制备肽的方法与流程

制备肽的方法
1.相关申请
2.本技术主张于2020年12月30日提交的美国专利临时申请案申请号为63/131,873的优先权，其公开内容通过引用并入本文作为参考。
3.序列表声明
4.档案命名为89546sequencelisting.txt的ascii格式文件创建于2021年12月27日，包含4,096个字节，与本技术同时提交，通过引用并入本文。
5.技术领域及

背景技术：

6.在本发明的一些实施例中，本发明涉及化学合成，更具体地说，但不限于制备肽，例如bl-8040的新方法，这些肽可用于治疗诸如癌症和/或关节炎等疾病。
7.bl-8040是一种肽，也称为4f-苯甲酰基-tn14003(4-氟-苯甲酰基-arg-arg-nal-cys-tyr-cit-lys-d-lys-pro-tyr-arg-cit-cys-arg-nh2，seq id no：1)，并且在其两个cys残基之间形成二硫键后呈环状。
8.美国专利号us 7,423,007描述了具有cxc4拮抗作用的肽；包括4f-苯甲酰基-tn14003。根据美国专利us 7,423,007的教示，4f-苯甲酰基-tn14003是通过使用dipcdi hobt作为偶联剂在dmf(添加2.5当量的氨基酸)中的固相合成来制备的，然后使用1m tmsbr-茴香硫醚/tfa与间甲酚和乙二硫醇脱保护和裂解，以及通过空气氧化进行环化。
9.另外的背景技术包括美国专利号us 7,138,488和us 8,435,939，以及专利合作条约申请公开号wo 2008/075369、wo 2008/075370、wo 2010/146578、wo 2012/095849和wo 2013/160895。


技术实现要素：

10.根据本发明一些实施例的一个目的，提供了一种大规模制备具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括：
11.(a)通过固相肽合成将氨基酸和4-氟苯甲酸(4-fluorobenzoic acid)依次偶联到树脂上，从而得到偶联到树脂上的线性肽；
12.(b)将线性肽从树脂上裂解，从而获得游离的线性肽；
13.(c)将线性肽的半胱氨酸残基氧化，形成分子内二硫键，从而得到溶液中的具有seq id no:1的环肽；以及
14.(d)分离具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐；
15.其中：
16.(i)所述偶联步骤是使用二异丙基碳二亚胺(diisopropylcarbodiimide,dic)与氰基羟基亚氨基乙酸乙酯(ethyl cyanohydroxyiminoacetate)和/或n-羟基苯并三唑(n-hydroxybenzotriazole)组合进行的；
17.(ii)通过使与所述树脂偶联的所述线性肽与包含三氟乙酸(trifluoroacetic acid,tfa)和选自二硫赤藓糖醇(dithioerythritol,dte)和二硫苏糖醇(dithiothreitol,dtt)的清除剂的溶液接触来实现所述裂解步骤；
18.(iii)所述方法还包括在裂解后沉淀所述游离的线性肽，而不在沉淀之前通过蒸发浓缩所述游离的线性肽；
19.(iv)通过使包含浓度至少5毫克/毫升的线性肽的水溶液与过氧化氢接触来实现所述氧化步骤；
20.(v)所述分离步骤包括将环肽以不超过40克环肽/每千克所述柱的浓度加载到反相色谱柱上，并从所述柱上洗脱环肽；
21.(vi)所述分离具有seq id no:1的环肽的步骤包括冷冻干燥，并且所述方法进一步包括在所述冷冻干燥之后研磨所述环肽；和/或
22.(vii)所述树脂的取代度为每克至少0.3毫当量，和/或所述树脂为rink氨基甲基苯乙烯(aminomethylstyrene,ams)树脂。
