明的免疫原性组合物包含佐剂或与一种或多种佐剂一起施用时，可使用的佐剂包括但不限于矿物盐佐剂或矿物盐凝胶佐剂、粒状佐剂、微粒型佐剂、黏膜佐剂和免疫刺激佐剂。佐剂的实例包括但不限于铝盐(alum)(诸如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝)、3脱-o-酰化单磷酰脂质a(mpl)(参见gb 2220211)、mf59(novartis)、as03(glaxo smithkline)、as04(glaxo smithkline)、聚山梨酯80(tween 80；icl americas，inc.)、咪唑并吡啶化合物(参见作为国际公布号wo2007/109812公布的国际申请号pct/us2007/064857)、咪唑并喹喔啉化合物(参见作为国际公布号wo2007/109813公布的国际申请号pct/us2007/064858)以及皂苷，诸如qs21(参见kensil等人，vaccine design:the subunit and adjuvant approach(编著者powell&newman，plenum press，ny，1995)；美国专利号5,057,540)。在一些实施方案中，佐剂是弗氏佐剂(完全或不完全)。其他佐剂是任选地与免疫刺激剂(诸如单磷酰脂质a)组合的水包油乳液(诸如角鲨烯或花生油)(参见stoute等人，n.engl.j.med.336，86-91(1997))。
[0089]
还报道了cpg免疫刺激性寡核苷酸在疫苗环境中增强
[0090]
佐剂的效果。还可使用其他tlr结合分子(诸如rna结合tlr 7、tlr 8和/或tlr 9)。
[0091]
有用佐剂的其他实例包括但不限于化学修饰的cpg(例如，cpr、idera)、聚(i:c)
(例如polyi:ci2u)、聚iclc、非cpg细菌dna或rna以及免疫活性小分子和抗体，诸如环磷酰胺、舒尼米布(sunitmib)、贝伐珠单抗、西乐葆(赛来昔布)、ncx-4016、西地那非、他达拉非、伐地那非、索拉非尼、xl-999、cp-547632、帕唑帕尼(pazopamb)、zd2171、azd2171、伊匹单抗、替西木单抗和sc58175，它们可在治疗上和/或作为佐剂起作用。在实施方案中，聚iclc是优选的佐剂。
[0092]
免疫原性组合物可单独或连同药学上可接受的载体一起包含本文描述的一种或多种肿瘤特异性新抗原。可使用一种或多种肿瘤特异性新抗原的悬浮液或分散液，尤其是等渗水相悬浮液、分散液或两亲溶剂(ampgipgilic solvent)。免疫原性组合物可为无菌的和/或可包含赋形剂(例如，防腐剂、稳定剂、润湿剂和/或乳化剂、增溶剂、调节渗透压的盐和/或缓冲液)，并且以原本已知的方式制备，例如通过常规的分散和悬浮工艺来制备。在某些实施方案中，此类分散液或悬浮液可包含黏度调节剂。悬浮液或分散液保持在大约2℃至8℃的温度，或优先地为了长时间储存可冷冻，然后在使用前不久解冻。为了注射，疫苗或免疫原性制剂可配制在水相溶液中，优选地配制在生理上相容的缓冲液中，诸如汉克斯溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液。所述溶液可含有配方剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
[0093]
在某些实施方案中，本文描述的组合物另外包括防腐剂，例如汞衍生物硫柳汞。在特定实施方案中，本文描述的药用组合物包含0.001％至0.01％的硫柳汞。在其他实施方案中，本文描述的药用组合物不包含防腐剂。
[0094]
赋形剂可独立于佐剂存在。赋形剂的功能可为例如增大免疫原性组合物的分子量、提高活性或免疫原性、赋予稳定性、提高生物活性或延长血清半衰期。赋形剂还可用于辅助将一种或多种肿瘤特异性新抗原呈递到t细胞(例如，cd4+或cd8+t细胞)。赋形剂可为载体蛋白质，诸如但不限于钥孔虫戚血蓝蛋白、血清蛋白诸如运铁蛋白、牛血清白蛋白、人类血清白蛋白、甲状腺球蛋白或卵清蛋白、免疫球蛋白或激素，诸如胰岛素或棕榈酸。对于人类的免疫来说，载体通常是人类可接受并且安全的生理上可接受的载体。替代地，所述载体可为葡聚糖，例如琼脂糖。
[0095]
细胞毒性t细胞辨识结合到mhc分子的肽形式的抗原，而非完整的外源抗原本身。mhc分子本身位于抗原呈递细胞的细胞表面处。因此，如果存在肽抗原、mhc分子和抗原呈递细胞(apc)的三聚体复合体，则可激活细胞毒性t细胞。如果不仅使用一种或多种肿瘤特异性抗原激活细胞毒性t细胞，而且如果添加具有相应mhc分子的附加apc，则可增强免疫应答。因此，在一些实施方案中，免疫原性组合物另外含有至少一种apc。
[0096]
免疫原性组合物可包含可接受的载体(例如，水相载体)。可使用各种水相载体，例如水、缓冲水、0.9％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。可通过常规的众所周知的灭菌技术对这些组合物进行灭菌，或可进行无菌过滤。所得的水相溶液可原样封装使用或冻干，冻干制剂在施用之前与无菌溶液组合。组合物可视需要含有在药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，诸如ph调节和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨醇酐月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。
