具有人源化TSLP基因、人源化TSLP受体基因和/或人源化IL7RA基因的非人动物的制作方法

具有人源化tslp基因、人源化tslp受体基因和/或人源化il7ra基因的非人动物
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背景技术：

5.胸腺基质淋巴细胞生成素(tslp)通过异源二聚体受体发挥作用，所述异源二聚体受体由对tslp(被称为“tslpr”或“tslpr”)具有特异性的链和il7受体α链组成，并与过敏性疾病和某些癌症有关。需要有效的体内系统来更好地理解过敏性疾病和癌症的发病机制并且开发治疗剂。


技术实现要素：

6.在一些实施例中，本文公开了一种经基因修饰的啮齿动物，所述啮齿动物在其基因组中包括人源化tslp基因，其中所述人源化tslp基因包括啮齿动物tslp核酸序列和人tslp核酸序列，其中所述人源化tslp基因编码人源化tslp多肽，所述人源化tslp多肽包括与人tslp蛋白的成熟蛋白序列基本上相同的成熟蛋白序列。
7.在一些实施例中，所述人源化tslp多肽包括与人tslp蛋白的成熟蛋白序列相同的成熟蛋白序列。
8.在一些实施例中，所述人源化tslp蛋白包括与啮齿动物tslp蛋白的信号肽基本上相同的信号肽。在一些实施例中，所述人源化tslp蛋白包括与啮齿动物tslp蛋白，例如内源性啮齿动物tslp蛋白的信号肽相同的信号肽。
9.在一些实施例中，人源化tslp基因中的所述人tslp核酸序列至少编码人tslp蛋白的大部分成熟蛋白序列。在一些实施例中，所述人tslp核酸序列编码人tslp蛋白的所述成熟蛋白序列，例如人tslp蛋白的氨基酸29-159(例如，seq id no:3中所示的人tslp蛋白)。在一些实施例中，所述人tslp核酸序列包括人tslp基因的从编码成熟蛋白序列的第一氨基酸的密码子开始的外显子1至外显子4中的终止密码子。
10.在一些实施例中，人源化tslp基因中的所述啮齿动物tslp核酸序列包括啮齿动物tslp基因(例如，内源性啮齿动物tslp基因)的编码啮齿动物tslp信号肽的外显子序列。在一些实施例中，所述啮齿动物是小鼠，并且人源化tslp基因中的所述啮齿动物核酸序列包括小鼠tslp基因的外显子1和编码信号肽氨基酸的外显子2的5'部分。在一些实施例中，人源化tslp基因中的所述啮齿动物tslp核酸序列还包括啮齿动物tslp基因(例如，内源性啮齿动物tslp基因)的3'utr。
11.在一些实施例中，所述啮齿动物是小鼠，并且所述人源化tslp基因包括：(i)小鼠tslp基因的外显子1和编码信号肽氨基酸的外显子2的5'部分；以及(ii)人tslp基因的从编码成熟蛋白序列的第一氨基酸的密码子开始的外显子1至外显子4中的终止密码子。在一些实施例中，所述人源化tslp基因进一步包括小鼠tslp基因的3'utr。在各个实施例中，小鼠tslp基因是内源性小鼠tslp基因。
12.在一些实施例中，人源化tslp基因与如内源性啮齿动物tslp启动子等啮齿动物tslp启动子可操作地连接。
13.在一些实施例中，人源化tslp基因位于除内源性啮齿动物tslp基因座之外的基因座处。在一些实施例中，人源化tslp基因位于内源性啮齿动物tslp基因座处。
14.在人源化tslp基因位于内源性啮齿动物tslp基因座处的实施例中的一些实施例中，所述人源化tslp基因是由于位于内源性啮齿动物tslp基因座处的啮齿动物tslp基因组dna被人tslp核酸置换而形成的。在一些实施例中，所述人源化tslp基因是由于包括至少编码所述内源性啮齿动物tslp蛋白的大部分成熟蛋白序列的外显子序列的啮齿动物基因组dna被至少编码人tslp蛋白的大部分成熟蛋白序列的人tslp核酸置换而形成的。在一些实施例中，人源化tslp基因是由于包括编码所述内源性啮齿动物tslp蛋白的成熟蛋白序列的外显子序列的啮齿动物基因组dna被编码人tslp蛋白的成熟蛋白序列的人tslp核酸置换而形成的。在一些实施例中，所述啮齿动物是小鼠，并且被置换的小鼠基因组dna包括内源性小鼠tslp基因的从编码成熟小鼠tslp蛋白的第一氨基酸的密码子开始的外显子2至外显子5中的终止密码子，并且所述人基因组dna包括人tslp基因的从编码成熟人tslp蛋白的第一氨基酸的密码子开始的外显子1至外显子4中的终止密码子。
15.在一些实施例中，所述啮齿动物对人源化tslp基因是纯合的。在一些实施例中，所述啮齿动物对人源化tslp基因是杂合的。
16.在一些实施例中，人源化tslp多肽在来自人源化tslp基因的啮齿动物中表达。
17.在一些实施例中，啮齿动物在其基因组中进一步包括人源化tslpr基因、人源化il7ra基因或其组合。
18.在一些实施例中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。
19.在一些实施例中，本文公开了一种分离的啮齿动物组织或细胞，其基因组包括本文所描述的人源化tslp基因。在一些实施例中，所述啮齿动物细胞是啮齿动物胚胎干细胞。在一些实施例中，所述啮齿动物细胞是卵子或精子。在一些实施例中，分离的啮齿动物组织或细胞是小鼠组织或细胞或大鼠组织或细胞。
20.在一些实施例中，本文公开了一种啮齿动物胚胎，所述啮齿动物胚胎包括啮齿动物胚胎干细胞，所述啮齿动物胚胎干细胞包括本文所描述的人源化tslp基因。
21.在一些实施例中，本文公开了一种制备经基因修饰的啮齿动物的方法。在一些实施例中，所述方法包括：修饰啮齿动物基因组以包括人源化tslp基因，其中所述人源化tslp基因包括啮齿动物tslp核酸序列和人tslp核酸序列，并且编码人源化tslp多肽，所述人源化tslp多肽包括与人tslp蛋白的成熟蛋白序列基本上相同的成熟蛋白序列；以及制备包括经修饰的啮齿动物基因组的啮齿动物。
22.在一些实施例中，修饰啮齿动物基因组包括以下步骤：将包括人tslp核酸序列的核酸分子引入到啮齿动物胚胎干(es)细胞的基因组中，从而获得啮齿动物es细胞，其中所
述人tslp核酸序列已整合到内源性tslp基因座中以置换啮齿动物tslp基因组dna，由此形成人源化tslp基因；以及从所获得的啮齿动物es细胞产生啮齿动物。在一些实施例中，所述人tslp核酸序列至少编码人tslp蛋白的大部分成熟蛋白序列。在一些实施例中，引入到所述es细胞中的所述核酸分子进一步包括侧接所述人tslp核酸序列的5'同源臂和3'同源臂，并且其中所述5'同源臂和所述3'同源臂与侧接待置换的啮齿动物tslp基因组dna的内源性啮齿动物基因座处的核酸序列同源。在一些实施例中，所述人源化tslp基因与啮齿动物tslp启动子，例如位于所述内源性啮齿动物tslp基因座处的内源性啮齿动物tslp启动子可操作地连接。
23.在所述方法的一些实施例中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。
24.在一些实施例中，本文公开了一种靶向核酸构建体，所述靶向核酸构建体包括将整合到内源性啮齿动物tslp基因座处的啮齿动物tslp基因中的人tslp核酸序列，所述人tslp核酸序列侧接有与所述啮齿动物tslp基因座处的核苷酸序列同源的5'核苷酸序列和3'核苷酸序列，其中所述人tslp核酸序列整合到所述啮齿动物tslp基因中使得啮齿动物tslp基因组dna被所述人tslp核酸序列置换，由此形成人源化tslp基因，并且其中所述人tslp核酸序列至少编码人tslp蛋白的大部分成熟蛋白序列。在靶向核酸的一些实施例中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。
25.在一些实施例中，本文公开了一种用于产生经基因修饰的啮齿动物细胞的体外方法，所述方法包括将靶向载体引入到啮齿动物细胞中，所述靶向载体包括至少编码人tslp蛋白的大部分成熟蛋白序列的人tslp核酸序列，所述人tslp核酸序列侧接有啮齿动物同源臂，所述啮齿动物同源臂介导所述人tslp核苷酸序列整合到内源性啮齿动物tslp基因座中，使得啮齿动物tslp基因组dna被所述人tslp核酸序列置换以形成如本文所描述的人源化tslp基因，由此产生经基因修饰的啮齿动物细胞。在一些实施例中，所述啮齿动物细胞是小鼠细胞或大鼠细胞。在一些实施例中，所述啮齿动物细胞是啮齿动物es细胞，并且所述方法产生经基因修饰的啮齿动物es细胞。
26.在一些实施例中，本文公开了一种经基因修饰的啮齿动物，所述啮齿动物在其基因组中包括人源化tslpr基因，其中所述人源化tslpr基因包括啮齿动物tslpr核酸序列和人tslpr核酸序列，其中所述人源化tslpr基因编码人源化tslpr多肽，所述人源化tslpr多肽包括与人tslpr蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域。
27.在一些实施例中，所述人源化tslpr蛋白包括与啮齿动物tslpr蛋白(例如，内源性啮齿动物tslpr蛋白)的跨膜细胞质序列基本上相同的跨膜细胞质序列。在一些实施例中，所述人源化tslpr蛋白包括与啮齿动物tslpr蛋白(例如，内源性啮齿动物tslpr蛋白)的跨膜细胞质序列相同的跨膜细胞质序列。
28.在一些实施例中，所述人源化tslpr蛋白包括与啮齿动物tslpr蛋白的信号肽基本上相同的信号肽。在一些实施例中，所述人源化tslpr蛋白包括与啮齿动物tslpr蛋白(例如，内源性啮齿动物tslpr蛋白)的信号肽相同的信号肽。
29.在一些实施例中，人源化tslpr基因中的所述人tslpr核酸序列至少编码人tslpr蛋白的大部分胞外结构域。在一些实施例中，人源化tslpr基因中的所述人tslpr核酸序列编码人tslpr的氨基酸29-231(例如，如seq id no:23中所示的人tslpr)。在一些实施例中，所述人tslpr核酸序列包括人tslpr基因的外显子2至编码外显子6中的最后一个胞外结构
域氨基酸的密码子。
30.在一些实施例中，人源化tslpr基因中的所述啮齿动物tslpr核酸序列包括至少编码啮齿动物tslpr蛋白(例如，内源性啮齿动物tslpr蛋白)的大部分跨膜细胞质序列的啮齿动物tslpr基因的外显子序列。在一些实施例中，所述啮齿动物是小鼠，并且所述啮齿动物tslpr核酸序列包括小鼠tslpr基因(例如，内源性小鼠tslpr基因)的从编码跨膜结构域的第一氨基酸的密码子开始的外显子6至外显子8。
31.在一些实施例中，人源化tslpr基因中的所述啮齿动物tslpr核酸序列包括啮齿动物tslpr基因的编码啮齿动物tslpr蛋白(例如，内源性啮齿动物tslpr蛋白)的信号肽的外显子序列。在一些实施例中，所述啮齿动物是小鼠，并且所述啮齿动物核酸序列包括小鼠tslpr基因(例如，内源性小鼠tslpr基因)的外显子1。
32.在一些实施例中，所述啮齿动物是小鼠，并且所述人源化tslpr基因包括：(i)小鼠tslpr基因(例如，内源性小鼠tslpr基因)的外显子1；(ii)人tslpr基因的外显子2至编码外显子6中的胞外结构域的最后一个氨基酸的密码子；以及(iii)小鼠tslpr基因的从编码跨膜结构域的第一氨基酸的密码子开始的外显子6至外显子8。
33.在一些实施例中，人源化tslpr基因与如内源性啮齿动物tslpr启动子等啮齿动物tslpr启动子可操作地连接。
34.在一些实施例中，人源化tslpr基因位于除内源性啮齿动物tslpr基因座之外的基因座处。在一些实施例中，人源化tslpr基因位于内源性啮齿动物tslpr基因座处。
35.在人源化tslpr基因位于内源性啮齿动物tslpr基因座处的实施例中的一些实施例中，所述人源化tslpr基因是由于位于内源性啮齿动物tslpr基因座处的啮齿动物tslpr基因组dna被人tslpr核酸置换而形成的。在一些实施例中，人源化tslpr基因是由于包括至少编码所述内源性啮齿动物tslpr蛋白的大部分胞外结构域的外显子序列的啮齿动物基因组dna被至少编码所述人tslpr蛋白的大部分胞外结构域的所述人tslpr核酸置换而形成的。在一些实施例中，所述啮齿动物是小鼠，并且其中被置换的小鼠基因组dna包括内源性小鼠tslpr基因的外显子2至编码外显子6中的胞外结构域的最后一个氨基酸的密码子，并且所述人基因组dna包括人tslpr基因的外显子2至编码外显子6中的胞外结构域的最后一个氨基酸的密码子。
36.在一些实施例中，啮齿动物对人源化tslpr基因是杂合的。在一些实施例中，啮齿动物对人源化tslpr基因是纯合的。
37.在一些实施例中，人源化tslpr多肽在来自人源化tslpr基因的啮齿动物中表达。
38.在一些实施例中，啮齿动物在其基因组中进一步包括人源化tslp基因、人源化il7ra基因或其组合。
39.在一些实施例中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。
40.在一些实施例中，本文公开了一种分离的啮齿动物组织或细胞，其基因组包括本文所描述的人源化tslpr基因。在一些实施例中，所述啮齿动物细胞是啮齿动物胚胎干细胞。在一些实施例中，所述啮齿动物细胞是卵子或精子。在一些实施例中，分离的啮齿动物组织或细胞是小鼠组织或细胞或大鼠组织或细胞。
41.在一些实施例中，本文公开了一种啮齿动物胚胎，所述啮齿动物胚胎包括啮齿动物胚胎干细胞，所述啮齿动物胚胎干细胞包括本文所描述的人源化tslpr基因。
42.在一些实施例中，本文公开了一种制备经基因修饰的啮齿动物的方法。在一些实施例中，所述方法包括：修饰啮齿动物基因组以包括人源化tslpr基因，其中所述人源化tslpr基因包括啮齿动物tslpr核酸序列和人tslpr核酸序列，并且编码人源化tslpr多肽，所述人源化tslpr多肽包括与人tslpr蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域；以及制备包括经修饰的啮齿动物基因组的啮齿动物。
43.在一些实施例中，修饰啮齿动物基因组包括以下步骤：将包括人tslpr核酸序列的核酸分子引入到啮齿动物胚胎干(es)细胞的基因组中，从而获得啮齿动物es细胞，其中所述人tslpr核酸序列已整合到内源性tslpr基因座中以置换啮齿动物tslpr基因组dna，由此形成人源化tslpr基因；以及从所获得的啮齿动物es细胞产生啮齿动物。在一些实施例中，所述人tslpr核酸序列至少编码人tslpr蛋白的大部分胞外结构域。在一些实施例中，引入到所述es细胞中的所述核酸分子进一步包括侧接所述人tslpr核酸序列的5'同源臂和3'同源臂，并且其中所述5'同源臂和所述3'同源臂与侧接待置换的啮齿动物tslpr基因组dna的内源性啮齿动物基因座处的核酸序列同源。在一些实施例中，所述人源化tslpr基因与啮齿动物tslpr启动子，例如位于所述内源性啮齿动物tslpr基因座处的内源性啮齿动物tslp启动子可操作地连接。
44.在所述方法的一些实施例中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。
45.在一些实施例中，本文公开了一种靶向核酸构建体，所述靶向核酸构建体包括将整合到内源性啮齿动物tslpr基因座处的啮齿动物tslpr基因中的人tslpr核酸序列，所述人tslpr核酸序列侧接有与所述啮齿动物tslpr基因座处的核苷酸序列同源的5'核苷酸序列和3'核苷酸序列，其中所述人tslpr核酸序列整合到所述啮齿动物tslpr基因中使得啮齿动物tslpr基因组dna被所述人tslpr核酸序列置换，由此形成人源化tslpr基因，并且其中所述人tslpr核酸序列至少编码人tslp蛋白的大部分胞外结构域。在靶向核酸的一些实施例中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。
46.在一些实施例中，本文公开了一种用于产生经基因修饰的啮齿动物细胞的体外方法，所述方法包括将靶向载体引入到啮齿动物细胞中，所述靶向载体包括至少编码人tslpr蛋白的大部分胞外结构域的人tslpr核酸序列，所述人tslpr核酸序列侧接有啮齿动物同源臂，所述啮齿动物同源臂介导所述人tslpr核苷酸序列整合到内源性啮齿动物tslpr基因座中，使得啮齿动物tslpr基因组dna被所述人tslp核酸序列置换以形成如本文所描述的人源化tslpr基因，由此产生经基因修饰的啮齿动物细胞。在一些实施例中，所述啮齿动物细胞是小鼠细胞或大鼠细胞。在一些实施例中，所述啮齿动物细胞是啮齿动物es细胞，并且所述方法产生经基因修饰的啮齿动物es细胞。
47.在一些实施例中，本文公开了一种经基因修饰的啮齿动物，所述啮齿动物在其基因组中包括人源化il7ra基因，其中所述人源化il7ra基因包括啮齿动物il7ra核酸序列和人il7ra核酸序列，其中所述人源化il7ra基因编码人源化il7ra多肽，所述人源化il7ra多肽包括与人il7ra蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域。
48.在一些实施例中，所述人源化il7ra蛋白包括与啮齿动物il7ra蛋白(例如，内源性啮齿动物il7ra蛋白)的跨膜细胞质序列基本上相同的跨膜细胞质序列。在一些实施例中，所述人源化il7ra蛋白包括与啮齿动物il7ra蛋白(例如，内源性啮齿动物il7ra蛋白)的跨膜细胞质序列相同的跨膜细胞质序列。
49.在一些实施例中，所述人源化il7ra蛋白包括与啮齿动物il7ra蛋白的信号肽基本上相同的信号肽。在一些实施例中，所述人源化il7ra蛋白包括与啮齿动物il7ra蛋白(例如，内源性啮齿动物il7ra蛋白)的信号肽相同的信号肽。
50.在一些实施例中，人源化il7ra基因中的所述人il7ra核酸序列至少编码所述人il7ra蛋白的大部分胞外结构域。在一些实施例中，人源化il7ra基因中的所述人il7ra核酸序列编码人il7ra蛋白的氨基酸21-236(例如，如seq id no:43中所示的人il7ra蛋白)。在一些实施例中，所述人il7ra核酸序列包括人il7ra基因的从编码成熟蛋白的第一氨基酸的外显子1中的密码子至外显子5。
51.在一些实施例中，人源化il7ra基因中的所述啮齿动物il7ra核酸序列包括至少编码啮齿动物il7ra蛋白(例如，内源性啮齿动物il7ra蛋白)的大部分跨膜细胞质序列的啮齿动物il7ra基因的序列。在一些实施例中，所述啮齿动物是小鼠，并且所述啮齿动物il7ra核酸序列包括小鼠il7ra基因(例如，内源性小鼠il7ra基因)的外显子6至外显子8。
52.在一些实施例中，人源化il7ra基因中的所述啮齿动物il7ra核酸序列包括啮齿动物il7ra基因的编码啮齿动物il7ra蛋白(例如，内源性啮齿动物il7ra蛋白)的信号肽的外显子1的一部分。在一些实施例中，所述啮齿动物是小鼠，并且所述啮齿动物核酸序列包括小鼠il7ra基因(例如，内源性小鼠il7ra基因)的包括小鼠il7ra的5'utr和编码信号肽两者的外显子1的一部分。
53.在一些实施例中，所述啮齿动物是小鼠，并且所述人源化il7ra基因包括：(i)小鼠il7ra基因(例如，内源性小鼠il7ra基因)的编码小鼠il7ra蛋白的信号肽的外显子1的一部分；(ii)人il7ra基因的从编码成熟蛋白的第一氨基酸的密码子开始的外显子1至外显子5；以及(iii)所述小鼠il7ra基因的外显子6至外显子8。
54.在一些实施例中，人源化il7ra基因与如内源性啮齿动物il7ra启动子等啮齿动物il7ra启动子可操作地连接。
55.在一些实施例中，人源化il7ra基因位于除内源性啮齿动物il7ra基因座之外的基因座处。在一些实施例中，人源化il7ra基因位于内源性啮齿动物il7ra基因座处。
56.在人源化il7ra基因位于内源性啮齿动物il7ra基因座处的实施例中的一些实施例中，所述人源化il7ra基因是由于位于内源性啮齿动物il7ra基因座处的啮齿动物il7ra基因组dna被人il7ra核酸置换而形成的。在一些实施例中，人源化il7ra基因是由于包括至少编码所述内源性啮齿动物il7ra蛋白的大部分胞外结构域的外显子序列的啮齿动物基因组dna被至少编码所述人il7ra蛋白的大部分胞外结构域的所述人il7ra核酸置换而形成的。在一些实施例中，所述啮齿动物是小鼠，并且其中被置换的小鼠基因组dna包括内源性小鼠il7ra基因的从编码成熟蛋白序列的第一氨基酸的外显子1中的密码子至外显子5，并且所述人基因组dna包括人il7ra基因的从编码成熟蛋白序列的第一氨基酸的外显子1中的密码子至外显子5。
57.在一些实施例中，啮齿动物对人源化il7ra基因是杂合的。在一些实施例中，啮齿动物对人源化il7ra基因是纯合的。
58.在一些实施例中，人源化il7ra多肽在来自人源化il7ra基因的啮齿动物中表达。
59.在一些实施例中，啮齿动物在其基因组中进一步包括人源化tslp基因、人源化tslpr基因或其组合。
60.在一些实施例中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。
61.在一些实施例中，本文公开了一种分离的啮齿动物组织或细胞，其基因组包括本文所描述的人源化il7ra基因。在一些实施例中，所述啮齿动物细胞是啮齿动物胚胎干细胞。在一些实施例中，所述啮齿动物细胞是卵子或精子。在一些实施例中，分离的啮齿动物组织或细胞是小鼠组织或细胞或大鼠组织或细胞。
62.在一些实施例中，本文公开了一种啮齿动物胚胎，所述啮齿动物胚胎包括啮齿动物胚胎干细胞，所述啮齿动物胚胎干细胞包括本文所描述的人源化il7ra基因。
63.在一些实施例中，本文公开了一种制备经基因修饰的啮齿动物的方法。在一些实施例中，所述方法包括：修饰啮齿动物基因组以包括人源化il7ra基因，其中所述人源化il7ra基因包括啮齿动物il7ra核酸序列和人il7ra核酸序列，并且编码人源化il7ra多肽，所述人源化il7ra多肽包括与人il7ra蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域；以及制备包括经修饰的啮齿动物基因组的啮齿动物。
64.在一些实施例中，修饰啮齿动物基因组包括以下步骤：将包括人il7ra核酸序列的核酸分子引入到啮齿动物胚胎干(es)细胞的基因组中，从而获得啮齿动物es细胞，其中所述人il7ra核酸序列已整合到内源性il7ra基因座中以置换啮齿动物il7ra基因组dna，由此形成人源化il7ra基因；以及从所获得的啮齿动物es细胞产生啮齿动物。在一些实施例中，所述人il7ra核酸序列至少编码人il7ra蛋白的大部分胞外结构域。在一些实施例中，引入到所述es细胞中的所述核酸分子进一步包括侧接所述人il7ra核酸序列的5'同源臂和3'同源臂，并且其中所述5'同源臂和所述3'同源臂与侧接待置换的啮齿动物il7ra基因组dna的内源性啮齿动物基因座处的核酸序列同源。在一些实施例中，所述人源化il7ra基因与啮齿动物il7ra启动子，例如位于所述内源性啮齿动物il7ra基因座处的内源性啮齿动物il7ra启动子可操作地连接。
65.在所述方法的一些实施例中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。
66.在一些实施例中，本文公开了一种靶向核酸构建体，所述靶向核酸构建体包括将整合到内源性啮齿动物il7ra基因座处的啮齿动物il7ra基因中的人il7ra核酸序列，所述人il7ra核酸序列侧接有与所述啮齿动物il7ra基因座处的核苷酸序列同源的5'核苷酸序列和3'核苷酸序列，其中所述人il7ra核酸序列整合到所述啮齿动物il7ra基因中使得啮齿动物il7ra基因组dna被所述人il7ra核酸序列置换，由此形成人源化il7ra基因，并且其中所述人il7ra核酸序列至少编码人il7ra蛋白的大部分胞外结构域。在靶向核酸的一些实施例中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。
67.在一些实施例中，本文公开了一种用于产生经基因修饰的啮齿动物细胞的体外方法，所述方法包括将靶向载体引入到啮齿动物细胞中，所述靶向载体包括至少编码人il7ra蛋白的大部分胞外结构域的人il7ra核酸序列，所述人il7ra核酸序列侧接有啮齿动物同源臂，所述啮齿动物同源臂介导所述人il7ra核苷酸序列整合到内源性啮齿动物il7ra基因座中，使得啮齿动物il7ra基因组dna被所述人il7ra核酸序列置换以形成如本文所描述的人源化il7ra基因，由此产生经基因修饰的啮齿动物细胞。在一些实施例中，所述啮齿动物细胞是小鼠细胞或大鼠细胞。在一些实施例中，所述啮齿动物细胞是啮齿动物es细胞，并且所述方法产生经基因修饰的啮齿动物es细胞。
