化学上确定的血清白蛋白替代物的制作方法

化学上确定的血清白蛋白替代物
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背景技术：

5.白蛋白(一种分子量为约66,000道尔顿的单一多肽)是脊椎动物血清中最丰富的蛋白质。白蛋白用作细胞培养物的关键组分，并赋予扩增细胞有益的性质。然而，白蛋白也是细胞培养性能变化的主要来源。例如，白蛋白的化学组合物在不同批次之间有所不同，即使是来自单个制造商。白蛋白携带许多来自血液的物质，包括激素、维生素和酶，并且可能被对细胞有毒的组分(例如，过渡金属)或提高细胞活力的组分污染。所有这些污染物都会影响细胞培养物的活力，并导致生物研究中的不一致。另外，很难控制培养基组分与白蛋白之间的相互作用，并且白蛋白对培养基组分的螯合可能会限制它们对所培养的细胞的可及性。
6.鉴于前述情况，非常需要用于细胞培养基的化学上确定的白蛋白替代物，也需要用于含有白蛋白的细胞培养基中的化学上确定的培养基补充物，例如以挽救白蛋白诱导的毒性。本文提供了针对本领域中的这些和其他问题的解决方案。


技术实现要素：

7.本文公开的实施方案总体上涉及包含白蛋白的化学上确定的替代物或部分替代物的组合物及其使用方法。这些组合物可以是支持细胞培养(例如应激敏感性细胞的培养)的培养基或补充物。这些组合物可以保护细胞(例如干细胞、神经细胞和少突胶质细胞)免受由包括冷冻/解冻循环、运输和实验室程序(包括转染)的过程造成的损伤。本文提供的培养基或补充物可用于包含白蛋白的细胞培养基中，以例如挽救细胞免受白蛋白诱导的毒性。本文提供的培养基或补充物可进一步增强所培养的细胞的活力。
8.在一个方面，提供了一种细胞培养基，该细胞培养基包含具有超氧化物歧化酶活性和cu+、zn+螯合活性的肽。在实施方案中，该细胞培养基还包含维生素e类似物、过氧化氢还原试剂和超氧化物清除剂中的一种或多种。
9.在一个方面，提供了一种细胞培养补充物，该细胞培养补充物包含具有超氧化物歧化酶活性和cu+、zn+螯合活性的肽。在实施方案中，该细胞培养补充物还包含维生素e类似物、过氧化氢还原试剂和超氧化物清除剂中的一种或多种。
10.在一个方面，提供了一种用于使细胞在培养物中生长的方法，该方法包括使细胞在本文(包括其实施方案)提供的细胞培养基中生长。
11.在一个方面，提供了一种使细胞在培养物中生长的方法，该方法包括使细胞在补充有本文(包括其实施方案)提供的细胞培养补充物的细胞培养基中生长。
12.在一个方面，提供了一种挽救细胞免受白蛋白诱导的毒性的方法，该方法包括使表现出白蛋白诱导的毒性的细胞与本文(包括其实施方案)提供的细胞培养补充物接触。
13.在一个方面，提供了一种用于使细胞在培养物中扩增的方法，该方法包括使细胞与本文(包括其实施方案)提供的细胞培养基中的无血清、无白蛋白的细胞培养基接触。
14.在一个方面，提供了一种用于使细胞从氧化应激中恢复的方法，该方法包括使细胞与本文(包括其实施方案)提供的细胞培养补充物接触，或使细胞在本文(包括其实施方案)提供的细胞培养基中生长。
15.在一个方面，提供了一种细胞培养补充物，该细胞培养补充物包含：(i)具有超氧化物歧化酶活性和cu+、zn+螯合活性的肽；(ii)维生素e或其类似物；和(iii)超氧化物清除剂。
16.在一个方面，提供了一种细胞培养试剂盒，该细胞培养试剂盒包括本文(包括其实施方案)提供的无血清细胞培养基和细胞培养补充物。
附图说明
17.图1a示出，当存在于在b27培养基中生长的各种细胞培养物中时，市售白蛋白之间存在性能差异。
18.图1b至图1c示出了说明不同b27培养物组分与bsa之间的相互作用以及这些相互作用对神经元细胞活力的影响的主效应图。
19.图1d至图1e示出了说明不同b27培养物组分与重组人血清白蛋白(rhsa)之间的相互作用以及这些相互作用对神经元细胞活力的影响的主效应图。
20.图1f至图1j示出了说明在宽浓度的rhsa下不同b27培养物组分之间的相互作用以及这些相互作用对神经元细胞活力的影响的主效应图。
21.图2a示出了在不同批次和来源的bsa之间观察到的组分变化。
22.图2b是比较在存在bsa1和bsa2的情况下大鼠神经元细胞存活(上图)以及添加的铁对大鼠神经元细胞存活的影响(下图)的柱状图。
23.图2c是说明在培养物中添加抗氧化剂防止和/或逆转铁诱导的毒性的柱状图。
24.图2d至图2e是示出不同白蛋白来源对干细胞增殖的影响的柱状图。小鼠胚胎干细胞(mesc)的结果如图2d所示，人神经干细胞(hnsc)的结果如图2e所示。
25.图2f示出了来自不同来源的白蛋白对在essential 6培养基中生长的人多能干细胞中叉头盒蛋白g1(foxg1)和配对盒蛋白(pax-6)的表达的影响。
26.图3是示出来自不同来源的白蛋白同源物的总还原活性变化的柱状图。
27.图4a是示出不同来源的白蛋白同源物中不同超氧化物歧化酶(sod)活性的柱状图。
28.图4b是示出mito-tempo在一系列浓度处具有sod活性的柱状图。
29.图5是说明mito-tempo可以减少由活性氧物质(ros)诱导的细胞应激的柱状图。
30.图6是示出白蛋白同源物具有过氧化氢酶活性的柱状图。
31.图7是示出多种白蛋白同源物具有基于硫醇的抗氧化活性的柱状图。
32.图8示出了化学上确定的组分，包括谷胱甘肽和硫辛酸，可以去除h2o2以提高培养物中大鼠神经元细胞的活力。
33.图9是示出向大鼠神经元细胞的培养基中添加铜导致神经元细胞死亡的柱状图。
34.图10是示出某些浓度的肽c保留了hsa的金属结合特性而肽a和肽b在测试浓度处不螯合金属的柱状图。
35.图11是示出四肽dahk(seq id no:1)(第1批次，第2批次，bsa肽)具有与hsa相似的金属结合活性而乱序序列(乱序)没有的柱状图。
36.图12是示出肽c挽救和/或防止培养的大鼠神经元细胞中铜诱导的毒性的柱状图。
37.图13是示出肽c(dahk(seq id no:1))以浓度依赖性方式挽救小鼠胚胎干细胞免受铜诱导的应激的柱状图。该图公开了seq id no:1。
38.图14是说明铜的存在降低了培养物中hek-293细胞的细胞活力而肽c挽救细胞免受铜诱导的应激的柱状图。该图公开了seq id no:1。
39.图15是示出多种批次和来源的bsa和hsa具有不同的抗氧化水平和活性(如通过铁还原抗氧化剂能力(frap)测定所测量的)的柱状图。
40.图16a是示出来自不同来源的白蛋白包括不同水平的抗氧化维生素e的柱状图。
41.图16b和图16c是说明维生素e(图16b)和trolox(图16c)对大鼠皮质神经元(rcn)细胞存活的影响的柱状图。
42.图17a和图17b是说明肽c对在essential 6培养基中生长的人多能干细胞中foxg1表达的影响(如通过icc(图17a)和qpcr(图17b)所测量的)的柱状图。
43.图18a至图18b是说明rhsa对hek-293细胞(图18a)和hela细胞(图18b)有毒并且如本文所公开的化学上确定的补充物挽救hek-293和hela细胞免受rhsa诱导的毒性的柱状图。
44.图19a至图19b是示出原代神经元的神经元活力(图19a)和神经突长度(图19b)在存在如本文所公开的化学上确定的补充物的情况下增强的柱状图。
45.图20是比较重组hsa和多种长度的多种肽c衍生肽对大鼠神经元细胞生长的影响的图。该图按出现顺序分别公开了seq id no 1、10、11、14、12、13和15-17。
46.图21是比较重组hsa和多种肽c衍生肽对大鼠神经元细胞生长的影响的图。肽c衍生肽保留了肽c的电荷性质。该图按出现顺序分别公开了seq id no 1、7、8、19和9。
具体实施方式
47.在阅读本说明书之后，对于本领域的技术人员而言，如何在各个替代性实施方案和替代性应用中实施本公开将变得显而易见。然而，本文中将不描述本发明的所有各个实施方案。将理解的是，此处所呈现的实施方案仅通过举例而非限制的方式进行呈现。如此，各个替代性实施方案的这种详细描述不应被解释为限制如本文所阐述的本公开的范围或广度。
48.在公开和描述本发明技术之前，应当理解，以下描述的方面并不限于具体组合物、制备此类组合物的方法或其用途，因而这些方面当然可以变化。还应当理解，本文所使用的术语仅出于描述特定方面的目的，而不旨在是限制性的。
49.详细描述仅出于读者的方便而被分成各个部分，并且在任何部分中发现的公开内
容可以与在另一个部分中的公开内容组合。为了方便读者，可以在说明书中使用标题或子标题，其并不旨在影响本公开的范围。
50.定义
51.除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在本说明书和以下权利要求书中，将参考多个术语，所述多个术语应被定义为具有以下含义：
52.本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不旨在进行限制。除非上下文另外清楚地说明，否则如本文所用，单数形式“一个/一种(a、an)”和“所述(the)”旨在包含复数形式。
[0053]“任选的(optional)”或“任选地(optionally)”是指随后描述的事件或情况可能发生或不发生，并且所述描述包含事件或情况发生的实例以及事件或情况不发生的实例。
[0054]
当在包含范围的数值指定例如温度、时间、量、浓度以及此类其他之前使用时，术语“约”指示可以变化(+)或(-)10％、5％、1％或在其之间的任何子范围或子值的近似值。优选地，当关于量使用时，术语“约”意指量可以变化+/-10％。
[0055]“包括(comprising)”或“包括(comprises)”旨在意味着组合物和方法包含所叙述的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由
……
组成(consisting essentially of)”应当意味着排除对于所述目的的组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由如本文所定义的要素组成的组合物将不排除对所要求保护的发明的基本和新颖特性不具有实质影响的其他材料或步骤。“由
……
组成(consisting of)”应当意味着排除大于痕量要素的其他成分和大量方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本公开的范围内。
[0056]
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由基因密码编码的氨基酸以及之后被修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ－羧基谷氨酸和o－磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和r基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经过修饰的r基团(例如，正亮氨酸)或经过修饰的肽主链，但是保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的通式化学结构不同的结构但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。
[0057]
氨基酸在本文中可以通过其通常已知的三字母符号或通过iupac-iub生物化学命名法委员会(the iupac-iub biochemical nomenclature commission)推荐的单字母符号提及。同样，核苷酸可以通过其普遍接受的单字母代码来表示。
[0058]
术语“多肽”、“肽”以及“蛋白质”在本文中可互换使用以指氨基酸残基的聚合物，其中聚合物可以任选地与不由氨基酸组成的部分结合。这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是天然存在的相应氨基酸的人工化学模拟物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
[0059]“重组蛋白”是指由引入到宿主细胞中的核酸编码的蛋白质。宿主细胞表达核酸。术语“表达核酸”与“表达来自由核酸编码的rna的蛋白质”同义。本文所使用的“蛋白质”广义上是指聚合的氨基酸，例如肽、多肽、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白等。
[0060]“保守修饰的变体”适用于氨基酸序列和核酸序列两者。就特定的核酸序列而言，保守修饰的变体是指编码一致或基本上一致氨基酸序列的那些核酸，或者其中核酸不编码氨基酸序列；基本一致的序列。关于氨基酸序列，技术人员将认识到改变、添加或缺失所编码序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸的针对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”，其中改变引起氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的。这种保守修饰的变体另外是并且不排除本发明的多态性变体、种间同源物以及等位基因。
[0061]
以下八组各自含有彼此保守取代的氨基酸：(1)丙氨酸(a)、甘氨酸(g)；(2)天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)；(3)天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)；(4)精氨酸(r)、赖氨酸(k)；(5)异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、缬氨酸(v)；(6)苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)；(7)丝氨酸(s)、苏氨酸(t)；(8)半胱氨酸(c)、甲硫氨酸(m)(参见例如creighton,《蛋白质(proteins)》(1984))。
[0062]
通过在比较窗中比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性百分比”，其中比较窗中的多核苷酸或多肽序列部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即空位)以使两个序列达到最佳比对。如下计算百分比：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数目并将结果乘以100而得到序列同一性百分比。
[0063]
术语“相同”或百分比“同一性”在两种或更多种核酸或多肽序列的上下文中是指两种或更多种序列或子序列当在比较窗或指定区域上进行最大对应性的比较和比对时，具有相同的氨基酸残基或核苷酸或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在本发明的整个多肽序列的例如指定区域或本发明的多肽的各个结构域上50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性)，如使用序列比较算法或通过人工比对和目视检查所测量。至少约80％相同的此类序列被称为“基本上相同”。在一些实施方案中，两个序列100％相同。在某些实施方案中，两个序列在其中一个序列(例如，在序列具有不同长度的情况下，两个序列中较短的一个序列)的全长上是100％相同的。在各种实施方案中，同一性可以指测试序列的互补序列。在一些实施方案中，同一性存在于长度为至少约10至约100、约20至约75、约30至约50个氨基酸或核苷酸的区域上。在某些实施方案中，同一性存在于长度为至少约50个氨基酸的区域上，或更优选地存在于长度为100至500、100至200、150至200、175至200、175至225、175至250、200至225、200至250或更多个氨基酸的区域上。
[0064]
氨基酸或核苷酸碱基“位置”由编号表示，该编号基于其相对于n端(或5'末端)的位置依次鉴定参考序列中的每个氨基酸(或核苷酸碱基)。由于在确定最佳比对时必须考虑的缺失、插入、截短、融合等，因此通常通过从n端简单计数确定的测试序列中的氨基酸残基数不一定与其在参考序列中的相应位置的编号相同。例如，在变体相对于比对参考序列具有缺失的情况下，变体中不存在对应于参考序列中缺失位点的位置的氨基酸。当所比对的参考序列中存在插入时，所述插入不对应于参考序列中所编号的氨基酸位置。在截短或融合的情况下，参考序列或比对序列中的氨基酸区段可以不对应于相应序列中的任何氨基酸。
[0065]
当在给定氨基酸或多核苷酸序列的编号的上下文中使用时，术语“编号参考”或“对应于”是指当给定氨基酸或多核苷酸与参考序列进行比较时所指定参考序列的残基的编号。当蛋白质中的氨基酸残基在蛋白质中占据与给定残基相同的基本结构位置时，该氨基酸残基“对应于”给定残基。
[0066]
对于本文描述的特定蛋白质(例如，hsa)，所指定的蛋白质包括任何蛋白质的天然存在形式，或变体或同源物，其维持蛋白质活性(例如，与天然蛋白质相比，活性在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)。在各方面，与天然存在的形式相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在各方面，蛋白质是根据其ncbi序列参照物鉴定的蛋白质。在各方面，蛋白质是根据其ncbi序列参照物或其功能片段或同源物鉴定的蛋白质。