[0097]
还可经由脂质体施用新抗原，所述脂质体使新抗原靶向特定细胞组织，诸如淋巴组织。脂质体还可用于延长半衰期。脂质体包括乳液、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散液、片状层等。待递送的新抗原作为脂质体的一部分单独地掺入或与结合到(例如)淋巴样细胞当中普遍存在的受体的分子(诸如结合到cd45抗原的单克隆抗体)一起，或者与其他
治疗或免疫原性组合物一起掺入在这些制剂中。因此，可将填充有所需新抗原的脂质体引导到淋巴样细胞的位点，其中脂质体接着递送所选择的免疫原性组合物。脂质体可由标准的囊泡形成脂质形成，所述囊泡形成脂质通常包括中性和带负电的磷脂以及固醇，诸如胆固醇。通常通过考虑例如脂质体大小、血流中脂质体的酸不稳定性和稳定性来指导脂质的选择。各种方法均可用于制备脂质体，如在例如szoka等人an.rev.biophys.bioeng.9；467(1980)，美国专利号4,235,871、4,501,728、4,501,728、4,837,028和5,019,369中所描述。
[0098]
为了靶向免疫细胞，待掺入到脂质体中的配体可包括例如对所需免疫系统细胞的细胞表面决定簇具有特异性的抗体或其片段。可以一定剂量静脉地、局部地、局部性地等施用脂质体悬浮液，所述剂量尤其根据施用方式、所递送的肽和正在治疗的疾病的阶段而变化。
[0099]
作为靶向免疫细胞的替代方法，可将免疫原性组合物的组分(诸如抗原(即，肿瘤特异性新抗原)、配体或佐剂(例如，tlr))掺入到聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)微球中。聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)微球可作为内体递送装置包埋免疫原性组合物的组分。
[0100]
为了达到治疗或免疫目的，还可对患者施用编码本文描述的肿瘤特异性新抗原的核酸。可便利地使用许多方法来将核酸递送给患者。举例来说，核酸可作为“裸dna”被直接递送。例如wolff等人science247:1465-1468(1990)以及美国专利号5,580,859和5,589,466中描述了这种方法。还可使用例如美国专利号5,204,253中所描述的弹道递送施用核酸。可施用仅由dna构成的颗粒。替代地，dna可附着到颗粒，诸如金颗粒。用于递送核酸序列的方法可包括病毒载体、mrna载体和dna载体，同时进行或不进行电穿孔。还可将核酸与阳离子化合物(诸如阳离子脂质)复合来进行递送。
[0101]
可通过(包括但不限于)口腔、皮内、瘤内、肌内、腹膜内、静脉、局部、皮下、经皮、鼻内和吸入途径，并经由划痕(例如使用分叉针划破皮肤表层)来将本文提供的免疫原性组合物施用于受试者。可在肿瘤部位处施用免疫原性组合物以诱导对肿瘤的局部免疫应答。
[0102]
一种或多种肿瘤特异性新抗原的剂量可取决于组合物的类型并且取决于受试者的年龄、体重、体表面积、个体条件、个体药物代谢动力学数据和施用模式。
[0103]
本文还公开了一种生产免疫原性组合物的方法，所述免疫原性组合物包含通过执行本文公开的方法的步骤选择的一种或多种肿瘤特异性新抗原。可使用本领域已知的方法生产如本文所描述的免疫原性组合物。举例来说，本文公开的一种产生肿瘤特异性新抗原或载体(例如，包含编码一种或多种肿瘤特异性新抗原的至少一种序列的载体)的方法可包括在适合于表达新抗原或载体的条件下培养宿主细胞，其中宿主细胞包含编码新抗原或载体的至少一种多核苷酸；以及将新抗原或载体纯化。标准的纯化方法包括层析技术、电泳、免疫、沉淀、透析、过滤、浓缩和聚焦层析技术。
[0104]
宿主细胞可包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞、ns0细胞、酵母或hek293细胞。可用一种或多种多核苷酸来转化宿主细胞，所述一种或多种多核苷酸包含编码本文公开的一种或多种肿瘤特异性新抗原或载体的至少一种核酸序列。在某些实施方案中，分离的多核苷酸可为cdna。
[0105]ⅳ.样本
[0106]
本文公开的方法包括选择来源于肿瘤的一种或多种肿瘤特异性新抗原。选择一种或多种肿瘤特异性新抗原的方法包括获得来源于肿瘤的序列数据。这种序列数据可来源于
受试者的肿瘤样本。所述肿瘤样本可从肿瘤活检获得。
[0107]
所述肿瘤样本可从人类受试者或非人类受试者获得。优选地，所述肿瘤样本从人类获得。所述肿瘤样本可从包含癌性肿瘤的各种生物源获得。肿瘤可来自肿瘤部位或来自血液中的循环肿瘤细胞。示例性样本可包括但不限于体液、组织活检、血液样本、血清血浆、粪便、皮肤样本等。样本源可为实体组织样本，诸如肿瘤组织活检。组织活检样本可为来自例如肺、前列腺、结肠、皮肤、乳腺组织或淋巴结的活检。样本还可为例如骨髓样本，包括骨髓抽出物和骨髓活检。样本还可为液体活检，例如循环肿瘤细胞、无细胞循环肿瘤dna或外泌体。血液样本可为全血、部分纯化的血液、或全血或部分纯化的血液的一部分，诸如外周血单核细胞(pbmc)。
[0108]