68.在一些实施例中，本文公开的啮齿动物在其基因组中包括一种或多种另外的基因
修饰，如人源化sirpα基因、内源性rag2基因的破坏、内源性il-2rg基因的破坏、人源化tpo基因和人源化gm-csf/il-3基因座。啮齿动物对任何此类另外的基因修饰可以是杂合的或纯合的。
69.在一些实施例中，本文公开的啮齿动物在其基因组中包括人源化tslp基因和人源化sirpα基因，并且对rag2和il-2rg基因两者是纯合无效的。在一些此类实施例中，啮齿动物在其基因组中进一步包括人源化tpo基因和/或人源化gm-csf/il-3基因座。啮齿动物对人源化基因可以是杂合的或纯合的。
70.在一些实施例中，本文公开的啮齿动物在其基因组中包括人源化tslp基因、人源化tslpr基因和人源化sirpα基因，并且对rag2和il-2rg基因两者是纯合无效的。在一些此类实施例中，啮齿动物在其基因组中进一步包括人源化tpo基因和/或人源化gm-csf/il-3基因座。啮齿动物对人源化基因可以是纯合的或杂合的。
71.在一些实施例中，本文公开的啮齿动物在其基因组中包括人源化tslp基因、人源化tslpr基因、人源化il7ra基因和人源化sirpα基因，并且对rag2和il-2rg基因两者是纯合无效的。在一些此类实施例中，啮齿动物在其基因组中进一步包括人源化tpo基因和/或人源化gm-csf/il-3基因座。啮齿动物对人源化基因可以是纯合的或杂合的。
72.在一些实施例中，如本文所公开的包括人源化tslp基因、人源化tslpr基因、人源化il7ra基因或其组合，任选地具有一种或多种另外的基因修饰的经基因修饰的啮齿动物用于制备过敏性疾病(例如，气道或皮肤炎症)或癌症的啮齿动物模型。
73.在一些实施例中，本文公开了一种测试用于治疗过敏性病状的候选药剂的方法，所述方法包括：诱导本文公开的经基因修饰的啮齿动物的过敏性病状；向所述啮齿动物施用候选药剂；以及确定所述候选药剂是否抑制所述啮齿动物的所述过敏性病状。
74.在一些实施例中，本文公开了一种测试用于治疗癌症的候选药剂的方法，所述方法包括：将人癌细胞移植到本文公开的经基因修饰的啮齿动物体内；向所述啮齿动物施用候选药剂；以及确定所述候选药剂是否抑制所述啮齿动物体内的癌细胞的生长。在一些实施例中，所述癌症是th2驱动的癌症，包含例如乳腺癌、肺癌和胰腺癌。
附图说明
75.本专利或申请的文件含有至少一幅彩色绘制的图。在请求并支付必要的费用后，专利和商标局将提供具有彩图的本专利的副本。
76.并入本说明书中并且构成本说明书的一部分的附图展示了若干实施例，并且与描述一起展示了所公开的组合物和方法。
77.图1a描绘了小鼠tslp基因座人源化的策略的示例性实施例。小鼠tslp基因和人tslp基因由水平线表示，其外显子由置于所述线上方的方框表示。从编码氨基酸20的外显子2中的密码子开始至外显子5中的终止密码子的内源性小鼠tslp基因座处的3486bp的连续小鼠tslp基因组片段被从编码氨基酸29的人tslp外显子1中的密码子开始至外显子4中的终止密码子的4100bp的人tslp基因组片段置换。置换产生了包含小鼠tslp信号肽和人成熟tslp多肽的小鼠-人杂交体(“人源化”)tslp蛋白。还参见图1d和1f。
78.图1b描绘了用于包括小鼠tslp基因座的核酸的小鼠tslp基因座(未按比例)和包括人源化小鼠tslp基因座的靶向核酸构建体的人源化的策略的示例性实施例，其中小鼠
tslp基因座处的3.49kb的小鼠基因组片段已被包括1.9kb的人基因组片段1(人tlsp的从编码氨基酸29的外显子1中的密码子至外显子3的3'末端后的257bp)、4.4kb的floxed hub-puro盒(插入人tlsp内含子3)和2.2kb的人基因组片段2(人tlsp的从外显子3的末端后的258bp至外显子4中的终止密码子)的人源化片段置换。靶向构建体中的人源化片段侧接有114.3kb的小鼠5'同源臂和65.3kb的小鼠3'同源臂。包括人源化小鼠tslp基因座的靶向核酸构建体可以被引入到小鼠胚胎干细胞中，用于靶向插入到小鼠基因组中的小鼠tslp基因中。还指示了用于等位基因的人获得和等位基因的小鼠丢失测定以确认正确靶向的引物和探针的位置。引物和探针的序列如表6所示。
79.图1c描绘了用包括人基因组片段1、floxed hub-puro盒和人基因组片段2的人源化片段置换上文针对图1b所描述的小鼠tslp基因组片段而产生的、被指定为maid#7466的人源性tslp等位基因的小鼠tslp等位基因(不按比例)的人源化的策略的示例性实施例。在去除floxed hub-puro盒之后，人源化tslp等位基因被指定为maid#7467。
80.图1d示出了小鼠tslp(seq id no:1)、人tslp同种型1(seq id no:3)(粗体斜体)和人源化(杂交体)tslp(seq id no:5)(人部分为粗体斜体)的蛋白序列的示例性实施例。信号肽在每个蛋白序列中带有下划线。
81.图1e示出了小鼠tslp(seq id no:2)、人tslp同种型1(seq id no:4)(粗体斜体)和人源化(杂交体)tslp(seq id no:6)(人部分为粗体斜体)的mrna序列的示例性实施例。编码信号肽的部分在每个mrna中带有划线。
82.图1f示出了小鼠tslp(“mtslp”，seq id no:1)，人tslp同种型1(“htslp”，seq id no:3)和人源化(杂交体)tslp(seq id no:5)蛋白序列的示例性实施例的比对。蛋白的信号肽加方框。小鼠与人序列之间在形成人源化(杂交体)tslp蛋白中的接合点由分子的5'(n末端)和3'(c末端)处的箭头指示。三角形表示人内含子3(2429bp)的位置，其中插入了floxed hub-puro盒。
83.图1g示出了在示例性实施例中，对如实例1中所描述的tslp人源化杂合的小鼠在小鼠血清中表达成熟人tslp蛋白(中间)，其中未进行tslp人源化的小鼠作为阴性对照(左)并且正常人血清作为阳性对照(右)。每个点表示一只小鼠。
84.图2a描绘了小鼠tslpr基因座人源化的策略的示例性实施例。小鼠tslpr基因和人tslpr基因由水平线表示，其外显子由置于所述线上方的方框表示。从外显子2前328bp处的内含子1开始并在外显子6中的第47个bp处结束的内源性小鼠tslpr基因座处的2362bp的连续小鼠tslpr基因组片段被从外显子2前909bp处的内含子1开始并在外显子6中的第47个bp处结束的13743bp的人tslpr基因组片段置换。置换使得小鼠tslpr的氨基酸27至243缺失，但保留了小鼠tslpr信号肽(氨基酸1-19)、小鼠tslpr成熟蛋白的前7个氨基酸和小鼠tslpr跨膜结构域(氨基酸244-264)和细胞内结构域，并插入了大部分人tslpr胞外结构域(从氨基酸27开始，并在氨基酸231处结束，正好在氨基酸232-252的人跨膜结构域之前)。还参见图2d。
85.图2b描绘了用于包括小鼠tslpr基因座的核酸的小鼠tslpr基因座(未按比例)和包括人源化小鼠tslpr基因座的靶向核酸构建体的人源化的策略的示例性实施例，其中小鼠tslpr基因座处的2.36kb的小鼠基因组片段已被包括4.8kb的floxed hub-neo盒和13.7kb的人基因组片段(包括人tslpr的外显子6中的内含子1的3'部分、外显子2至第47个
bp)的人源化片段置换。靶向构建体中的人源化片段侧接有29.1kb的小鼠5'同源臂(在小鼠tslpr的外显子2之前高达328bp)和133.2kb的小鼠3'同源臂(从小鼠tslpr的外显子6至外显子8中的第48个bp，随后是小鼠3'基因组序列)。包括人源化小鼠tslpr基因座的靶向核酸构建体可以被引入到小鼠胚胎干细胞中，用于靶向插入到小鼠基因组中。还指示了用于等位基因的人获得和等位基因的小鼠丢失测定以确认正确靶向的引物和探针的位置。引物和探针的序列如表9所示。
86.图2c描绘了用包括4.8kb的floxed hub-neo盒和13743bp的人tslpr基因组片段的人源化片段置换上文针对图2b所描述的小鼠tslp基因组片段而产生的、被指定为maid#7558的人源性tslpr等位基因的小鼠tslp等位基因(不按比例)的人源化的策略的示例性实施例。在去除floxed hub-neo盒之后，人源化tslpr等位基因被指定为maid#7559。
87.图2d示出了小鼠tslpr(seq id no:21)、人tslpr(seq id no:23)(粗体斜体)和人源化(杂交体)tslpr(seq id no:25)(人部分为粗体斜体)的蛋白序列的示例性实施例。信号肽(“sp”)和跨膜区段(“tm”)在每个蛋白序列中带有下划线。
88.图2e示出了小鼠tslpr(seq id no:22)、人tslpr(seq id no:24)(粗体斜体)和人源化(杂交体)tslpr(seq id no:26)(人部分为粗体斜体)的mrna序列的示例性实施例。编码信号肽和跨膜区段的部分分别在每个mrna中带有下划线。
89.图2f示出了小鼠tslpr(“mtslpr”，seq id no:21)、人tslpr(“htslpr”，seq id no:23)和人源化(杂交体)tslpr(seq id no:25)蛋白序列的示例性实施例的比对。蛋白的信号肽用虚线加方框。跨膜结构域用实线加方框。小鼠与人序列之间在形成人源化(杂交体)tslpr中的接合点由分子的5'(内含子1中)和3'(外显子6中)处的三角形指示。
90.图3a描绘了小鼠il7ra基因座人源化的策略的示例性实施例。小鼠il7ra基因和人il7ra基因由水平线表示，其外显子由置于所述线上方的方框表示。从外显子1的编码序列中的第69个bp开始至内含子5的5'部分的内源性小鼠il7ra基因座处的19235bp的连续小鼠il7ra基因组片段被包含从外显子1的编码序列中的第69个bp至内含子5的5'部分的17232bp的人il7ra基因组片段置换。置换产生包含小鼠il7ra信号肽的小鼠-人杂交体(“人源化”)tslp蛋白、基本上是人的胞外结构域(除了最后两个氨基酸gly-trp)以及小鼠il7ra的跨膜和细胞内结构域。还参见图3d。
91.图3b描绘了用于包括小鼠il7ra基因座的核酸的小鼠il7ra基因座(未按比例)和包括人源化小鼠il7ra基因座的靶向核酸构建体的人源化的策略的示例性实施例，其中小鼠il7ra基因座处的19.2kb的小鼠基因组片段已被包括126bp的人基因组片段1(包含人il7ra的外显子1中的最后14个bp和内含子1中的第一个112bp)、5.2kb的floxed hub-hyg盒(插入人il7ra内含子1)和17106bp的人基因组片段2(包含人il7ra的内含子1的3'部分、外显子2至外显子5和内含子5的5'部分)的人源化片段置换。靶向构建体中的人源化片段侧接有48.8kb的小鼠5'同源臂和124.3kb的小鼠3'同源臂。包括人源化小鼠il7ra基因座的靶向核酸构建体可以被引入到小鼠胚胎干细胞中，用于靶向插入到小鼠基因组中。还指示了用于等位基因的人获得和等位基因的小鼠丢失测定以确认正确靶向的引物和探针的位置。引物和探针的序列如表12所示。
92.图3c描绘了用包括人基因组片段1(126bp)、floxed hub-hyg盒和人基因组片段2(17106bp)的人源化片段置换上文针对图3b所描述的小鼠il7ra基因组片段而产生的、被指
定为maid#7266的人源性il7ra等位基因的小鼠il7ra等位基因(不按比例)的人源化的策略的示例性实施例。在去除floxed hub-hyg盒之后，人源化il7ra等位基因被指定为maid#7267。
93.图3d示出了小鼠il7ra(seq id no:41)、人il7ra(seq id no:43)(粗体斜体)和人源化(杂交体)il7ra(seq id no:45)(人部分为粗体斜体)的蛋白序列。信号肽和跨膜结构域在每个蛋白序列中带有下划线。
94.图3e示出了小鼠il7ra(seq id no:42)、人il7ra(seq id no:44)(粗体斜体)和人源化(杂交体)il7ra(seq id no:46)(人部分为粗体斜体)的编码序列(cds)的示例性实施例。用于人源化的人il7ra序列的部分带有下划线。具有人源的杂合体il7ra序列的部分也带有下划线。
95.图3f示出了小鼠il7ra(seq id no:41，顶部)和人il7ra(seq id no:43，底部)蛋白序列的示例性实施例的比对。指示了信号肽和蛋白的跨膜片段(在方框中)。小鼠与人序列之间在形成图3a-3e中所描述的人源化(杂交体)il7ra中的接合点由n末端处的竖直线(“5'接合点”)和胞外结构域的c末端附近的线(“3'接合点”)指示。突出显示了涉及人源化的胞外结构域的氨基酸(在5'接合点之后立即从氨基酸开始并且在3'接合点处结束)。三角形表示编码序列中的外显子的接合点。
96.图4a-4e。小鼠在第0天和第14天对盐水和明矾(仅明矾)或卵清蛋白和明矾(ova-明矾)腹膜内致敏，随后在第21天至第24天用ova连续4次鼻内激发。在第25天，收集肺组织和血清用于进一步分析。4a.流式细胞术对肺细胞浸润的评估。肺组织嗜酸性粒细胞的细胞频率被绘制为总活细胞的频率。4b.muc5ac mrna表达水平的评估通过实时qpcr测量并相对于β2m(β2-微球蛋白)对照mrna表达进行表达。血清ova特异性ige(4c)和ova特异性igg1(4d)的elisa测定。每个点表示单个小鼠。符号表示与盐水对照相比的统计显著性(*)。4e描绘了实验方案：小鼠在第0天和第14天对盐水和明矾(仅明矾)或卵清蛋白和明矾(ova-明矾)腹膜内致敏，随后在第21天至第24天用ova连续4次鼻内激发。在第25天，收集肺组织和血清用于进一步分析4a-4d中示出的参数。
具体实施方式
97.本文公开了啮齿动物(如但不限于小鼠和大鼠)，所述啮齿动物被基因修饰以包括人源化tslp基因、人源化tslpr基因、人源化il7ra基因或其组合。本文公开的啮齿动物可以用作例如但不限于th2驱动的过敏性疾病的模型，或用作炎性th2驱动的癌症的模型。提供并且在下文进一步描述了用于制备此类经基因修饰的啮齿动物的组合物和方法以及使用此类经基因修饰的啮齿动物测试用于治疗过敏或癌症的候选治疗剂的方法。
98.tslp人源化啮齿动物
99.胸腺基质淋巴细胞生成(tslp)是4-螺旋束细胞因子家族的成员和白细胞介素-7(il-7)的远处旁系同源物。tslp最初是在小鼠胸腺基质细胞系的培养上清液中发现的，并已被证明是t细胞和b细胞的生长因子。参见例如tsilingiri等人,《细胞和分子胃肠病学和肝病学(cell mol.gastroenterology&hepatology)》2017；3:174-182，所述文献通过引用以其整体并入本文。表达tslp的细胞包含上皮细胞、角质细胞、成纤维细胞、基质细胞、树突状细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。参见tsilingiri等人(2017),同上所描述的。在人体内
存在两种tslp同种型：长tslp同种型(同种型1)，其在稳定状态下以低/不可检测的水平表达，并在一些组织的炎症中上调并且是多种th2相关疾病(例如但不限于特应性皮炎、哮喘、过敏性应答和某些类型的癌症)中th2应答加剧的标志；以及短tslp同种型(同种型2),其由单独的启动子组成型表达并在肠道和胸腺中介导某些免疫稳态功能。参见tsilingiri等人(2017),同上所描述的。除非特别指出，否则人tslp基因的外显子编号基于编码长同种型(人tslp蛋白同种型1)的外显子。
100.序列表中公开了示例性序列，包含人tslp同种型1、小鼠tslp、大鼠tslp和人源化tslp的核酸和蛋白序列，并总结于表1中。小鼠和大鼠tslp基因具有小的编码外显子1和总共5个外显子，而不是像人tslp基因中的4个外显子。图1f中提供了人tslp同种型1、小鼠tslp和人源化(杂交体)tslp蛋白序列的比对。
101.表1
[0102][0103]
在一些实施例中，本文公开的啮齿动物包括种系中的人源化tslp基因。
[0104]
在一些实施例中，本文公开的啮齿动物包括在其基因组中包含啮齿动物tslp基因的核苷酸序列和人tslp基因的核苷酸序列的人源化tslp基因。如本文所使用的，“基因的核苷酸序列”包含基因的基因组序列、mrna或cdna序列的全部或部分。例如，人tslp基因的核苷酸序列可以是人tslp基因的基因组序列、mrna序列或cdna序列的全部或部分；并且啮齿动物tslp基因的核苷酸序列可以是啮齿动物tslp基因(例如，内源性啮齿动物tslp基因)的基因组序列、mrna序列或cdna序列的全部或部分。啮齿动物tslp基因的核苷酸序列和人tslp基因的核苷酸序列可操作地彼此连接，使得啮齿动物基因组中的人源化tslp基因编码执行tslp蛋白的功能，例如与tslp受体(tslpr)结合的人源化tslp蛋白。
[0105]
如本文所使用的“人tslp”基因和蛋白是指人来源的tslp基因和蛋白。
[0106]
在一些实施例中，人tslp蛋白包括seq id no:3的氨基酸序列。在一些实施例中，
人tslp蛋白包括与seq id no:3的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，人tslp蛋白包括与seq id no:3的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，人tslp蛋白包括与seq id no:3的氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列。
[0107]
如本文所使用的“啮齿动物tslp”基因和蛋白是指啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)来源的tslp基因和蛋白。
[0108]
在一些实施例中，小鼠tslp蛋白包括
[0109]
seq id no:1的氨基酸序列。在一些实施例中，小鼠tslp蛋白包括与seq id no:1的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。在一些
[0110]
实施例中，小鼠tslp蛋白包括
[0111]
与seq id no:1的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，小鼠tslp蛋白包括与seq id no:1的氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列。
[0112]
在一些实施例中，大鼠tslp蛋白包括seq id no:7的氨基酸序列。在一些实施例中，大鼠tslp蛋白包括与seq id no:7的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，大鼠tslp蛋白包括与seq id no:7的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，大鼠tslp蛋白包括与seq id no:7的氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列。
[0113]
在一些实施例中，经基因修饰的啮齿动物包括在其基因组中的人源化tslp基因，其中人源化tslp基因编码人源化tslp蛋白，所述人源化tslp蛋白包括与人tslp蛋白(如seq id no:3中所示的人tslp蛋白)的成熟蛋白序列基本上相同的成熟蛋白序列。
[0114]“成熟蛋白”是指在n末端信号肽已被切割之后的蛋白的部分。
[0115]
与人tslp蛋白的成熟蛋白序列基本上相同的成熟蛋白序列可以是(i)与人tslp蛋白的成熟蛋白至少95％相同的多肽序列、与人tslp蛋白的成熟蛋白至少98％相同的多肽序列或与人tslp蛋白的成熟蛋白至少99％相同的多肽序列。与人tslp蛋白的成熟蛋白序列基本上相同的成熟蛋白序列可以是与人tslp蛋白的成熟蛋白序列相同的多肽序列。与人tslp蛋白的成熟蛋白序列基本上相同的成熟蛋白序列可以可替代地或另外地是(ii)与人tslp蛋白的成熟蛋白序列相差不超过5个氨基酸的多肽序列、与人tslp蛋白的成熟蛋白序列相差不超过4个氨基酸的多肽序列、与人tslp蛋白的成熟蛋白序列相差不超过3个氨基酸的多肽序列、与人tslp蛋白的成熟蛋白序列相差不超过2个氨基酸的多肽序列或与人tslp蛋白的成熟蛋白序列相差不超过1个氨基酸的多肽序列。与人tslp蛋白的成熟蛋白序列基本上相同的成熟蛋白序列可以可替代地或另外地是(iii)仅在结构域的n或c末端部分处不同于人tslp蛋白的成熟蛋白序列的多肽，例如通过在成熟蛋白的n或c末端部分处添加、缺失或取代氨基酸(不超过5个氨基酸)；“成熟蛋白的n或c末端部分”意指从成熟蛋白的n或c末端开始5-10个氨基酸内。与人tslp蛋白的成熟蛋白序列基本上相同的成熟蛋白序列可以可替代地或另外地是(iv)具有上文(i)-(iii)中所描述的一种或多种特征的多肽，例如，与人tslp蛋白的成熟蛋白至少95％相同并且仅在结构域的n或c末端部分处与人tslp蛋白的成熟蛋白序列相差不超过5个氨基酸的多肽或与人tslp蛋白的成熟蛋白至少98％相同并且仅在结构域的n或c末端部分处与人tslp蛋白的成熟蛋白序列相差不超过3个氨基酸的多肽。
[0116]
在一些实施例中，人tslp蛋白是如seq id no:3中所示的人tslp蛋白同种型1，其中氨基酸29-159构成成熟蛋白序列。因此，在一些实施例中，经基因修饰的啮齿动物包括在其基因组中的人源化tslp基因，所述人源化tslp基因编码人源化tslp蛋白，所述人源化
tslp蛋白包括与如seq id no:3的氨基酸29-159中所示的氨基酸序列基本上相同的成熟蛋白序列。在一些实施例中，人源化tslp蛋白包括包含seq id no:3的氨基酸29-159的成熟蛋白序列。在一些实施例中，人源化tslp蛋白包括包含seq id no:3的氨基酸30-159的成熟蛋白序列。在一些实施例中，人源化tslp蛋白包括包含seq id no:3的氨基酸31-159的成熟蛋白序列。在一些实施例中，人源化tslp蛋白包括包含seq id no:3的氨基酸32-159的成熟蛋白序列。在一些实施例中，人源化tslp蛋白包括包含seq id no:3的氨基酸29-158的成熟蛋白序列。在一些实施例中，人源化tslp蛋白包括包含seq id no:3的氨基酸29-157的成熟蛋白序列。在一些实施例中，人源化tslp蛋白包括包含seq id no:3的氨基酸29-156的成熟蛋白序列。在一些实施例中，人源化tslp蛋白包括如seq id no:3的氨基酸29-159中所示的成熟蛋白序列。
[0117]
在一些实施例中，所述人源化tslp基因编码人源化tslp蛋白，所述人源化tslp蛋白包括与人tslp蛋白的信号肽基本上相同的信号肽。在一些实施例中，与人tslp蛋白的信号肽基本上相同的信号肽是与人tslp蛋白的信号肽序列至少95％相同的信号肽。与人tslp蛋白的信号肽基本上相同的信号肽可以是与人tslp蛋白的信号肽相同的信号肽。另外地或可替代地，与人tslp蛋白的信号肽基本上相同的信号肽可以是与人tslp蛋白的信号肽相差不超过3个氨基酸、不超过2个氨基酸或不超过1个氨基酸的信号肽。在具体实施例中，人tslp蛋白的信号肽包括如seq id no:3的氨基酸1-28中所示的氨基酸序列。
[0118]