[0067]
序列比较时，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。优选地，可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
[0068]“比较窗口”是指多个连续位置(例如，至少约10至约100、约20至约75、约30至约50、100至500、100至200、150至200、175至200、175至225、175至250、200至225、200至250个)中的任一个的区段，其中在两个序列最佳比对之后，可以将该序列与相同数量的连续位置的参考序列进行比较。在各种实施方案中，比较窗口是两个比对序列中的一个或两个的全长。在一些实施方案中，被比较的两个序列包含不同的长度，并且比较窗口是两个序列中较长或较短的序列的全长。在涉及不同长度的两个序列的某些实施方案中，比较窗口包括两个序列中较短的序列的全长。在涉及不同长度的两个序列的一些实施方案中，比较窗口包括两个序列中较长的序列的全长。
[0069]
用于比较的序列比对方法在本领域中是公知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过smith和waterman的局部同源性算法(1970)《高等应用数学(adv.appl.math.)》2:482c，通过needleman和wunsch的同源性比对算法(1970)《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》48:443，通过pearson和lipman的寻找相似性方法(1988)《美国国家科学院学报(proc.nat'l.acad.sci.usa)》85:2444，通过这些算法的计算机实现(wisconsin遗传性软件包，genetics computer group，575science dr.，威斯康星州麦迪逊中的gap、bestfit、fasta和tfasta)，或通过手工比对和目视检查(参见例如ausubel等人，《分子生物学最新方案(current protocols in molecular biology)》(1995年增刊))进行。
[0070]
适于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的优选示例是blast和blast 2.0算法，其分别描述于altschul等人(1977)《核酸研究(nuc.acids res.)》25:3389-3402和altschul等人(1990)《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》215:403-410。进行blast分析的软件可以通过国家生物技术信息中心(ncbi)公开获得，如本领域已知的。示例性blast算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度为w的短字来鉴定高得分序列对(hsp)，当与数据库序列中相同长度的字比对时，其匹配或满足一些正值阈值分数t。t被称为邻域字分数阈值(altschul等人，如上)。这些初始邻域字命中点充当开始检索以找到含有其的更长hsp的种子。只要累积比对分数可以增加，那么字命中点就会沿着每个序列在两个方向上延伸。对于核苷酸序列，使用参数m(一对匹配残基的奖励分数；始终》0)和n(错配残基的罚分；始终《0)
来计算累积分数。对于氨基酸序列来说，使用计分矩阵计算累积分数。在以下情况下，将停止字命中在每个方向上的延伸：累积比对得分从其最大实现值下降了数量x；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分趋于零或更低；或者到达任一序列的末端。blast算法参数w、t以及x决定比对的灵敏度和速度。在某些实施方案中，ncbi blastn或blastp程序用于比对序列。在某些实施方案中，blastn或blastp程序使用由ncbi使用的默认值。在某些实施方案中，blastn程序(用于核苷酸序列)使用以下默认值：28的字长(w)；10的预期阈值(e)；查询范围中设为0的最大匹配；1,-2的匹配/不匹配分数；线性空位成本；使用针对低复杂度区域的过滤器；以及仅使用查找表的掩码。在某些实施方案中，blastp程序(用于氨基酸序列)使用以下默认值：3的字长(w)；10的预期阈值(e)；查询范围中设为0的最大匹配；blosum62矩阵(参见henikoff和henikoff 1992《美国国家科学院学报(proc.natl.acad.sci.usa)》89:10915)；存在性空位成本：11和扩展空位成本：1；以及条件组成分数矩阵调整。
[0071]
blast算法还对两个序列之间的类似性进行统计分析(参见例如karlin和altschul(1993)《美国国家科学院学报(proc.natl.acad.sci.usa)》90:5873-5787)。由blast算法提供的一种相似度度量是最小和概率(p(n))，其提供对两个核苷酸或氨基酸序列之间将偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸比较时的最小和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，并且最优选小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
[0072]
当应用于核酸或蛋白质时，术语“分离的”表示该核酸或蛋白质基本上不含在天然状态下与其缔合的其他细胞组分。例如，其可以处于均匀状态并且可以处于干燥或水溶液中。纯度和均匀性通常使用分析化学技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法确定。作为制剂中存在的主要物种的蛋白质是基本上纯化的。
[0073]
如本文所用，术语“脂质”是指一组天然存在的分子，包括脂肪、蜡、固醇、脂溶性维生素(诸如维生素a、d、e和k)、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂等。脂质可以广泛地定义为疏水性或两亲性小分子；一些脂质的两亲性性质允许它们在水性环境中形成诸如囊泡、多层/单层脂质体或膜的结构。生物脂质源自两种不同类型的生化亚基异戊二烯和酮酰基。脂质可以分为以下类别：脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、糖脂和聚酮化合物(衍生自酮酰基亚基的缩合)；以及固醇脂质和异戊烯醇脂质(衍生自异戊二烯亚基的缩合)。脂肪是称为甘油三酯的脂质亚组。脂质还涵盖诸如脂肪酸及其衍生物(包括甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂)以及其他含固醇的代谢物(诸如胆固醇)的分子。
[0074]
如本文所用的“细胞”是指执行足以保持或复制其基因组dna的代谢功能或其他功能的细胞。细胞可以通过本领域熟知的方法来鉴定，包含例如完整膜的存在、通过特定染料染色、产生子代的能力或在配子的情况下与第二配子组合以产生活的后代的能力。细胞可以包括原核细胞和真核细胞。原核细胞包含但不限于细菌。真核细胞包含但不限于酵母细胞和源自植物和动物的细胞，例如哺乳动物细胞、昆虫(例如，夜蛾)细胞和人细胞。
[0075]
如本文所用，术语“治疗性细胞”是指可施用于需要其的患者或受试者以实现医学效果的细胞。施用可以包括注射、移植或植入到所述患者或受试者体内。例如，可以将t细胞移植到患者体内以调节免疫反应来治疗癌症。
[0076]
本文所使用的术语“分化”是指细胞生命周期发育的阶段。
[0077]
短语“细胞培养基”、“组织培养基”、“培养基”(在每一种情况下复数“培养基”)和“培养基配制物”是指用于培育细胞或组织的营养性溶液。这些短语可以互换使用。
[0078]“细胞培养”或“培养”意指在人工体外环境中维持或扩增细胞。
[0079]
术语“细胞培养补充物”、“培养补充物”或“培养基补充物”是指添加到细胞培养基中以增强细胞扩增的组分。这些短语可以互换使用。细胞培养补充物可以包括氨基酸、盐、肽、糖、脂质、维生素、矿物质、金属等中的一种或多种。在实施方案中，细胞培养补充物包括化学上确定的组分。
[0080]
如本文所用，术语“化学上确定”是指已知分子结构和浓度的组分。
[0081]
本文所使用的术语“化学限定的培养基”是指适用于细胞，特别是真核细胞的体外培养的培养基，其中所有化学组分及其浓度都是已知的。
[0082]
本文所使用的术语“无血清”是指不含或基本上不含血清的培养基。本文所使用的“基本上不含血清”是指含有少于约1重量％的血清，仅含有痕量的血清或含有不可检测量的血清的培养基。在实施方案中，基本上不含血清是指培养基含有小于1重量％的血清、小于0.95重量％的血清、小于0.9重量％的血清、小于0.85重量％的血清、小于0.8重量％的血清、小于0.75重量％的血清、小于0.7重量％的血清、小于0.65重量％的血清、小于0.6重量％的血清、小于0.55重量％的血清、小于0.5重量％的血清、小于0.45重量％的血清、小于0.4重量％的血清、小于0.35重量％的血清、小于0.3重量％的血清、小于0.25重量％的血清、小于0.2重量％的血清、小于0.15重量％的血清、小于0.1重量％的血清、小于0.09重量％的血清、小于0.08重量％的血清、小于0.07重量％的血清、小于0.06重量％的血清、小于0.05重量％的血清、小于0.04重量％的血清、小于0.03重量％的血清、小于0.02重量％的血清或小于0.01重量％的血清。
[0083]
短语“无白蛋白”培养基是指不含白蛋白或基本上不含白蛋白的培养基。因此，基本上不含白蛋白是指白蛋白以小于约1％(w/v)、更优选小于约0.1％(w/v)、并且甚至更优选小于约0.01％(w/v)的浓度存在于培养基中。因此，在实施方案中，无白蛋白培养基是指含有小于1％(w/v)白蛋白、小于0.95％(w/v)白蛋白、小于0.9％(w/v)白蛋白、小于0.85％(w/v)白蛋白、小于0.8％(w/v)白蛋白、小于0.75％(w/v)白蛋白、小于0.7％(w/v)白蛋白、小于0.65％(w/v)白蛋白、小于0.6％(w/v)白蛋白、小于0.55％(w/v)白蛋白、小于0.5％(w/v)白蛋白、小于0.45％(w/v)白蛋白、小于0.4％(w/v)白蛋白、小于0.35％(w/v)白蛋白、小于0.3％(w/v)白蛋白、小于0.25％(w/v)白蛋白、小于0.2％(w/v)白蛋白、小于0.15％(w/v)白蛋白、小于0.1％(w/v)白蛋白、小于0.09％(w/v)白蛋白、小于0.08％(w/v)白蛋白、小于0.07％(w/v)白蛋白、小于0.06％(w/v)白蛋白、小于0.05％(w/v)白蛋白、小于0.04％(w/v)白蛋白、小于0.03％(w/v)白蛋白、小于0.02％(w/v)白蛋白或小于0.01％(w/v)白蛋白的培养基。
[0084]
如本文所用，短语“合成制备”或“合成的”是指通过体外化学(例如，蛋白质)合成制备的分子。肽的合成是本领域熟知的。例如但不限于，可以使用液相肽合成或固相肽合成来合成肽。通常，将纯化合成制备的分子，例如以除去污染物和不正确形成的分子(例如，不完整或不正确的肽序列)。纯化蛋白质的方法是本领域熟知的，并且包括但不限于尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法(iec)、分配色谱法、高效液相色谱法(hplc)和反相色谱法(rpc)。在实施方案中，合成制备的肽是至少70％纯的(含有至少70％的所需肽)。在实施方案中，合成制备的肽是至少80％纯的。在实施方案中，合成制备的肽是至少90％纯的。在实施方案
中，合成制备的肽是至少95％纯的。在实施方案中，合成制备的肽是至少96％纯的。在实施方案中，合成制备的肽是至少97％纯的。在实施方案中，合成制备的肽是至少98％纯的。在实施方案中，合成制备的肽是至少99％纯的。百分比可基于重量(w/w)或体积(w/v)。
[0085]“接触”根据其普通一般含义使用，并且是指使至少两个不同的物种(例如，包含生物分子或细胞的化学化合物)变得足够接近以进行反应、相互作用或物理触摸的过程。然而，应当理解，所得反应产物可以由所添加的试剂之间的反应或由来自所添加的试剂中的一种或多种的可以在反应混合物中产生的中间体来直接产生。
[0086]
术语“接触”可以包含允许两种物种反应、相互作用或物理触摸，其中所述两种物种可以是如本文所述的化合物和蛋白质或酶。在一些实施方案中，接触包含允许本文所述的化合物与信号传导路径中涉及的蛋白质或酶相互作用。
[0087]“对照”样品或值是指用作参照物(通常是已知参照物，用于与测试样品进行比较)的样品。例如，测试样品可以取自测试条件，例如在存在测试化合物的情况下，并且与来自已知条件的样品比较，例如在不存在测试化合物(阴性对照)的情况下或在存在已知化合物(阳性对照)的情况下。对照也可以表示从大量测试或结果中收集的平均值。本领域技术人员将认识到，可以设计用于评估任何数目个参数的对照。例如，可以设计对照以比较基于药理学数据(例如半衰期)或治疗措施(例如副作用比较)的治疗益处。本领域技术人员将理解哪些对照在给定情况下是有价值的并且能够基于与对照值的比较来分析数据。对照对于确定数据的显著性也是有价值的。例如，如果给定参数的值在对照中变化很大，则测试样品的变化不会被认为是显著的。
[0088]
组合物
[0089]
在一个方面，提供了一种细胞培养基，其包含具有超氧化物歧化酶活性和cu+、zn+螯合活性的肽。
[0090]
在实施方案中，肽具有约25μg/ml至约150μg/ml之间的浓度(以最终浓度存在)。在实施方案中，肽具有约25μg/ml至约150μg/ml之间的浓度。在实施方案中，肽具有约50μg/ml至约150μg/ml之间的浓度。在实施方案中，肽具有约75μg/ml至约150μg/ml之间的浓度。在实施方案中，肽具有约100μg/ml至约150μg/ml之间的浓度。在实施方案中，肽具有约125μg/ml至约150μg/ml之间的浓度。
[0091]
在实施方案中，肽具有约25μg/ml至约125μg/ml之间的浓度。在实施方案中，肽具有约25μg/ml至约100μg/ml之间的浓度。在实施方案中，肽具有约25μg/ml至约75μg/ml之间的浓度。在实施方案中，肽具有约25μg/ml至约50μg/ml之间的浓度。在实施方案中，肽具有约25μg/ml、约50μg/ml、约75μg/ml、约100μg/ml、约125μg/ml或约150μg/ml的浓度。
[0092]
在实施方案中，肽具有约30μg/ml至约125μg/ml的浓度。在实施方案中，肽具有约50μg/ml至约100μg/ml的浓度。
[0093]
在一个方面，提供了一种细胞培养补充物，其包含具有超氧化物歧化酶活性和cu+、zn+螯合活性的肽。在实施方案中，细胞培养补充物作为5x溶液提供，当添加到培养基中时，提供约25μg/ml至约150μg/ml之间的最终肽浓度。在实施方案中，细胞培养补充物作为10x溶液提供，当添加到培养基中时，提供约25μg/ml至约150μg/ml之间的最终肽浓度。在实施方案中，细胞培养补充物作为50x溶液提供，当添加到培养基中时，提供约25μg/ml至约150μg/ml之间的最终肽浓度。在实施方案中，细胞培养补充物作为100x溶液提供，当添加到
培养基中时，提供约25μg/ml至约150μg/ml之间的最终肽浓度。
[0094]
在实施方案中，当添加到培养基中时，细胞培养补充物提供约25μg/ml至约150μg/ml之间的最终肽浓度。在实施方案中，当添加到培养基中时，细胞培养补充物提供约30μg/ml至125μg/ml之间的最终肽浓度。在实施方案中，当添加到培养基中时，细胞培养补充物提供约50μg/ml至约100μg/ml之间的最终肽浓度。
[0095]