本文描述的肿瘤样本可直接从受试者获得、来源于受试者、或来源于从受试者获得的样本，诸如来源于生物流体或组织样本的培养细胞。肿瘤活检可为新鲜样本。新鲜样本可在从受试者移除之后用任何已知的固定剂(例如，福尔马林、岑克尔固定剂或b-5固定剂)固定。肿瘤活检还可为存档样本，诸如直接从受试者获得的细胞或来源于从受试者获得的细胞的细胞的冷冻样本、冷藏样本。优选地，从受试者获得的肿瘤样本是新鲜肿瘤活检。
[0109]
可通过任何手段(包括但不限于肿瘤活检、针抽吸、刮削、手术切除、手术切开、静脉穿刺或本领域已知的其他手段)从受试者获得肿瘤样本。肿瘤活检是一种获得肿瘤的优选方法。可从任何癌症部位(例如，原发性肿瘤或继发性肿瘤)获得肿瘤活检。来自原发性肿瘤的肿瘤活检通常是优选的。本领域技术人员将认识到用于获得肿瘤样本的其他合适的技术。
[0110]
可在单次程序中从受试者获得肿瘤样本。可在一段时间内反复地从受试者获得肿瘤样本。举例来说，可一天一次、一周一次、每月、每半年或每年获得肿瘤样本。在一段时间内获得许多样本可用于识别并选择新的肿瘤特异性新抗原。可从同一处肿瘤或不同的肿瘤获得肿瘤样本。
[0111]
肿瘤样本可从原发性肿瘤、一个或多个转移瘤和/或个别肿瘤生长部位(例如，来自不同骨骼部分(诸如髋、骨或椎骨)的骨髓)获得。肿瘤样本可从同一部位或不同的部位获得。
[0112]
等效形式
[0113]
本领域技术人员将容易显而易见的是，本文描述的发明方法的其他合适的修改和改动是明显的，并且可在不脱离本公开或实施方案的范围的情况下使用合适的等效形式做出所述修改和改动。尽管现在已详细描述了某些组合物和方法，但通过参考以下实施例将更清楚地理解所述组合物和方法，介绍以下实施例仅是为了说明而不意图加以限制。
[0114]
实施例
[0115]
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，考虑到本文提供的一般描述，可实践各种其他实施方案。
[0116]
实施例1.新抗原肽选择
[0117]
这个实施例描述用于选择根据从患者的肿瘤组织和正常组织产生的新一代测序数据识别的新抗原免疫原性肽的各个程序步骤。
[0118]
1.1.样本制备以及wes、wgs和rna-seq数据的产生
[0119]
在知情同意的情况下从研究参与者收集肿瘤活检或手术外植体，并以冰镇的组织
培养基的形式运输到临床试验clia实验室。在该处，对样本进行登记并分配特定的唯一样本标识。接下来，对组织称重、分份并放置在五(5)倍于其体积的rnalater稳定溶液(thermofisher，catno am7020)中。接着，使样本在4℃下过夜，从rnalater溶液移除，并放置在具有1ml stemcell croystor10(catno 07952)的冷冻小瓶中，并且在-80℃下转移到coolcell(corning，catno 432000)中。
[0120]
将在随附研究方案下从参与者收集在acd管中的外周血运输到试样处理与研究细胞库，在该处根据sop使用ficoll进行pbmc处理。可在肿瘤活检之前进行pbmc处理以允许将pbmc和肿瘤活检组织同时运送给测序提供商。
[0121]
表1.样本
[0122][0123][0124]
注意：
[0125]1通过组织消化和组织破坏产生单细胞悬浮液
[0126]2用3mm的打孔工具进行两遍处理
[0127]3用14号针总共进行10遍处理
[0128]
所有试样(肿瘤活检和pbmc)由clia实验室在干冰上连夜送往测序提供商。
[0129]
使用allprep dna/rna/mirna通用试剂盒(qiagen)从同一组织或细胞试样中同时分离出dna、rna和mirna。
[0130]
使用合适的方法(例如，qubit，bioanalyzer)评定dna/rna样本的质量和数量并记录以下量度：
[0131]
dna：浓度(ng/μl)、总量(ng)、体积(μl)
[0132]
rna：浓度(ng/μl)、总量(ng)、体积(μl)、纯度(rin)
[0133]
表2.来自工程试运样本的基因组dna和总rna产率
[0134][0135]
将含有超过200ng基因组dna的dna样本等分，其中200ng用于wes，并且将剩余的dna运送给另一个测序提供商以进行wgs。
[0136]
执行ngs。下表3中示出了文库制备和测序策略的概述。
[0137]
表3.在pnv-21生产中执行的新一代测序的细节
[0138][0139]
使用来自成对的肿瘤/正常样本的wes数据来识别患者及其肿瘤的种系和体细胞变体。
[0140]
在商业测序供应商处使用agilent sureselect all exon v6诱饵试剂盒执行wes，并且产生文库并在illumina novaseq6000仪器上进行测序。使用100bp pe策略、75x平均覆盖率和3800万读段的目标对来自pbmc样本的dna进行wes。使用100bp pe策略、125x平均覆盖率和6300万读段的目标对来自组织样本的dna进行wes。
[0141]
使用rna测序数据来识别对具有足够高表达的rna转录物进行编码的新抗原，并且独立地确认来自wes的体细胞变体。
[0142]
使用illumina stranded mrna测序方法，使用50bp pe策略和一亿读段的目标来对rna进行测序。
[0143]