在一些实施例中，所述人源化tslp基因编码人源化tslp蛋白，所述人源化tslp蛋白包括与如内源性啮齿动物tslp蛋白等啮齿动物tslp蛋白的信号肽基本上相同的信号肽。在一些实施例中，与啮齿动物tslp蛋白的信号肽基本上相同的信号肽是与啮齿动物tslp蛋白的信号肽在序列上至少95％相同的信号肽；在一些实施例中，与啮齿动物tslp蛋白的信号肽基本上相同的信号肽是与啮齿动物tslp蛋白的信号肽在序列上相同的信号肽。在一些实施例中，与啮齿动物tslp蛋白的信号肽基本上相同的信号肽是与啮齿动物tslp蛋白蛋白的信号肽相差不超过3个氨基酸的信号肽；在一些实施例中，与啮齿动物tslp蛋白的信号肽基本上相同的信号肽是与啮齿动物tslp蛋白蛋白的信号肽相差不超过2个氨基酸的信号肽；在一些实施例中，与啮齿动物tslp蛋白的信号肽基本上相同的信号肽是与啮齿动物tslp蛋白蛋白的信号肽相差不超过1个氨基酸的信号肽。在具体实施例中，人源化tslp蛋白包括与小鼠tslp蛋白的信号肽，例如seq id no:1的氨基酸1-19中所示的信号肽基本上相同的信号肽。在具体实施例中，人源化tslp蛋白包括与大鼠tslp蛋白，例如seq id no:7中所示的大鼠tslp蛋白的信号肽基本上相同的信号肽。
[0119]
如上文所描述的，经基因修饰的啮齿动物的基因组中的人源化tslp基因包含人tslp基因的核苷酸序列(“人tslp核苷酸序列”)和啮齿动物tslp基因的核苷酸序列(“啮齿动物tslp核苷酸序列”，例如，内源性啮齿动物tslp核苷酸序列)。
[0120]
在一些实施例中，人源化tslp基因中的人tslp核苷酸序列至少编码人tslp蛋白(例如，人tslp蛋白同种型1)的大部分成熟蛋白序列。成熟tslp蛋白序列的“大部分”是指接近成熟蛋白序列的全长的多肽。在一些实施例中，大部分成熟蛋白序列是指全长成熟蛋白序列的至少95％的多肽；在一些实施例中，大部分成熟蛋白序列是指全长成熟蛋白序列的至少98％的多肽；在一些实施例中，大部分成熟蛋白序列是指全长成熟蛋白序列的至少99％的多肽。在一些实施例中，大部分成熟蛋白序列是指与成熟蛋白序列的不同之处在于
在成熟蛋白序列的n或c末端处缺少不超过5个氨基酸的多肽；在一些实施例中，大部分成熟蛋白序列是指与成熟蛋白序列的不同之处在于在成熟蛋白序列的n或c末端处缺少不超过4个氨基酸的多肽；在一些实施例中，大部分成熟蛋白序列是指与成熟蛋白序列的不同之处在于在成熟蛋白序列的n或c末端处缺少不超过3个氨基酸的多肽；大部分成熟蛋白序列是指与成熟蛋白序列的不同之处在于在成熟蛋白序列的n或c末端处缺少不超过2个氨基酸的多肽；大部分成熟蛋白序列是指与成熟蛋白序列的不同之处在于在成熟蛋白序列的n或c末端处缺少不超过1个氨基酸的多肽。在一些实施例中，人源化tslp基因中的人tslp核苷酸序列编码人tslp蛋白(例如，人tslp蛋白同种型1，如seq id no:3中所示的人tslp蛋白同种型1)的成熟蛋白序列。在一些实施例中，人源化tslp基因中的所述人tslp核苷酸序列编码seq id no:3的氨基酸29-159。在一些实施例中，人源化tslp基因中的所述人tslp核苷酸序列编码seq id no:3的氨基酸30-159。在一些实施例中，人源化tslp基因中的所述人tslp核苷酸序列编码seq id no:3的氨基酸31-159。在一些实施例中，人源化tslp基因中的所述人tslp核苷酸序列编码seq id no:3的氨基酸32-159。在一些实施例中，人源化tslp基因中的所述人tslp核苷酸序列编码seq id no:3的氨基酸29-158。在一些实施例中，人源化tslp基因中的所述人tslp核苷酸序列编码seq id no:3的氨基酸29-157。在一些实施例中，人源化tslp基因中的所述人tslp核苷酸序列编码seq id no:3的氨基酸29-156。
[0121]
在一些实施例中，人源化tslp基因中的人tslp核苷酸序列是cdna序列。在一些实施例中，人tslp核苷酸序列是人tslp基因的基因组片段。在一些实施例中，人tslp核苷酸序列是包括至少编码人tslp蛋白的大部分成熟蛋白序列的外显子序列的基因组片段。在一些实施例中，人tslp核苷酸序列是包括编码人tslp蛋白(例如，人tslp蛋白同种型1，如seq id no:3中所示的人tslp蛋白同种型1)的成熟蛋白序列的外显子序列的基因组片段。在一些实施例中，人tslp核苷酸序列是人tslp基因的基因组片段，所述片段包括外显子1、外显子2、外显子3的成熟蛋白氨基酸编码部分和外显子4的编码部分(即，至外显子4中的终止密码子)。
[0122]
在一些实施例中，人tslp核苷酸序列是人tslp基因的基因组片段，所述片段还包括人tslp基因的3'utr(人tslp外显子4的3'部分)。
[0123]
在一些实施例中，人源化tslp基因中的所述啮齿动物tslp核苷酸序列编码与啮齿动物tslp蛋白(例如，内源性啮齿动物tslp蛋白)的所述信号肽基本上相同的多肽。在一些实施例中，与啮齿动物tslp蛋白的信号肽基本上相同的多肽包含与啮齿动物tslp蛋白的信号肽在序列上至少95％相同的多肽。在一些实施例中，与啮齿动物tslp蛋白的信号肽基本上相同的多肽包含与啮齿动物tslp蛋白蛋白的信号肽相差不超过3个氨基酸的多肽。在一些实施例中，与啮齿动物tslp蛋白的信号肽基本上相同的多肽包含与啮齿动物tslp蛋白蛋白的信号肽相差不超过2个氨基酸的多肽。在一些实施例中，与啮齿动物tslp蛋白的信号肽基本上相同的多肽包含与啮齿动物tslp蛋白蛋白的信号肽相差不超过1个氨基酸的多肽。在一些实施例中，人源化tslp基因中的啮齿动物tslp核苷酸序列编码啮齿动物tslp蛋白(例如，内源性啮齿动物tslp蛋白，例如，小鼠或大鼠tslp蛋白)的信号肽。在一些实施例中，啮齿动物tslp核苷酸序列包括编码啮齿动物tslp蛋白的信号肽的啮齿动物tslp基因的外显子序列。在一些实施例中，啮齿动物tslp核苷酸序列是小鼠tslp核苷酸序列，并且在一些此类实施例中，小鼠tslp核苷酸序列包括小鼠tslp基因(例如，内源性小鼠tslp基因)的外
显子1和外显子2的信号肽氨基酸编码部分。在一些实施例中，人源化tslp基因中的啮齿动物tslp核苷酸序列包括啮齿动物tslp基因(例如，小鼠或大鼠tslp基因，如内源性小鼠或大鼠tslp基因)的5'utr。
[0124]
在一些实施例中，人源化tslp基因与啮齿动物tslp调控序列，例如，5'转录调控序列，如啮齿动物tslp基因的启动子和/或增强子，如位于内源性啮齿动物tslp基因座处的内源性啮齿动物5'转录调控序列可操作地连接，使得人源化tslp基因的表达在啮齿动物tslp 5'调控序列的控制下。
[0125]
在一些实施例中，人源化tslp基因位于内源性啮齿动物tslp基因座处。在一些实施例中，人源化tslp基因位于除内源性啮齿动物tslp基因座之外的基因座处；例如，由于随机整合。在人源化tslp基因位于除内源性啮齿动物tslp基因座之外的基因座处的一些实施例中，所述啮齿动物不能表达啮齿动物tslp蛋白，例如，由于内源性啮齿动物tslp基因的失活(例如，全部或部分缺失)。
[0126]
在人源化tslp基因位于内源性啮齿动物tslp基因座处的一些实施例中，人源化tslp基因可能是由于位于内源性啮齿动物tslp基因座处的内源性啮齿动物tslp基因的核苷酸序列被人tslp基因的核苷酸序列置换而产生的。
[0127]
在一些实施例中，置换位于内源性啮齿动物tslp基因座处的啮齿动物tslp基因的基因组片段的人tslp基因的核苷酸序列是cdna序列。在一些实施例中，置换位于内源性啮齿动物tslp基因座处的啮齿动物tslp基因的基因组片段的人tslp核苷酸序列是人tslp基因的基因组片段。在一些实施例中，人tslp核苷酸序列至少编码人tslp蛋白的大部分成熟蛋白序列。在一些实施例中，人tslp核苷酸序列是包含包含至少编码人tslp蛋白的大部分成熟蛋白序列的人tslp基因的全部或部分中的外显子的人tslp基因的基因组片段。在一些实施例中，人基因组片段包括人tslp基因外显子1、外显子2、外显子3的成熟蛋白氨基酸编码部分和外显子4的编码部分。在一些实施例中，人基因组片段可以进一步包括人tslp基因的外显子4的3'utr部分。
[0128]
在一些实施例中，整合在内源性啮齿动物tslp基因座处的人核苷酸序列与编码与啮齿动物tslp蛋白的信号肽基本上相同的多肽的啮齿动物tslp核苷酸序列可操作地连接。在一些实施例中，整合在内源性啮齿动物tslp基因座处的人核苷酸序列与基本上编码内源性啮齿动物tslp蛋白的信号肽的内源性啮齿动物tslp基因组序列可操作地连接。在一些实施例中，人核苷酸序列整合在内源性小鼠tslp基因座处并与编码与小鼠tslp蛋白的信号肽基本上相同的多肽的小鼠tslp核苷酸序列可操作地连接；并且在一些此类实施例中，小鼠tslp核苷酸序列包括小鼠tslp基因(例如，内源性小鼠tslp基因)的外显子1和外显子2的信号肽氨基酸编码部分。
[0129]
在一些实施例中，包括编码位于内源性啮齿动物tslp基因座处的内源性啮齿动物tslp蛋白的成熟蛋白序列的外显子序列的基因组片段(例如，从编码成熟小鼠tslp蛋白的第一氨基酸的外显子2中的密码子开始至终止密码子的小鼠基因组片段)已经被包括编码人tslp蛋白的成熟蛋白序列的外显子序列的人tslp基因的基因组片段(例如，从编码成熟人tslp蛋白的第一氨基酸的外显子1中的密码子开始至外显子4中终止密码子的基因组片段)置换。因此，人源化tslp基因在内源性啮齿动物tslp基因座处形成。在一些实施例中，人源化tslp基因在内源性小鼠tslp基因座处形成并包括小鼠tslp外显子1、小鼠tslp外显子2
的信号肽氨基酸编码部分、编码成熟人tslp蛋白的第一氨基酸的人tslp外显子1中的密码子至人tslp外显子4中的终止密码子和小鼠tslp外显子5中的小鼠3'utr。此类人源化tslp基因编码包括小鼠tslp信号肽和成熟人tslp多肽的人源化tslp蛋白。
[0130]
在一些实施例中，本文提供的啮齿动物对其基因组中的人源化tslp基因是杂合的。在一些实施例中，本文提供的啮齿动物对其基因组中的人源化tslp基因是纯合的。
[0131]
在一些实施例中，人源化tslp基因使经编码的人源化tslp蛋白在啮齿动物中，例如在啮齿动物的血清中表达。在一些实施例中，人源化tslp蛋白在细胞和组织中表达，其中对应的啮齿动物tslp蛋白在对照啮齿动物(例如，没有人源化tslp基因的啮齿动物)中表达；例如皮肤、肠、肺和眼组织中的上皮细胞和角质细胞，以及树突状细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。参见例如tsilingiri等人(2017),同上所描述的。
[0132]
在一些实施例中，本文公开的啮齿动物例如由于内源性啮齿动物tslp基因的失活(例如，全部或部分缺失)或置换(全部或部分)而不能表达啮齿动物tslp蛋白。
[0133]
tslpr人源化
[0134]
tslp通过异源二聚体发挥作用，所述异源二聚体由对tslp(被称为“tslpr”或“tslpr”)具有特异性的链和il7受体α链组成。tslpr含有信号肽、细胞外结构域(“ecd”或“胞外结构域”)、跨膜结构域和细胞内(细胞质)结构域。
[0135]
序列表中公开了示例性序列，包含人tslpr同种型1、小鼠tslpr同种型1、大鼠tslpr同种型1和人源化(小鼠-人杂交体)tslpr的核酸和蛋白序列，并总结于表2中。图2f中提供了人tslpr同种型1、小鼠tslpr同种型1和人源化(小鼠-人杂交体)tslpr蛋白序列的比对。除非特别指出，否则人和小鼠基因的外显子编号基于编码人和小鼠蛋白同种型1的外显子。
[0136]
表2
[0137][0138]
在一些实施例中，本文公开的啮齿动物包括种系中的人源化tslpr基因。
[0139]
在一些实施例中，本文公开的啮齿动物包括在其基因组中包含啮齿动物tslpr基因(例如，内源性啮齿动物tslpr基因)的核苷酸序列和人tslpr基因的核苷酸序列的人源化tslpr基因。如本文所使用的，“基因的核苷酸序列”包含基因的基因组序列、mrna或cdna序列的全部或部分。作为非限制性实例，人tslpr基因的核苷酸序列包含人tslpr基因的基因组序列、mrna或cdna序列的全部或部分。啮齿动物tslpr基因的核苷酸序列和人tslpr基因的核苷酸序列可操作地彼此连接，使得啮齿动物基因组中的人源化tslpr基因编码具有tslpr蛋白结构(包括胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域)并执行tslpr功能(例如，与tslp蛋白结合并与il-7受体形成异源二聚体)的人源化tslpr蛋白。
[0140]
如本文所使用的“人tslpr”基因和蛋白是指人来源的tslpr基因和蛋白。在一些实施例中，人tslpr蛋白包括seq id no:23的氨基酸序列。在一些实施例中，人tslpr蛋白包括与seq id no:23的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，人tslpr蛋白包括与seq id no:23的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，人tslpr蛋白包括与seq id no:23的氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列。
[0141]
如本文所使用的“啮齿动物tslpr”基因和蛋白是指啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)来源的tslpr基因和蛋白。在一些实施例中，小鼠tslpr蛋白包括seq id no:21的氨基酸序列。在一些实施例中，小鼠tslpr蛋白包括与seq id no:21的氨基酸序列至少95％相同的氨
基酸序列。在一些实施例中，小鼠tslpr蛋白包括与seq id no:21的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，小鼠tslpr蛋白包括与seq id no:21的氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，大鼠tslpr蛋白包括seq id no:27的氨基酸序列。在一些实施例中，大鼠tslpr蛋白包括与seq id no:27的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，大鼠tslpr蛋白包括与seq id no:27的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，大鼠tslpr蛋白包括与seq id no:27的氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列。
[0142]
在一些实施例中，经基因修饰的啮齿动物含有在其基因组中的人源化tslpr基因，其中人源化tslpr基因编码人源化tslpr蛋白，所述人源化tslpr蛋白含有与人tslpr蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域。在一些实施例中，与人tslpr蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域表现出与人tslpr蛋白的胞外结构域相同的功能性(例如，配体结合性质)。“与人tslpr蛋白的胞外结构域基本上相同”的胞外结构域或多肽可以是(i)与人tslpr蛋白的胞外结构域在序列上至少95％相同的多肽、与人tslpr蛋白的胞外结构域在序列上至少98％相同的多肽或与人tslpr蛋白的胞外结构域在序列上至少99％相同的多肽。“与人tslpr蛋白的胞外结构域基本上相同”的胞外结构域或多肽可以是与人tslpr蛋白的胞外结构域在序列上100％相同的多肽。可替代地或另外地，“与人tslpr蛋白的胞外结构域基本上相同”的胞外结构域或多肽可以是(ii)与人tslpr蛋白的胞外结构域相差不超过10个氨基酸的多肽、与人tslpr蛋白的胞外结构域相差不超过7个氨基酸的多肽、与人tslpr蛋白的胞外结构域相差不超过5个氨基酸的多肽、与人tslpr蛋白的胞外结构域相差不超过4个氨基酸的多肽、与人tslpr蛋白的胞外结构域相差不超过3个氨基酸的多肽、与人tslpr蛋白的胞外结构域相差不超过2个氨基酸的多肽、与人tslpr蛋白的胞外结构域相差不超过1个氨基酸的多肽。可替代地或另外地，“与人tslpr蛋白的胞外结构域基本上相同”的胞外结构域或多肽可以是(iii)仅在胞外结构域的n或c末端部分处不同于人tslpr蛋白的胞外结构域的多肽，例如通过在胞外结构域的n和/或c末端部分处添加、缺失和/或取代氨基酸(即，从胞外结构域的n或c末端开始5-10个氨基酸内)。可替代地或另外地，“与人tslpr蛋白的胞外结构域基本上相同”的胞外结构域或多肽可以是(iv)具有上文(i)-(iii)中所描述的特征中的一种或多种的多肽，例如，与人tslpr蛋白的胞外结构域在序列上至少95％相同并且仅在胞外结构域的n或c末端部分处与人tslpr蛋白的胞外结构域相差不超过10个氨基酸的多肽、与人tslpr蛋白的胞外结构域在序列上至少95％相同并且仅在胞外结构域的n或c末端部分处与人tslpr蛋白的胞外结构域相差不超过5个氨基酸的多肽或与人tslpr蛋白的胞外结构域在序列上至少98％相同并且仅在胞外结构域的n或c末端部分处与人tslpr蛋白的胞外结构域相差不超过3个氨基酸的多肽。在一些实施例中，人tslpr蛋白包括如seq id no:23中所示的氨基酸序列，并且其胞外结构域由seq id no:23的氨基酸23-231组成。在一些实施例中，人源化tslpr基因编码人源化tslpr蛋白，其胞外结构域与如seq id no:23中所示的人tslpr蛋白的胞外结构域基本上相同，即与seq id no:23的氨基酸23-231基本上相同。例如，人源化tslpr基因编码具有包括seq id no:23的氨基酸23-231、24-231、25-231、26-231、27-231、28-231、23-230、23-229、23-228、23-227或23-226的胞外结构域的人源化tslpr蛋白。在一些实施例中，人源化tslpr基因编码具有包括seq id no:23的氨基酸23-231的胞外结构域的人源化tslpr蛋白。在一些实施例中，人源化tslpr基因编码具有包括
seq id no:23的氨基酸25-231的胞外结构域的人源化tslpr蛋白。在一些实施例中，人源化tslpr基因编码具有包括seq id no:23的氨基酸27-231的胞外结构域的人源化tslpr蛋白。在一些实施例中，人源化tslpr基因编码具有包括seq id no:23的氨基酸23-228的胞外结构域的人源化tslpr蛋白。在一些实施例中，人源化tslpr基因编码具有包括seq id no:23的氨基酸23-226的胞外结构域的人源化tslpr蛋白。
[0143]
在一些实施例中，人源化tslpr基因编码具有胞外结构域的人源化tslpr蛋白，所述胞外结构域包括来自啮齿动物tslpr(例如，内源性啮齿动物tslpr)的胞外结构域的n末端的氨基酸，随后是人tslpr的胞外结构域或其大部分。人tslpr(或啮齿动物tslpr)蛋白的“大部分胞外结构域”是指接近蛋白的全胞外结构域的多肽。在一些实施例中，人tslpr蛋白的大部分胞外结构域是指人tslpr蛋白全长胞外结构域的至少95％的多肽。在一些实施例中，人tslpr蛋白的大部分胞外结构域是指人tslpr蛋白全长胞外结构域的至少98％的多肽。序列。在一些实施例中，人tslpr蛋白的大部分胞外结构域是指与全长胞外结构域的不同之处在于在胞外结构域的n或c末端处缺少不超过10个氨基酸的多肽。在一些实施例中，人tslpr蛋白的大部分胞外结构域是指与全长胞外结构域的不同之处在于在胞外结构域的n或c末端处缺少不超过5个氨基酸的多肽。在一些实施例中，人tslpr蛋白的大部分胞外结构域是指与全长胞外结构域的不同之处在于在胞外结构域的n或c末端处缺少不超过4个氨基酸的多肽。例如，如seq id no:23中所示的人tslpr蛋白的胞外结构域由氨基酸23-231定义，并且大部分胞外结构域的实例可以包含seq id no:23的氨基酸25-231、26-231、27-231、23-228、23-227或23-226。在一些实施例中，人tslpr蛋白的大部分胞外结构域包括seq id no:23的氨基酸25-231。在一些实施例中，人tslpr蛋白的大部分胞外结构域包括seq id no:23的氨基酸27-231。在一些实施例中，人tslpr蛋白的大部分胞外结构域包括seq id no:23的氨基酸23-228。在一些实施例中，人tslpr蛋白的大部分胞外结构域包括seq id no:23的氨基酸23-226。在一些实施例中，人源化tslpr蛋白的胞外结构域包括来自啮齿动物tslpr(例如，内源性啮齿动物tslpr)的胞外结构域的n末端的6-8个氨基酸，随后是人tslpr蛋白的大部分胞外结构域。在一些实施例中，人源化tslpr蛋白的胞外结构域包括来自啮齿动物tslpr(例如，内源性啮齿动物tslpr)的胞外结构域的n末端的7个氨基酸，随后是seq id no:23的氨基酸27-231。在一些实施例中，人源化tslpr基因编码含有如seq id no:25的氨基酸20-231中所示的胞外结构域的人源化tslpr蛋白——该胞外结构域包括来自小鼠tslpr胞外结构域的n末端的7个氨基酸，随后是seq id no:23(人tslpr)的氨基酸27-231；并且在胞外结构域的n末端中不同于seq id no:23的人tslpr蛋白的胞外结构域(seq id no:25的人源化tslpr中的“aaavtsr”(seq id no:67)，与seq id no:23的人tslpr中的“qgga”(seq id no:68)相反)，但是在其余的ame 205个氨基酸中与人tslp胞外结构域相同。
[0144]
在一些实施例中，人源化tslpr基因编码人源化tslpr蛋白，所述人源化tslpr蛋白含有与啮齿动物tslpr蛋白，例如内源性啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列基本上相同的跨膜细胞质序列(即，包含跨膜结构域和细胞质结构域两者的序列)。在一些实施例中，与内源性啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列基本上相同的跨膜细胞质序列表现出与如内源性啮齿动物tslpr蛋白等啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列相同的功能性(例如，信号转导和/或与细胞内分子的相互作用)。“与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列基本上