在实施方案中，肽是合成制备的。在实施方案中，合成肽包含至少4个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含8个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含12个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含16个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含20个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含24个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含28个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含32个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含36个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含40个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含44个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含48个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含52个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含56个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含60个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含64个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含68个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含72个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含76个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含80个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含84个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含88个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含92个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含96个氨基酸残基至100个氨基酸残基。
[0096]
在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至96个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至92个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至88个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至84个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至80个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至76个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至72个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至68个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至64个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至60个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至56个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至52个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至48个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至44个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至40个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至36个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至32个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至28个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至24个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至20个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至16个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个
氨基酸残基至12个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4个氨基酸残基至8个氨基酸残基。在实施方案中，合成肽包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96或100个氨基酸残基。合成肽长度可以是所叙述范围内的任何值或子范围，包括端点。
[0097]
在实施方案中，肽包含至少一个带负电荷的残基。在实施方案中，肽包含至少一个带正电荷的残基。在实施方案中，肽包含一个带正电荷的残基。在实施方案中，肽包含两个带正电荷的残基。
[0098]
在实施方案中，肽选自dahk(seq id no:1)、dthk(seq id no:2)或eahk(seq id no:7)。在实施方案中，肽是dahk(seq id no:1)。在实施方案中，肽是dthk(seq id no:2)。在实施方案中，肽是eahk(seq id no:7)。在实施方案中，肽是白蛋白衍生的肽。在实施方案中，肽是以下中的一种或多种：dahk(seq id no:1)、dthk(seq id no:2)、vfrreahkseiahr(seq id no:6)、eahk(seq id no:7)、dahr(seq id no:8)、dark(seq id no:9)、rdahk(seq id no:10)、rdahks(seq id no:11)、rrdahk(seq id no:12)、rrdahks(seq id no:13)、rdahkse(seq id no:14)、rrdahkse(seq id no:15)、frrdahksev(seq id no:16)或frrdahkseva(seq id no:17)。在实施方案中，可以排除所列的肽中的任何一种或多种。
[0099]
在实施方案中，肽包含四个氨基酸残基的序列，其依次包含一个带负电荷的(-)氨基酸、一个中性(x)氨基酸和两个带正电荷的(+)氨基酸。包含一个带负电荷的(-)氨基酸、一个中性(x)氨基酸和两个带正电荷的(+)氨基酸的四个氨基酸残基的序列可称为-x++肽。在实施方案中，肽在c-末端侧和/或n-末端侧不具有侧接-x++肽(例如，在肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸内)的额外氨基酸分支，这中断了-x++序列暴露于螯合靶标。
[0100]
肽可以螯合对细胞有毒的化合物(例如过渡金属)。在实施方案中，肽的包含-x++序列的部分螯合化合物(例如过渡金属)。因此，在实施方案中，肽不包含破坏功能性肽序列与靶标(例如过渡金属)接触的额外c-末端或n-末端残基。在实施方案中，功能序列是seq id no:1的氨基酸序列。
[0101]
在实施方案中，肽的长度为约至少4个氨基酸(例如，至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60个氨基酸)。在实施方案中，肽的长度为约至少4个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约至少5个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约至少6个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约至少7个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约至少8个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约至少9个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约至少10个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约至少11个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约至少12个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约至少13个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约至少14个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约至少15个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约至少16个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约至少17个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约至少18个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约至少19个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约至少20个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60个氨基酸。
[0102]
在实施方案中，肽的长度为4个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为5个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为6个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为7个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为8个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为9个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为10个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为11个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为12个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为13个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为14个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为15个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为16个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为17个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为18个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为19个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为20个氨基酸。
[0103]
在实施方案中，肽的长度为约4至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约8至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约12至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约16至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约20至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约24至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约28至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约32至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约36至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约40至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约44至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约48至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约52至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约56至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约60至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约64至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约68至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约72至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约76至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约80至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约84至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约88至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约92至约100个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约96至约100个氨基酸。
[0104]
在实施方案中，肽的长度为约4至约96个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4至约92个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4至约88个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4至约84个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4至约80个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4至约76个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4至约72个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4至约68个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4至约64个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4至约60个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4至约56个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4至约52个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4至约48个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4至约44个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4至约40个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4至约36个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4至约32个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4至约28个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4至约24个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4至约20个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4至约16个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4至约12个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4至约8个氨基酸。在实施方案中，肽的长度为约4个氨基酸、约8个氨基酸、约12个氨基酸、约16个氨基酸、约20个氨基酸、约24个氨基酸、约28个氨基酸、约32个氨基酸、约36个氨基酸、约40个氨基酸、约44个氨基酸、约48个氨基酸、约52个氨基酸、约56个氨基酸、约60个氨基酸、约64个氨基酸、约68个氨基酸、约72个氨基酸、约76个氨基酸、约80个氨基酸、约84个氨基酸、约88个氨基酸、约92个氨基酸、约96个氨基酸或约100个氨基