23.根据本发明一些实施例的一个目的，提供了一种大规模制备具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括：
24.(a)使用二异丙基碳二亚胺(diisopropylcarbodiimide,dic)与氰基羟基亚氨基乙酸乙酯(ethyl cyanohydroxyiminoacetate)和/或n-羟基苯并三唑(n-hydroxybenzotriazole)组合，通过固相肽合成将氨基酸和4-氟苯甲酸(4-fluorobenzoic acid)依次偶联到树脂上，从而获得偶联到树脂上的线性肽；
25.(b)从树脂上裂解线性肽，从而获得游离的线性肽；
26.(c)将线性肽的半胱氨酸残基氧化，形成分子内二硫键，从而得到溶液中的具有seq id no:1的环肽；以及
27.(d)分离具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐。
28.根据本发明一些实施例的一个目的，提供了一种大规模制备具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括：
29.(a)通过固相肽合成将氨基酸和4-氟苯甲酸(4-fluorobenzoic acid)依次偶联到树脂上，从而得到偶联到树脂上的线性肽；
30.(b)通过使与树脂偶联的线性肽与包含三氟乙酸(trifluoroacetic acid,tfa)和选自二硫赤藓糖醇(dithioerythritol,dte)和二硫苏糖醇(dithiothreitol,dtt)的清除剂的溶液接触，从树脂上裂解线性肽，从而获得游离的线性肽；
31.(c)将线性肽的半胱氨酸残基氧化，形成分子内二硫键，从而得到溶液中的具有seq id no:1的环肽；以及
32.(d)分离具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐。
33.根据本发明一些实施例的一个目的，提供了一种大规模制备具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括：
34.(a)通过固相肽合成将氨基酸和4-氟苯甲酸(4-fluorobenzoic acid)依次偶联到树脂上，从而得到偶联到树脂上的线性肽；
35.(b)将线性肽从树脂上裂解，从而获得游离的线性肽，并在裂解后沉淀游离的线性肽，而不在沉淀之前通过蒸发浓缩游离的线性肽；
36.(c)将线性肽的半胱氨酸残基氧化，形成分子内二硫键，从而得到溶液中的具有seq id no:1的环肽；以及
37.(d)分离具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐。
38.根据本发明一些实施例的一个目的，提供了一种大规模制备具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括：
39.(a)通过固相肽合成将氨基酸和4-氟苯甲酸(4-fluorobenzoic acid)依次偶联到树脂上，从而得到偶联到树脂上的线性肽；
40.(b)从树脂上裂解线性肽，从而获得游离的线性肽；
41.(c)氧化所述线性肽的半胱氨酸残基，形成分子内二硫键，所述氧化步骤是通过将浓度至少为5毫克/毫升的所述线性肽的水溶液与过氧化氢接触来实现的，从而在溶液中获得具有seq id no:1的环肽；以及
42.(d)分离具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐。
43.根据本发明一些实施例的一个目的，提供了一种大规模制备具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括：
44.(a)通过固相肽合成将氨基酸和4-氟苯甲酸(4-fluorobenzoic acid)依次偶联到树脂上，从而得到偶联到树脂上的线性肽；