使用illumina truseq stranded mrna方法创建测序文库，所述方法优先通过利用聚腺苷酸化尾选择信使rna。
[0144]
使用wgs数据来执行cnv调用并识别肿瘤样本的亚克隆。
[0145]
在商业clia验证实验室中根据如上文所详述制备的肿瘤和正常基因组dna来执行wgs。在illumina s4流动池(fc)上对来自同一个体的两个汇集的文库进行测序，其中读段长度为2x101。传递q30》80％且错误率《3％的在fc上产生的数据以进行解复用。
[0146]
从测序供应商传送fastq格式的ngs数据以供进一步的生物信息分析。
[0147]
在经官方认可的临床免疫遗传学实验室处利用分子测定执行hla分型。
[0148]
1.2.ngs数据的生物信息分析
[0149]
使用illumina dragen bio-it平台(v3.8.5)对ngs读段与hg19参考基因组进行映射和比对。图2中描述了关于输入和输出文件的细节，以及用于映射和比对的处理步骤的自动执行。
[0150]
所有ngs分析是使用hg19人类参考基因组组装(初始ucsc参考组装，基于初始grch37版本，md5检验和a244d8a32473650b25c6e8e1654387d6，从sentieon参考包下载)执行。从ucsc下载已知的ensembl基因与hg19染色体坐标(gtf文件)之间的映射。此文件用于量化rna基因表达。dragen bio-it平台用于产生进行映射、比对和变体调用所需的一系列哈希表文件。将产生的哈希表文件和hg19 ensemble gtf文件上传到s3数据存储贮体。
[0151]
dna序列映射和比对步骤采用ngs fastq文件作为输入，并独立于正常样本和肿瘤样本(如果提供的话)而将读段与所提供的参考基因组哈希表进行比对。正常映射/比对包括产生种系变体调用，其在模块a3中用于体细胞cnv调用(称为b等位基因文件)。
[0152]
表.4ngs fastq输入
[0153][0154][0155]
除了映射/比对算法之外，此模块利用用于质量控制的dragen的报告功能(包括映射统计和修整报告)。
[0156]
对于肿瘤样本映射/比对，表5中概括了命令行。
[0157]
表.5用于肿瘤样本映射/比对的命令行
[0158][0159][0160]
使用启用了量化和基因融合检测的dragen bio-it平台(v3.8.5)rna模块对rna seq fastq文件与ucsc hg19人类参考基因组进行比对。gencode hg19/grcg37.p13 gtf文
件用于将基因和基因转录物(ensembl基因和转录物id)映射到基因组区域。
[0161]
表6.用于rna序列比对和rna量化的命令行
[0162]
[0163][0164]
单独使用与ucsc hg19人类参考基因组比对的正常(pbmc)wes和wgs.bam文件以产生种系变体调用的列表(.vcf文件)，从而指示研究参与者的基因组与参考基因组的差异。检测到的变体是单碱基或多碱基突变、插入和缺失。不处理结构变体。下文描述了用dragen bio-it平台(v3.8.5)导出种系变体调用并产生未过滤和已过滤的种系.vcf文件的详细命令行自变量。
[0165]
使用所得的种系.vcf文件来确保候选疫苗肽不表示研究参与者的种系序列(自体肽)，并且还作为输入b等位基因频率文件用于cnv调用。
[0166]
使用dragen bio-it平台从wes和wgs比对的.bam文件识别作为肿瘤样本与正常研究参与者样本之间的差异而出现的体细胞变体。在第一步骤中，对肿瘤.bam文件与正常.bam文件进行比较以识别肿瘤特异性(体细胞)dna突变，所述突变以.vcf文件输出，一个未经过滤，并且一个经过过滤以得到高置信度变体。在第二步骤中且仅针对wgs，产生cnv调用并以.vcf文件输出。此步骤的输入是肿瘤.bam文件和正常.bam文件以及用作b等位基因频率输入的硬过滤的种系变体调用文件。
[0167]
表8中描述了用于执行体细胞变体和cnv调用的附加细节和命令行界面选项。
[0168]
表7.dna体细胞变体调用的自动化工作流程
[0169]
[0170][0171]
将体细胞.vcf文件(硬过滤)用于下游的疫苗肽选择模块。
[0172]
dragen中的cnv调用需要b等位基因.vcf文件。cnv调用之前是种系调用和来自模块a1的正常/肿瘤.bam文件。
[0173]
表8.模块a4 dna体细胞cnv调用
[0174]
[0175][0176]
为了分析重叠群间的映射/比对效果，模块a-qc1采用以.bam文件作为输入的mosdepth分析程序。对于wes，另外提供将分析限制于限定的基因组区域的.bed文件。从agilent网站下载agilent sure select all exon v6捕获诱饵集的hg19 bed文件并存储在s3中以由处理管道自动下载。
[0177]
表9.模块a-qc1比对覆盖率分析
[0178]
[0179][0180]
mosdepth汇总文件是由制表符分隔的文本文件，其指示.bam文件中存在的所有重叠群(染色体列)的平均覆盖率(平均值列)。如果提供了.bed文件，则后缀“_region”标示.bed限制重叠群的度量。示出了mosdepth汇总文件的缩略列表(例如，表10)。
[0181]
表10.mosdepth汇总文件