相同”的跨膜细胞质序列或多肽可以是(i)与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列在序列上至少95％相同的多肽或与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列在序列上至少98％相同的多肽。“与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列基本上相同”的跨膜细胞质序列或多肽可以是与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列相同的多肽。可替代地或另外地，“与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列基本上相同”的跨膜细胞质序列或多肽可以是(ii)与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列相差不超过5个氨基酸的多肽、与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列相差不超过4个氨基酸的多肽、与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列相差不超过3个氨基酸的多肽、与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列相差不超过2个氨基酸的多肽或与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列相差不超过1个氨基酸的多肽。可替代地或另外地，“与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列基本上相同”的跨膜细胞质序列或多肽可以是(iii)在一些实施例中，仅在n或c末端处不同于啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列的多肽，例如通过在跨膜细胞质序列的n或c末端部分处添加、缺失或取代氨基酸。可替代地或另外地，“与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列基本上相同”的跨膜细胞质序列或多肽可以是(iv)具有上文(i)-(iii)中所描述的一种或多种特征的多肽，例如与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列在序列上至少95％相同并且仅在n或c末端处与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列相差不超过5个氨基酸的多肽；或与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列在序列上至少95％相同并且仅在n或c末端处与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列相差不超过3个氨基酸的多肽。“跨膜细胞质序列的n或c末端部分”意指从跨膜结构域的n末端开始5-10个氨基酸内或从细胞质结构域的c末端开始5-10个氨基酸内。在一些实施例中，人源化tslpr蛋白含有与小鼠tslpr蛋白(如内源性小鼠tslpr蛋白)的跨膜细胞质序列基本上相同的跨膜细胞质序列。在一些实施例中，人源化tslpr蛋白含有与大鼠tslpr蛋白(如内源性大鼠tslpr蛋白)的跨膜细胞质序列基本上相同的跨膜细胞质序列。
[0145]
在一些实施例中，人源化tslp基因编码人源化tslpr蛋白，所述人源化tslpr蛋白含有与啮齿动物tslpr蛋白(例如，内源性啮齿动物tslpr蛋白)的信号肽基本上相同的信号肽。“与啮齿动物tslpr蛋白的信号肽基本上相同”的信号肽可以是(i)与啮齿动物tslpr蛋白的信号肽在序列上至少95％相同的多肽或与啮齿动物tslpr蛋白的信号肽在序列上相同的多肽。可替代地或另外地，“与啮齿动物tslpr蛋白的信号肽基本上相同”的信号肽可以是(ii)与内源性啮齿动物tslpr蛋白的信号肽相差不超过3个氨基酸的多肽、与内源性啮齿动物tslpr蛋白的信号肽相差不超过2个氨基酸的多肽或与内源性啮齿动物tslpr蛋白的信号肽相差不超过1个氨基酸的多肽。可替代地或另外地，“与啮齿动物tslpr蛋白的信号肽基本上相同”的信号肽可以是仅在n或c末端处不同于内源性啮齿动物tslpr蛋白的信号肽的多肽，例如通过在信号肽的n或c末端部分处添加、缺失或取代氨基酸。可替代地或另外地，“与啮齿动物tslpr蛋白的信号肽基本上相同”的信号肽可以是(iv)具有上文(i)-(iii)中所描述的一种或多种特征的多肽，例如与啮齿动物tslpr蛋白的信号肽至少95％相同并且仅在n或c末端处与啮齿动物tslpr蛋白的信号肽相差不超过3个氨基酸的多肽。“信号肽的n或c末端部分”意指从信号肽的n或c末端开始5个氨基酸内。在一些实施例中，人源化tslpr蛋白包含与小鼠tslpr蛋白(如内源性小鼠tslpr蛋白)的信号肽基本上相同的信号肽。在一些实施例中，人源化tslpr蛋白包含与大鼠tslpr蛋白(如内源性大鼠tslpr蛋白)的信号肽基本上相同的信号肽。
[0146]
在一些实施例中，经基因修饰的啮齿动物的基因组中的人源化tslpr基因包含人tslpr基因的核苷酸序列(“人tslpr核苷酸序列”)和啮齿动物tslpr基因的核苷酸序列(“啮齿动物tslpr核苷酸序列”，如内源性啮齿动物tslpr核苷酸序列)，其中人tslpr核苷酸序列至少编码人tslpr蛋白的大部分胞外结构域。如上文所描述的，人tslpr的大部分胞外结构域的实例可以包含seq id no:23的氨基酸25-231、26-231、27-231、23-228、23-227或23-226。在一些实施例中，大部分胞外结构域包括seq id no:23的氨基酸27-231。在一些实施例中，大部分胞外结构域包括seq id no:23的氨基酸25-231。在一些实施例中，大部分胞外结构域包括seq id no:23的氨基酸23-228。在一些实施例中，大部分胞外结构域包括seq id no:23的氨基酸23-226。在一些实施例中，人tslpr核苷酸序列是cdna序列。在一些实施例中，人源化tslpr基因中的人tslpr核苷酸序列编码人tslpr蛋白(例如，seq id no:23中定义的人tslpr蛋白同种型1)的胞外结构域。在一些实施例中，人tslpr核苷酸序列是人tslpr基因的基因组片段。在一些实施例中，人tslpr核苷酸序列是人tslpr基因的基因组片段，所述人tslpr基因包括外显子2至编码人tslpr蛋白的胞外结构域的最后一个氨基酸的外显子6中的密码子。在一些实施例中，人tslpr基因组片段编码人tslpr同种型1的氨基酸27-231，缺少人tslpr同种型1的胞外结构域的n末端处的4个氨基酸。在一些实施例中，人tslpr基因组片段进一步包括内含子1的3'部分，与外显子2至编码人tslpr蛋白的胞外结构域的最后一个氨基酸的外显子6中的密码子可操作地连接。
[0147]
在一些实施例中，经基因修饰的啮齿动物的基因组中的人源化tslpr基因包含啮齿动物tslpr核苷酸序列和人tslpr核苷酸序列，其中啮齿动物tslpr核苷酸序列编码与啮齿动物tslpr蛋白(例如，内源性啮齿动物tslpr蛋白)的跨膜细胞质序列基本上相同的多肽。在一些实施例中，人源化tslpr基因中存在的啮齿动物tslpr核苷酸序列编码内源性啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列。在一些实施例中，人源化tslpr基因中存在的啮齿动物tslpr核苷酸序列是小鼠tslpr核苷酸序列；并且在一些此类实施例中，小鼠tslpr核苷酸序列包括小鼠tslpr基因(例如，内源性小鼠tslpr基因)的外显子6(从编码小鼠tslpr跨膜结构域的第一氨基酸的密码子开始)至外显子8的一部分。
[0148]
在一些实施例中，经基因修饰的啮齿动物的基因组中的人源化tslpr基因包含人tslpr核苷酸序列上游(5')的啮齿动物tslpr核苷酸序列，其中啮齿动物tslpr核苷酸序列编码与啮齿动物tslpr蛋白(例如，内源性啮齿动物tslpr蛋白)的信号肽基本上相同的多肽。在一些实施例中，编码与啮齿动物tslpr蛋白的信号肽基本上相同的多肽的啮齿动物tslpr核苷酸序列是小鼠tslpr核苷酸序列(例如，内源性小鼠tslpr核苷酸序列)或大鼠tslpr核苷酸序列(例如，内源性大鼠tslpr核苷酸序列)。在一些实施例中，啮齿动物tslpr核苷酸序列编码包括信号肽序列和来自啮齿动物tslpr蛋白的胞外结构域的n末端的氨基酸(例如，6-8个氨基酸)的多肽。在一些实施例中，啮齿动物tslpr核苷酸序列编码包括信号肽序列和来自啮齿动物tslpr蛋白的胞外结构域的n末端的7个氨基酸的多肽。在一些实施例中，啮齿动物tslpr核苷酸序列是包括小鼠tslpr基因(例如，内源性小鼠tslpr基因)的外显子1的小鼠tslpr核苷酸序列；并且在一些此类实施例中，小鼠tslpr核苷酸序列进一步包括小鼠tslpr基因的内含子1的5'部分。
[0149]
在一些实施例中，人源化tslpr基因与啮齿动物tslpr 5'调控序列，如内源性啮齿动物tslpr调控序列，例如5'转录调控序列，如启动子和/或增强子可操作地连接，使得人源
化tslpr基因的表达在啮齿动物tslpr 5'调控序列的控制下。
[0150]
在一些实施例中，人源化tslpr基因位于内源性啮齿动物tslpr基因座处。在一些实施例中，人源化tslpr基因位于除内源性啮齿动物tslpr基因座之外的基因座处；例如，由于随机整合。在人源化tslpr基因位于除内源性啮齿动物tslpr基因座之外的基因座处的一些实施例中，所述啮齿动物不能表达啮齿动物tslpr蛋白，例如，由于内源性啮齿动物tslpr基因的失活(例如，全部或部分缺失)。
[0151]
在人源化tslpr基因位于内源性啮齿动物tslpr基因座处的一些实施例中，人源化tslpr基因是由于内源性啮齿动物tslpr基因座处的内源性啮齿动物tslpr基因的核苷酸序列被人tslpr基因的核苷酸序列置换而产生的。
[0152]
在一些实施例中，正在被置换的内源性啮齿动物tslpr基因座处的内源性啮齿动物tslpr基因的核苷酸序列是内源性啮齿动物tslpr基因的基因组片段，所述基因组片段至少编码啮齿动物tslpr蛋白的大部分胞外结构域。在一些实施例中，啮齿动物是小鼠，并且被置换的小鼠tslpr基因组片段至少编码内源性小鼠tslpr蛋白的大部分胞外结构域。例如，seq id no:21的小鼠tslpr的胞外结构域由氨基酸20-243定义，大部分胞外结构域的实例可以包含seq id no:21的氨基酸21-243、22-243、23-243、24-243、25-243、26-243、27-243、20-241、20-240、20-239和20-238。在一些实施例中，小鼠tslpr蛋白的大部分胞外结构域包括seq id:21的氨基酸27-243。在一些实施例中，小鼠tslpr蛋白的大部分胞外结构域包括seq id:21的氨基酸25-243。在一些实施例中，小鼠tslpr蛋白的大部分胞外结构域包括seq id:21的氨基酸20-240。在一些实施例中，小鼠tslpr蛋白的大部分胞外结构域包括seq id:21的氨基酸20-238。在一些实施例中，要置换的小鼠tslpr基因组片段包括外显子2至编码胞外结构域的最后一个氨基酸的外显子6中的密码子。
[0153]
在一些实施例中，置换内源性啮齿动物tslpr基因座处的啮齿动物tslpr基因的基因组片段的人tslpr基因的核苷酸序列是cdna序列。在一些实施例中，置换内源性啮齿动物tslpr基因座处的啮齿动物tslpr基因的基因组片段的人tslpr核苷酸序列是人tslpr基因的基因组片段。在一些实施例中，置换内源性啮齿动物tslpr基因座处的啮齿动物tslpr基因的基因组片段的人tslpr基因的基因组片段包含人tslpr基因的外显子的全部或部分，所述外显子至少编码人tslpr蛋白的大部分胞外结构域。上文已经描述了人tslpr的大部分胞外结构域的实例，例如seq id no:23的氨基酸23-231、24-231、25-231、26-231、27-231、28-231、23-230、23-229、23-228、23-227或23-226。在一些实施例中，人tslpr的大部分胞外结构域包括seq id no:23的氨基酸25-231。在一些实施例中，人tslpr的大部分胞外结构域包括seq id no:23的氨基酸27-231。在一些实施例中，人tslpr的大部分胞外结构域包括seq id no:23的氨基酸23-228。在一些实施例中，人tslpr的大部分胞外结构域包括seq id no:23的氨基酸23-226。在一些实施例中，人基因组片段包括人tslpr外显子2至编码人tslpr胞外结构域的最后一个氨基酸的外显子6中的密码子。
[0154]
在一些实施例中，插入到内源性啮齿动物tslpr基因座中的人tslpr核苷酸序列与啮齿动物tslpr基因的基因组序列可操作地连接，所述啮齿动物tslpr基因编码与啮齿动物tslpr蛋白(如内源性啮齿动物，例如小鼠或大鼠，tslpr蛋白)的跨膜细胞质序列基本上相同的多肽。在啮齿动物是小鼠的实施例中，小鼠tslpr基因的基因组序列在一些实施例中包括小鼠tslpr基因(例如，内源性小鼠tslpr基因)的从编码跨膜结构域的第一氨基酸的密码
子开始的外显子6至外显子8。
[0155]
在一些实施例中，插入到内源性啮齿动物tslpr基因座中的人tslpr核苷酸序列与啮齿动物tslpr基因的基因组序列可操作地连接，所述啮齿动物tslpr基因编码与啮齿动物tslpr蛋白(如内源性啮齿动物，例如小鼠或大鼠，tslpr蛋白)的信号肽基本上相同的多肽。在啮齿动物是小鼠的实施例中，小鼠tslpr基因的基因组序列在一些实施例中包括小鼠tslpr基因(例如，内源性小鼠tslpr基因)的外显子1以及任选地内含子1的全部或部分。
[0156]
在一些实施例中，啮齿动物是小鼠，并且包括外显子2至编码小鼠tslpr胞外结构域的最后一个氨基酸的外显子6中的密码子的内源性小鼠tslpr基因座处的内源性小鼠tslpr基因的基因组片段已被包括外显子2至编码人tslpr胞外结构域的最后一个氨基酸的外显子6中的密码子的人tslpr基因的基因组片段置换。在一些实施例中，人源化tslpr基因在内源性啮齿动物tslpr基因座处形成并且包括小鼠tslpr基因的外显子1、外显子2至编码人tslpr基因的最后一个氨基酸的外显子6中的密码子，以及从编码小鼠tslpr跨膜结构域的第一氨基酸的密码子开始的外显子6至小鼠tslpr基因的外显子8。
[0157]
在一些实施例中，本文提供的啮齿动物对其基因组中的人源化tslpr基因是杂合的。在一些实施例中，本文提供的啮齿动物对其基因组中的人源化tslpr基因是纯合的。
[0158]
在一些实施例中，人源化tslpr基因使经编码的人源化tslpr蛋白在啮齿动物中表达。在一些实施例中，人源化tslpr蛋白在细胞和组织中表达，其中对应的啮齿动物(例如，没有人源化tslpr基因的啮齿动物)中的对应啮齿动物tslpr蛋白通常在例如树突状细胞、cd4+t细胞和第2组先天淋巴细胞以及非免疫细胞类型如上皮细胞、内皮细胞和平滑肌细胞上表达。
[0159]
在一些实施例中，本文公开的啮齿动物例如由于内源性啮齿动物tslpr基因的失活(例如，全部或部分缺失)或置换(全部或部分)而不能表达啮齿动物tslpr蛋白。
[0160]
il7ra人源化
[0161]
tslp通过异源二聚体发挥作用，所述异源二聚体由对tslp(被称为“tslpr”或“tslpr”)具有特异性的链和il7受体α链组成(“il7ra”用于人并且“il7ra”用于非人或人源化分子)。il7ra含有信号肽、细胞外结构域(“ecd”或“胞外结构域”)、跨膜结构域和细胞内(细胞质)结构域。
[0162]
序列表中公开了示例性序列，包含人il7ra、小鼠il7ra、大鼠il7ra和人源化(小鼠-人杂交体)il7ra的核酸和蛋白序列，并总结于表3中。图3f中提供了人il7ra和小鼠il7ra蛋白序列的比对。
[0163]
表3
[0164]
[0165][0166]
在一些实施例中，本文公开的啮齿动物包括种系中的人源化il7ra基因。
[0167]
在一些实施例中，本文公开的啮齿动物包括在其基因组中包含啮齿动物il7ra基因(例如，内源性啮齿动物il7ra基因)的核苷酸序列和人il7ra基因的核苷酸序列的人源化il7ra基因。如本文所使用的，“基因的核苷酸序列”包含基因的基因组序列、mrna或cdna序列的全部或部分。作为非限制性实例，人il7ra基因的核苷酸序列包含人il7ra基因的基因组序列、mrna或cdna序列的全部或部分。啮齿动物il7ra基因的核苷酸序列和人il7ra基因的核苷酸序列可操作地彼此连接，使得啮齿动物基因组中的人源化il7ra基因编码具有il7ra蛋白结构(包括胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域)并执行il7ra功能(例如，与il7蛋白结合并与和tslp结合的tslpr形成异源二聚体)的人源化il7ra蛋白。
[0168]
如本文所使用的“人il7ra”基因和蛋白是指人来源的il7ra基因和蛋白。在一些实施例中，人il7ra蛋白包括seq id no:43的氨基酸序列。在一些实施例中，人il7ra蛋白包括与seq id no:43的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，人il7ra蛋白包括与seq id no:43的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，人il7ra蛋白包括与seq id no:43的氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列。
[0169]
如本文所使用的“啮齿动物il7ra”基因和蛋白是指啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)来源的il7rar基因和蛋白。在一些实施例中，小鼠il7ra蛋白包括seq id no:41的氨基酸序列。在一些实施例中，小鼠il7ra蛋白包括与seq id no:41的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，小鼠il7rar蛋白包括与seq id no:41的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，小鼠il7rar蛋白包括与seq id no:41的氨基酸序列
至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，大鼠il7ra蛋白包括seq id no:47的氨基酸序列。在一些实施例中，大鼠il7ra蛋白包括与seq id no:47的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，大鼠il7ra蛋白包括与seq id no:47的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，大鼠il7ra蛋白包括与seq id no:47的氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列。
[0170]
在一些实施例中，经基因修饰的啮齿动物含有在其基因组中的人源化il7ra基因，其中人源化il7ra基因编码人源化il7ra蛋白，所述人源化il7ra蛋白含有与人il7ra蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域。在一些实施例中，与人il7ra蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域表现出与人il7ra蛋白的胞外结构域相同的功能性(例如，配体结合性质)。“与人il7ra蛋白的胞外结构域基本上相同”的胞外结构域或多肽可以是与人il7ra蛋白的胞外结构域在序列上至少95％相同的多肽；与人il7ra蛋白的胞外结构域在序列上至少98％相同的多肽；或与人il7ra蛋白的胞外结构域在序列上至少99％相同的多肽。“与人il7ra蛋白的胞外结构域基本上相同”的胞外结构域或多肽可以是与人il7ra蛋白的胞外结构域在序列上100％相同的多肽。可替代地或另外地，“与人il7ra蛋白的胞外结构域基本上相同”的胞外结构域或多肽可以是(ii)与人il7ra蛋白的胞外结构域相差不超过10个氨基酸的多肽、与人il7ra蛋白的胞外结构域相差不超过7个氨基酸的多肽、与人il7ra蛋白的胞外结构域相差不超过5个氨基酸的多肽、与人il7ra蛋白的胞外结构域相差不超过4个氨基酸的多肽、与人tslpr蛋白的胞外结构域相差不超过3个氨基的多肽、与人tslpr蛋白的胞外结构域相差不超过2个氨基酸的多肽或与人tslpr蛋白的胞外结构域相差不超过1个氨基酸的多肽。可替代地或另外地，“与人il7ra蛋白的胞外结构域基本上相同”的胞外结构域或多肽可以是(iii)仅在胞外结构域的n或c末端部分处不同于人il7ra蛋白的胞外结构域的多肽，例如通过在胞外结构域的n和/或c末端部分处添加、缺失和/或取代氨基酸(即，从胞外结构域的n或c末端开始5-10个氨基酸内)。可替代地或另外地，“与人il7ra蛋白的胞外结构域基本上相同”的胞外结构域或多肽可以是(iv)具有上文(i)-(iii)中所描述的特征中的一种或多种的多肽，例如，与人il7ra蛋白的胞外结构域在序列上至少95％相同并且仅在胞外结构域的n或c末端部分处与人il7ra蛋白的胞外结构域相差不超过5个氨基酸的多肽；或与人il7ra蛋白的胞外结构域在序列上至少98％相同并且仅在胞外结构域的n或c末端部分处与人il7ra蛋白的胞外结构域相差不超过3个氨基酸的多肽。在一些实施例中，人il7ra蛋白包括如seq id no:43中所示的氨基酸序列，并且其胞外结构域由seq id no:43的氨基酸21-238定义。在一些实施例中，人源化il7ra基因编码人源化il7ra蛋白，其胞外结构域与如seq id no:43中所示的人il7ra蛋白的胞外结构域基本上相同，即与seq id no:43的氨基酸21-238基本上相同。在一些实施例中，人源化il7ra蛋白包括包含seq id no:43的氨基酸21-238的胞外结构域。在一些实施例中，人源化il7ra蛋白包括包含seq id no:43的氨基酸21-237的胞外结构域。在一些实施例中，人源化il7ra蛋白包括包含seq id no:43的氨基酸21-236的胞外结构域。在一些实施例中，人源化il7ra蛋白包括包含seq id no:43的氨基酸22-238的胞外结构域。在一些实施例中，人源化il7ra蛋白包括包含seq id no:43的氨基酸24-238的胞外结构域。
[0171]
在一些实施例中，人源化il7ra基因编码具有胞外结构域的人源化il7ra蛋白，所述胞外结构域包括人il7ra的胞外结构域或其大部分，随后是来自啮齿动物il7ra(例如，内
源性啮齿动物il7ra)的胞外结构域的c末端的氨基酸。人il7ra(或啮齿动物il7ra)蛋白的“大部分胞外结构域”是指接近人il7ra(或啮齿动物il7ra)蛋白的全胞外结构域的多肽。在一些实施例中，大部分胞外结构域包含全长胞外结构域序列的至少95％。在一些实施例中，大部分胞外结构域包含全长胞外结构域序列的至少98％。在一些实施例中，大部分胞外结构域与胞外结构域的不同之处在于在胞外结构域的n或c末端处缺少不超过10个氨基酸。在一些实施例中，大部分胞外结构域与胞外结构域的不同之处在于在胞外结构域的n或c末端处缺少不超过7个氨基酸。在一些实施例中，大部分胞外结构域与胞外结构域的不同之处在于在胞外结构域的n或c末端处缺少不超过5个氨基酸。在一些实施例中，大部分胞外结构域与胞外结构域的不同之处在于在胞外结构域的n或c末端处缺少不超过3个氨基酸。例如，如seq id no:43中所示的人il7ra蛋白的胞外结构域由氨基酸21-238定义，并且大部分胞外结构域的实例可以包含如seq id no:43中所示的人il7ra蛋白的氨基酸22-238、23-238、24-238、21-237、21-236、21-235。在一些实施例中，人il7ra的大部分胞外结构域包括seq id no:43的氨基酸21-236。在一些实施例中，人il7ra的大部分胞外结构域包括seq id no:43的氨基酸21-237。在一些实施例中，人il7ra的大部分胞外结构域包括seq id no:43的氨基酸22-238。在一些实施例中，人il7ra的大部分胞外结构域包括seq id no:43的氨基酸23-238。在一些实施例中，人源化il7ra蛋白的胞外结构域包括人il7ra的大部分胞外结构域，随后是来自啮齿il7ra(例如，内源性啮齿动物il7ra)的胞外结构域的c末端的1-3个氨基酸。在一些实施例中，人源化il7ra蛋白的胞外结构域包括seq id no:43的氨基酸21-236，随后是来自啮齿动物il7ra的胞外结构域的c末端的2个氨基酸。在一些实施例中，人源化il7ra基因编码含有包括seq id no:45的氨基酸21-238的胞外结构域的人源化il7ra蛋白——该胞外结构域包括seq id no:43(人il7ra)的氨基酸21-236和来自小鼠il7ra的胞外结构域的c末端的最后2个氨基酸(“gw”)，并且在胞外结构域的c末端处的两个氨基酸中不同于seq id no:43的人il7ra蛋白的胞外结构域(seq id no:45的人源化il7ra中的“gw”，与seq id no:43的人il7ra中的“em”相反)并且在其它方面与人il7ra胞外结构域相同。