45.(b)从树脂上裂解线性肽，从而获得游离线性肽游离的线性肽；
46.(c)将线性肽的半胱氨酸残基氧化，形成分子内二硫键，从而得到溶液中的具有seq id no:1的环肽；以及
47.(d)分离具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐，其中所述分离步骤包括以不超过40克环肽/每千克柱的浓度将所述环肽加载到反相色谱柱上，并从所述柱洗脱所述环肽。
48.根据本发明一些实施例的一个目的，提供了一种大规模制备具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括：
49.(a)通过固相肽合成将氨基酸和4-氟苯甲酸(4-fluorobenzoic acid)依次偶联到树脂上，其中所述树脂的取代度为至少0.3毫当量/克和/或所述树脂为rink氨基甲基苯乙烯(aminomethylstyrene,ams)树脂，从而获得偶联到所述树脂上的线性肽；
50.(b)从树脂上裂解线性肽，从而获得游离线性肽游离的线性肽；
51.(c)将线性肽的半胱氨酸残基氧化，形成分子内二硫键，从而得到溶液中的具有seq id no:1的环肽；以及
52.(d)分离具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐。
53.根据本文描述的任何相应实施例中的一些，所述偶联步骤使用二异丙基碳二亚胺(diisopropylcarbodiimide,dic)与氰基羟基亚氨基乙酸乙酯(ethyl cyanohydroxyiminoacetate)和/或n-羟基苯并三唑(n-hydroxybenzotriazole)组合来实现。
54.根据本文描述的涉及与dic(diisopropylcarbodiimide)和氰基羟基亚氨基乙酸乙酯(ethyl cyanohydroxyiminoacetate)和/或n-羟基苯并三唑(n-hydroxybenzotriazole)偶联的任何实施例中的一些，所述dic(diisopropylcarbodiimide)和所述氰基羟基亚氨基乙酸乙酯(ethyl cyanohydroxyiminoacetate)和/或n-羟基苯并三唑(n-hydroxybenzotriazole)以约两倍的摩尔过量使用。
55.根据本文描述的任何相应实施例中的一些，所述裂解步骤是通过使与所述树脂偶
联的所述线性肽与包含三氟乙酸(trifluoroacetic acid,tfa)和清除剂的溶液接触来实现的，所述清除剂选自二硫赤藓糖醇(dithioerythritol,dte)和二硫苏糖醇(dithiothreitol,dtt)所组成的群组中。
56.根据本文描述的涉及用包含选自二硫赤藓糖醇(dithioerythritol,dte)和二硫苏糖醇(dithiothreitol,dtt)的清除剂的溶液裂解的任何实施例中的一些，所述溶液中的所述清除剂的浓度在10毫克/毫升至500毫克/毫升的范围内。
57.根据本文描述的涉及用包含二硫苏糖醇(dithiothreitol,dtt)的溶液裂解的任何实施例中的一些，溶液中二硫苏糖醇(dithiothreitol,dtt)的浓度为约50毫克/毫升。
58.根据本文描述的任何相应实施例中的一些，所述方法进一步包括在所述裂解步骤后沉淀所述游离的线性肽，而不在所述沉淀前通过蒸发浓缩所述游离的线性肽。
59.根据本文描述的与沉淀线性肽有关的任何实施例中的一些，所述沉淀通过加入叔丁基甲基醚(tert-butyl methyl ether,mtbe)和己烷的混合物来实现，所述混合物的体积为每克所述树脂约45毫升所述混合物。
60.根据本文所述的任何相应实施例中的一些，氧化是通过使线性肽与过氧化氢接触来实现的。