[0182]
染色体长度碱基平均值最小最大chrm1657138578123.28791chrm_region000.0000chr12492506219741068963.9104709chr1_region6066056716175291118.0604709chr22431993736805419432.8003488chr2_region4449345484022026108.7901162chr31980224305291984672.6702197chr3_region3462072381197919110.1102197
[0183]
为了进行分析和质量控制，使用肿瘤和正常mosdepth汇总文件来产生规范报告。
[0184]
下表11至表15中示出了来自映射比对的示例结果。
[0185]
表11.每个重叠群的wes正常(pbmc)样本和总比对覆盖率
[0186][0187]
表12.每个重叠群的wes肿瘤样本和总比对覆盖率
[0188]
[0189][0190]
表13.每个重叠群的wgs正常(pbmc)样本和总比对覆盖率
[0191]
[0192][0193]
表14.每个重叠群的wgs肿瘤样本和总比对覆盖率
[0194][0195]
表15.每个重叠群的rna seq肿瘤样本和总比对覆盖率
[0196]
[0197][0198]
表16至表19中示出了变体调用过程的结果。
[0199]
表16.wes正常(pmc)种系变体的数目
[0200]
区域量度aaaaabbbbbcccccdddddeeeeefffffggggg全部
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
插入缺失数30,97325,93432,14850,83329,68147,55651,418 记录数209,535180,749219,602307,090204,141294,761307,494 snp数178,629154,862187,522256,349174,505247,278256,162cds
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
插入缺失数1,1051,0611,1041,1201,0551,1101,066 记录数33,75333,42233,59533,76433,36433,73333,402 snp数32,65332,36632,49432,64632,31032,62832,342
[0201]
表17.wes肿瘤/正常体细胞变体的数目
[0202][0203]
[0204]
表18.wgs正常种系变体的数目
[0205]
区域量度dddddfffffggggg全部
ꢀꢀꢀꢀꢀ
插入缺失数931,451934,986939,511 记录数4,693,5174,705,6124,727,192 snp数3,767,0563,775,6093,792,797cds
ꢀꢀꢀꢀꢀ
插入缺失数1,1901,1491,119 记录数34,54634,43134,649 snp数33,35933,28733,536
[0206]
表19.wgs肿瘤/正常体细胞变体的数目
[0207]
区域量度dddddfffffggggg
ꢀꢀꢀꢀꢀ
全部
ꢀꢀꢀꢀꢀ
插入缺失数3,1867,884928 记录数29,927182,2055,103 snp数26,741174,3214,175cds
ꢀꢀꢀꢀꢀ
插入缺失数3162 记录数3661,57054 snp数3631,55452
[0208]
工作流程的后续模块处理由模块a从肿瘤-正常wgs样本调用的肿瘤体细胞变体和拷贝数变体，并且将每个体细胞变体的归属概率输出到一组n个肿瘤特异性亚克隆中，其中n是模块输出的参数。所述模块还输出每个突变的细胞患病率的估计。此模块还执行变体到亚克隆的大量反卷积。在模块a中从dragen产生wgs文件并且在此模块中加以处理，以从体细胞变体的细胞患病率估计亚克隆性。图3示出了用于克隆性反卷积的模块的工作流程图。
[0209]
1.3.根据ngs数据进行肽选择
[0210]
通过个体化肽预测管道(p4vax)内的肽预测和机器学习算法选择待生产的疫苗肽。本文简要描述了这种软件解决方案的所有组件。
[0211]
肽预测工作流程引入了映射/比对、rna基因表达、种系变体、体细胞变体和cnv调用程序输出文件以及hla单体分型的结果以：
[0212]
1.识别对表达的rna具有编码效果的变体
[0213]
2.跨越非同义变体选择推定的mhc i类和ii类结合肽
[0214]
3.确认rna测序读段中变体的存在
[0215]
4.估计mhc i类和ii类处理、呈递和免疫原性
[0216]
5.通过用种系变体调用校正hg19参考来确认突变仅存在于肿瘤dna中而不存在于种系(正常)dna中
[0217]
6.过滤可能有毒性的肽或者内肽酶或外肽酶代谢产物
[0218]
7.根据mhc i类和ii类处理、呈递和免疫原性对肽进行排名
[0219]
8.将肽靶向的肿瘤细胞的预期百分比最大化
[0220]
具体来说，针对肽选择，使用基于wes和wes的体细胞变体调用的结果。
[0221]