酸。肽长度可以是所叙述范围内的任何值或子范围，包括端点。
[0105]
在实施方案中，肽包含seq id no:1的氨基酸序列。在实施方案中，肽是seq id no:1的氨基酸序列。在实施方案中，肽包含seq id no:2的氨基酸序列。在实施方案中，肽是seq id no:2的氨基酸序列。在实施方案中，肽包含seq id no:6的氨基酸序列。在实施方案中，肽是seq id no:6的氨基酸序列。在实施方案中，肽包含seq id no:7的氨基酸序列。在实施方案中，肽是seq id no:7的氨基酸序列。在实施方案中，肽包含seq id no:8的氨基酸序列。在实施方案中，肽是seq id no:8的氨基酸序列。在实施方案中，肽包含seq id no:9的氨基酸序列。在实施方案中，肽是seq id no:9的氨基酸序列。在实施方案中，肽包含seq id no:10的氨基酸序列。在实施方案中，肽是seq id no:10的氨基酸序列。在实施方案中，肽包含seq id no:11的氨基酸序列。在实施方案中，肽是seq id no:11的氨基酸序列。在实施方案中，肽包含seq id no:12的氨基酸序列。在实施方案中，肽是seq id no:12的氨基酸序列。在实施方案中，肽包含seq id no:13的氨基酸序列。在实施方案中，肽是seq id no:13的氨基酸序列。在实施方案中，肽包含seq id no:14的氨基酸序列。在实施方案中，肽是seq id no:14的氨基酸序列。在实施方案中，肽包含seq id no:15的氨基酸序列。在实施方案中，肽是seq id no:15的氨基酸序列。在实施方案中，肽包含seq id no:16的氨基酸序列。在实施方案中，肽是seq id no:16的氨基酸序列。在实施方案中，肽包含seq id no:17的氨基酸序列。在实施方案中，肽是seq id no:17的氨基酸序列。在实施方案中，可以排除所列的肽中的任何一种或多种的序列。
[0106]
在实施方案中，细胞培养基是无血清的。在实施方案中，细胞培养基是无白蛋白的。在实施方案中，细胞培养基是无血清且无白蛋白的。在实施方案中，细胞培养基是基本上无血清的。在实施方案中，细胞培养基是基本上无白蛋白的。在实施方案中，细胞培养基是基本上无血清且基本上无白蛋白的。
[0107]
在实施方案中，本文(包括其实施方案)提供的细胞培养补充物以1x至100x浓度提供。在实施方案中，本文(包括其实施方案)提供的细胞培养补充物以1x、2x、3x、5x、10x、20x、25x、50x、75x或100x浓度提供。在实施方案中，本文(包括其实施方案)提供的细胞培养补充物以1x浓度提供。在实施方案中，本文(包括其实施方案)提供的细胞培养补充物以2x浓度提供。在实施方案中，本文(包括其实施方案)提供的细胞培养补充物以3x浓度提供。在实施方案中，本文(包括其实施方案)提供的细胞培养补充物以5x浓度提供。在实施方案中，本文(包括其实施方案)提供的细胞培养补充物以10x浓度提供。在实施方案中，本文(包括其实施方案)提供的细胞培养补充物以20x浓度提供。在实施方案中，本文(包括其实施方案)提供的细胞培养补充物以25x浓度提供。在实施方案中，本文(包括其实施方案)提供的细胞培养补充物以50x浓度提供。在实施方案中，本文(包括其实施方案)提供的细胞培养补充物以75x浓度提供。在实施方案中，本文(包括其实施方案)提供的细胞培养补充物以100x浓度提供。
[0108]
在实施方案中，本文提供的细胞培养基或细胞培养补充物还包含超氧化物清除剂。在实施方案中，超氧化物清除剂包含含有(2,2,6,6-四甲基-1-基)氧基或其变体的化合物或类黄酮。在实施方案中，超氧化物清除剂包含(2,2,6,6-四甲基-1-基)氧基。在实施方案中，超氧化物清除剂包含(2,2,6,6-四甲基-1-基)氧基的一种或多种变体。在实施方案中，超氧化物清除剂包含类黄酮。在实施方案中，可以明确排除所叙述的超氧化物清除剂中
的一种或多种。
[0109]
在实施方案中，超氧化物清除剂包括对细胞(例如，正在培养的细胞)而言不是天然的(内源性的)化合物。在实施方案中，超氧化物清除剂可以包括tempo(2,2,6,6-四甲基哌啶-n-氧基)、羟基-tempo(4-羟基-2,2,6,6-四甲基-哌啶-n-氧基)、tempol(1-氧基-2,2,6,6-四甲基-4-羟基哌啶)或它们的变体。在实施方案中，超氧化物清除剂包括tempo。在实施方案中，超氧化物清除剂包括tempo的变体。在实施方案中，超氧化物清除剂包括tempol。在实施方案中，超氧化物清除剂包括tempol的变体。在实施方案中，超氧化物清除剂包括mito-tempo((2-(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基-4-基氨基)-2-氧代乙基)三苯基氯化鏻)。另外的超氧化物清除剂可以在例如美国专利号6,759,430中找到，该专利以引用方式并入本文以获得公开的所有内容，包括化合物、组合物、方法、分子、合成等。在实施方案中，可以明确排除所叙述的超氧化物清除剂中的一种或多种。
[0110]
超氧化物清除剂的浓度可以指本文(包括其实施方案)提供的细胞培养基中的超氧化物清除剂的浓度。超氧化物清除剂的浓度可以指完全细胞培养基(即添加有本文提供的细胞培养补充物的基础培养基)中的最终浓度。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约1μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约2μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约3μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约4μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约5μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约6μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约7μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约8μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约9μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约10μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约11μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约12μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约13μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约14μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约15μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约16μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约17μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约18μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约19μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约20μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约21μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约22μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约23μm至约25μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约24μm至约25μm。浓度可以是本文所叙述的任何范围内的任何值或子范围，包括端点。
[0111]
在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约1μm至约24μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约1μm至约23μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约1μm至约22μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约1μm至约21μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约1μm至约20μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约1μm至约19μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约1μm至约18μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约1μm至约17μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约16μm至约24μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约15μm至约24μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约14μm至约24μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约13μm至约24μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约12μm至约24μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约
11μm至约24μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约10μm至约24μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约9μm至约24μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约8μm至约24μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约7μm至约24μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约6μm至约24μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约5μm至约24μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约4μm至约24μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约3μm至约24μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约2μm至约24μm。在实施方案中，超氧化物清除剂的浓度为约1μm、约2μm、约3μm、约4μm、约5μm、约6μm、约7μm、约8μm、约9μm、约10μm、约11μm、约12μm、约13μm、约14μm、约15μm、约16μm、约17μm、约18μm、约19μm、约20μm、约21μm、约22μm、约23μm、约24μm或约25μm。本文(包括其实施方案)提供的超氧化物清除剂的浓度可以是所叙述的范围内的任何值或子范围，包括端点。
[0112]
在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约5μm至约25μm。超氧化物清除剂的最终浓度可以指完全细胞培养基(即添加有本文提供的细胞培养补充物的基础培养基)中的超氧化物清除剂浓度。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约6μm至约25μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约7μm至约25μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约8μm至约25μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约9μm至约25μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约10μm至约25μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约11μm至约25μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约12μm至约25μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约13μm至约25μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约14μm至约25μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约15μm至约25μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约16μm至约25μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约17μm至约25μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约18μm至约25μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约19μm至约25μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约20μm至约25μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约21μm至约25μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约22μm至约25μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约23μm至约25μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约24μm至约25μm。
[0113]
在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约5μm至约24μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约5μm至约23μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约5μm至约22μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约5μm至约21μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约5μm至约20μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约5μm至约19μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约5μm至约18μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约5μm至约17μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约5μm至约16μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约5μm至