61.根据本文所述的涉及使线性肽与过氧化氢接触的任何实施例中的一些，通过使包含浓度至少5毫克/毫升的线性肽的水溶液与过氧化氢接触来实现接触。
62.根据本文描述的任何相应实施例中的一些，所述分离步骤包括以不超过40克环肽/每千克柱的浓度将所述环肽加载到反相色谱柱上，并从所述柱洗脱所述环肽。
63.根据本文描述的涉及反相色谱柱的任何实施例中的一些，所述柱是c18柱。
64.根据本文描述的涉及洗脱的任何实施例中的一些，用磷酸三乙铵(triethylammonium phosphate)溶液进行洗脱。
65.根据本文描述的任何相应实施例中的一些，所述分离具有seq id no:1的环肽的步骤包括冷冻干燥，并且所述方法进一步包括在所述冷冻干燥之后研磨所述环肽。
66.根据本文描述的任何相应实施例中的一些，固相肽合成树脂的取代度为至少0.3毫当量/克和/或树脂为rink氨基甲基苯乙烯(aminomethylstyrene,ams)树脂。
67.除非另有定义，否则本文使用的所有技术及/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然在本发明实施例的实施或测试中可以使用与本文所述方法和材料类似或等同的方法和材料，下面描述的方法及/或材料为例示性的。如果发生矛盾，专利说明书包括其定义，将受到限制。另外，这些材料、方法和实施例仅是说明性的，并非用以限制。
68.本发明实施例的方法及/或系统的实现可以关于手动地、自动地或者其组合地执行或完成选择的任务。而且，根据本发明方法及/或系统的实施例的实际仪器和设备，可以通过硬件、通过软件、或通过韧体或其组合通过使用操作系统来实现几个选择的任务。
69.例如，根据本发明的实施例执行选定任务的硬件可以被实现为芯片或电路。作为软件，根据本发明实施例的选定任务可以被实现为由使用任何合适的操作系统的计算器执行的多个软件指令。在本发明例示性实施例中，根据本文描述的方法及/或系统的例示性实施例的一个或多个任务由诸如用于执行多个指令的计算平台的数据处理器执行。可选地，数据处理器包括用于存储指令及/或数据的挥发性内存和/或用于存储指令和/或数据的非
挥发性内存，例如磁性硬盘和/或可移动介质。可选地，也提供网络连接。更可选地提供显示器及/或用户输入设备，例如键盘或鼠标。
附图说明
70.这里仅通过举例的方式参考附加的图式来描述本发明的一些实施例。现在具体参照附图详细说明，需强调的是，所示出的细节是作为例示并且出于对本发明实施例的说明性讨论的目的。就这一点而言，对于本领域技术人员而言，利用附图进行的描述对于可以如何实践本发明的实施例是显而易见的。
71.在附图中：
72.图1是根据本发明的一些示例性实施例的制备bl-8040的方法的固相合成部分的流程图，包括将cys、cit(瓜氨酸)、arg、tyr、pro、d-lys、lys、cit、tyr，cys、nal(萘基丙氨酸)、arg、arg和fba(4-氟苯甲酸)偶联到树脂的顺序循环。
具体实施方式
73.在本发明的一些实施例中，本发明涉及化学合成，更具体地说，但不限于制备肽(例如bl-8040)的新方法，这些肽可用于治疗诸如癌症和/或关节炎等疾病。
74.在详细解释本发明的至少一实施例之前，应当理解的是，本发明在其应用中不一定限于以下描述中阐述的组件及/或方法及/或在附图及/或实施例中所示出的构造和设置细节。本发明能够具有其他实施例或以各种方式实施或执行。
75.肽通常通过固相合成来制备，其中肽(以受保护的形式)附着在树脂上形成，然后从树脂上裂解(同时去除保护基团)。分子内二硫键，例如在bl-8040中(4-氟-苯甲酰基(4-fluoro-benzoyl)-arg-arg-nal-cys-tyr-cit-d-lys-plo-tyr-arg-cit-cys-arg-nh2，seq id no:1)，然后通过cys残基的氧化形成。
76.经过辛苦的实验，本发明人发现了新的方法，这些方法对于大规模合成这种肽，特别是bl-8040，是令人惊讶地有效的。