[0172]
在一些实施例中，人源化il7ra基因编码人源化il7ra蛋白，所述人源化il7ra蛋白含有与啮齿动物il7ra蛋白，例如内源性啮齿动物il7ra蛋白的跨膜细胞质序列基本上相同的跨膜细胞质序列(即，包含跨膜结构域和细胞质结构域两者的序列)。在一些实施例中，与内源性啮齿动物il7ra蛋白的跨膜细胞质序列基本上相同的跨膜细胞质序列表现出与如内源性啮齿动物il7ra蛋白等啮齿动物il7ra蛋白的跨膜细胞质序列相同的功能性(例如，信号转导和/或与细胞内分子的相互作用)。“与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列基本上相同”的跨膜细胞质序列或多肽可以是(i)与啮齿动物il7ra蛋白的跨膜细胞质序列在序列上至少95％相同的多肽或与啮齿动物il7ra蛋白的跨膜细胞质序列在序列上至少98％相同的多肽；在一些实施例中。“与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列基本上相同”的跨膜细胞质序列或多肽可以是与啮齿动物il7ra蛋白的跨膜细胞质序列在序列上相同的多肽。可替代地或另外地，“与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列基本上相同”的跨膜细胞质序列或多肽可以是(ii)与啮齿动物il7ra蛋白的跨膜细胞质序列相差不超过5个氨基酸的多肽、与啮齿动物il7ra蛋白的跨膜细胞质序列相差不超过4个氨基酸的多肽、与啮齿动物il7ra蛋白的跨膜细胞质序列相差不超过3个氨基酸的多肽、与啮齿动物il7ra蛋白的跨膜
细胞质序列相差不超过2个氨基酸的多肽、与啮齿动物il7ra蛋白的跨膜细胞质序列相差不超过1个氨基酸的多肽。可替代地或另外地，“与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列基本上相同”的跨膜细胞质序列或多肽可以是(iii)仅在n或c末端处不同于啮齿动物il7ra蛋白的跨膜细胞质序列的多肽，例如通过在跨膜细胞质序列的n或c末端部分处添加、缺失或取代氨基酸。可替代地或另外地，“与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列基本上相同”的跨膜细胞质序列或多肽可以是(iv)具有上文(i)-(iii)中所描述的一种或多种特征的多肽，例如，与啮齿动物il7ra蛋白的跨膜细胞质序列在序列上至少95％相同并且仅在n或c末端处与啮齿动物il7ra蛋白的跨膜细胞质序列相差不超过3个氨基酸的多肽。“跨膜细胞质序列的n或c末端部分”意指从跨膜结构域的n末端开始5-10个氨基酸内或从细胞质结构域的c末端开始5-10个氨基酸内。在一些实施例中，人源化il7ra蛋白含有与小鼠il7ra蛋白(如内源性小鼠il7ra蛋白)的跨膜细胞质序列基本上相同，或与大鼠il7ra蛋白(如内源性大鼠il7ra蛋白)的跨膜细胞质序列基本上相同的跨膜细胞质序列。
[0173]
在一些实施例中，人源化il7ra基因编码人源化il7ra蛋白，所述人源化il7ra蛋白含有与啮齿动物il7ra蛋白(例如，内源性啮齿动物il7ra蛋白)的信号肽基本上相同的信号肽。在一些实施例中，人源化il7ra基因编码人源化il7ra蛋白，所述人源化il7ra蛋白含有与人il7ra蛋白(例如，如seq id no:43中所示的人il7ra蛋白)的信号肽基本上相同的信号肽。与参考蛋白(人il7ra蛋白或啮齿动物il7ra蛋白)的信号肽“基本上相同”的信号肽可以是(i)与参考蛋白的信号肽在序列上至少95％相同的多肽或与参考蛋白的信号肽在序列上相同的多肽。可替代地或另外地，与参考蛋白的信号肽“基本上相同”的信号肽可以是(ii)与参考蛋白的信号肽相差不超过3个氨基酸的多肽、与参考蛋白的信号肽相差不超过2个氨基酸的多肽；在一些实施例中，或与参考蛋白的信号肽相差不超过1个氨基酸的多肽。可替代地或另外地，与参考蛋白的信号肽“基本上相同”的信号肽可以是(iii)仅在n或c末端处不同于参考蛋白的信号肽的多肽，例如通过在信号肽的n或c末端部分处添加、缺失或取代氨基酸；或(iv)具有上文(i)-(iii)中所描述的一种或多种特征的多肽，例如与参考蛋白的信号肽至少95％相同并且仅在n或c末端处与参考蛋白的信号肽相差不超过3个氨基酸的多肽。“信号肽的n或c末端部分”意指从信号肽的n或c末端开始5个氨基酸内。在一些实施例中，人源化il7ra蛋白包含与小鼠il7ra蛋白(如内源性小鼠il7ra蛋白)的信号肽基本上相同的信号肽。在一些实施例中，人源化il7ra蛋白包含与大鼠il7ra蛋白(如内源性大鼠il7ra蛋白)的信号肽基本上相同的信号肽。在一些实施例中，人源化il7ra蛋白包含与人il7ra蛋白(例如，如seq id no:43中所示的人il7ra蛋白)的信号肽基本上相同的信号肽。
[0174]
在一些实施例中，经基因修饰的啮齿动物的基因组中的人源化il7ra基因包含人il7ra基因的核苷酸序列(“人il7ra核苷酸序列”)和啮齿动物il7ra基因的核苷酸序列(“啮齿动物il7ra核苷酸序列”，如内源性啮齿动物il7ra核苷酸序列)，其中人il7ra核苷酸序列至少编码人il7ra蛋白的大部分胞外结构域。在一些实施例中，人il7ra核苷酸序列是cdna序列。在一些实施例中，人源化il7ra基因中的人il7ra核苷酸序列编码人il7ra蛋白的胞外结构域(例如，seq id no:43的人il7ra蛋白)。在一些实施例中，人il7ra核苷酸序列是人il7ra基因的基因组片段。在一些实施例中，人il7ra核苷酸序列是人il7ra基因的基因组片段，所述基因组片段包括从编码成熟蛋白序列中的第一氨基酸的外显子2中的密码子至外显子5(即，至编码氨基酸残基的密码子，所述氨基酸残基是人il7ra蛋白的跨膜区段开始前
的两个氨基酸)。在一些实施例中，人il7ra基因组片段编码人il7ra蛋白的氨基酸21-238(例如，如seq id no:43中所示的人il7ra蛋白)。在一些实施例中，人il7ra基因组片段编码人il7ra蛋白的氨基酸21-237(例如，如seq id no:43中所示的人il7ra蛋白)。在一些实施例中，人il7ra基因组片段编码人il7ra蛋白的氨基酸21-236(例如，如seq id no:43中所示的人il7ra蛋白)。在一些实施例中，人il7ra基因组片段编码人il7ra蛋白的氨基酸21-235(例如，如seq id no:43中所示的人il7ra蛋白)。在一些实施例中，人il7ra基因组片段编码人il7ra蛋白的氨基酸22-238(例如，如seq id no:43中所示的人il7ra蛋白)。在一些实施例中，人il7ra基因组片段编码人il7ra蛋白的氨基酸24-238(例如，如seq id no:43中所示的人il7ra蛋白)。在一些实施例中，人il7ra基因组片段进一步包括内含子5的5'部分。
[0175]
在一些实施例中，经基因修饰的啮齿动物的基因组中的人源化il7ra基因包含啮齿动物il7ra核苷酸序列和人il7ra核苷酸序列，其中啮齿动物il7ra核苷酸序列编码与啮齿动物il7ra蛋白(例如，内源性啮齿动物il7ra蛋白)的跨膜细胞质序列基本上相同的多肽。在一些实施例中，人源化il7ra基因中存在的啮齿动物il7ra核苷酸序列编码内源性啮齿动物il7ra蛋白的跨膜细胞质序列。在一些实施例中，人源化il7ra基因中存在的啮齿动物il7ra核苷酸序列是小鼠il7ra核苷酸序列；并且在一些此类实施例中，小鼠il7ra核苷酸序列包括小鼠il7ra基因(例如，内源性小鼠il7ra基因)的内含子5和外显子6至外显子8的3'部分。
[0176]
在一些实施例中，经基因修饰的啮齿动物的基因组中的人源化il7ra基因包含人il7ra核苷酸序列上游(5')的啮齿动物il7ra核苷酸序列，其中啮齿动物il7ra核苷酸序列编码与啮齿动物il7ra蛋白(例如，内源性啮齿动物il7ra蛋白)的信号肽基本上相同的多肽。在一些实施例中，编码与啮齿动物il7ra蛋白的信号肽基本上相同的多肽的啮齿动物il7ra核苷酸序列是小鼠il7ra核苷酸序列(例如，内源性小鼠il7ra核苷酸序列)或大鼠il7ra核苷酸序列(例如，内源性大鼠il7ra核苷酸序列)。在一些实施例中，人源化il7ra基因中的小鼠il7ra核苷酸序列包括小鼠il7ra基因(例如，内源性小鼠il7ra基因)的编码小鼠il7ra的信号肽的外显子1的部分；在一些实施例中，小鼠il7ra核苷酸序列还包括小鼠il7ra基因的外显子1的5'utr。
[0177]
在一些实施例中，人源化il7ra基因与啮齿动物il7ra 5'调控序列，如内源性啮齿动物il7ra调控序列，例如5'转录调控序列，如启动子和/或增强子可操作地连接，使得人源化il7ra基因的表达在啮齿动物il7ra 5'调控序列的控制下。
[0178]
在一些实施例中，人源化il7ra基因位于内源性啮齿动物il7ra基因座。在一些实施例中，人源化il7ra基因位于除内源性啮齿动物il7ra基因座之外的基因座处；例如，由于随机整合。在人源化il7ra基因位于除内源性啮齿动物il7ra基因座之外的基因座处的一些实施例中，所述啮齿动物不能表达啮齿动物il7ra蛋白，例如，由于内源性啮齿动物il7ra基因的失活(例如，全部或部分缺失)。
[0179]
在人源化il7ra基因位于内源性啮齿动物il7ra基因座的一些实施例中，人源化il7ra基因是由于内源性啮齿动物il7ra基因座处的内源性啮齿动物il7ra基因的核苷酸序列被人il7ra基因的核苷酸序列置换而产生的。
[0180]
在一些实施例中，正在被置换的内源性啮齿动物il7ra基因座处的内源性啮齿动物il7ra基因的核苷酸序列是内源性啮齿动物il7ra基因的基因组片段，所述基因组片段至
少编码啮齿动物il7ra蛋白的大部分胞外结构域。在一些实施例中，啮齿动物是小鼠，并且被置换的小鼠il7ra基因组片段至少编码内源性小鼠il7ra蛋白的大部分胞外结构域。内源性小鼠il7ra蛋白的大部分胞外结构域的实例包含内源性小鼠il7ra蛋白的氨基酸22-238、23-238、24-238、21-237、21-236或21-235(例如，seq id no:41)。在一些实施例中，要置换的小鼠il7ra基因组片段编码内源性小鼠il7ra蛋白的氨基酸21-235(例如，seq id no:41)。在一些实施例中，要置换的小鼠il7ra基因组片段编码内源性小鼠il7ra蛋白的氨基酸21-236(例如，seq id no:41)。在一些实施例中，要置换的小鼠il7ra基因组片段编码内源性小鼠il7ra蛋白的氨基酸21-237(例如，seq id no:41)。在一些实施例中，要置换的小鼠il7ra基因组片段编码内源性小鼠il7ra蛋白的氨基酸21-238(例如，seq id no:41)。在一些实施例中，要置换的小鼠il7ra基因组片段编码内源性小鼠il7ra蛋白的氨基酸22-238(例如，seq id no:41)。在一些实施例中，要置换的小鼠il7ra基因组片段编码内源性小鼠il7ra蛋白的氨基酸23-238(例如，seq id no:41)。在一些实施例中，要置换的小鼠il7ra基因组片段包括小鼠il7ra基因的从编码成熟il7ra蛋白的第一氨基酸的外显子1中的密码子至外显子5，并且在一些实施例中至内含子5的5'部分。
[0181]
在一些实施例中，置换内源性啮齿动物il7ra基因座处的啮齿动物il7ra基因的基因组片段的人il7ra基因的核苷酸序列是cdna序列。在一些实施例中，置换内源性啮齿动物il7ra基因座处的啮齿动物il7ra基因的基因组片段的人il7ra核苷酸序列是人il7ra基因的基因组片段。在一些实施例中，置换内源性啮齿动物il7ra基因座处的啮齿动物il7ra基因的基因组片段的人il7ra基因的基因组片段包含人il7ra基因的外显子的全部或部分，所述外显子至少编码人il7ra蛋白的大部分胞外结构域。在一些实施例中，人il7ra基因组片段编码人il7ra，例如，如seq id no:43中所示的人il7ra的氨基酸21-238。在一些实施例中，人il7ra基因组片段编码人il7ra，例如，如seq id no:43中所示的人il7ra的氨基酸21-237。在一些实施例中，人il7ra基因组片段编码人il7ra，例如，如seq id no:43中所示的人il7ra的氨基酸21-236。在一些实施例中，人il7ra基因组片段编码人il7ra，例如，如seq id no:43中所示的人il7ra的氨基酸21-235。在一些实施例中，人il7ra基因组片段编码人il7ra，例如，如seq id no:43中所示的人il7ra的氨基酸22-238。在一些实施例中，人il7ra基因组片段编码人il7ra，例如，如seq id no:43中所示的人il7ra的氨基酸24-238。在一些实施例中，人基因组片段包括人il7ra基因的编码成熟人il7ra蛋白的第一氨基酸的外显子1中的密码子至外显子5，并且在一些实施例中至内含子5的5'部分。
[0182]
在一些实施例中，插入到内源性啮齿动物il7ra基因座中的人il7ra核苷酸序列与啮齿动物il7ra基因的基因组序列可操作地连接，所述啮齿动物il7ra基因编码与啮齿动物il7ra蛋白(如内源性啮齿动物，例如小鼠或大鼠，il7ra蛋白)的跨膜细胞质序列基本上相同的多肽。在啮齿动物是小鼠的实施例中，小鼠il7ra基因的基因组序列在一些实施例中包括小鼠il7ra基因(例如，内源性小鼠il7ra基因)的外显子6至外显子8；在一些实施例中包括小鼠il7ra基因(例如，内源性小鼠il7ra基因)的内含子5至外显子8的3'部分。
[0183]
在一些实施例中，插入到内源性啮齿动物il7ra基因座中的人il7ra核苷酸序列与啮齿动物il7ra基因的基因组序列可操作地连接，所述啮齿动物il7ra基因编码与啮齿动物il7ra蛋白(如内源性啮齿动物，例如小鼠或大鼠，il7ra蛋白)的信号肽基本上相同的多肽。在啮齿动物是小鼠的实施例中，小鼠il7ra基因的基因组序列在一些实施例中包括编码小
鼠il7ra的信号肽的小鼠il7ra基因(例如，内源性小鼠il7ra基因)的外显子1的部分；并且在一些实施例中包括编码小鼠il7ra的信号肽的小鼠il7ra基因(例如，内源性小鼠il7ra基因)的外显子1的5'utr和外显子1的部分。
[0184]
在一些实施例中，啮齿动物是小鼠，并且包括从编码第一成熟il7ra氨基酸的外显子1中的第一密码子至外显子5(或在一些实施例中至内含子5的5'部分)的内源性小鼠il7ra基因座处的内源性小鼠il7ra基因的基因组片段已被包括从编码第一成熟il7ra氨基酸的外显子1中的第一密码子至外显子5(或在一些实施例中至内含子5的5'部分)的人il7ra基因的基因组片段置换。在一些实施例中，人源化il7ra基因在内源性啮齿动物il7ra基因座处形成并包括小鼠il7ra基因的外显子1的5'utr和信号肽编码部分、人il7ra基因的外显子1至外显子5的成熟氨基酸编码部分和小鼠il7ra基因的外显子6至外显子8；并且在一些此类实施例中，人源化il7ra基因的内含子5包含来自人内含子5的5'部分和来自内源性小鼠内含子5的3'部分。
[0185]
在一些实施例中，啮齿动物是在内源性小鼠il7ra基因座处包括人源化il7ra基因的小鼠，其中人源化il7ra基因编码人源化il7ra蛋白，所述人源化il7ra蛋白包括与人il7ra蛋白的信号肽至少基本上相同的信号肽、与人il7ra蛋白的胞外结构域至少基本上相同的胞外结构域和内源性小鼠il7ra蛋白的跨膜胞质结构域。在一些实施例中，人源化il7ra蛋白的胞外结构域包括人il7ra蛋白的全长胞外结构域。在一些实施例中，人源化il7ra蛋白的胞外结构域包括：(i)几乎全长的人il7ra蛋白的胞外结构域，除了人il7ra蛋白的胞外结构域的c末端处的2个氨基酸；以及(ii)内源性小鼠il7ra蛋白的胞外结构域的c末端处的2个氨基酸。在一些实施例中，啮齿动物是在内源性小鼠il7ra基因座处包括人源化il7ra基因的小鼠，如cn111808882a中所描述的，所述文献通过引用整体并入本文。
[0186]
在一些实施例中，本文提供的啮齿动物对其基因组中的人源化il7ra基因是杂合的。在一些实施例中，本文提供的啮齿动物对其基因组中的人源化il7ra基因是纯合的。
[0187]
在一些实施例中，人源化il7ra基因使经编码的人源化il7ra蛋白在啮齿动物中表达。在一些实施例中，人源化il7ra蛋白在细胞和组织中表达，其中对照啮齿动物(例如，没有人源化il7ra基因的啮齿动物)中的对应的啮齿动物il7ra蛋白通常在例如t淋巴细胞上表达。
[0188]
在一些实施例中，本文公开的啮齿动物例如由于内源性啮齿动物il7ra基因的失活(例如，全部或部分缺失)或置换(全部或部分)而不能表达啮齿动物il7ra蛋白。
[0189]
另外的基因特征
[0190]
在一些实施例中，本文公开的啮齿动物在其基因组中进一步包括人源化sirpα基因。啮齿动物sirpα基因的人源化已经在例如wo 2015/042557 a1(再生元制药公司(regeneron pharmaceuticals inc.))和us20190373867a1(北京百奥赛图基因生物技术公司(beijing biocytogen))中有所描述，所述文献通过引用以其整体并入本文。
[0191]
在一些实施例中，人源化sirpa基因编码包括人sirpα蛋白的胞外结构域的全部或部分的人源化sirpα蛋白。在一些实施例中，人源化sirpa基因编码包括负责配体结合(即，与cd47结合)的人sirpα蛋白的胞外部分的人源化sirpα蛋白。在一些实施例中，人源化sirpa基因编码包括人sirpα蛋白的氨基酸残基28-362的人源化sirpα蛋白，例如，如在genbank登录号np_001035111.1中所示的人sirpα蛋白。在一些实施例中，人源化sirpa基因
编码包括啮齿动物sirpα蛋白(例如，内源性啮齿动物sirpα蛋白)的跨膜结构域和胞质结构域的人源化sirpα蛋白。在一些实施例中，人源化sirpα基因包括人sirpα基因的外显子2、3和4。在一些实施例中，人源化sirpα基因位于内源性啮齿动物sirpα基因座。在一些实施例中，人源化sirpα基因是由于内源性啮齿动物sirpα基因座处的内源性啮齿动物sirpα基因的外显子2-4被人sirpα基因的外显子2-4置换而形成的。在一些实施例中，人源化sirpα基因位于内源性啮齿动物sirpα基因座，并且包括内源性啮齿动物sirpα基因的外显子1、人sirpα基因的外显子2-4和内源性啮齿动物sirpα基因的外显子5-8，其中人源化sirpα基因可操作地连接到内源性啮齿动物sirpα基因座处的啮齿动物sirpα启动子。在一些实施例中，啮齿动物对人源化sirpα基因是杂合的。在一些实施例中，啮齿动物对人源化sirpα基因是纯合的。在一些实施例中，包括人源化sirpα基因的啮齿动物表达人源化sirpα蛋白，如包括人sirpα蛋白的胞外结构域和啮齿动物sirpα蛋白的跨膜胞质结构域的蛋白。在一些实施例中，本文公开的啮齿动物不能表达内源性啮齿动物sirpα蛋白(例如，由于内源性啮齿动物sirpα基因的破坏或置换)。
[0192]
在一些实施例中，本文公开的啮齿动物进一步包括在其基因组中的人源化tpo(血小板生成素)基因。啮齿动物tpo基因的人源化已在例如美国专利第8541646号(再生元制药公司、耶鲁大学和生物医学研究所irb)和rongvaux等人(《美国国家科学院院刊(proc natl acad sci usa.)》2011；108(6):2378-2383)中描述，所述文献通过引用以其整体并入本文。在一些实施例中，人源化包括用人tpo基因置换内源性啮齿动物tpo基因。在一些实施例中，啮齿动物表达来自人源化tpo基因的人tpo蛋白。在一些实施例中，啮齿动物对人源化tpo基因是杂合的。在一些实施例中，啮齿动物对人源化tpo基因是纯合的。在一些实施例中，包括人源化tpo基因的啮齿动物不能表达内源性啮齿动物tpo蛋白(例如，由于内源性啮齿动物tpo基因的破坏或置换)。
[0193]
在一些实施例中，本文公开的啮齿动物在其基因组中进一步包括人源化gm-csf/il-3基因座，其中内源性啮齿动物gm-csf基因被人gm-csf基因置换并且内源性啮齿动物il-3基因被人il-3基因置换。啮齿动物gm-csf/il-3基因座的人源化已在例如美国专利第8541646号(再生元制药公司、耶鲁大学和生物医学研究所irb)和willinger等人(《美国国家科学院院刊》,108(6):2390-2395,2011)中描述，所有文献以其整体并入本文)。在一些实施例中，啮齿动物对人源化gm-csf/il-3基因座是杂合的。在一些实施例中，啮齿动物对人源化gm-csf/il-3基因座是纯合的。在一些实施例中，啮齿动物表达来自人源化gm-csf/il-3基因座的人gm-csf和人il-3。在一些实施例中，本文公开的啮齿动物不能表达内源性啮齿动物gm-csf蛋白并且不能表达内源性啮齿动物il-3蛋白(例如，由于内源性啮齿动物gm-csf/il-3基因座的破坏或置换)。
[0194]
在一些实施例中，本文公开的啮齿动物的内源性rag2基因被破坏；并且在一些实施例中，啮齿动物对破坏(rag2-/-或rag敲除)是纯合的并且不能表达内源性rag2蛋白。在一些实施例中，本文公开的啮齿动物的内源性il-2rg基因被破坏；并且在一些实施例中，啮齿动物对破坏(il-2rg-/或il-2rg敲除)是纯合的并且不能表达内源性il-2rg蛋白(也被称为“γc”)。rag2和il-2rg双敲除(dko)啮齿动物是已知的免疫缺陷啮齿动物(参见例如traggiai e等人(2004)脐带血细胞移植小鼠中人适应性免疫系统的开发(development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice),《科学
(science)》304:104-107，所述文献通过引用整体并入本文)，并且易于(例如从纽约泰康利生物科学公司(taconic biosciences,inc.,new york))商购获得。
[0195]
在一些实施例中，本文公开的啮齿动物在其基因组中包括人源化tslp基因和人源化sirpα基因，并且对rag2和il-2rg基因两者是纯合无效的。在一些此类实施例中，啮齿动物在其基因组中进一步包括人源化tpo基因和/或人源化gm-csf/il-3基因座。啮齿动物对人源化基因可以是杂合的或纯合的。
[0196]
在一些实施例中，本文公开的啮齿动物在其基因组中包括人源化tslp基因、人源化tslpr基因和人源化sirpα基因，并且对rag2和il-2rg基因两者是纯合无效的。在一些此类实施例中，啮齿动物在其基因组中进一步包括人源化tpo基因和/或人源化gm-csf/il-3基因座。啮齿动物对人源化基因可以是纯合的或杂合的。
[0197]
在一些实施例中，本文公开的啮齿动物在其基因组中包括人源化tslp基因、人源化tslpr基因、人源化il7ra基因和人源化sirpα基因，并且对rag2和il-2rg基因两者是纯合无效的。在一些此类实施例中，啮齿动物在其基因组中进一步包括人源化tpo基因和/或人源化gm-csf/il-3基因座。啮齿动物对人源化基因可以是纯合的或杂合的。
[0198]
啮齿动物物种和品系
[0199]
在一些实施例中，作为非限制性实例，本公开的啮齿动物包含小鼠、大鼠和仓鼠。在一些实施例中，啮齿动物选自鼠总科(superfamily muroidea)。在一些实施例中，本公开的啮齿动物来自选自以下的科：丽仓鼠科(calomyscidae)(例如，丽仓鼠(mouse-like hamster))、仓鼠科(cricetidae)(例如，仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、棘鼠、冠鼠)、马岛鼠科(nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、具尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(platacanthomyidae)(例如，刺棒睡鼠)和鼹形鼠科(spalacidae)(例如，鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)。在一些实施例中，本公开的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、棘鼠和冠鼠。在一些实施例中，本公开的小鼠来自鼠科的成员。