约15μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约5μm至约14μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约5μm至约13μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约5μm至约12μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约5μm至约11μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约5μm至约10μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约5μm至约9μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约5μm至约8μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约5μm至约7μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约5μm至约6μm。在实施方案中，本文提供的超氧化物清除剂培养基的最终浓度为约5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm或25μm。超氧化物清除剂培养基的最终浓度可以以涵盖本文所叙述的任何范围内的任何值或子范围(包括端点)的浓度提供。
[0114]
在实施方案中，本文提供的细胞培养基或细胞培养补充物包含维生素e或其类似物。在实施方案中，维生素e类似物包括6-色原烷醇(chromanol)基团部分。
[0115]
在实施方案中，维生素e或其类似物或变体包括α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、δ-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、α-生育酚琥珀酸酯、α-生育酚单葡糖苷、γ-生育酚n,n-二甲基甘氨酸酯或它们的取代物、纯异构体(isoform pure)、外消旋混合物和/或混合物。
[0116]
在实施方案中，维生素e或其类似物或变体包括α-生育酚。在实施方案中，维生素e或其类似物或变体包括β-生育酚。在实施方案中，维生素e或其类似物或变体包括γ-生育酚。在实施方案中，维生素e或其类似物或变体包括δ-生育酚。在实施方案中，维生素e或其类似物或变体包括α-生育三烯酚。在实施方案中，维生素e或其类似物或变体包括β-生育三烯酚。在实施方案中，维生素e或其类似物或变体包括δ-生育三烯酚。在实施方案中，维生素e或其类似物或变体包括γ-生育三烯酚。在实施方案中，维生素e或其类似物或变体包括α-生育酚琥珀酸酯。在实施方案中，维生素e或其类似物或变体包括α-生育酚单葡糖苷。在实施方案中，维生素e或其类似物或变体包括γ-生育酚n,n-二甲基甘氨酸酯。在实施方案中，维生素e或其类似物或变体包括维生素e的内源性代谢物。在实施方案中，维生素e或其类似物或变体包括α-生育酚氢醌。在实施方案中，维生素e或其类似物或变体包括维生素e的内源性代谢物、α-生育酚氢醌等。
[0117]
在实施方案中，维生素e或其类似物或变体包括本文提供的维生素e或类似物或变体的纯异构体。在实施方案中，维生素e或其类似物或变体包括本文提供的取代的维生素e或类似物或变体。在实施方案中，维生素e或其类似物或变体包括本文提供的维生素e或类似物或变体的外消旋混合物。在实施方案中，维生素e或其类似物或变体包括本文提供的两种或更多种维生素e化合物或类似物或变体的混合物。在实施方案中，可以明确排除所叙述的维生素e化合物中的一种或多种。
[0118]
维生素e或其类似物的浓度可以指本文(包括其实施方案)提供的细胞培养基中的浓度。维生素e或其类似物的浓度可以指所述维生素e或类似物在完全培养基(即添加有本文提供的细胞培养补充物的基础培养基)中的最终浓度。因此，在实施方案中，维生素e或其类似物的浓度为约0.1μg/ml至约4.5μg/ml。在实施方案中，维生素e或其类似物的浓度为约
0.5μg/ml至约4.5μg/ml。在实施方案中，维生素e或其类似物的浓度为约1μg/ml至约4.5μg/ml。在实施方案中，维生素e或其类似物的浓度为约1.5μg/ml至约4.5μg/ml。在实施方案中，维生素e或其类似物的浓度为约2μg/ml至约4.5μg/ml。在实施方案中，维生素e或其类似物的浓度为约2.5μg/ml至约4.5μg/ml。在实施方案中，维生素e或其类似物的浓度为约3μg/ml至约4.5μg/ml。在实施方案中，维生素e或其类似物的浓度为约3.5μg/ml至约4.5μg/ml。在实施方案中，维生素e或其类似物的浓度为约4μg/ml至约4.5μg/ml。
[0119]
在实施方案中，维生素e或其类似物的浓度为约0.1μg/ml至约4μg/ml。在实施方案中，维生素e或其类似物的浓度为约0.1μg/ml至约3.5μg/ml。在实施方案中，维生素e或其类似物的浓度为约0.1μg/ml至约3μg/ml。在实施方案中，维生素e或其类似物的浓度为约0.1μg/ml至约2.5μg/ml。在实施方案中，维生素e或其类似物的浓度为约0.1μg/ml至约2μg/ml。在实施方案中，维生素e或其类似物的浓度为约0.1μg/ml至约1.5μg/ml。在实施方案中，维生素e或其类似物的浓度为约0.1μg/ml至约1μg/ml。在实施方案中，维生素e或其类似物的浓度为约0.1μg/ml至约0.5μg/ml。在实施方案中，维生素e或其类似物的浓度为约0.1μg/ml、约0.5μg/ml、约1μg/ml、约1.5μg/ml、约2μg/ml、约2.5μg/ml、约3μg/ml、约3.5μg/ml、约4μg/ml或约4.5μg/ml。维生素e或其类似物的浓度可以是本文所叙述的任何范围内的任何值或子范围，包括端点。
[0120]
在实施方案中，维生素e的浓度为0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml、0.8μg/ml、0.9μg/ml、1.0μg/ml、1.1μg/ml、1.2μg/ml、1.3μg/ml、1.4μg/ml、1.5μg/ml、1.6μg/ml、1.7μg/ml、1.8μg/ml、1.9μg/ml、2.0μg/ml、2.1μg/ml、2.2μg/ml、2.3μg/ml、2.4μg/ml、2.5μg/ml、2.6μg/ml、2.7μg/ml、2.8μg/ml、2.9μg/ml、3μg/ml、3.1μg/ml、3.2μg/ml、3.3μg/ml、3.4μg/ml、3.5μg/ml、3.6μg/ml、3.7μg/ml、3.8μg/ml、3.9μg/ml、4μg/ml、4.1μg/ml、4.2μg/ml、4.3μg/ml、4.4μg/ml、4.5μg/ml、4.6μg/ml、4.7μg/ml、4.8μg/ml、4.9μg/ml或5.0μg/ml。维生素e或其类似物的浓度可以是所叙述的范围内的任何值或子范围，包括端点。
[0121]
在实施方案中，维生素e类似物的浓度为约2μm至约100μm。例如，在一些实施方案中，细胞培养基或细胞培养补充物提供的维生素e类似物的最终浓度为约2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm、30μm、31μm、32μm、33μm、34μm、35μm、36μm、37μm、38μm、39μm、40μm、41μm、42μm、43μm、44μm、45μm、46μm、47μm、48μm、49μm、50μm、51μm、52μm、53μm、54μm、55μm、56μm、57μm、58μm、59μm、60μm、61μm、62μm、63μm、64μm、65μm、66μm、67μm、68μm、69μm、70μm、71μm、72μm、73μm、74μm、75μm、76μm、77μm、78μm、79μm、80μm或更大或介于两者之间的任何量。维生素e类似物的浓度可以是所叙述的范围内的任何值或子范围，包括端点。
[0122]
在实施方案中，维生素e类似物是水溶性的。在实施方案中，维生素e类似物包括6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸(trolox)。
[0123]
trolox的浓度可以指如本文(包括其实施方案)提供的细胞培养基中的浓度。trolox的浓度可以指完全培养基(即添加有本文提供的细胞培养补充物的基础培养基)中的浓度。在实施方案中，trolox的浓度为至少约2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm、30μm、31μm、32μm、33μm、34μm、35μm、36μm、37μm、38μm、39μm、40μm、41μ
m、42μm、43μm、44μm、45μm、46μm、47μm、48μm、49μm、50μm、51μm、52μm、53μm、54μm、55μm、56μm、57μm、58μm、59μm、60μm、61μm、62μm、63μm、64μm、65μm、66μm、67μm、68μm、69μm、70μm、71μm、72μm、73μm、74μm、75μm、76μm、77μm、78μm、79μm、80μm或更大。trolox的浓度可以是所叙述的范围内的任何值或子范围，包括端点。
[0124]
在实施方案中，本文提供的细胞培养基或细胞培养补充物还包含过氧化氢还原试剂。在实施方案中，过氧化氢还原剂是细胞可渗透的。在实施方案中，过氧化氢还原剂不是细胞可渗透的。在实施方案中，过氧化氢还原剂是细胞可渗透试剂和细胞不可渗透试剂的混合物。在实施方案中，过氧化氢还原剂包括谷胱甘肽、n-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、亚硒酸钠、甘露醇、类黄酮、硫辛酸或它们的任何组合。在实施方案中，过氧化氢还原剂包括谷胱甘肽。在实施方案中，过氧化氢还原剂包括n-乙酰半胱氨酸。在实施方案中，过氧化氢还原剂包括半胱氨酸。在实施方案中，过氧化氢还原剂包括亚硒酸钠。在实施方案中，过氧化氢还原剂包括甘露醇。在实施方案中，过氧化氢还原剂包括类黄酮。在实施方案中，过氧化氢还原剂包括硫辛酸。在实施方案中，过氧化氢还原剂包括本文提供的两种或更多种过氧化氢还原剂的组合。在实施方案中，可以明确排除所叙述的过氧化氢还原试剂中的一种或多种。
[0125]
过氧化氢还原剂的浓度可以指本文(包括其实施方案)提供的细胞培养基中的浓度。过氧化氢还原剂的浓度可以指完全培养基(即添加有细胞培养补充物的基础培养基)中的浓度。
[0126]
因此，在实施方案中，谷胱甘肽的浓度为约1μg/ml至约200μg/ml。在实施方案中，谷胱甘肽的浓度为约20μg/ml至约200μg/ml。在实施方案中，谷胱甘肽的浓度为约40μg/ml至约200μg/ml。在实施方案中，谷胱甘肽的浓度为约60μg/ml至约200μg/ml。在实施方案中，谷胱甘肽的浓度为约80μg/ml至约200μg/ml。在实施方案中，谷胱甘肽的浓度为约100μg/ml至约200μg/ml。在实施方案中，谷胱甘肽的浓度为约120μg/ml至约200μg/ml。在实施方案中，谷胱甘肽的浓度为约140μg/ml至约180μg/ml。在实施方案中，谷胱甘肽的浓度为约160μg/ml至约200μg/ml。在实施方案中，谷胱甘肽的浓度为约180μg/ml至约200μg/ml。
[0127]
在实施方案中，谷胱甘肽的浓度为约1μg/ml至约200μg/ml。在实施方案中，谷胱甘肽的浓度为约1μg/ml至约180μg/ml。在实施方案中，谷胱甘肽的浓度为约1μg/ml至约160μg/ml。在实施方案中，谷胱甘肽的浓度为约1μg/ml至约140μg/ml。在实施方案中，谷胱甘肽的浓度为约1μg/ml至约120μg/ml。在实施方案中，谷胱甘肽的浓度为约1μg/ml至约100μg/ml。在实施方案中，谷胱甘肽的浓度为约1μg/ml至约80μg/ml。在实施方案中，谷胱甘肽的浓度为约1μg/ml至约60μg/ml。在实施方案中，谷胱甘肽的浓度为约1μg/ml至约40μg/ml。在实施方案中，谷胱甘肽的浓度为约1μg/ml至约20μg/ml。在实施方案中，谷胱甘肽的浓度为约1μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml、140μg/ml、160μg/ml、180μg/ml或200μg/ml。谷胱甘肽的浓度可以是所叙述的范围内的任何值或子范围，包括端点。
[0128]
在实施方案中，细胞培养基或细胞培养补充物提供的谷胱甘肽在完全培养基(即，添加有补充物的基础培养基)中的最终浓度为约1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml、13μg/ml、14μg/ml、15μg/ml、16μg/ml、17μg/ml、18μg/ml、19μg/ml、20μg/ml、21μg/ml、22μg/ml、23μg/ml、24μg/ml、25μg/ml、26μg/ml、27μg/ml、28μg/ml、29μg/ml、30μg/ml、31μg/ml、32μg/ml、33μg/ml、34μg/ml、35μg/ml、36μg/ml、37μg/ml、38μg/ml、39μg/ml、40μg/ml、41μg/ml、42μg/ml、43μg/ml、44μg/
ml、45μg/ml、46μg/ml、47μg/ml、48μg/ml、49μg/ml、50μg/ml、51μg/ml、52μg/ml、53μg/ml、54μg/ml、55μg/ml、56μg/ml、57μg/ml、58μg/ml、59μg/ml、60μg/ml、61μg/ml、62μg/ml、63μg/ml、64μg/ml、65μg/ml、66μg/ml、67μg/ml、68μg/ml、69μg/ml、70μg/ml、71μg/ml、72μg/ml、73μg/ml、74μg/ml、75μg/ml、76μg/ml、77μg/ml、78μg/ml、79μg/ml、80μg/ml、81μg/ml、82μg/ml、83μg/ml、84μg/ml、85μg/ml、86μg/ml、87μg/ml、88μg/ml、89μg/ml、90μg/ml、91μg/ml、92μg/ml、93μg/ml、94μg/ml、95μg/ml、96μg/ml、97μg/ml、98μg/ml、99μg/ml、100μg/ml、105μg/ml、110μg/ml、115μg/ml、120μg/ml、125μg/ml、130μg/ml、135μg/ml、140μg/ml、145μg/ml或150μg/ml。谷胱甘肽的最终浓度可以是所叙述的范围内的任何值或子范围，包括端点。
[0129]
在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.1μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.5μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约1μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约1.5μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约2μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约2.5μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约3μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约3.5μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约4μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约4.5μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约5μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约5.5μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约6μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约6.5μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约7μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约7.5μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约8μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约8.5μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约9μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约9.5μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约10μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约10.5μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约11μg/ml至约12μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约11.5μg/ml至约12μg/ml。