77.根据本发明一些实施例的一个目的，提供了一种制备包含分子内二硫键的环肽或其药学上可接受的盐的方法。在本文所述的任何实施例中，环肽具有seq id no:1(4-氟-苯甲酰基(4-fluoro-benzoyl)-arg-arg-nal-cys-tyr-cit-lys-d-lys-pro-tyr-arg-cit-cys-arg-nh2)，并且cys残基通过分子内二硫键连接。这个肽还可以是具有seq id no：1的肽的类似物或衍生物。
78.所述方法包括通过固相肽合成(根据本领域已知的一般程序)将肽中存在的氨基酸和任选的氨基酸类似物(例如，n-端羧酸，例如4-氟-苯甲酸)顺序偶联至树脂(例如rink ams树脂)，以获得偶联至所述树脂的一线性肽。
79.所述方法进一步包括从所述树脂上裂解通过偶联形成的肽，从而获得游离的(线性)肽(根据本文所述的各个实施例中的任一个)，并氧化线性肽的半胱氨酸残基以形成分子内二硫键(根据文中所述的各个实施例中的任一个)，从而获得环肽(在溶液中)。
80.在本文描述的任何实施例中的一些，所述方法是大规模方法。
81.本文中所用术语“大规模方法”是指制备至少100克最终产品的方法(在所述方法的单次运行中)。
82.在本文描述的涉及大规模方法的任何实施例中，制备至少250克环肽，或至少500克肽，或至少1kg肽，或至少3kg肽，甚至至少可以制备10公斤的环肽。
83.偶联：
84.顺序偶联的顺序是从c-端开始，到n-端结束。例如，对于seq id no:1，连续偶联的顺序是arg、cys、cit(瓜氨酸)、arg、tyr、pro、d-lys(d-赖氨酸)、lys、cit、tyr、cys、nal(萘基丙氨酸)，arg，arg，4-氟苯甲酸(4-fluorobenzoic acid)。
85.偶联包括在羧酸盐基团(例如，氨基酸或n-端羧酸的)和胺基基团(例如，第一步骤中的树脂的或后续步骤中的n-端的)之间形成酰胺键，并且优选使用本领域已知的适合于酰胺键形成的一种或多种偶联试剂来实现，例如，碳二亚胺(例如，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、二环己基碳二亚胺和/或二异丙基碳二亚胺(di isopropylcarbodi imide,dic))、铵/脲(例如，hatu、hbtu、tbtu和/或hctu)或鏻盐(例如，pybop和/或pyaop)和/或丙膦酸酐。
86.在本文所描述的任何实施例中的一些实施例中，一种或多种偶联剂包括碳二亚胺(例如，二异丙基碳二亚胺(di isopropylcarbodiimide,dic))和附加试剂(例如，与碳二亚胺的摩尔浓度约相同)，例如羟基三唑(例如，n-羟基苯并三唑(hobt)或1-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(hoat)和/或氰基羟基亚氨基乙酸酯(例如，氰基羟基亚氨基乙酸乙酯)。
87.在本文所述的任何实施例中的一些实施例中，使用碳二亚胺和氰基羟基亚氨基乙酸酯进行偶联。在一些这样的实施例中，碳二亚胺和/或氰基羟基亚氨基乙酸酯以约两倍的摩尔过量(相对于所偶联的氨基酸或其它羧酸)使用。
88.在本文所述的任何实施例中的一些实施例中，使用碳二亚胺与氰基羟基亚氨基乙酸乙酯(ethyl cyanohydroxyiminoacetate)和/或n-羟基苯并三唑(n-hydroxybenzotriazole)进行偶联。在一些这样的实施例中，碳二亚胺和/或氰基羟基亚氨基乙酸乙酯(ethyl cyanohydroxyiminoacetate)和/或n-羟基苯并三唑(n-hydroxybenzotriazole)以约两倍摩尔过量使用(相对于所偶联的氨基酸或其他羧酸)。