使用肿瘤亚克隆反卷积算法，工作流程处理由模块a从肿瘤-正常wgs样本调用的肿瘤体细胞变体和拷贝数变体并且另外将每个体细胞变体的归属概率输出到一组n个肿瘤特异性突变/细胞患病率组群中。步骤8中使用来自此步骤的结果。
[0222]
肽预测管道的输出是按mhc i类和ii类结合/呈递评分、免疫原性以及肿瘤细胞患病率组群的组合排名的潜在疫苗肽的详尽列表。
[0223]
从潜在肽合成候选物的这个排名列表中，选择列表中排名最高的一组多达80个的肽。在手动验证了体细胞变体的存在之后，将由验证的体细胞变体产生的肽序列传达给肽生产商以进行合成。
[0224]
对工作示例样本ddddd、fffff和ggggg执行肽选择(表20至表22)并且进一步选择20个肽作为池配制的候选物。
[0225]
表20.工程试运样本ddddd的肽选择
[0226]
[0227]
[0228][0229]
表21.工程试运样本fffff的肽选择
[0230]
[0231][0232]
表22.工程试运样本ggggg的肽选择
[0233]
[0234]
[0235][0236]
1.4.肽生产
[0237]
疫苗肽生产和池配制由肽生产商执行肽合成、质量控制、肽和肽池的溶解和混合来进行。
[0238]
通过固相肽合成制备肽，使用rp-hplc柱纯化，并分析质量(身份、纯度、肽含量、乙酸盐/tfa含量、残留有机溶剂)。
[0239]
表23至表25中示出了肽合成的结果。
[0240]
表23.样本ddddd_2020的肽合成工程试运批次
[0241]
[0242]
[0243]
[0244][0245]
表24.样本fffff的肽合成工程试运批次
[0246]
[0247]
[0248]
[0249][0250]
表25.样本ggggg的肽合成工程试运批次
[0251]
[0252]
[0253]
[0254][0255]
接着将如通过质量控制标准(外观、身份、肽含量、肽纯度、乙酸盐含量、tfa含量、残留有机溶剂)所确定成功生产的肽引入到池优化算法中。
[0256]
简要来说，此算法将所选择的肽分配到4个池，从而优化分配，使得每个池含有具有高mhc i类和ii类评分的肽。在最初排除含有多于两个半胱氨酸的序列以避免池配制期间的多聚化之后，优化算法识别出大约14种长疫苗肽与6种短肽的最佳组合，以组合成单独的疫苗肽池。如果最初的肽预测或生产产生少于14种长疫苗肽，则长肽与短肽的比率可能会改变，以适应四个池各自具有五种肽的目标。类似地，如果疫苗肽池由少于三(3)种长肽组成(外推到cd4参与的机会低)，则选择池肽中的一个肽作为padre。
[0257]
接着将提议的池组合物传达给肽生产商，并执行疫苗肽池配制：
[0258]
选择并汇集成组的肽。制备多达四(4)个池，每个池中具有不超过(nmt)五(5)种肽。将每种肽溶解于5.538％(v/v)dmso中，然后溶解于0.9％nacl溶液中，每种肽的浓度为0.4158mg/ml。对于该组池，接受明显溶解的肽。在成功汇集组内的所有肽之后，通过0.2μm尼龙过滤器过滤所述池。将肽装在无菌管中运送，并标有池名、批号、组分、生产数据、数量/浓度和储存条件。
[0259]
1.5.肽疫苗的配制
[0260]
为了配制个体化疫苗，使用以下程序将肽池与作为佐剂的聚iclc混合：
[0261]
从冰箱中对每个池分别取出一个肽小瓶。对肽池中的每一者执行以下步骤。
[0262]
在室温下将肽池解冻20至30分钟。肽溶液含有dmso并且可需要轻微加热(手动加热)和/或搅动才能完全解冻。预期物质是透明的无色溶液。如果形成沉淀物，则可使用旋涡混合器混合溶液以解决沉淀物。
[0263]
解冻时，为步骤4-9准备并标记注射器(参见表26)。(a)每个池两(2)个混合注射器，标记为“m1-2[a-d]”(标示池)：(i)注射器1:10ml(或适当大小)和(ii)注射器2:1ml(或适当大小)；以及(b)每个池一(1)个施用注射器，标记为“施用注射器[a-d]”(标示池)。
[0264]
表26.用于制备和施用的注射器的列表。
[0265][0266][0267]
所需的附加材料(每个肽池)
[0268]
1(一)个保护型母头对母头鲁尔适配器
[0269]
1(一)个3”抽吸针，用于将肽池转移到混合注射器m1中
[0270]
1(一)个无菌低蛋白结合注射器过滤器，无热原。孔大小0.22μm。(例如，pall dmso-safe aerodisc注射器过滤器，#4433，或millex-gv 0.22μm pvdf，33mm，γ灭菌.millipore，#slgvm33rs)
[0271]
3(三)个适当规格的无菌皮下注射针
[0272]
1(一)个用于im注射的spiros封闭系统药物转移装置(cstd)[icu医疗，#sh2000sc-10]
[0273]
无菌过滤每个小瓶的内容物：使用连接到0.22μm无菌过滤器的具有卢尔锁的10ml注射器(混合注射器1，m1)，在组件上滑动3”抽吸针，并从小瓶取出2ml肽池。
[0274]
制备聚iclc溶液。使用1ml注射器(混合注射器2，m2)和适当大小的针，在无菌条件下抽吸0.760ml的聚iclc。聚iclc是白色乳白色溶液。下游步骤可产生可接受的乳白色产物。
[0275]
从混合注射器1(m1)和混合注射器2(m2)移除针，并从混合注射器1(m1)移除无菌过滤器。
[0276]
经由母头对母头鲁尔锁保护连接器将聚iclc混合注射器2(m2)与肽池混合注射器1(m1)连接