[0130]
在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml至约11.5μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml至约11μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml至约10.5μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml至约10μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml至约9.5μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml至约9μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml至约8.5μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.1μg/ml至约8μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml至约7.5μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml至约7μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml至约6.5μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml至约6μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml至约5.5μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml至约4μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml至约3.5μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml至约3μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml至约2.5μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml至约2μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml至约1.5μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml至约1μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml至约0.5μg/ml。在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml、约0.1μg/ml、约0.5μg/ml、约1μg/ml、约1.5μg/ml、约
2μg/ml、约2.5μg/ml、约3μg/ml、约3.5μg/ml、约4μg/ml、约4.5μg/ml、约5μg/ml、约5.5μg/ml、约6μg/ml、约6.5μg/ml、约7μg/ml、约7.5μg/ml、约8μg/ml、约8.5μg/ml、约9μg/ml、约9.5μg/ml、约10μg/ml、约10.5μg/ml、约11μg/ml、约11.5μg/ml或约12μg/ml。
[0131]
在实施方案中，硫辛酸的浓度为约0.05μg/ml、0.075μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml、0.8μg/ml、0.9μg/ml、1.0μg/ml、1.25μg/ml、1.50μg/ml、1.75μg/ml、2.0μg/ml、2.25μg/ml、2.5μg/ml、2.75μg/ml、3.0μg/ml、3.25μg/ml、3.5μg/ml、3.75μg/ml、4.0μg/ml、4.25μg/ml、4.5μg/ml、4.75μg/ml、5.0μg/ml、5.25μg/ml、5.5μg/ml、5.75μg/ml、6.0μg/ml、6.25μg/ml、6.5μg/ml、6.75μg/ml、7.0μg/ml、7.25μg/ml、7.5μg/ml、7.75μg/ml、8.0μg/ml、8.25μg/ml、8.5μg/ml、8.75μg/ml、9.0μg/ml、9.25μg/ml、9.5μg/ml、9.75μg/ml、10.0μg/ml、11.0μg/ml、12.0μg/ml或更大。硫辛酸的浓度可以是所叙述的范围内的任何值或子范围，包括端点。
[0132]
在实施方案中，本文提供的细胞培养基或细胞培养补充物还包含稳定剂分子。稳定剂分子稳定蛋白质抵抗环境应激，例如氧化应激。不受理论的束缚，据信稳定剂分子可以减轻脂质过氧化和脂肪酸形成。在实施方案中，稳定剂分子是糖或多元醇。在实施方案中，稳定剂分子是海藻糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、乳糖、山梨糖醇或甘油。在实施方案中，稳定剂分子是甘露醇。
[0133]
稳定剂的浓度可以指本文(包括其实施方案)提供的细胞培养基中的浓度。稳定剂的浓度可以指完全培养基(即添加有本文提供的细胞培养补充物的基础培养基)中的浓度。
[0134]
在实施方案中，甘露醇的浓度为约1mm至约150mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约10mm至约150mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约20mm至约150mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约30mm至约150mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约40mm至约150mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约50mm至约150mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约60mm至约150mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约70mm至约150mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约80mm至约150mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约90mm至约150mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约100mm至约150mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约110mm至约150mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约120mm至约150mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约130mm至约150mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约140mm至约150mm。
[0135]
在实施方案中，甘露醇的浓度为约1mm至约140mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约1mm至约130mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约1mm至约120mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约1mm至约110mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约1mm至约100mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约1mm至约90mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约1mm至约80mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约1mm至约70mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约1mm至约60mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约1mm至约50mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约1mm至约40mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约1mm至约30mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约1mm至约20mm。在实施方案中，甘露醇的浓度为约1mm至约10mm。
[0136]
在实施方案中，甘露醇的浓度为约1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、21mm、22mm、23mm、24mm、25mm、26mm、27mm、28mm、29mm、30mm、31mm、32mm、33mm、34mm、35mm、36mm、37mm、38mm、39mm、40mm、41mm、42mm、43mm、44mm、45mm、46mm、47mm、48mm、49mm、50mm、51mm、52mm、53mm、54mm、
55mm、56mm、57mm、58mm、59mm、60mm、61mm、62mm、63mm、64mm、65mm、66mm、67mm、68mm、69mm、70mm、71mm、72mm、73mm、74mm、75mm、76mm、77mm、78mm、79mm、80mm、81mm、82mm、83mm、84mm、85mm、86mm、87mm、88mm、89mm、90mm、91mm、92mm、93mm、94mm、95mm、96mm、97mm、98mm、99mm、100mm、105mm、110mm、115mm、120mm、125mm、130mm、135mm、140mm、145mm或150mm。
[0137]
在实施方案中，甘露醇的浓度为约0.05μg/ml至约10μg/ml。甘露醇的浓度可以是所叙述的范围内的任何值或子范围，包括端点。
[0138]
在实施方案中，细胞培养补充物是无血清的。在实施方案中，细胞培养补充物是无白蛋白的。在实施方案中，细胞培养补充物是无血清且无白蛋白的。在实施方案中，细胞培养补充物是基本上无血清的。在实施方案中，细胞培养补充物是基本上无白蛋白的。在实施方案中，细胞培养补充物是基本上无血清且基本上无白蛋白的。在实施方案中，将补充物添加到无血清细胞培养基中。在实施方案中，将补充物添加到无白蛋白细胞培养基中。在实施方案中，将补充物添加到无血清且无白蛋白的细胞培养基中。在实施方案中，将补充物添加到基本上无血清和/或基本上无白蛋白的细胞培养基中。
[0139]
在实施方案中，本文提供的细胞培养基包括平衡盐溶液、基础培养基和/或复合培养基中的至少一种。在实施方案中，本文提供的细胞培养基包含平衡盐溶液。在实施方案中，本文提供的细胞培养基包含基础培养基。在实施方案中，本文提供的细胞培养基包含复合培养基。
[0140]
在实施方案中，本文提供的细胞培养基包含以下中的至少一种：盐水、磷酸盐缓冲盐水、杜尔贝科(dulbelcco)磷酸盐缓冲盐水、汉克(hank)平衡盐溶液、厄尔(earle)平衡盐溶液、mem、opti-mem、dmem、cts knockout dmem、rpmi-1640、imdm、汉姆氏(ham)f12、f-12k、f-10、dmem/f12、neurobasal、麦考伊(mccoy)5a培养基、莱博维茨(leibowitz)l-15、培养基199、neurobasal a、brainphys、gmem和/或威廉(william)e培养基。在实施方案中，细胞培养基包含盐水。在实施方案中，细胞培养基包含磷酸盐缓冲盐水。在实施方案中，细胞培养基包含杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水。在实施方案中，细胞培养基包含汉克平衡盐溶液。在实施方案中，细胞培养基包含厄尔平衡盐溶液。在实施方案中，细胞培养基包含mem。在实施方案中，细胞培养基包含opti-mem。在实施方案中，细胞培养基包含dmem。在实施方案中，细胞培养基包含cts knockout dmem。在实施方案中，细胞培养基包含rpmi-1640。在实施方案中，细胞培养基包含imdm。在实施方案中，细胞培养基包含汉姆氏f12。在实施方案中，细胞培养基包含f-12k。在实施方案中，细胞培养基包含f-10。在实施方案中，细胞培养基包含dmem/f12。在实施方案中，细胞培养基包含neurobasal培养基。在实施方案中，细胞培养基包含麦考伊5a培养基。在实施方案中，细胞培养基包含莱博维茨l-15。在实施方案中，细胞培养基包含培养基199。在实施方案中，细胞培养基包含neurobasal a。在实施方案中，细胞培养基包含brainphys
tm
培养基。在实施方案中，细胞培养基包含gmem。在实施方案中，细胞培养基包含威廉e培养基。在实施方案中，细胞培养基包含本文提供的两种或更多种组合物的组合。在实施方案中，可以明确排除所叙述的培养基中的一种或多种。
[0141]
在一个方面，提供了一种细胞培养补充物，其包含：(i)具有超氧化物歧化酶活性和cu+、zn+螯合活性的肽；(ii)维生素e或其类似物；和(iii)超氧化物清除剂。例如，本文提供的细胞培养补充物可以包含例如肽c(seq id no:1)、mito-tempo和6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满羧酸。
[0142]
在一个方面，提供了一种包含肽c(seq id no:1)、mito-tempo和6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满羧酸的无血清细胞培养基。
[0143]
在一个方面，提供了一种包含肽c(seq id no:1)、mito-tempo和6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满羧酸的无白蛋白细胞培养基。
[0144]
方法
[0145]
在一个方面，提供了一种用于使细胞在培养物中生长的方法。该方法包括使细胞在根据本文(包括其实施方案)提供的细胞培养基中生长。
[0146]
在另一个方面，提供了一种使细胞在培养物中生长的方法。该方法包括使细胞在补充有本文(包括其实施方案)提供的细胞培养补充物的细胞培养基中生长。
[0147]
在一个方面，提供了一种挽救细胞免受白蛋白诱导的毒性的方法。该方法包括使表现出白蛋白诱导的毒性的细胞与本文(包括其实施方案)提供的细胞培养补充物或细胞培养基接触。
[0148]
在一个方面，提供了一种用于使细胞在培养物中扩增的方法。在一个实施方案中，该方法包括使细胞与本文(包括其实施方案)提供的细胞培养基中的无血清、无白蛋白细胞培养基接触。在一个实施方案中，该方法包括接触补充有本文(包括其实施方案)提供的细胞培养补充物的细胞培养基。在一个实施方案中，细胞培养基是无血清和/或无白蛋白的。
[0149]