89.在本文所述的任何实施例中的一些实施例中，使用二异丙基碳二亚胺(di isopropylcarbodiimide,dic)与氰基羟基亚氨基乙酸乙酯(ethyl cyanohydroxyiminoacetate)和/或n-羟基苯并三唑(n-hydroxybenzotriazole)进行偶联。在一些这样的实施例中，dic和氰基羟基亚氨基乙酸乙酯和(ethyl cyanohydroxyiminoacetate)/或n-羟基苯并三唑(n-hydroxybenzotriazole)以约两倍摩尔过量(相对于所偶联的氨基酸或其他羧酸)使用。
90.在不受任何特定理论约束的情况下，相信氰基羟基亚氨基乙酸乙酯与碳二亚胺的组合(例如，依照本文所述的比例)的使用特别适合于大规模合成本文所述的肽，例如，与羟基三唑相比。
91.在每一个氨基酸偶联步骤中，氨基酸的n端由容易去除的基团保护，优选芴基甲氧基羰基(fmoc)，其可以任选地被弱碱如哌啶(例如20％至50％哌啶在dmf中)裂解。哌啶在dmf中的示例性浓度为约20％。
92.例如，fmoc基团可任选地通过在哌啶溶液中洗涤两次(根据本文所述的任何实施例)来去除，任选地一次5-10分钟，然后任选地一次25-30分钟；然后洗涤树脂(例如，在不含哌啶的dmf中)以除去碱(可以任选地通过测定ph来确定碱)。
93.此外，某些氨基酸的侧链可以通过容易除去的基团(其不会被上述弱碱裂解)保护，例如叔丁氧基。因此，侧链羟基(例如，在tyr、ser和thr中)和/或羧酸根基团(例如，在asp和glu中)可以优选地被叔丁基(t-bu)保护(以形成叔丁氧基))，并且侧链胺基(例如，在lys、trp和his中)可以被叔丁氧基羰基(boc)(其包含叔丁氧基)保护；在这两种情况下，裂解(例如，在酸性环境中)可能会重新生成未受保护的羟基或胺基。类似地，侧链硫代羟基基团(例如，cys)和/或羧酸根基团(例如，asp和glu)可以优选地用三苯甲基(trt)保护，和/或侧链胍基团(例如，arg)可以优选地用2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-磺酰基(pbf)保护；每一个都可以任选地在酸性环境中裂解。已知上述侧链保护基团与fmoc的使用特别兼容。本领域技术人员将了解适用于氨基酸侧链中特定基团的额外保护基团，以及它们彼此之间以及与各种n-端保护基团的兼容性。
94.在本文描述的任何实施例中的一些，氨基酸顺序偶联的树脂是rink氨基甲基苯乙烯(aminomethylstyrene,ams)树脂(被rink连接符取代的氨基甲基苯乙烯树脂)。rink ams树脂任选地被fmoc基团保护，其可以在偶联之前被去除以暴露胺基团(第一个氨基酸偶联至其上)。
95.在本文所述的任何实施例中的一些实施例中，树脂(氨基酸依次偶联至其上)的取代度为每克树脂至少0.3毫当量(例如，每克树脂0.3至1.1毫当量)，任选地每克树脂0.6至1.1毫当量，并且任选地每克树脂0.6至0.9毫当量。在一些这样的实施例中，树脂是rink ams树脂。
96.在每个偶联步骤之前，任选地用溶剂例如二甲基甲酰胺(dmf)洗涤树脂(例如一次或两次)，例如以促进树脂的溶胀。在一些示例性实施例中，在树脂去保护(例如，根据本文所述的任何相应实施例去除fmoc基团)和第一氨基酸的偶联之前，将树脂洗涤20-30分钟，并且在每个随后的偶联步骤之前洗涤(例如两次)约2分钟。
97.从树脂裂解：
98.当根据本文所述的任何相应实施例通过顺序偶联形成附接至树脂的肽时，所获得的肽从树脂上裂解(例如，根据本文所述的任何相应实施例)。
99.优选通过使肽(偶联至树脂的)与包含酸例如三氟乙酸(trifluoroacetic acid,tfa)的液体接触来实现肽从树脂(以及来自氨基酸侧链的任何保护基团)的裂解。液体中tfa的浓度任选为至少约80重量％，或至少约90重量％，或至少约95重量％，例如，其中余量主要是水。在示例性实施例中，液体中tfa的浓度为约95重量％，余量主要是水。