[0200]
在一些实施例中，啮齿动物是小鼠。在一些实施例中，啮齿动物是选自以下的c57bl品系的小鼠：c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kalwn、c57bl/6、c57bl/6j、c57bl/6byj、c57bl/6nj、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl/10cr和c57bl/ola。在一些实施例中，啮齿动物是选自由以下品系组成的组的129品系的小鼠，即129p1、129p2、129p3、129x1、129s1(例如，129s1/sv、129s1/svim)、129s2、129s4、129s5、129s9/svevh、129/svjae、129s6(129/svevtac)、129s7、129s8、129t1、129t2(参见例如festing等人,1999,《哺乳动物基因组(mammalian genome)》10:836；auerbach等人,2000,《生物技术(biotechniques)》29(5):1024-1028,1030,1032)。在一些实施例中，啮齿动物是129品系和c57bl/6品系的混合体的小鼠。在一些实施例中，啮齿动物是前述129品系的混合体或前述bl/6品系的混合体的小鼠。在一些实施例中，啮齿动物是balb品系(例如，balb/c品系)的小鼠。在一些实施例中，啮齿动物是balb品系和另一前述品系的混合物的小鼠。
[0201]
在一些实施例中，啮齿动物是大鼠。在一些某些实施例中，大鼠选自威斯塔大鼠(wistar rat)、lea品系、斯泼累格多雷品系(sprague dawley strain)、费舍尔品系(fischer strain)、f344、f6和黑刺鼠(dark agouti)。在一些实施例中，如本文所描述的大鼠品系是选自由以下组成的组的两个或更多个品系的混合体：威斯塔、lea、斯泼累格多雷、费舍尔、f344、f6和黑刺鼠。
[0202]
经基因修饰的啮齿动物的组织和细胞
[0203]
在一些实施例中，本文公开了一种分离的啮齿动物细胞或组织，所述分离的啮齿动物细胞或组织的基因组包括人源化tslp基因、人源化tslpr基因、人源化il7ra基因或其组合。在一些实施例中，分离的啮齿动物细胞或组织进一步包括上文所描述的另外的基因修饰中的一种或多种(例如，人源化sirpα基因、rag2-/-和il-2rg-/-、人源化tpo基因或人源化gm-csf/il-3基因座)。
[0204]
在一些实施例中，组织选自脂肪、膀胱、脑、乳房、骨髓、眼、心脏、肠、肾、肝、肺、淋巴结、肌肉、胰腺、血浆、血清、皮肤、脾、胃、胸腺、睾丸、卵子以及其组合。
[0205]
在一些实施例中，细胞选自上皮细胞、角质细胞、树突状细胞、淋巴细胞(例如，b或t细胞)、巨噬细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。在一些实施例中，分离的啮齿动物细胞是啮齿动物胚胎干细胞。在一些实施例中，分离的啮齿动物细胞是啮齿动物卵子或啮齿动物精子。
[0206]
用于制备人源化啮齿动物的组合物和方法
[0207]
本文公开了包括人tslp核苷酸序列、人tslpr核苷酸序列或人il7ra核苷酸序列的期望被整合到啮齿动物基因座中以形成本文所描述的人源化基因的靶向载体(或核酸构建体)。
[0208]
在一些实施例中，靶向载体包括至少编码如上文所描述的人tslp蛋白的大部分成熟蛋白序列的人tslp核苷酸序列。在一些实施例中，人tslp核苷酸序列编码包括seq id no:3的氨基酸29-159的多肽。在一些实施例中，所述人tslp核苷酸序列包括从所述成熟蛋白的第一氨基酸的密码子开始至人tslp基因的外显子4中的终止密码子的外显子1。
[0209]
在一些实施例中，靶向载体包括至少编码如上文所描述的人tslpr蛋白的大部分胞外结构域的人tslpr核苷酸序列。在一些实施例中，人tslpr核苷酸序列编码包括seq id no:23的氨基酸27-231的多肽。在一些实施例中，人tslpr核苷酸序列包括外显子2至编码人tslpr基因的最后一个胞外结构域氨基酸的外显子6中的密码子。
[0210]
在一些实施例中，靶向载体包括至少编码如上文所描述的人il7ra蛋白的大部分胞外结构域的人il7ra核苷酸序列。在一些实施例中，人il7ra核苷酸序列编码包括seq id no:43的氨基酸21-236的多肽。在一些实施例中，人il7ra核苷酸序列包括人il7ra基因的从编码成熟il7ra蛋白的第一氨基酸的外显子1中的密码子至外显子5(并且在一些实施例中至内含子5的5'部分)。
[0211]
靶向载体还包含侧接待整合的人核苷酸序列的5'和3'啮齿动物序列，也称为5'和3'同源臂，所述啮齿动物序列介导人核苷酸序列的同源重组和将所述人核苷酸序列整合到靶啮齿动物基因座(例如，内源性啮齿动物tslp基因座、内源性啮齿动物tslpr基因座或内源性啮齿动物il7ra基因座)中，从而形成如上文所描述的人源化基因。通常，5'和3'侧接啮齿动物序列是在将被人核苷酸序列置换的靶啮齿动物基因座处侧接对应啮齿动物核苷酸序列的核苷酸序列。在一些实施例中，靶向载体包括如上文所描述的人源化基因。在一些实施例中，靶向载体包括包含人tslp核苷酸序列和啮齿动物tslp核苷酸序列的人源化tslp基因，如上文所描述的。在一些实施例中，靶向载体包括包含人tslpr核苷酸序列和啮齿动物tslpa核苷酸序列的人源化tslpr基因，如上文所描述的。在一些实施例中，靶向载体包括包含人il7ra核苷酸序列和啮齿动物il7ra核苷酸序列的人源化il7ra基因，如上文所描述的。
[0212]
在一些实施例中，靶向载体包括选择标记基因。可以将选择标记基因插入要整合的人基因组序列的内含子中。在一些实施例中，选择标记基因作为自删除盒提供，所述自删除盒可以在成功整合人核苷酸序列之后删除。
[0213]
在示例性实施例中，使用细菌同源重组和技术(参见例如u.s.6,586,251和valenzuela等人(2003)《自然生物科学(nature biotech.)》21(6):652-659，所述文献通过引用以其整体并入本文)从携带啮齿动物tslp、tslpr或il7ra基因组dna的细菌人工染色体(bac)克隆产生靶向载体。由于细菌同源重组，从bac克隆中缺失啮齿动物基因组序列，并且插入人核苷酸序列，从而产生携带人核苷酸序列的经修饰的bac克隆，所述人核苷酸序列侧接有5'和3'啮齿动物同源臂。在一些实施例中，人核苷酸序列可以是cdna序列或人基因组dna。经修饰的bac克隆一旦线性化就可以引入到啮齿动物胚胎干(es)细胞中。
[0214]
在一些实施例中，本发明提供了如本文所描述的靶向载体用于制备经修饰的啮齿动物胚胎干(es)细胞的用途。可以通过例如电穿孔将靶向载体引入到啮齿动物es细胞中。本领域已经描述了小鼠es细胞和大鼠es细胞两者。参见例如us 7,576,259、us 7,659,442、us 7,294,754和us 2008-0078000a1(所述文献全部以全文引用的方式并入本文)，所述文献描述了小鼠es细胞和用于制备经基因修饰的小鼠的方法；us 2014/0235933a1(再生元制药公司)、us 2014/0310828 a1(再生元制药公司)，tong等人(2010)《自然(nature)》467:211-215以及tong等人(2011)《自然实验手册(nat protoc.)》6(6):doi:10.1038/nprot.2011.338(所述文献全部以全文引用的方式并入本文)，所述文献描述了大鼠es细胞和用于制备经基因修饰的大鼠的方法，所述经基因修饰的大鼠可以用于制备经修饰的啮齿动物胚胎，所述经修饰的啮齿动物胚胎进而可以用于制备啮齿动物。
[0215]
在一些实施例中，可以选择具有整合在基因组中的期望的人核苷酸序列(例如，人tslp、人tslpr或人il7ra核苷酸序列)的es细胞。在一些实施例中，基于啮齿动物等位基因的丢失和/或人等位基因测定的增益来选择es细胞。在一些实施例中，然后将所选es细胞用作供体es细胞以通过使用方法(参见例如us 7,576,259、us 7,659,442、us 7,294,754和us 2008-0078000 a1，所述专利全部以全文引用的方式并入)或在us 2014/0235933 a1和us 2014/0310828 a1(所述文献均以全文引用的方式并入)中描述的方法注射到桑椹胚前期胚胎(例如，8细胞期胚胎)中。在一些实施例中，包括供体es细胞的胚胎被温育并且植入到代孕母亲体内以产生f0啮齿动物。可以通过使用啮齿动物等位基因的丢失和/或人等位基因测定的增益对从剪尾分离的dna进行基因分型来鉴定携带人核苷酸序列的啮齿动物幼崽。
[0216]
在一些实施例中，可以使对人源化基因而言杂合的啮齿动物杂交以产生纯合的啮齿动物。
[0217]
如本文所描述的人源化啮齿动物(即，包括人源化tslp基因、人源化tslpr基因、人源化il7ra基因或其组合的啮齿动物)可以与另一种啮齿动物繁殖或杂交。因此，繁殖方法以及从此类繁殖获得的子代也是本公开的实施例。
[0218]
在一些实施例中，提供了一种方法，所述方法包括如上所描述的繁殖第一啮齿动物(例如，基因组包括人源化tslp基因、人源化tslpr基因、人源化il7ra基因或其组合的啮
齿动物)与第二啮齿动物，从而产生基因组包括人源化tslp、tslpr和/或il7ra基因的子代啮齿动物。子代可以拥有从繁殖中所使用的第二啮齿动物遗传的其它期望的表型或基因修饰。在一些实施例中，子代啮齿动物对来自第一啮齿动物的一种或多种人源化基因是杂合的。在一些实施例中，子代啮齿动物对来自第一啮齿动物的人源化基因是纯合的。在一些实施例中，用于繁殖的第二啮齿动物包括另外的基因修饰中的一种或多种，如人源化sirpα基因、rag2-/-和il-2rg-/-、人源化tpo基因或人源化gm-csf/il-3基因座。
[0219]
在一些实施例中，提供了一种子代啮齿动物，所述子代啮齿动物的基因组包括人源化tslp基因、人源化tslpr基因、人源化il7ra基因或其组合，其中子代啮齿动物是通过包括繁殖第一啮齿动物与第二啮齿动物的方法产生的，所述第一啮齿动物的基因组包括一种或多种人源化基因。在一些实施例中，子代啮齿动物对来自第一啮齿动物的一种或多种人源化基因是杂合的。在一些实施例中，子代啮齿动物对来自第一啮齿动物的一种或多种人源化基因是纯合的。
[0220]
在一些实施例中，本文公开了一种用于产生经基因修饰的啮齿动物细胞的体外方法，所述方法包括将靶向载体引入到啮齿动物细胞中，所述靶向载体包括至少编码人tslp蛋白的大部分成熟蛋白序列的人tslp核酸序列，所述人tslp核酸序列侧接有啮齿动物同源臂，所述啮齿动物同源臂介导所述人tslp核苷酸序列整合到内源性啮齿动物tslp基因座中，使得啮齿动物tslp基因组dna被所述人tslp核酸序列置换以形成如本文所描述的人源化tslp基因，由此产生经基因修饰的啮齿动物细胞。在一些实施例中，所述啮齿动物细胞是小鼠细胞或大鼠细胞。在一些实施例中，所述啮齿动物细胞是啮齿动物es细胞，并且所述方法产生经基因修饰的啮齿动物es细胞。
[0221]
在一些实施例中，本文公开了一种用于产生经基因修饰的啮齿动物细胞的体外方法，所述方法包括将靶向载体引入到啮齿动物细胞中，所述靶向载体包括至少编码人tslpr蛋白的大部分胞外结构域的人tslpr核酸序列，所述人tslpr核酸序列侧接有啮齿动物同源臂，所述啮齿动物同源臂介导所述人tslpr核苷酸序列整合到内源性啮齿动物tslpr基因座中，使得啮齿动物tslpr基因组dna被所述人tslp核酸序列置换以形成如本文所描述的人源化tslpr基因，由此产生经基因修饰的啮齿动物细胞。在一些实施例中，所述啮齿动物细胞是小鼠细胞或大鼠细胞。在一些实施例中，所述啮齿动物细胞是啮齿动物es细胞，并且所述方法产生经基因修饰的啮齿动物es细胞。
[0222]
在一些实施例中，本文公开了一种用于产生经基因修饰的啮齿动物细胞的体外方法，所述方法包括将靶向载体引入到啮齿动物细胞中，所述靶向载体包括至少编码人il7ra蛋白的大部分胞外结构域的人il7ra核酸序列，所述人il7ra核酸序列侧接有啮齿动物同源臂，所述啮齿动物同源臂介导所述人il7ra核苷酸序列整合到内源性啮齿动物il7ra基因座中，使得啮齿动物il7ra基因组dna被所述人il7ra核酸序列置换以形成如本文所描述的人源化il7ra基因，由此产生经基因修饰的啮齿动物细胞。在一些实施例中，所述啮齿动物细胞是小鼠细胞或大鼠细胞。在一些实施例中，所述啮齿动物细胞是啮齿动物es细胞，并且所述方法产生经基因修饰的啮齿动物es细胞。
[0223]
采用人源化啮齿动物的方法
[0224]
本文公开的啮齿动物提供了一种用于鉴定和测试化合物治疗人类疾病的潜力的有用的体内系统和生物材料来源，所述疾病包含特别是与tslp信号传导相关的疾病，如th2
驱动的过敏性疾病、哮喘和癌症。
[0225]
在一些实施例中，本文公开的啮齿动物用于开发靶向tslp信号传导的药剂，例如通过靶向人tslp、人tslpr或人il7ra。在一些实施例中，本文公开的啮齿动物用于筛选和开发与人tslp、人tslpr或人il7ra特异性地结合的候选药剂(例如，抗体)。在一些实施例中，本文公开的啮齿动物用于确定药剂(例如，抗体)的结合谱。在一些实施例中，本文公开的啮齿动物用于测量阻断或调节人tslp、tslpr或il7ra活性的效应。在一些实施例中，本文公开的啮齿动物被暴露于与人tslp结合并且抑制其的候选药剂，并且被用于分析对人tslp依赖性过程的影响。
[0226]
在一些实施例中，本文所描述的经基因修饰的啮齿动物用作过敏性疾病的模型。在一些实施例中，过敏性疾病涉及气道炎症(例如，哮喘)。
[0227]
在一些实施例中，肺部炎症的ova-明矾模型用于评估tslp信号传导。肺部炎症的ova-明矾模型在本领域中已被充分证明(al-shami等人,《实验医学杂志(jem)》,第202卷,第6期,829-839,2005；chu等人,《过敏症与临床免疫学杂志(j.allergy clin immunol)》2013；131:187-200，所述文献通过引用以其整体并入本文)。在一些实施例中，将乳化在氢氧化铝中的ova或单独的氢氧化铝(作为对照)腹膜内施用于啮齿动物(例如，小鼠，如针对本文公开的tslp、tslpr和/或il7ra中的一种或多种人源化的小鼠，或未人源化的野生型小鼠)。然后用ova对小鼠进行鼻内激发，并且随后分析指示肺部炎症的参数，包含例如血清ova特异性ige和ova特异性igg1、杯状细胞化生和/或肺组织嗜酸性粒细胞增多。在一些实施例中，在激发之后分析哮喘肺的气道中过表达的代表性粘蛋白基因muc5ac的肺表达并且可以作为杯状细胞化生的替代终点。在示例性方案中，将乳化在2mg的氢氧化铝中的50μg的ova或单独的2mg的氢氧化铝腹膜内施用于啮齿动物(例如，小鼠，如对tslp和tslpr双重人源化的小鼠，对tslp、tslpr和il7ra三重人源化的小鼠，如本文所公开的，或未人源化的野生型小鼠，在第1天和第14天)。从第21天开始，用pbs中的150μg的ova对麻醉的小鼠进行鼻内激发4天。在最后一次激发之后24小时，分析小鼠的血清ova特异性ige和ova特异性igg1、杯状细胞化生和/或肺组织嗜酸性粒细胞增多。在一些实施例中，在激发之后分析哮喘肺的气道中过表达的代表性粘蛋白基因muc5ac的肺表达并且可以作为杯状细胞化生的替代终点。
[0228]
在一些实施例中，可以通过以一种或多种剂量鼻内施用过敏原(例如，屋尘螨提取物或“hdm”模型)一段时间来诱导啮齿动物的气道炎症，并且可以基于粘液累积、支气管肺泡灌洗液中的嗜酸性浸润细胞、总循环ige水平和/或通过微阵列表达分析可测量的表达谱的改变来测量气道炎症。候选治疗剂的效果可以通过测量气道炎症的程度在ova-明矾模型或hdm模型中是否因施用药剂而降低来确定。用于诱导气道炎症的过敏原和要测试的药剂可以同时或在不同时间施用。在一些实施例中，将过敏原以一种或多种剂量给予啮齿动物，并且在将至少一种剂量的过敏原给予啮齿动物之后将要测试的药剂施用于啮齿动物。
[0229]
在一些实施例中，过敏性疾病涉及皮肤炎症或特应性皮炎。可以通过造成皮肤损伤并将受伤的皮肤暴露于一种或多种剂量的过敏原(例如，细菌毒素或屋尘螨提取物)一段时间来诱导啮齿动物的皮肤炎症。药剂的效果可以通过测量皮肤炎症(如通过评估例如ige水平、瘙痒、表皮增厚和特应性皮炎的其它典型症状来确定)是否因施用药剂而减轻来确定。
[0230]
在一些实施例中，本文公开的啮齿动物用作如th2驱动的癌症等癌症的动物模型，以便例如评估靶向人癌细胞的治疗药物的功效。在各个实施例中，将本文公开的啮齿动物与人癌细胞移植，并且将靶向此类人癌细胞的候选药物施用于啮齿动物。然后通过在施用药物之后监测啮齿动物体内的人癌细胞(例如，通过评估药物的施用是否抑制啮齿动物体内的人癌细胞的生长或转移)来确定药物的治疗疗效。适于移植到啮齿动物体内的人癌细胞包含例如乳腺癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、结肠癌细胞、黑色素瘤等。可以在非人动物中测试的药物包含小分子化合物(即，分子量小于1500kd、1200kd、1000kd或800道尔顿的化合物)和大分子化合物(如蛋白，例如，抗体)两者，所述小分子化合物和所述大分子化合物具有通过靶向人类细胞(例如，与人类细胞结合和/或作用于人类细胞)治疗人类疾病和病状的预期治疗效果。
[0231]
通过以下实例进一步展示本说明书，所述实例不应被解释为以任何方式进行限制。所有引用文献(包含贯穿本技术所引用的参考文献、发布的专利和公开的专利申请)的内容特此以全文引用的方式明确并入。
[0232]
实例
[0233]
提出以下实例以便向所属领域的普通技术人员提供如何制备和评估本文所要求保护的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的完整公开和描述，并且旨在单纯作为示例而非意图限制本公开。
[0234]
实例1.人源化tslp小鼠的产生
[0235]
通过使用技术使小鼠tslp基因座人源化(参见例如美国专利第6,586,251号和valenzuela等人(2003)小鼠基因组的高通量工程与高分辨率表达分析,《自然实验手册》21(6):652-659，所有文献通过引用以其整体并入本文)。所得人源化tslp基因座包含小鼠tslp启动子、小鼠tslp外显子1、部分小鼠tslp外显子2(从外显子2的5'末端至编码小鼠tslp信号肽的最后一个氨基酸的密码子)、部分人tslp外显子1(从编码成熟人tslp蛋白的第一氨基酸的密码子至外显子1的3'末端)至人tslp外显子4的终止密码子，随后是小鼠tslp 3'utr和下游小鼠基因组序列。参见图1a-1c。
[0236]
为了使小鼠tslp基因座人源化，基于以下小鼠和人序列产生靶向核酸构建体：
[0237]
表4
[0238][0239]
表5
[0240][0241]
靶向核酸构建体从5'至3'含有：
[0242]
(i)编码成熟小鼠tslp蛋白的第一氨基酸的小鼠tslp外显子2中的密码子上游的114.3kb的5'小鼠同源臂；参见图1b；
[0243]
(ii)从编码成熟人tslp蛋白的第一氨基酸(氨基酸29)的人tslp外显子1中的密码子开始并在人tslp外显子3的末端后的257bp处结束、被指定为“人基因组片段1”的1.9kb的人tslp基因组序列；参见图1b；
[0244]
(iii)插入人tslp的内含子3中的被指定为“floxed hub-puro”(与人泛素启动子可操作地连接的嘌呤霉素抗性基因，侧接loxp位点)的4.4kb的选择盒；参见图1b；
[0245]
(iv)从人tslp外显子3的末端后的258bp开始并在人tslp外显子4的终止密码子处结束、被指定为“人基因组片段2”的2.2kb的人tslp基因组序列；参见图1b；以及
[0246]
(v)包含小鼠tslp外显子5的3'utr序列和下游小鼠基因组序列的约65.3kb的3'小鼠同源臂；参见图1b。
[0247]
将靶向核酸构建体电穿孔到f1h4小鼠胚胎干(es)细胞中。通过等位基因修饰(moa)测定证实了成功整合，如例如在valenzuela等人,同上中所描述的。表6中描述了用于检测人tslp序列的存在并确认小鼠tslp序列的丢失和/或保留的moa测定的引物和探针，并且图1b中示出了引物和探针的位置。
[0248]
表6
[0249][0250]
[0251]
在选择正确靶向的es细胞克隆之后，切除嘌呤霉素选择盒。人源化tslp基因的编码序列和经编码的氨基酸序列分别阐述于seq id no:6和seq id no:5中。图1f中提供了小鼠tslp(seq id no:1)、人tslp(seq id no:3)和人源化tslp(seq id no:5)蛋白序列的比对。
[0252]
阳性靶向的es细胞用作供体es细胞，并且通过方法将其显微注射到桑椹胚前期(8细胞)小鼠胚胎中(参见例如us 7,576,259、us 7,659,442、us 7,294,754和us 2008-0078000 a1，所有文献通过引用以其整体并入本文)。在体外温育包括供体es细胞的小鼠胚胎，并且然后将所述小鼠胚胎植入到代孕母亲体内以产生完全源自供体es细胞的f0小鼠。使用上文所描述的moa测定，通过基因分型来鉴定携带人源化tslp基因的小鼠。将对人源化tslp基因杂合的小鼠繁殖为纯合性的。
[0253]
为了确定对tslp人源化纯合的小鼠是否表达人源化tslp蛋白，对小鼠实施安乐死并通过心脏穿刺放血。将血液收集到血清分离管中并制备血清。根据制造商的说明，使用人quantikine tslp elisa(r&d系统公司(r&dsystems)；目录号dtslp0)确定血清中的人tslp水平。1000pg/ml的重组鼠类tslp(r&d系统公司目录号555-ts-010)也用作阴性对照，以验证elisa的物种特异性(数据未显示)并且正常人血清(nhs)用作阳性对照。发现对如上文所述的tslp人源化杂合的小鼠在血清中表达成熟人tslp(图1g)。
[0254]
实例2.人源化tslpr小鼠的产生
[0255]
通过使用技术使小鼠tslpr基因座人源化(参见例如美国专利第6,586,251号和valenzuela等人(2003)小鼠基因组的高通量工程与高分辨率表达分析,《自然实验手册》21(6):652-659，所有文献通过引用以其整体并入本文)。所得人源化tslpr基因座包含小鼠tslpr启动子、小鼠tslpr外显子1(包含5'utr和编码小鼠tslpr信号肽和小鼠tslpr成熟蛋白的前7个氨基酸的序列)、部分小鼠tslpr内含子1(在外显子2前高达328bp)、部分人tslpr内含子1(从外显子2前的909bp处开始)、人tslpr外显子2至外显子6的前47个bp(基本上编码人tslpr胞外结构域，即从氨基酸27至刚好在跨膜结构域之前)、从第48个bp开始至外显子8的小鼠tslpr外显子6(编码小鼠tslpr跨膜和细胞内结构域，并且包含小鼠tslpr 3'utr)，随后是下游小鼠基因组序列。参见图2a-2c。
[0256]
为了使小鼠tslpr基因座人源化，基于以下序列信息产生靶向核酸构建体：
[0257]
表7
[0258][0259]
表8
[0260] 基因组构建开始结束长度(bp)5'小鼠臂grcm38/mm10chr5：109557943chr5：10958699929057人插入物grch37/hg37chrx：1314968chrx：132871013743
3'小鼠臂grcm38/mm10chr5：109422337chr5：109555580133244