在一个方面，提供了一种用于使细胞从氧化应激中恢复的方法。该方法可以包括使细胞与本文(包括其实施方案)提供的细胞培养补充物接触。该方法可以包括使细胞在本文(包括其实施方案)提供的细胞培养基中生长。在实施方案中，氧化应激来自冷冻细胞。在实施方案中，氧化应激是暴露于富含脂质的条件。
[0150]
对于本文提供的方法，在实施方案中，细胞是治疗性细胞。在实施方案中，细胞是用于生产生物制品的细胞。在实施方案中，细胞是用于生产治疗性肽的细胞。在实施方案中，细胞是真核细胞。在实施方案中，细胞用作细胞疗法。在实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在实施方案中，细胞是啮齿动物细胞。在实施方案中，细胞是灵长类动物细胞。在实施方案中，细胞是人细胞。在实施方案中，细胞是干细胞，诸如胚胎干细胞、诱导的多能干细胞等。在实施方案中，细胞是胚胎干细胞。在实施方案中，细胞是诱导的多能干细胞。在实施方案中，细胞是免疫细胞，诸如b细胞、t细胞、nk细胞等。在实施方案中，细胞是b细胞。在实施方案中，细胞是t细胞。在实施方案中，细胞是nk细胞。
[0151]
在实施方案中，细胞是干细胞。在实施方案中，细胞是胚胎干细胞。在实施方案中，细胞是多能干细胞。在实施方案中，细胞是ipsc。在实施方案中，细胞是祖细胞。在实施方案中，细胞是永生化细胞。在实施方案中，细胞是原代细胞。在实施方案中，细胞是细胞系。在实施方案中，细胞是生产细胞。在实施方案中，细胞选自：间充质干细胞、ipsc、hesc、神经祖细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺β细胞、心肌细胞、hek-293细胞和cho细胞。在实施方案中，细胞是间充质干细胞。在实施方案中，细胞是神经祖细胞。在实施方案中，细胞是视网膜色素上皮细胞。在实施方案中，细胞是胰腺β细胞。在实施方案中，细胞是心肌细胞。在实施方案中，细胞是hek-293细胞。在实施方案中，细胞是cho细胞。在实施方案中，可以明确排除所叙述的细胞类型中的一种或多种。
[0152]
试剂盒
[0153]
在一个方面，提供了一种细胞培养试剂盒，其包括本文(包括其实施方案)提供的
无血清细胞培养基和细胞培养补充物。在实施方案中，细胞培养补充物包含：(i)具有超氧化物歧化酶活性和cu+、zn+螯合活性的肽；(ii)维生素e或其类似物；和(iii)超氧化物清除剂，并且其中(i)-(iii)在两个或更多个单独的容器中提供。在实施方案中，细胞培养补充物包含：(i)具有超氧化物歧化酶活性和cu+、zn+螯合活性的肽；(ii)维生素e或其类似物；和(iii)超氧化物清除剂，并且其中(i)-(iii)在单个容器中提供。
[0154]
在实施方案中，试剂盒还包括过氧化氢还原试剂。在实施方案中，过氧化氢还原试剂包括谷胱甘肽和/或硫辛酸或它们的变体。在实施方案中，过氧化氢还原试剂包括谷胱甘肽。在实施方案中，过氧化氢还原试剂包括硫辛酸。在实施方案中，过氧化氢还原试剂包括谷胱甘肽的变体。在实施方案中，过氧化氢还原试剂包括硫辛酸的变体。
[0155]
在一个方面，提供了一种细胞培养试剂盒，其包括细胞培养基和一种或多种细胞培养补充物，该细胞培养基包含具有超氧化物歧化酶活性和cu+、zn+螯合活性的肽，如本文(包括其实施方案)提供的。在实施方案中，一种或多种细胞培养补充物包含维生素e或其类似物、超氧化物清除剂或过氧化氢还原试剂。在一个实施方案中，一种或多种细胞培养补充物在单个容器中提供。在一个实施方案中，一种或多种细胞培养补充物在两个或更多个容器中提供。
[0156]
应当理解，本文所描述的实施例和实施方案仅是出于说明性目的，并且根据其进行的各种修改或改变将启发本领域的技术人员并且将被包含在本技术的精神与权限范围内和所附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的特此以引用方式整体并入。
[0157]
实施例
[0158]
本领域技术人员应理解，对本文所描述的制备和使用颗粒的描述仅出于说明目的，并且本公开不受这种说明的限制。
[0159]
实施例1.白蛋白的不同组分影响细胞培养性能
[0160]
分析了市售白蛋白在细胞培养中的性能。对来自不同来源(包括不同制造商、牛、人、重组hsa(在酵母或稻米中制备)和freestyle cho max培养基(thermo fisher目录号k900020))的牛血清白蛋白(bsa)、人血清白蛋白(hsa)和重组人血清白蛋白(rec hsa)进行了分析。制备了用于小鼠多能干细胞(psc)、原代大鼠神经元细胞或人神经干细胞(nsc)的b-27(thermo fisher scientific目录号17504044)补充的细胞培养物(在培养基中约0.5至1x最终浓度的b27)。这些培养物仅在所存在的白蛋白的来源或类型上有所不同。图1a中示出的结果表明，在所测试的白蛋白中存在显著的性能差异，并且进一步说明性能取决于细胞类型。事实上，包含相同细胞系且仅在添加bsa1或bsa2方面不同的两种培养物在性能上不同。bsa1在小鼠psc和人nsc培养物中表现出支持性质，而添加bsa2在两种细胞培养物中均引起毒性。此外，所测试的重组(rec)hsa样品的不同之处在于，添加到培养物中的某些样品对原代大鼠神经元细胞具有中性作用，一种是支持性的，并且两种在细胞中引起毒性。这些结果表明，白蛋白的类型和来源对细胞培养性能都具有显著不同的影响，并且这些影响因细胞类型而不同。
[0161]
接下来，分析了b27补充物的不同组分与各种白蛋白之间的相互作用(图1b至图1j)。还评估了这些分子相互作用对细胞培养物中神经元细胞稳定性的影响。例如，bsa和hsa均与b27组分x1(生育酚)和x2(生育酚乙酸酯)相互作用，这对神经元细胞活力显示出积
极影响。此外，当将更高浓度的bsa滴定到培养物中时，x1和x2与bsa的相互作用变得饱和。相反，添加到培养物中的相同浓度的rhsa没有导致x1和x2组分饱和。此外，bsa与x3(亚油酸)和x4(亚麻酸)组分的相互作用对b27补充的培养基中的神经元活力产生积极影响，而添加rhsa对培养物中的活力产生负面影响。结果示于图1b至图1e中。当在b27补充的培养物中测试宽范围的rhsa时，显示组分x1和组分x2竞争与rhsa结合。相反，即使在高浓度下，组分x5也不与rhsa相互作用，如图1f至图1j所示。这些结果共同表明，各种白蛋白与细胞培养基组分具有不同的相互作用，从而对培养性能产生差异。
[0162]
分析了来自三种来源的bsa(bsa1、bsa2和bsa3)对大鼠神经元存活的作用。与bsa2和bsa3相比，bsa1包含更高的铁含量，而bsa3具有比其他两者更高的胆固醇含量(图2a)。铁和胆固醇含量的批次间差异(即，来自相同来源的不同批次)很小。总蛋白质在来源与批次之间有所不同。这些数据表明，白蛋白中污染物的类型和量因来源而变化，甚至在批次之间变化。
[0163]
使用ebioscience
tm
钙黄绿素am活力染料根据制造商的方案测试了不同bsa对细胞活力的影响。简言之，在补充有its和浓度为0.25％的bsa1或bsa2的神经基础培养基中培养大鼠神经元细胞。如图2b(上图)所示，来自钙黄绿素am活力测定(thermo fisher scientific,waltham,ma，目录号65-0853-78)的结果表明，与在bsa2存在下生长的大鼠神经元细胞相比，bsa1(其具有比bsa2更高的铁含量)降低了大鼠神经元细胞的活力。当包含bsa2的培养物掺有铁时，大鼠神经元活力降低，如图2b(下图)的结果所示。这些结果表明，包含较高铁含量的白蛋白对神经元细胞活力具有毒性作用。
[0164]
然后研究了抗氧化剂逆转铁诱导的毒性的能力。将补充有瘦肉补充物(胰岛素-转铁蛋白-硒，its)的神经基础培养基中浓度为2μg/ml的tocopherol添加到培养的大鼠神经元细胞和bsa1或bsa2中的一者中。由于bsa1(图2c，左)或铁(图2c，右)，抗氧化剂的添加逆转了大鼠神经元细胞活力的降低。这些结果表明，由铁引起的神经元应激可以通过添加抗氧化剂来逆转。
[0165]
进一步分析了bsa1和bsa2对干细胞的影响。使小鼠胚胎干细胞(mesc)或人神经干细胞(hnsc)在含有bsa1或bsa2的细胞培养基中生长，并测量增殖。使用prestoblue测定法(thermo fisher scientific)根据制造商的方案测量mesc的增殖。使用vi-cell
tm
xr细胞计数测定法(beckman coulter)根据制造商的方案测量hnsc的增殖。
[0166]
如图2d和图2e所示，当与在bsa1存在下培养的相同细胞的增殖相比时，bsa2减少了mesc和hnsc两者的增殖。这些结果表明，bsa样品之间的差异将导致它们在细胞培养物中的支持作用发生变化，因此显著影响培养性能。
[0167]
来自不同来源的bsa的胆固醇浓度不同(参见图2a)。不希望受理论束缚，在包含胆固醇的培养基中培养的细胞中可能发生涉及细胞分化的基因表达的变化，因为胆固醇是shh途径的激动剂。细胞在essential 6培养基中分化，并检查叉头盒蛋白g1(foxg1)和配对盒蛋白(pax-6)表达，以分析白蛋白对基因表达的影响。在用bsa1(不含脂肪酸)、bsa2(富含脂肪酸)或bsa3(富含脂肪酸)培养的hpsc细胞中，通过qpcr测量shh下游的foxg1和pax-6的表达水平。结果示于图2f中。结果表明，来自不同来源的bsa对pax6和foxg1基因表达具有不同的影响，这可能是由于所测试的白蛋白样品中污染物胆固醇的变化。因此，白蛋白中脂质污染物的水平可影响多能干细胞分化。
[0168]
这些结果共同表明，未确定的污染物伴随白蛋白，并对细胞培养性能产生不同的影响。因此，从细胞培养物中去除白蛋白可以降低污染物的风险，特别是血液来源的污染物和其他不确定因素。
[0169]
实施例2：白蛋白及其化学上确定的抗氧化剂替代物的抗氧化性质
[0170]
进行本文所述的实验以探索白蛋白的生理功能并探索用化学上确定的组分替代白蛋白。首先，分析了白蛋白的抗氧化性质。使用铁抗氧化状态检测试剂盒(thermo fisher scientific,waltham,ma)根据制造商的方案测量各种白蛋白的总抗氧化能力。图3中示出的结果表明，抗氧化活性在所测试的白蛋白之间显著不同。结果进一步表明，与重组hsa相比，人血浆血清白蛋白具有显著更高水平的还原力。由于在培养基中使用血浆是血液源污染物的来源，因此非常需要去除血清和血浆。
[0171]
研究了白蛋白中各种类别的抗氧化活性。申请人首先利用超氧化物歧化酶(sod)比色活性试剂盒(thermo fisher scientific,waltham,ma)根据制造商的方案分析了各种白蛋白的超氧化物歧化酶(sod)活性。简言之，sod活性利用包括底物和黄嘌呤氧化酶反应形成超氧化物(o-2
)的测定法来评估，该超氧化物的水平因sod活性而降低。如图4a所示，白蛋白被证实具有sod活性，此外，分析的白蛋白中的sod活性显著不同。值得注意的是，来源于稻米的重组hsa显示出最高的抗氧化活性。
[0172]
接下来，测试了化学上确定的组分替代sod抗氧化活性的能力。如使用超氧化物歧化酶(sod)比色活性试剂盒(thermo fisher scientific,waltham,ma)根据制造商的方案评估的，比较了清除线粒体中的o2π-的mito-tempo与hsa的还原超氧化物的能力。如图4b所示，mito-tempo浓度以剂量依赖性方式降低超氧化物水平。因此，该化合物可用于复制和替代白蛋白sod样抗氧化功能。
[0173]
测试了mito-tempo挽救所培养的细胞免受氧化应激的能力。原代大鼠神经元细胞特别容易受到ros的影响，因此用作评估mito-tempo是否对细胞培养产生有益影响的模型。在存在0.12μg/ml铁的情况下，在补充有its的神经基础培养基中培养原代大鼠神经元细胞。在第6天，将mito-tempo以指定浓度滴定到培养基中。培养6天后，用钙黄绿素am染色来测量细胞活力。如图5所示，mito-tempo在浓度高达约12.5μm至约25μm的情况下对挽救细胞有效。这些结果表明，mito-tempo可以替代白蛋白的功能，用于从ros相关应激中挽救细胞。
[0174]
然后通过amplex
tm
red过氧化氢/过氧化物酶测定法(thermo fisher scientific)根据制造商的方案鉴定和测量白蛋白的过氧化氢酶活性。简言之，过氧化氢和过氧化氢酶形成当与amplex red和辣根过氧化物酶混合时形成荧光产物试卤灵的产物。因此，荧光信号的强度可用于测量过氧化氢酶活性水平。使用该方法评估了所示的不同来源的bsa、重组hsa或血浆hsa。所测试的每种白蛋白都具有过氧化氢酶活性，尽管在白蛋白样品之间的水平不同(图6)。具体地，所测试的两个bsa样品在还原活性方面表现出显著变化。
[0175]
白蛋白在位置34处具有半胱氨酸残基，它作为游离硫醇存在或者可以与谷胱甘肽(gsh)形成二硫键。因为谷胱甘肽过氧化物酶使用gsh作为还原剂来去除h2o2(一种可能对细胞造成损害的强氧化剂)，因此白蛋白在调节细胞内gsh水平方面起着关键作用。使用在硫醇存在的情况下产生1,3,5-三硝基苯(tnb)的ellman试剂(dtnb，5,5-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸))，测试了各种白蛋白的基于硫醇的抗氧化活性。结果表明，基于gsh的抗氧化活性在血浆hsa中最高(图7)。此外，活性水平因分析的白蛋白类型和来源而异。
[0176]
申请人然后测试了可以替代白蛋白的过氧化氢酶和硫醇抗氧化活性的化学上确定的组分。通过在存在低浓度或高浓度gsh或硫辛酸的情况下培养大鼠神经元细胞并随后测定细胞活力，评估了gsh和硫辛酸提供过氧化氢酶和硫醇抗氧化活性的能力。与对照培养物相比，硫辛酸增强大鼠神经元细胞活力(图8)，因此可用于替代hsa的过氧化氢酶和硫醇活性。相反，与对照相比，所测试的gsh浓度均没有显示出对细胞活力的显著影响。
[0177]
实施例3.白蛋白金属螯合特性及其化学上确定的肽替代物
[0178]
游离氧化还原活性过渡金属离子(包括铁和铜)可以是助氧化剂并参与反应，包括fenton和haber weiss反应，产生羟基oh
π
。细胞培养物中自由基的存在会损害细胞并降低培养性能。例如，与在不存在金属(nocu)的情况下培养的细胞相比，在存在铜(对于cu10和cu50，分别为10μm或50μm)的情况下培养的大鼠神经元细胞表现出降低的活力，如图9所示。白蛋白可以与金属结合以控制反应性并限制可用性，从而减少由oh
π
自由基引起的损害。
[0179]
白蛋白诸如hsa具有金属结合位点，其作为对神经元细胞有毒的过渡金属的螯合剂。因此，申请人研究了hsa是否可以被模拟功能性金属结合位点的高亲和力结合的合成肽替代。图10中所示的结果表明，当在缺乏白蛋白的培养基中生长时，某些浓度的包含螯合氨基酸序列dahk(肽c；seq id no:1)的hsa金属结合位点，增强了大鼠神经元细胞活力，从而模拟hsa的支持特征。令人惊讶的是，肽a(其是延伸至在n-末端和c-末端均包括10个额外的hsa残基的肽c序列)不保留hsa支持性质。肽b(其是在任一端延伸5个额外的侧翼hsa残基的肽c序列)类似地是无功能的。这些结果表明，尽管肽c的功能受到相邻氨基酸残基的影响，但它保留了金属螯合能力。不希望受科学理论的束缚，额外的氨基酸残基可以阻断或以其他方式抑制肽c序列的螯合功能。此外，这些数据表明本文所述的肽(包括肽c)可以替代培养基中的白蛋白(例如，当作为补充物或作为完全培养基的一部分提供时)。
[0180]
研究了肽c离子特性和序列特异性在赋予细胞培养物增强特性方面的重要性。四肽dahk(seq id no:1)是包含负电荷的、中性的和两个带正电荷的氨基酸(-x++)的序列。包含序列dthk(seq id no:2)的对应bsa肽明显具有与肽c相同的带电荷氨基酸顺序。类似于肽c(第1批次和第2批次)，dthk(seq id no:2；bsa肽)表现出在提高培养的大鼠神经元细胞的活力方面发挥作用，如图11中所示。为了评估氨基酸序列或电荷特异性是否赋予有益特性，制备并测试了乱序肽c序列。测试了包含序列akdh(seq id no:3；乱序)和x+-+电荷的乱序肽，结果示出在图11中。结果表明，四肽的培养支持功能与带电荷氨基酸的特定组合有关。例如，-x++的电荷序列赋予细胞培养增强特性，但当电荷序列被打乱时，hsa样功能被消除。
[0181]
申请人进一步测试了多个批次的hsa肽dahk(seq id no:1)，并且图11中示出的结果表明该肽显示出批次间一致性和良好的保存期限，即使在溶液中。这些结果共同表明，合成肽可以替代细胞培养物中的人血清白蛋白作为支持性补充物。
[0182]
必须调节铜水平以获得最佳细胞活力，并且包含铜的细胞培养物始终对大鼠神经元细胞产生毒性。因此，对肽c进行了研究以确认其保留hsa金属螯合活性的能力。原代大鼠神经元细胞在补充有its的神经基础培养基中培养，在存在50μm铜的情况下会对细胞产生毒性。然而，即使在存在铜的情况下，在培养物中添加肽c也能防止毒性，如图12中所示。事实上，与不含铜的培养物相比，在存在铜和肽c的情况下培养的大鼠神经元细胞显示出相似水平的活的健康细胞。这些结果表明，肽c保留了作为过渡金属螯合剂的hsa功能。因此，合
成肽可以在细胞培养物和其他生物测定中复制并替代白蛋白的金属结合活性。
[0183]
在小鼠胚胎干细胞(mesc)和hek293细胞增殖培养物中进一步评估了金属和合成肽的作用。向mesc和hek293培养物中掺入50μm cu，从而产生了有毒的培养环境并抑制了细胞增殖。向培养物中添加100μg/ml或50μg/ml的肽c以浓度依赖性方式挽救应激细胞，特别是对于mesc细胞，并且在较小程度上挽救hek293细胞。使用prestoblue