[0277]
将聚iclc混合注射器2(m2)转移到混合注射器1(m1)中并在两个注射器之间充分混合。产物中可形成气泡。轻敲注射器可有助于收集气泡。所得的混合物是个体化疫苗。

技术特征：
1.一种从受试者的肿瘤选择一种或多种肿瘤特异性新抗原以用于受试者特异性免疫原性组合物的方法，所述方法包括：a)从所述肿瘤获得序列数据，其中所述序列数据用于获得表示一种或多种肿瘤特异性新抗原的多肽序列的数据；b)将所述受试者的所述多肽序列和mhc分子输入到机器学习平台中以产生所述一种或多种肿瘤特异性新抗原将引发所述受试者的免疫应答的数值概率评分；c)将所述一种或多种肿瘤特异性新抗原在肿瘤中的rna表达量化，以识别表达所述一种或多种肿瘤特异性新抗原的足以引发所述受试者的免疫应答的量的一种或多种肿瘤特异性新抗原；d)基于步骤b)和步骤c)而计算所述一种或多种肿瘤特异性新抗原的肿瘤特异性新抗原评分；以及e)基于所述肿瘤特异性评分而选择一种或多种肿瘤特异性新抗原以用于配制受试者特异性免疫原性组合物。2.一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括：a)从肿瘤获得序列数据，其中所述序列数据用于获得一种或多种肿瘤特异性新抗原的多肽序列；b)将所述受试者的所述多肽序列和mhc分子输入到机器学习平台中以产生所述一种或多种肿瘤特异性新抗原将引发所述受试者的免疫应答的数值概率评分；c)将所述一种或多种肿瘤特异性新抗原在肿瘤中的rna表达量化，以识别表达所述一种或多种肿瘤特异性新抗原的足以引发所述受试者的免疫应答的量的一种或多种肿瘤特异性新抗原；d)基于步骤b)和步骤c)而计算所述一种或多种肿瘤特异性新抗原的肿瘤特异性新抗原评分；e)基于所述肿瘤特异性评分而选择一种或多种肿瘤特异性新抗原以为所述受试者配制受试者特异性免疫原性组合物；f)形成包含一种或多种肿瘤特异性新抗原的受试者特异性免疫原性组合物；以及g)对所述受试者施用所述免疫原性组合物。3.如权利要求1或2中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤d)之前，对所述肿瘤的肿瘤克隆进行测序以识别代表足够分数的所述肿瘤的一种或多种肿瘤特异性新抗原。4.如权利要求3所述的方法，其中所述肿瘤特异性新抗原评分是基于步骤b)、步骤c)和对所述肿瘤克隆进行测序而计算。5.如权利要求1或2中任一项所述的方法，其中步骤b的编码一种或多种肿瘤特异性新抗原的所述多肽序列是来自短多肽。6.如权利要求5所述的方法，其中所述短多肽由mhc i类分子呈递。7.如权利要求1或2中任一项所述的方法，其中步骤b的编码一种或多种肿瘤特异性新抗原的所述多肽序列是来自长多肽。8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者的所述免疫应答包括将所述一种或多种肿瘤特异性新抗原呈递到肿瘤细胞表面。9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者的所述免疫应答包括由肿瘤
细胞上的一种或多种mhc分子呈递所述一种或多种肿瘤特异性新抗原。10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者的所述免疫应答是cd4+介导应答。11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者的所述免疫应答是cd8+介导应答。12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者的所述免疫应答是cd4+介导应答或cd8+介导应答。13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者的所述免疫应答包括能够通过抗原呈递细胞将一种或多种肿瘤特异性新抗原呈递到t细胞。14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中相对于较低的数值概率评分来说，肿瘤特异性新抗原具有较高的数值概率评分指示所述肿瘤特异性新抗原将在所述受试者体内引发较大的免疫应答。15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mhc分子是mhc i类分子和/或mhc ii类分子。16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述rna表达是mrna表达。17.如权利要求3-16中任一项所述的方法，其中所述一种或多种肿瘤特异性新抗原代表至少约1％的所述肿瘤。18.如权利要求3-16中任一项所述的方法，其中所述一种或多种肿瘤特异性新抗原代表至少约5％的所述肿瘤。19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述序列数据是核苷酸序列数据。20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述序列数据是多肽序列数据。21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述序列数据是外显子组、转录物组或全基因组核苷酸序列数据。