[0261]
靶向核酸构建体从5'至3'含有：
[0262]
(i)小鼠tslpr外显子2前的约29.1kb至328bp的5'小鼠同源臂；参见图2b；
[0263]
(ii)含有与人泛素启动子可操作地连接的新霉素抗性基因的自删除选择盒，侧接loxp位点(“floxed hub-neo”)，参见图2b；
[0264]
(iii)从人tslpr的外显子2前的909bp开始至外显子6中的前47个bp、基本上编码人tslpr胞外结构域，即从氨基酸27至氨基酸231(在人tslpr中：构成信号肽的氨基酸1-22和构成跨膜结构域的氨基酸232至252)的13743bp的人tslpr核酸序列，参见图2b；以及
[0265]
(iv)从外显子6至外显子8中的第48个bp开始、编码小鼠tslpr跨膜结构域和细胞内结构域并包含小鼠tslpr3'utr随后是下游小鼠基因组序列的约133.2kb的3'小鼠同源臂；参见图2b。
[0266]
将靶向核酸构建体电穿孔到小鼠胚胎干(es)细胞中。通过等位基因修饰(moa)测定证实了成功整合，如例如在valenzuela等人,同上中所描述的。表9中示出了用于检测人tslpr序列的存在并确认小鼠tslpr序列的丢失和/或保留的moa测定的引物和探针，并且图2b中指示了引物和探针的位置。在选择正确靶向的es细胞克隆之后，可以切除新霉素选择盒。带有和不带有盒的靶向的(人源化)tslpr等位基因的基因组序列分别在seq id no:63和64中示出。人源化tslpr基因的编码序列和经编码的氨基酸序列分别阐述于seq id no:26和seq id no:25中。图2f中提供了小鼠tslpr(seq id no:21)、人tslpr(seq id no:23)和人源化tslpr(seq id no:25)蛋白序列的比对。
[0267]
表9
[0268][0269]
阳性靶向的es细胞用作供体es细胞，并且通过方法将其显微注射到桑椹胚前期(8细胞)小鼠胚胎中(参见例如us 7,576,259、us 7,659,442、us 7,294,754和us 2008-0078000 a1，所有文献通过引用以其整体并入本文)。在体外温育包括供体es细胞的小鼠胚胎，并且然后将所述小鼠胚胎植入到代孕母亲体内以产生完全源自供体es细胞的f0小鼠。使用上文所描述的moa测定，通过基因分型来鉴定携带人源化tslpr基因的小鼠。将对人源化tslpr基因杂合的小鼠繁殖为纯合性的。
[0270]
实例3.人源化il7ra小鼠的产生
[0271]
通过使用技术使小鼠il7ra基因座人源化(参见例如美国专利第6,586,251号和valenzuela等人(2003)小鼠基因组的高通量工程与高分辨率表达分析,《自然实验手册》21(6):652-659，所有文献通过引用以其整体并入本文)。所得人源化il7ra基因座包含小鼠il7ra启动子、部分小鼠il7ra外显子1(包含从起始密码子开始的5'utr和前68个bp，并编码小鼠il7ra信号肽和小鼠il7ra成熟蛋白的前3个氨基酸)、部分人il7ra外显子1(外显子1的最后14个bp)、人il7ra内含子1、人il7ra外显子2至外显子5、部分人il7ra内含子5、部分小鼠il7ra内含子5、小鼠il7ra外显子6至外显子8(编码小鼠il7ra胞外结构域、小鼠il7ra的跨膜结构域和细胞内结构域的最后两个氨基酸，并且包含小鼠il7ra 3'utr)。参见图3a-3f。
[0272]
为了使小鼠il7ra基因座人源化，基于以下序列信息产生靶向核酸构建体：
[0273]
表10
[0274][0275]
表11
[0276] 基因组构建开始结束长度(bp)5'小鼠臂grcm38/mm10chr15：9529675chr15：957848448810人插入物grch38/hg38chr5：35857046chr5：35874277172323'小鼠臂grcm38/mm10chr15：9386119chr15：9510439124321
[0277]
靶向核酸构建体从5'至3'含有：
[0278]
(i)约48.8kb以上的5'小鼠同源臂(小鼠il7ra 5'序列至部分外显子1，即5'utr和从起始密码子开始的前68个bp)；参见图3b和图3e；
[0279]
(ii)126bp的人基因组片段1(seq id no:69)(其包含人il7ra的外显子1的最后14个bp和内含子1的前112个bp)；参见图3b和图3e；
[0280]
(iii)含有与人泛素启动子可操作地连接的潮霉素抗性基因的约5.2kb的自删除选择盒，侧接loxp位点(“floxed hub-hyg”)；参见图3b；
[0281]
(iv)包含人il7ra的内含子1的3'部分、外显子2至外显子5和内含子5的5'部分的17106bp的人基因组片段2；参见图3b；以及
[0282]
(v)包含小鼠il7ra(包含小鼠il7ra 3'utr)的内含子5的3'部分、外显子6至外显子8，随后是下游小鼠基因组序列的约124.3kb的3'小鼠同源；参见图3b和3f。小鼠il7ra的外显子6至外显子8编码小鼠il7ra的胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域的最后两个氨基酸(gly-trp)。
[0283]
将靶向核酸构建体电穿孔到f1h4小鼠胚胎干(es)细胞中。通过等位基因修饰(moa)测定证实了成功整合，如例如在valenzuela等人,同上中所描述的。表12中示出了用于检测人il7ra序列的存在并确认小鼠il7ra序列的丢失和/或保留的moa测定的引物和探
针，并且图3b中指示了引物和探针的位置。在选择正确靶向的es细胞克隆之后，可以切除潮霉素选择盒。带有和不带有盒的靶向的(人源化)il7ra等位基因的基因组序列分别在seq id no:65和66中示出。人源化il7ra基因的编码序列和经编码的氨基酸序列分别阐述于seq id no:46和seq id no:45中。图3f中提供了小鼠il7ra(seq id no:41)和人il7ra(seq id no:43)蛋白序列的比对。
[0284]
表12
[0285][0286]
阳性靶向的es细胞用作供体es细胞，并且通过方法将其显微注射到桑椹胚前期(8细胞)小鼠胚胎中(参见例如us 7,576,259、us 7,659,442、us 7,294,754和us 2008-0078000 a1，所有文献通过引用以其整体并入本文)。在体外温育包括供体es细胞的小鼠胚胎，并且然后将所述小鼠胚胎植入到代孕母亲体内以产生完全源自供体es细胞的f0小鼠。使用上文所描述的moa测定，通过基因分型来鉴定携带人源化il7ra基因的小鼠。将对人源化il7ra基因杂合的小鼠繁殖为纯合性的。
[0287]
实例4.ova-明矾诱导野生型、双重人源化小鼠(tslp hu/hu
/tslpr hu/hu
)和三重人源化小鼠(tslp hu/hu
/tslpr hu/hu
/il7ra
hu/hu
)的2型驱动的炎症
[0288]
为了证实各种人源化小鼠品系在2型驱动的炎症的模型中具有可比较的病理学，采用了卵清蛋白(ova)/明矾诱导的肺部炎症模型，其中tslp的作用先前已有报道(chu等人,《过敏症与临床免疫学杂志》2013；131:187-200.e1-8，所述文献的全部内容通过引用并入本文)。传统的2型炎症终点，如抗原特异性ige和igg1的循环水平，肺组织嗜酸性粒细胞浸润和哮喘肺的气道中过表达的代表性粘蛋白基因muc5ac的肺表达，以及杯状细胞化生(gcm)的替代终点(wills-karp等人,《科学》1998；282:2258-61，所述文献的全部内容通过引用并入本文)在三种小鼠品系中进行评估：野生型小鼠(wt)、双重人源化小鼠(tslp
hu/hu
/tslpr
hu/hu
)和三重人源化小鼠(tslp
hu/hu
/tslpr
hu/hu
/il7r
hu/hu
)。tslp、tslpr和il7r分子中的每一个的人源化分别如实例1、2和3中所描述的。
[0289]
由于肺是高度血管化的器官，在对嗜酸性粒细胞进行门控之前，使用基于cd45的血管内标记技术(anderson等人,《自然实验手册》2014；9:209-22，所述文献的全部内容通过引用并入本文)来区分浸润肺(肺组织)的细胞和在肺血管系统中循环(肺循环)的细胞。如所预期的，tslp/ova施用以跨小鼠品系的相当水平诱导肺组织嗜酸性粒细胞的增加(图4a)。另外，tslp/ova诱导muc5ac(图4b)的肺表达的相当水平以及ova特异性ige(图4c)和ova特异性igg1(图4d)的循环水平的相当水平。
[0290]
方法
[0291]
ova-明矾诱导的肺部炎症。在第1天和第14天将乳化在2mg的氢氧化铝(西格玛奥德里奇公司(sigma aldrich))中的50μg的ova(v级；西格玛奥德里奇公司)或单独的2mg的氢氧化铝中腹膜内施用于wt balb/c小鼠。从第21天开始，用20μl的pbs中的150μg的ova(iii级，西格玛奥德里奇公司)对麻醉的小鼠进行鼻内激发4天。在最后一次激发之后24小时对小鼠进行分析。
[0292]
在研究结束时，将小鼠处死并收集血液和肺用于分析肺组织中的嗜酸性粒细胞浸润、通过实时qpcr的肺基因表达和循环血清免疫球蛋白水平。
[0293]
流式细胞术分析。为了能够对肺中的循环免疫细胞与组织浸润免疫细胞进行流式细胞术分析，在处死之前5分钟，向小鼠静脉内注射抗cd45 bv650抗体(bd生物科学公司(bd biosciences))以选择性地标记仍在血管系统中的免疫细胞，而不标记已经浸润肺实质的细胞。使用liberase th(罗氏公司(roche))和dnase i(罗氏公司)的溶液消化小鼠尾侧肺叶以制备单细胞悬浮液，随后进行机械解离。然后用活/死可固定死细胞染色剂(bd生物科学公司)对细胞进行染色，以排除死细胞，随后是针对以下的抗体：cd45、cd26、siglec-f、ly6g、ly6c、cd11b、cd19、sirpα、cd23、cd127、sca-1、cd44、cd4、cd8、tcrb、cd69 cd62l(bd生物科学公司)；cd64、xcr1、i-a/i-e、cd11c、cd301b(百进生物公司(biolegend))；mertk、st2(e生物科学公司(ebioscience))。使用hts附件(bd)在lsr fortessa x-20或facsymphony细胞分析仪上采集样品。使用flowjo v10软件(bd)执行数据分析。
[0294]
血清ige和抗原特异性ige或igg1的测量。将全血收集到微容器sst血清管中并通过在4℃下以15,000g离心10分钟来沉淀。血清样品用于确定浓度：通过ige夹心elisa opteia试剂盒(bd生物科学公司)确定总ige浓度；通过间接elisa(chondrex公司(chondrex))确定总抗ova ige和抗ova igg1浓度；通过夹心elisa(chondrex公司)确定总抗hdm ige；以及通过内部夹心elisa确定总抗hdm igg1滴度。所有elisa试剂盒遵循制造商的说明。
[0295]
muc5ac的测量。肺muc5ac基因表达通过实时qpcr在采集的肺组织中检测并归一化为管家基因。简而言之，在研究结束时，对小鼠进行放血并取出每只小鼠右肺的副叶，然后放入含有400μl的rna的管中并储存在-20℃下。所有样品在trizol中均质化并且氯仿用于相分离。根据制造商的说明书，使用用于微阵列总rna分离试剂盒的magmax
tm-96(艾莫宾生命技术公司(ambion by life technologies))纯化含有总rna的水相。使用无rnase的dnase组(凯杰公司(qiagen))去除基因组dna。使用vilo
tm
master mix(英杰生命技术公司(invitrogen by life technologies))将mrna逆转录为cdna。将cdna稀释至2ng/ul，并使用abi 7900ht序列检测系统(应用生物系统公司(applied biosystems))用sensifast探针hi-rox(meridian公司(meridian))扩增10ng cdna。内部对照管家基因用于
归一化任何cdna输入差异。测量肺组织mrna表达水平相对于对照小鼠的变化倍数并相对于管家mrna表达进行表达。
[0296]
表13
[0297][0298]
结论
[0299]
基于对肺嗜酸性粒细胞浸润、肺基因表达分析和循环抗体抗体水平的分析，ova-明矾模型诱导在双重人源化(tslp
hu/hu
/tslpr
hu/hu
)和三重人源化(tslp
hu/hu
/tslpr
hu/hu
/il7ra
hu/hu
)小鼠的相当水平的2型驱动的炎症。

技术特征：
1.一种经基因修饰的啮齿动物，其在其基因组中包括：人源化tslp基因，所述人源化tslp基因包括：啮齿动物tslp核酸序列；以及人tslp核酸序列，其中所述人源化tslp基因编码人源化tslp多肽，所述人源化tslp多肽包括与人tslp蛋白的成熟蛋白序列基本上相同的成熟蛋白序列。2.根据权利要求1所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化tslp多肽包括与所述人tslp蛋白的成熟蛋白序列具有至少95％同一性的成熟蛋白序列。3.根据权利要求1所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化tslp多肽包括与所述人tslp蛋白的成熟蛋白序列相同的成熟蛋白序列。4.根据权利要求1至3中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化tslp蛋白包括与啮齿动物tslp蛋白的信号肽基本上相同的信号肽。5.根据权利要求4所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化tslp蛋白包括与啮齿动物tslp蛋白的信号肽具有至少95％同一性的信号肽。6.根据权利要求4所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化tslp蛋白包括与内源性啮齿动物tslp蛋白的信号肽相同的信号肽。7.根据前述权利要求中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人tslp核酸序列至少编码所述人tslp蛋白的大部分成熟蛋白序列。8.根据权利要求7所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人tslp核酸序列编码所述人tslp蛋白的成熟蛋白序列。9.根据权利要求8所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人tslp核酸序列包括人tslp基因的从成熟蛋白序列的第一氨基酸的密码子开始的外显子1至外显子4中的终止密码子。10.根据权利要求1至9中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物tslp核酸序列包括编码啮齿动物tslp信号肽的啮齿动物tslp基因的外显子序列。11.根据权利要求10所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物是小鼠，并且所述啮齿动物核酸序列包括小鼠tslp基因的外显子1和编码信号肽氨基酸的外显子2的5'部分。12.根据权利要求1至9中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物tslp核酸序列包括啮齿动物tslp基因的3'utr。13.根据权利要求10至12中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物tslp基因是内源性tslp基因。14.根据权利要求1所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物是小鼠，并且所述人源化tslp基因包括：(i)小鼠tslp基因的外显子1和编码信号肽氨基酸的外显子2的5'部分；以及(ii)人tslp基因的从成熟蛋白序列的第一氨基酸的密码子开始的外显子1至外显子4中的终止密码子。15.根据权利要求14所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化tslp基因进一步包括所述小鼠tslp基因的3'utr。16.根据权利要求1至15中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化tslp
基因与啮齿动物tslp启动子可操作地连接。17.根据权利要求16所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物tslp启动子是内源性啮齿动物tslp启动子。18.根据权利要求1至17中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化tslp基因位于内源性啮齿动物tslp基因座处。19.根据权利要求18所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化tslp基因是由于位于内源性啮齿动物tslp基因座处的啮齿动物tslp基因组dna被人tslp核酸置换而形成的。20.根据权利要求19所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化tslp基因是由于包括至少编码所述内源性啮齿动物tslp蛋白的大部分成熟蛋白序列的外显子序列的啮齿动物基因组dna被至少编码所述人tslp蛋白的大部分成熟蛋白序列的所述人tslp核酸置换而形成的。21.根据权利要求20所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化tslp基因是由于包括编码所述内源性啮齿动物tslp蛋白的成熟蛋白序列的外显子序列的啮齿动物基因组dna被编码所述人tslp蛋白的成熟蛋白序列的所述人tslp核酸置换而形成的。22.根据权利要求21所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物是小鼠，并且其中被置换的小鼠基因组dna包括内源性小鼠tslp基因的从成熟小鼠tslp蛋白的第一氨基酸的密码子开始的外显子2至外显子5中的终止密码子，并且人基因组dna包括人tslp基因的从成熟人tslp蛋白的第一氨基酸的密码子开始的外显子1至外显子4中的终止密码子。23.根据权利要求1至22中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物对所述人源化tslp基因是纯合的。24.根据权利要求1至22中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物对所述人源化tslp基因是杂合的。25.根据前述权利要求中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物表达所述人源化tslp多肽。26.根据前述权利要求中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其基因组进一步包括位于内源性啮齿动物tslpr基因座处的人源化tslpr基因、位于内源性啮齿动物il7ra基因座处的人源化il7ra基因或其组合。27.根据前述权利要求中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。28.一种分离的啮齿动物组织或细胞，其基因组包括人源化tslp基因，所述人源化tslp基因包括啮齿动物tslp核酸序列和人tslp核酸序列，其中所述人源化tslp基因编码人源化tslp多肽，所述人源化tslp多肽包括与人tslp蛋白的成熟蛋白序列基本上相同的成熟蛋白序列。29.根据权利要求28所述的分离的啮齿动物组织或细胞，其中所述人源化tslp多肽包括与人tslp蛋白的成熟蛋白序列具有至少95％同一性的成熟蛋白序列。30.根据权利要求28或29所述的分离的啮齿动物组织或细胞，其中所述啮齿动物细胞是啮齿动物胚胎干细胞。31.根据权利要求28至30中任一项所述的分离的啮齿动物组织或细胞，其中所述啮齿
动物是小鼠或大鼠。32.一种啮齿动物胚胎，其包括权利要求30的所述啮齿动物胚胎干细胞。33.一种制备经基因修饰的啮齿动物的方法，所述方法包括：修饰啮齿动物基因组以包括人源化tslp基因，其中所述人源化tslp基因包括啮齿动物tslp核酸序列和人tslp核酸序列，并且编码人源化tslp多肽，所述人源化tslp多肽包括与人tslp蛋白的成熟蛋白序列基本上相同的成熟蛋白序列；以及制备包括经修饰的啮齿动物基因组的啮齿动物。34.根据权利要求33所述的方法，其中所述人源化tslp多肽包括与人tslp蛋白的成熟蛋白序列具有至少95％同一性的成熟蛋白序列。35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述修饰包括：将包括所述人tslp核酸序列的核酸分子引入到啮齿动物胚胎干(es)细胞的基因组中；获得啮齿动物es细胞，其中所述人tslp核酸序列已整合到内源性tslp基因座中以置换啮齿动物tslp基因组dna，由此形成所述人源化tslp基因；以及由所获得的啮齿动物es细胞产生啮齿动物。36.根据权利要求35所述的方法，其中所述核酸分子进一步包括侧接所述人tslp核酸序列的5'同源臂和3'同源臂，并且其中所述5'同源臂和所述3'同源臂与侧接待置换的啮齿动物tslp基因组dna的内源性啮齿动物基因座处的核酸序列同源。37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述人源化tslp基因在内源性啮齿动物tslp基因座处与内源性啮齿动物tslp启动子可操作地连接。38.根据权利要求33至37中任一项所述的方法，其中所述人tslp核酸序列至少编码所述人tslp蛋白的大部分成熟蛋白序列。39.根据权利要求33至38中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。40.一种靶向核酸构建体，其包括将整合到内源性啮齿动物tslp基因座处的啮齿动物tslp基因中的人tslp核酸序列，所述人tslp核酸序列侧接有与所述啮齿动物tslp基因座处的核苷酸序列同源的5'核苷酸序列和3'核苷酸序列，其中所述人tslp核酸序列整合到所述啮齿动物tslp基因中使得啮齿动物tslp基因组dna被所述人tslp核酸序列置换，由此形成人源化tslp基因，并且其中所述人tslp核酸序列至少编码人tslp蛋白的大部分成熟蛋白序列。41.根据权利要求40所述的靶向核酸，其中啮齿动物是小鼠或大鼠。42.一种经基因修饰的啮齿动物，其在其基因组中包括：人源化tslpr基因，所述人源化tslpr基因包括：啮齿动物tslpr核酸序列；以及人tslpr核酸序列，其中所述人源化tslpr基因编码人源化tslpr多肽，所述人源化tslpr多肽包括与人tslpr蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域。43.根据权利要求42所述的经基因修饰的啮齿动物，其中人源化tslpr蛋白包括与人tslpr蛋白的胞外结构域具有至少95％同一性的胞外结构域。44.根据权利要求42所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化tslpr蛋白包括与