tm
细胞活力试剂(thermo fisher scientific,waltham,ma)根据制造商的方案来评估活力。活力测定表明，肽c挽救了铜诱导的应激并增强了细胞增殖，如图13和图14中所示。结果表明，肽c可以是无血清和瘦肉培养物的补充物(例如essential 8)，以提高培养基稳定性和质量，并且可以替代hsa的金属螯合能力。
[0184]
因为肽c在如本文所述的细胞培养物中表现出有益性质，申请人进一步测试了多种肽c衍生的合成肽在细胞培养物中替代白蛋白的能力。为了确定肽长度的影响，申请人评估了长度和侧接肽c dahk序列(seq id no:1)的氨基酸残基的同一性均不同的多种肽。此外，为了评估离子特性的影响，测试了包括对seq id no:1的肽的氨基酸取代的肽。设计氨基酸取代以保留seq id no:1的离子和疏水性质，即通过保留带负电荷的、疏水不带电荷的和带正电荷的残基的顺序。因此，在补充有its的神经基础培养基中培养原代大鼠神经元。用rhsa或肽c衍生的合成肽的变体进一步补充培养物。
[0185]
在第一组细胞培养物中，合成肽包含dahk(seq id no:1)氨基酸序列或在seq id no:1的n-末端和c-末端中的一者或两者上具有额外残基的肽。在培养的第5天，将细胞用钙黄绿素am标记并计数。图20中示出的结果表明，具有seq id no:12、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:16和seq id no:17的序列的肽向细胞培养传递有益特性，并且因此可以替代或部分替代培养物中的白蛋白，例如hsa。结果表明，如果肽c的活性构象得以维持，则在seq id no:1的一侧或两侧具有额外残基的合成肽可用于培养物中以至少部分替代白蛋白。也就是说，在肽的n-末端和c-末端上的相邻残基的长度对于维持肽c的功能并不重要，除非构象受到影响而不能维持其在细胞培养物中的有益特性。
[0186]
在第二组培养物中，用合成肽培养大鼠神经元细胞，这些合成肽包含肽dahk(seq id no:1)和保留dahk肽(seq id no:1)的离子和疏水性质的衍生物。图21中所示的结果表明，除了离子性质之外，第三个氨基酸的同一性也特别重要。例如，第一个氨基酸可以被带负电荷的氨基酸d或e占据，而第二个氨基酸可以是不带电荷的氨基酸，诸如a或t。此外，第四个氨基酸可以是带正电荷的氨基酸，诸如k或r。然而，第三个氨基酸必须是h残基，不能被其他带正电荷的氨基酸例如k或r取代。
[0187]
实施例4.干细胞培养物中白蛋白的合成肽替代物
[0188]
评估肽c(seq id no:1)对细胞分化的影响。如本文所述，来自不同来源的bsa的存在导致培养细胞中参与细胞分化的基因的表达水平不一致。不希望受理论的束缚，这可能是由于白蛋白样品中胆固醇水平的变化。为了评估四肽蛋白c对细胞分化的影响，在存在bsa1、bsa2或肽c的情况下培养多能干细胞(psc)。用肽c培养的psc产生了与对照培养物(无sa)相比相似的foxg1表达水平，如通过免疫细胞化学(icc)和qpcr所测定的。结果分别示于图17a和图17b中。对肽c的进一步分析证实了该肽不包含任何胆固醇污染物。分化后，细胞将产生它们的位置同一性，诸如前脑、中脑、后脑等。规范是psc产生这种位置标识的步骤。本文的数据表明，psc分化的规范受培养物中bsa1或bsa2的存在的影响，而肽c未显示出显
著影响。这些结果表明，合成肽可以替代干细胞培养物中的白蛋白，以防止导致不一致的细胞分化的基因表达的变化。
[0189]
实施例5.白蛋白及其化学上确定的替代物中的维生素e抗氧化活性
[0190]
如本文所述，白蛋白赋予抗氧化活性，但该活性是可变的并且在白蛋白同源物、来源和批次之间是不一致的。此外，如hplc所证实和图15所示，抗氧化剂组分在白蛋白样品之间的浓度和活性有所不同。由于已知具有抗氧化性质的脂溶性维生素与白蛋白结合，因此对两种白蛋白的维生素e含量进行了评估。通过将维生素e滴定到样品中来分析低脂白蛋白(白蛋白1)和高脂白蛋白(白蛋白2)。图16a中示出的结果表明，与白蛋白1相比，白蛋白2在较低浓度时发生维生素e饱和。这些数据表明，与白蛋白1相比，白蛋白2具有更高水平的维生素e(或维生素e激动剂)。
[0191]
维生素e属于一类亲脂性抗氧化剂，它们是ros和脂质自由基的有效清除剂，使它们成为不可缺少的保护剂和生物膜的必需组分。因此，申请人试图鉴定和表征可以复制白蛋白中维生素e性质的化学上确定的组分。
[0192]
研究了作为白蛋白的替代物的维生素e的水溶性衍生物trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸)。在存在渐增浓度的维生素e或trolox的情况下，在补充有its的神经基础培养基中培养大鼠皮层神经元(rcn)细胞。在没有任何抗氧化剂的情况下，老化的神经元在约第4天开始退化，几乎没有活的神经元留在板上。令人惊讶的是，将维生素e(图16b)或trolox(图16c)滴定到细胞培养物中逆转了细胞死亡，如在第6天所评估的。此外，trolox具有比维生素e更高的水溶性和更宽的工作范围，使其成为优于维生素的优选的培养补充物。这些结果表明trolox是用于预防细胞变性的白蛋白的维生素e活性的可行替代物。
[0193]
实施例6.包含化学上确定的白蛋白替代物的组合物
[0194]
在包含白蛋白的组合物中评估了本文提供的抗氧化剂。申请人研究了当组合使用时，除了逆转白蛋白的毒性特征之外，抗氧化剂是否可以赋予细胞培养物有益的性质。在存在或不存在抗氧化剂的情况下，在细胞培养物中测试了对培养物中的细胞表现出毒性的来源于稻米的重组人血清白蛋白(rhsa)。用prestoblue
tm
细胞活力试剂(thermo fisher scientific,waltham,ma)根据制造商的方案评估hek-293细胞。数据表明，与在不存在额外抗氧化剂的情况下培养的细胞相比，当细胞与rhsa一起培养时增殖水平更高，如图18a中所示。hela细胞显示出相似的结果，如图18b所示。令人惊讶的是，与在不存在rhsa的情况下培养的对照组细胞相比，抗氧化剂改善了细胞增殖。这些结果表明，化学上确定的抗氧化剂可以与白蛋白组合，以赋予有益性质并使其免受来自白蛋白污染物的毒性。
[0195]
此外，分析了包含肽c和抗氧化剂的混合物支持细胞在培养物中生长的能力。在补充有转铁蛋白(holo)的n2培养基中培养神经元细胞。在存在或不存在混合物的情况下培养细胞。随后将活细胞用钙黄绿素am标记并计数。图19a中示出的结果表明，在存在肽c和抗氧化剂的情况下，神经元细胞显示出比在不存在混合物的情况下培养的细胞更大的活力。此外，钙黄绿素am标记的细胞的图像和对神经突长度的分析表明混合物增强了神经突生长和形成，如图19b中所示。这些结果表明，包含肽c和其他化学上确定的白蛋白替代物的组合物可用于改善细胞培养性能。
[0196]
非正式序列表
[0197][0198]

技术特征：
1.一种细胞培养基，所述细胞培养基包含具有超氧化物歧化酶活性和cu+、zn+螯合活性的肽。2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中所述肽是合成制备的。3.根据权利要求1或权利要求2所述的细胞培养基，其中所述肽包含至少4个氨基酸残基。4.根据权利要求1-3中任一项所述的细胞培养基，其中所述肽包含至少一个带负电荷的残基。5.根据权利要求1-4中任一项所述的细胞培养基，其中所述肽包含至少一个带正电荷的残基。6.根据权利要求1-5中任一项所述的细胞培养基，其中所述肽选自由dahk(seq id no:1)、dthk(seq id no:2)和eahk(seqid no:7)组成的组。7.根据权利要求1-6中任一项所述的细胞培养基，其中所述肽以介于约50μg/ml和约100μg/ml之间的浓度存在。8.根据权利要求1-7中任一项所述的细胞培养基，其中所述培养基是无血清并且无白蛋白的。9.根据权利要求1-8中任一项所述的细胞培养基，所述细胞培养基还包含超氧化物清除剂。10.根据权利要求9所述的细胞培养基，其中所述超氧化物清除剂包含含有(2,2,6,6-四甲基-1-基)氧基或其变体的化合物或类黄酮。11.根据权利要求10所述的细胞培养基，其中所述超氧化物清除剂包含tempo、tempol或它们的变体。12.根据权利要求9所述的细胞培养基，其中所述超氧化物清除剂包含不是细胞天然存在的化合物。13.根据权利要求9或权利要求10所述的细胞培养基，其中所述超氧化物清除剂包含mito-tempo。14.根据权利要求1-13中任一项所述的细胞培养基，所述细胞培养基还包含维生素e或其类似物。15.根据权利要求14所述的细胞培养基，其中所述维生素e类似物包含6-色原烷醇基团部分。16.根据权利要求14所述的细胞培养基，其中所述维生素e或其类似物或变体包括α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、δ-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、α-生育酚琥珀酸酯、α-生育酚单葡糖苷、γ-生育酚n,n-二甲基甘氨酸酯或它们的取代物、纯异构体、外消旋混合物和/或混合物。17.根据权利要求14所述的细胞培养基，其中所述维生素e类似物是水溶性的。18.根据权利要求15所述的细胞培养基，其中所述维生素e类似物包括6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸。19.根据权利要求1-18中任一项所述的细胞培养基，所述细胞培养基还包含过氧化氢还原试剂。20.根据权利要求19所述的细胞培养基，其中所述过氧化氢还原剂包括谷胱甘肽、n-乙
酰半胱氨酸、半胱氨酸、亚硒酸钠、甘露醇、类黄酮、硫辛酸或它们的任何组合。21.根据权利要求1-20中任一项所述的细胞培养基，所述细胞培养基还包含稳定剂分子。22.根据权利要求21所述的细胞培养基，其中所述稳定剂分子是海藻糖或甘露醇。23.根据权利要求1-22中任一项所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含平衡盐溶液、基础培养基和/或复合培养基中的至少一种。24.根据权利要求1-23中任一项所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含以下中的至少一种：盐水、磷酸盐缓冲盐水、杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水、汉克平衡盐溶液、厄尔平衡盐溶液、mem、opti-mem、dmem、cts knockout dmem、rpmi-1640、imdm、汉姆氏f12、f-12k、f-10、dmem/f12、neurobasal、麦考伊5a培养基、莱博维茨l-15、培养基199、neurobasal a、brainphys、gmem和/或威廉e培养基。25.一种细胞培养补充物，所述细胞培养补充物包含具有超氧化物歧化酶活性和cu+、zn+螯合活性的肽。26.根据权利要求25所述的细胞培养补充物，其中所述肽是合成制备的。27.根据权利要求25或权利要求26所述的细胞培养补充物，其中所述肽包含至少4个氨基酸残基。28.根据权利要求25-27中任一项所述的细胞培养补充物，其中所述肽包含至少一个带负电荷的残基。29.根据权利要求21-28中任一项所述的细胞培养补充物，其中所述肽包含至少一个带正电荷的残基。30.根据权利要求25-29中任一项所述的细胞培养补充物，其中所述肽选自由dahk(seq id no:1)和dthk(seq id no:2)组成的组。31.根据权利要求25-30中任一项所述的细胞培养补充物，所述细胞培养补充物还包含超氧化物清除剂。32.根据权利要求31所述的细胞培养补充物，其中所述超氧化物清除剂包含含有(2,2,6,6-四甲基-1-基)氧基或其变体的化合物或类黄酮。33.根据权利要求32所述的细胞培养补充物，其中所述超氧化物清除剂包含tempo、tempol或它们的变体。34.根据权利要求31所述的细胞培养补充物，其中所述超氧化物清除剂包含不是细胞天然存在的化合物。35.根据权利要求31或权利要求32所述的细胞培养补充物，其中所述超氧化物清除剂包含mito-tempo。36.根据权利要求25-35中任一项所述的细胞培养补充物，所述细胞培养补充物还包含维生素e或其类似物。37.根据权利要求36所述的细胞培养补充物，其中所述维生素e类似物包含6-色原烷醇基团部分。38.根据权利要求36所述的细胞培养补充物，其中所述维生素e或其类似物或变体包括α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、δ-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、α-生育酚琥珀酸酯、α-生育酚单葡糖苷、γ-生育酚n,n-二甲基甘氨酸酯或
它们的取代物、纯异构体、外消旋混合物和/或混合物。39.根据权利要求36-38中任一项所述的细胞培养补充物，其中所述维生素e类似物是水溶性的。40.根据权利要求37所述的细胞培养补充物，其中所述维生素e类似物包括6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸。41.根据权利要求25-40中任一项所述的细胞培养补充物，所述细胞培养补充物还包含过氧化氢还原试剂。42.根据权利要求41所述的细胞培养补充物，其中所述过氧化氢还原剂包括谷胱甘肽、n-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、亚硒酸钠、甘露醇、类黄酮、硫辛酸或它们的任何组合。43.根据权利要求25-42中任一项所述的细胞培养补充物，所述细胞培养补充物还包含稳定剂分子。44.根据权利要求43所述的细胞培养补充物，其中所述稳定剂分子是海藻糖或甘露醇。45.根据权利要求25-44中任一项所述的细胞培养补充物，其中所述细胞培养补充物是无血清的。46.根据权利要求25-45中任一项所述的细胞培养补充物，其中所述细胞培养补充物是无白蛋白的。47.根据权利要求25-46中任一项所述的细胞培养补充物，其中所述补充物被添加到无血清细胞培养基中。48.一种细胞培养补充物，所述细胞培养补充物包含：(i)具有超氧化物歧化酶活性和cu+、zn+螯合活性的肽；(ii)维生素e或其类似物；和(iii)超氧化物清除剂。49.一种用于使细胞在培养物中生长的方法，所述方法包括使所述细胞在根据权利要求1-24中任一项所述的细胞培养基中生长。50.一种使细胞在培养物中生长的方法，所述方法包括使所述细胞在补充有根据权利要求25-48中任一项所述的细胞培养补充物的细胞培养基中生长。51.一种挽救细胞免受白蛋白诱导的毒性的方法，所述方法包括使表现出白蛋白诱导的毒性的细胞与根据权利要求25-48中任一项所述的细胞培养补充物接触。52.一种用于使细胞在培养物中扩增的方法，所述方法包括使所述细胞与根据权利要求1-24中任一项所述的细胞培养基中的无血清、无白蛋白的细胞培养基接触。53.一种使细胞从氧化应激中恢复的方法，所述方法包括使所述细胞与根据权利要求25-48中任一项所述的细胞培养补充物接触，或者使所述细胞在根据权利要求1-24中任一项所述的细胞培养基中生长。54.根据权利要求53所述的方法，其中所述氧化应激来自冷冻所述细胞。55.根据权利要求53所述的方法，其中所述氧化应激是暴露于富含脂质的条件。56.根据权利要求49-55中任一项所述的方法，其中所述细胞是治疗性细胞。57.根据权利要求49-56中任一项所述的方法，其中所述细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞、神经祖细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺β细胞、心肌细胞、hek-293细胞和cho细胞。
58.一种细胞培养试剂盒，所述细胞培养试剂盒包含无血清细胞培养基和根据权利要求25-46中任一项所述的细胞培养补充物。59.根据权利要求58所述的细胞培养试剂盒，其中所述细胞培养补充物包含：(i)具有超氧化物歧化酶活性和cu+、zn+螯合活性的肽；(ii)维生素e或其类似物；和(iii)超氧化物清除剂，并且其中(i)-(iii)在单独的容器中提供。60.根据权利要求58所述的试剂盒，其中所述细胞培养补充物包含：(i)具有超氧化物歧化酶活性和cu+、zn+螯合活性的肽；(ii)维生素e或其类似物；和(iii)超氧化物清除剂，并且其中(i)-(iii)在单个容器中提供。61.根据权利要求59或权利要求60所述的试剂盒，所述试剂盒还包含过氧化氢还原试剂。62.根据权利要求61所述的试剂盒，其中所述过氧化氢还原试剂包括谷胱甘肽和/或硫辛酸或它们的变体。

技术总结
本文尤其提供了替代或部分替代细胞培养基中的白蛋白的化学上确定的组分和组合物。这些组分和组合物可以支持细胞培养、保护细胞或增强所培养的细胞的活力。还提供了用于含有白蛋白的细胞培养基中的化学上确定的培养基补充物。这些化学上确定的培养基补充物可以挽救细胞免受白蛋白诱导的毒性。细胞免受白蛋白诱导的毒性。细胞免受白蛋白诱导的毒性。


技术研发人员：J
受保护的技术使用者：生命技术公司
技术研发日：2021.12.15
技术公布日：2023/9/23