22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中选择至少约10种肿瘤特异性新抗原来配制所述受试者特异性免疫原性组合物。23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中选择至少约20种肿瘤特异性新抗原来配制所述受试者特异性免疫原性组合物。24.如权利要求2-21中任一项所述的方法，其中所述免疫原性组合物包含至少约10种肿瘤特异性新抗原。25.如权利要求2-21中任一项所述的方法，其中所述免疫原性组合物包含至少约20种肿瘤特异性新抗原。26.如权利要求2-21中任一项所述的方法，其中所述免疫原性组合物包含由短多肽编码的一种或多种肿瘤特异性新抗原。27.如权利要求2-21中任一项所述的方法，其中所述免疫原性组合物包含由长多肽编码的一种或多种肿瘤特异性新抗原。28.一种治疗患有肿瘤的受试者的方法，所述方法包括执行如权利要求1所述的步骤，并且还包括配制包含肿瘤特异性新抗原中的所述选择的一种或多种的免疫原性组合物以及对所述受试者施用所述免疫原性组合物。29.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括测量所述一种或多种肿瘤
特异性新抗原诱导正常组织的自身免疫应答的能力。30.如权利要求29所述的方法，其中不选择诱导正常组织的自身免疫应答的所述一种或多种肿瘤特异性新抗原来用于所述免疫原性组合物。31.如权利要求29或30所述的方法，其中相对于不会诱导自身免疫应答的肿瘤特异性新抗原来说，诱导正常组织的自身免疫应答的所述一种或多种肿瘤特异性新抗原具有更低的肿瘤特异性新抗原评分。32.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是来自黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、结肠癌、睾丸癌、头颈癌、胰腺癌、脑癌、b细胞淋巴瘤、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、t细胞淋巴细胞白血病、膀胱癌或肺癌。33.如权利要求32所述的方法，其中所述肿瘤是选自由黑色素瘤、乳腺癌、肺癌和膀胱癌组成的组的癌症。34.如权利要求32或33中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是黑色素瘤。35.如权利要求32或33中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是乳腺癌肿瘤。36.如权利要求32或33中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是肺癌肿瘤。37.如权利要求2-31中任一项所述的方法，其中所述癌症是黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、结肠癌、睾丸癌、头颈癌、胰腺癌、脑癌、b细胞淋巴瘤、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、t细胞淋巴细胞白血病、膀胱癌或肺癌。38.如权利要求37所述的方法，其中所述癌症选自由黑色素瘤、乳腺癌、肺癌和膀胱癌组成的组。39.如权利要求37或38中任一项所述的方法，其中所述癌症是黑色素瘤。40.如权利要求37或38中任一项所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。41.如权利要求37或38中任一项所述的方法，其中所述癌症是肺癌。42.一种生产免疫原性组合物的方法，所述方法包括执行如权利要求1所述的步骤，并且还包括配制包含所述选择的一种或多种肿瘤特异性新抗原的免疫原性组合物。43.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含通过执行如权利要求1、3-27和29-41中任一项所述的方法选择的一种或多种肿瘤特异性新抗原。44.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含核苷酸序列、多肽序列、rna、dna、细胞、质粒、载体、树突状细胞或合成长肽。45.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含佐剂。46.如权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述序列数据是全外显子组序列数据、rna序列数据、全基因组序列数据或其组合。47.如权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述序列数据是全外显子组序列数据、rna序列数据和全基因组序列数据的组合。

技术总结
本文公开了用于从受试者的肿瘤选择一种或多种肿瘤特异性新抗原以用于个体化免疫原性组合物的方法。本文还公开了通过施用包含使用本文公开的所述方法选择的肿瘤特异性新抗原的免疫原性组合物来治疗有需要的受试者的癌症的方法。癌症的方法。癌症的方法。


技术研发人员：戴维
受保护的技术使用者：亚马逊科技公司
技术研发日：2021.11.05
技术公布日：2023/9/23