人tslpr蛋白的胞外结构域相同的胞外结构域。45.根据权利要求42至44中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化tslpr蛋白包括与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列基本上相同的跨膜细胞质序列。46.根据权利要求45所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化tslpr蛋白包括与啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列具有至少95％同一性的跨膜细胞质序列。47.根据权利要求46所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化tslpr蛋白包括内源性啮齿动物tslpr蛋白的跨膜细胞质序列。48.根据权利要求42至47中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化tslpr蛋白包括与啮齿动物tslpr蛋白的信号肽基本上相同的信号肽。49.根据权利要求48所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化tslpr蛋白包括与啮齿动物tslpr蛋白的信号肽具有至少95％同一性的信号肽。50.根据权利要求49所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化tslpr蛋白包括内源性啮齿动物tslpr蛋白的信号肽。51.根据权利要求40至50中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人tslpr核酸序列至少编码所述人tslpr蛋白的大部分胞外结构域。52.根据权利要求51所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人tslpr核酸序列包括人tslpr基因的外显子2至外显子6中的最后一个胞外结构域氨基酸的密码子。53.根据权利要求40至52中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物tslpr核酸序列包括至少编码啮齿动物tslpr蛋白的大部分跨膜细胞质序列的啮齿动物tslpr基因的外显子序列。54.根据权利要求53所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物是小鼠，并且所述啮齿动物tslpr核酸序列包括小鼠tslpr基因的从跨膜结构域的第一氨基酸的密码子开始的外显子6至外显子8。55.根据权利要求40至54中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物tslpr核酸序列包括啮齿动物tslpr基因的编码啮齿动物tslpr蛋白的信号肽的外显子序列。56.根据权利要求55所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物是小鼠，并且所述啮齿动物核酸序列包括小鼠tslpr基因的外显子1。57.根据权利要求53至56中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物tslpr基因是内源性tslpr基因。58.根据权利要求40所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物是小鼠，并且所述人源化tslpr基因包括：(i)小鼠tslpr基因的外显子1；(ii)人tslpr基因的外显子2至外显子6中的胞外结构域的最后一个氨基酸的密码子；以及(iii)所述小鼠tslpr基因的从所述跨膜结构域的所述第一氨基酸的所述密码子开始的外显子6至外显子8。59.根据权利要求40至58中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化tslpr基因与啮齿动物tslpr启动子可操作地连接。60.根据权利要求59所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物tslpr启动子是内源性啮齿动物tslpr启动子。61.根据权利要求40至60中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化
tslpr基因位于内源性啮齿动物tslpr基因座处。62.根据权利要求61所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化tslpr基因是由于内源性啮齿动物tslpr基因座处的啮齿动物tslpr基因组dna被人tslpr核酸置换而形成的。63.根据权利要求62所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化tslpr基因是由于包括至少编码所述内源性啮齿动物tslpr蛋白的大部分胞外结构域的外显子序列的啮齿动物基因组dna被至少编码所述人tslpr蛋白的大部分胞外结构域的所述人tslpr核酸置换而形成的。64.根据权利要求63所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物是小鼠，并且其中被置换的小鼠基因组dna包括内源性小鼠tslpr基因的外显子2至外显子6中的胞外结构域的最后一个氨基酸的密码子，并且人基因组dna包括人tslpr基因的外显子2至外显子6中的胞外结构域的最后一个氨基酸的密码子。65.根据权利要求40至64中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物对所述人源化tslpr基因是纯合的。66.根据权利要求40至62中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物对所述人源化tslpr基因是杂合的。67.根据权利要求40至66中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物表达所述人源化tslpr多肽。68.根据权利要求40至67中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其基因组进一步包括位于内源性啮齿动物tslp基因座处的人源化tslp基因、位于内源性啮齿动物il7ra基因座处的人源化il7ra基因或其组合。69.根据权利要求40至68中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。70.一种分离的啮齿动物组织或细胞，其基因组包括人源化tslpr基因，所述人源化tslpr基因包括啮齿动物tslpr核酸序列和人tslpr核酸序列，其中所述人源化tslpr基因编码人源化tslpr多肽，所述人源化tslpr多肽包括与人tslpr蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域。71.根据权利要求70所述的分离的啮齿动物组织或细胞，其中所述人源化tslpr多肽包括与人tslpr蛋白的胞外结构域具有至少95％同一性的胞外结构域。72.根据权利要求70或71所述的分离的啮齿动物组织或细胞，其中所述啮齿动物细胞是啮齿动物胚胎干细胞。73.根据权利要求70至72中任一项所述的分离的啮齿动物组织或细胞，其中啮齿动物是小鼠或大鼠。74.一种啮齿动物胚胎，其包括权利要求72的所述啮齿动物胚胎干细胞。75.一种制备经基因修饰的啮齿动物的方法，所述方法包括：修饰啮齿动物基因组以包括人源化tslpr基因，其中所述人源化tslpr基因包括啮齿动物tslpr核酸序列和人tslpr核酸序列，并且编码人源化tslpr多肽，所述人源化tslpr多肽包括与人tslp蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域；以及制备包括经修饰的啮齿动物基因组的啮齿动物。76.根据权利要求75所述的方法，其中所述人源化tslpr多肽包括与人tslp蛋白的胞外
结构域具有至少95％同一性的胞外结构域。77.根据权利要求75或76所述的方法，其中所述修饰包括：将包括所述人tslpr核酸序列的核酸分子引入到啮齿动物胚胎干(es)细胞的基因组中；获得啮齿动物es细胞，其中所述人tslpr核酸序列已整合到内源性tslpr基因座中以置换啮齿动物tslpr基因组dna，由此形成所述人源化tslpr基因；以及由所获得的啮齿动物es细胞产生啮齿动物。78.根据权利要求75所述的方法，其中所述核酸分子进一步包括侧接所述人tslpr核酸序列的5'同源臂和3'同源臂，并且其中所述5'同源臂和所述3'同源臂与侧接待置换的啮齿动物tslpr基因组dna的内源性啮齿动物基因座处的核酸序列同源。79.根据权利要求77或78所述的方法，其中所述人源化tslpr基因在内源性啮齿动物tslpr基因座处与内源性啮齿动物tslpr启动子可操作地连接。80.根据权利要求75至79中任一项所述的方法，其中所述人tslpr核酸序列至少编码人tslpr蛋白的大部分胞外结构域。81.根据权利要求75至80中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。82.一种靶向核酸构建体，其包括将整合到内源性啮齿动物tslpr基因座处的啮齿动物tslpr基因中的人tslpr核酸序列，所述人tslpr核酸序列侧接有与所述啮齿动物tslpr基因座处的核苷酸序列同源的5'核苷酸序列和3'核苷酸序列，其中所述人tslpr核酸序列整合到所述啮齿动物tslpr基因中使得啮齿动物tslpr基因组dna被所述人tslpr核酸序列置换，由此形成人源化tslpr基因，并且其中所述人tslpr核酸序列至少编码人tslpr蛋白的大部分胞外结构域。83.根据权利要求82所述的靶向核酸，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。84.一种经基因修饰的啮齿动物，其在其基因组中包括：人源化il7ra基因，所述人源化il7ra基因包括：啮齿动物il7ra核酸序列；以及人il7ra核酸序列，其中所述人源化il7ra基因编码人源化il7ra多肽，所述人源化il7ra多肽包括与人il7ra蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域。85.根据权利要求84所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化il7ra多肽包括与人il7ra蛋白的胞外结构域具有至少95％同一性的胞外结构域。86.根据权利要求84所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化il7ra多肽包括与人il7ra蛋白的胞外结构域相同的胞外结构域。87.根据权利要求84至86中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化il7ra蛋白包括与啮齿动物il7ra蛋白的跨膜细胞质序列基本上相同的跨膜细胞质序列。88.根据权利要求87所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化il7ra蛋白包括与啮齿动物il7ra蛋白的跨膜细胞质序列具有至少95％同一性的跨膜细胞质序列。89.根据权利要求87所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化il7ra蛋白包括内源性啮齿动物il7ra蛋白的跨膜细胞质序列。
90.根据权利要求84至89中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化il7ra蛋白包括与啮齿动物il7ra蛋白的信号肽基本上相同的信号肽。91.根据权利要求90所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化il7ra蛋白包括与啮齿动物il7ra蛋白的信号肽具有至少95％同一性的信号肽。92.根据权利要求90所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化il7ra蛋白包括内源性啮齿动物il7ra蛋白的信号肽。93.根据权利要求84至92中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人il7ra核酸序列至少编码所述人il7ra蛋白的大部分胞外结构域。94.根据权利要求93所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人il7ra核酸序列包括人il7ra基因的从编码成熟人il7ra蛋白的第一氨基酸的外显子2中的密码子至外显子5。95.根据权利要求84至94中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物il7ra核酸序列包括至少编码啮齿动物il7ra蛋白的大部分跨膜细胞质序列的啮齿动物il7ra基因的外显子序列。96.根据权利要求95所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物是小鼠，并且所述啮齿动物il7ra核酸序列包括小鼠il7ra基因的外显子6至外显子8。97.根据权利要求84至96中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物il7ra核酸序列包括啮齿动物il7ra基因的编码啮齿动物il7ra蛋白的信号肽的外显子1中的部分。98.根据权利要求97所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物il7ra核酸序列包括所述啮齿动物il7ra基因的外显子1的5'utr部分。99.根据权利要求95至98中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物il7ra基因是内源性il7ra基因。100.根据权利要求84所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物是小鼠，并且所述人源化il7ra基因包括：(i)小鼠il7ra基因的包括小鼠il7ra的5'utr和编码信号肽的序列的外显子1的一部分；(ii)人il7ra基因的编码成熟人il7ra蛋白的第一氨基酸的外显子1中的密码子至所述人il7ra基因的外显子5；以及(iii)所述小鼠il7ra基因的外显子6至外显子8。101.根据权利要求84至100中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化il7ra基因与啮齿动物il7ra启动子可操作地连接。101.根据权利要求101所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物il7ra启动子是内源性啮齿动物il7ra启动子。102.根据权利要求84至101中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化il7ra基因位于内源性啮齿动物il7ra基因座处。103.根据权利要求102所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化il7ra基因是由于内源性啮齿动物il7ra基因座处的啮齿动物il7ra基因组dna被人il7ra核酸置换而形成的。104.根据权利要求103所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述人源化il7ra基因是由于包括至少编码所述内源性啮齿动物il7ra蛋白的大部分胞外结构域的外显子序列的啮齿动物基因组dna被至少编码所述人il7ra蛋白的大部分胞外结构域的所述人il7ra核酸置换
而形成的。105.根据权利要求105所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物是小鼠，并且其中被置换的小鼠基因组dna包括内源性小鼠il7ra基因的编码成熟小鼠il7ra蛋白的第一氨基酸的外显子1中的密码子至外显子5，并且人基因组dna包括人il7ra基因的编码所述成熟人il7ra蛋白的第一氨基酸的外显子1中的密码子至外显子5。106.根据权利要求84至105中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物对所述人源化il7ra基因是纯合的。107.根据权利要求84至105中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物对所述人源化il7ra基因是杂合的。108.根据权利要求84至107中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物表达所述人源化il7ra多肽。109.根据权利要求84至108中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其基因组进一步包括位于内源性啮齿动物tslp基因座处的人源化tslp基因、位于内源性啮齿动物tslpr基因座处的人源化tslpr基因或其组合。110.根据权利要求84至109中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。111.一种分离的啮齿动物组织或细胞，其基因组包括人源化il7ra基因，所述人源化il7ra基因包括啮齿动物il7ra核酸序列和人il7ra核酸序列，其中所述人源化il7ra基因编码人源化il7ra多肽，所述人源化il7ra多肽包括与人il7ra蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域。112.根据权利要求111所述的分离的啮齿动物组织或细胞，其中所述人源化il7ra多肽包括与人il7ra蛋白的胞外结构域具有至少95％同一性的胞外结构域。113.根据权利要求111或112所述的分离的啮齿动物组织或细胞，其中所述啮齿动物细胞是啮齿动物胚胎干细胞。114.根据权利要求111至113中任一项所述的分离的啮齿动物组织或细胞，其中啮齿动物是小鼠或大鼠。115.一种啮齿动物胚胎，其包括权利要求113的所述啮齿动物胚胎干细胞。116.一种制备经基因修饰的啮齿动物的方法，所述方法包括：修饰啮齿动物基因组以包括人源化il7ra基因，其中所述人源化il7ra基因包括啮齿动物il7ra核酸序列和人il7ra核酸序列，并且编码人源化il7ra多肽，所述人源化il7ra多肽包括与人il7ra蛋白的胞外结构域基本上相同的胞外结构域；以及制备包括经修饰的啮齿动物基因组的啮齿动物。117.根据权利要求116所述的方法，其中所述人源化il7ra多肽包括与人il7ra蛋白的胞外结构域具有至少95％同一性的胞外结构域。118.根据权利要求116或117所述的方法，其中所述修饰包括：将包括所述人il7ra核酸序列的核酸分子引入到啮齿动物胚胎干(es)细胞的基因组中；获得啮齿动物es细胞，其中所述人il7ra核酸序列已整合到内源性il7ra基因座中以置换啮齿动物il7ra基因组dna，由此形成所述人源化il7ra基因；以及
由所获得的啮齿动物es细胞产生啮齿动物。119.根据权利要求118所述的方法，其中所述核酸分子进一步包括侧接所述人il7ra核酸序列的5'同源臂和3'同源臂，并且其中所述5'同源臂和所述3'同源臂与侧接待置换的啮齿动物il7ra基因组dna的内源性啮齿动物基因座处的核酸序列同源。120.根据权利要求118或119所述的方法，其中所述人源化il7ra基因在内源性啮齿动物tslpr基因座处与内源性啮齿动物il7ra启动子可操作地连接。121.根据权利要求116至120中任一项所述的方法，其中所述人il7ra核酸序列至少编码所述人il7ra蛋白的大部分胞外结构域。122.根据权利要求116至121中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。123.一种靶向核酸构建体，其包括将整合到内源性啮齿动物il7ra基因座处的啮齿动物il7ra基因中的人il7ra核酸序列，所述人il7ra核酸序列侧接有与所述啮齿动物il7ra基因座处的核苷酸序列同源的5'核苷酸序列和3'核苷酸序列，其中所述人il7ra核酸序列整合到所述啮齿动物il7ra基因中使得啮齿动物il7ra基因组dna被所述人il7ra核酸序列置换，由此形成人源化il7ra基因，并且其中所述人il7ra核酸序列编码人il7ra蛋白的大部分胞外结构域。124.根据权利要求123所述的靶向核酸，其中啮齿动物是小鼠或大鼠。125.根据权利要求1至27、42至69或84至110中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，其进一步包括人源化sirpα基因，其中所述啮齿动物对rag2-/-和il2rg-/-是纯合的。126.根据权利要求125所述的经基因修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物进一步包括人源化tpo基因和/或人源化gm-csf/il-3基因座。127.一种根据权利要求1至27、42至69、84至110或125至126中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物在制备过敏性疾病(例如，哮喘或皮肤炎症)或癌症的啮齿动物模型中的用途。128.一种测试用于治疗过敏性病状的候选药剂的方法，所述方法包括：诱导根据权利要求1至27、42至69、84至110或125至126中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物的过敏性病状；向所述经基因修饰的啮齿动物施用候选药剂；以及确定所述候选药剂是否抑制所述经基因修饰的啮齿动物的所述过敏性病状。129.一种测试用于治疗癌症的候选药剂的方法，所述方法包括：将人癌细胞移植到根据权利要求1至27、42至69、84至110或125至126中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物体内；向所述经基因修饰的啮齿动物施用候选药剂；以及确定所述候选药剂是否抑制所述经基因修饰的啮齿动物体内的癌细胞的生长。130.根据权利要求128或129所述的方法，其中所述候选药剂是小分子化合物、核酸或抗体。131.一种用于产生经基因修饰的啮齿动物细胞的体外方法，所述方法包括将根据权利要求40或41所述的靶向核酸构建体引入到啮齿动物细胞中，由此将所述人tslp核酸序列整合到内源性啮齿动物tslp基因中，使得啮齿动物tslp基因组dna被所述人
tslp核酸序列置换以形成人源化tslp基因，由此产生所述经基因修饰的啮齿动物细胞。132.根据权利要求131所述的方法，其中所述啮齿动物细胞是啮齿动物es细胞。133.一种用于产生经基因修饰的啮齿动物细胞的体外方法，所述方法包括将根据权利要求82或83所述的靶向核酸构建体引入到啮齿动物细胞中，由此将所述人tslpr核酸序列整合到内源性啮齿动物tslpr基因中，使得啮齿动物tslpr基因组dna被所述人tslpr核酸序列置换以形成人源化tslpr基因，由此产生所述经基因修饰的啮齿动物细胞。134.根据权利要求133所述的方法，其中所述啮齿动物细胞是啮齿动物es细胞。135.一种用于产生经基因修饰的啮齿动物细胞的体外方法，所述方法包括将根据权利要求123或124所述的靶向核酸构建体引入到啮齿动物细胞中，由此将所述人il7ra核酸序列整合到内源性啮齿动物il7ra基因中，使得啮齿动物il7ra基因组dna被所述人il7ra核酸序列置换以形成人源化il7ra基因，由此产生所述经基因修饰的啮齿动物细胞。136.根据权利要求135所述的方法，其中所述啮齿动物细胞是啮齿动物es细胞。

技术总结
本文公开了啮齿动物(如但不限于小鼠和大鼠)，所述啮齿动物被基因修饰以包括人源化Tslp基因、人源化Tslpr基因、人源化Il7ra基因或其组合。提供了用于制备此类经基因修饰的啮齿动物的组合物和方法以及使用此类经基因修饰的啮齿动物作为如过敏性疾病和癌症等疾病的动物模型的方法。的动物模型的方法。


技术研发人员：Y
受保护的技术使用者：瑞泽恩制药公司
技术研发日：2021.12.20
技术公布日：2023/9/23