100.用于裂解的液体(例如，根据本文所述的各个实施例中的任一个的酸性液体)任选地还包含清除剂(例如，在裂解过程中可能形成的反应性阳离子物质的清除剂)，例如硫醇(例如，乙二硫醇、二硫赤藓糖醇、二硫苏糖醇)、三烷基硅烷(例如，三异丙基硅烷)、苯酚(例如，间甲酚)和/或水。
101.在本文所述的任何实施例中的一些，用于裂解的液体(例如，根据本文所述的各个实施例的酸性液体)中的清除剂是二硫苏糖醇(dithiothreitol,dtt)和/或二硫赤藓醇(dte)。在一些这样的实施例中，液体是包含tfa(例如，以本文所述的浓度)和dtt和/或dte的溶液，优选与水组合。
102.在本文描述的涉及dtt和/或dte的任何实施例中的一些，用于裂解的溶液中dtt和/或dte的(总)浓度为至少10毫克/毫升。在一些这样的实施例中，dtt和/或dte的浓度在
10毫克/毫升至500毫克/毫升的范围内。在一些这样的实施例中，dtt和/或dte的浓度在10毫克/毫升至200毫克/毫升的范围内。在一些这样的实施例中，dtt和/或dte的浓度在10毫克/毫升至100毫克/毫升的范围内。在一些这样的实施例中，dtt和/或dte的浓度在10毫克/毫升至50毫克/毫升的范围内。dtt的示例性浓度为约50毫克/毫升。
103.在本文描述的涉及dtt和/或dte的任何实施例中的一些，用于裂解的溶液中dtt和/或dte的(总)浓度为至少25毫克/毫升。在一些这样的实施例中，dtt和/或dte的浓度在25毫克/毫升至500毫克/毫升的范围内。在一些这样的实施例中，dtt和/或dte的浓度在25毫克/毫升至200毫克/毫升的范围内。在一些这样的实施例中，dtt和/或dte的浓度在25毫克/毫升至100毫克/毫升的范围内。在一些这样的实施例中，dtt和/或dte的浓度在25毫克/毫升至50毫克/毫升的范围内。
104.在本文描述的涉及dtt和/或dte的任何实施例中的一些，用于裂解的溶液中dtt和/或dte的(总)浓度为至少50毫克/毫升。在一些这样的实施例中，dtt和/或dte的浓度在50毫克/毫升至500毫克/毫升的范围内。在一些这样的实施例中，dtt和/或dte的浓度在50毫克/毫升至200毫克/毫升的范围内。在一些这样的实施例中，dtt和/或dte的浓度在50毫克/毫升至100毫克/毫升的范围内。
105.当肽从树脂上裂解时，优选例如通过添加肽不溶的液体来沉淀游离的肽。任选地在沉淀之前通过蒸发溶液的一部分溶剂来浓缩游离的肽，从而减少溶液的体积(例如，约65％至约70％)。或者，在沉淀之前不进行游离的肽的浓缩。
106.在本文所述的任何实施例中的一些，进行游离的肽的沉淀，而在沉淀之前不浓缩游离的肽。
107.根据本文描述的任何相应实施例，肽的沉淀任选地通过添加二烷基醚例如叔丁基甲基醚(tert-butyl methyl ether,mtbe)来实现。
108.mtbe任选地与己烷混合。在一些实施例中，将mtbe和己烷的混合物(任选地冷却，例如，至约5℃至约15℃范围内的温度)以每克树脂至少40毫升混合物和任选地每克树脂约45毫升混合物的体积添加到肽中。示例性的mtbe和己烷的混合物由体积比为60:40(mtbe:己烷)的mtbe和己烷组成。
109.沉淀的肽任选地通过例如冷冻干燥或真空干燥。在示例性实施例中，通过真空进行干燥。
110.二硫键的形成:
111.如本文所述，通过氧化肽的半胱氨酸残基形成分子内二硫键(导致肽的环化)(其可任选地使用本文所述的与偶联有关的任何实施例和本文所描述的与从树脂裂解肽有关的任何实施例形成)。可以任选地使用本领域中已知的任何合适的技术。
112.在本文所述的任何相应实施例中的一些，氧化是通过使肽与过氧化氢接触来实现的，例如，通过逐渐(例如，逐滴)添加过氧化氢溶液(例如，水中约1.5重量％的过氧化氢)来实现。过氧化氢与一对cys残基的摩尔比(例如，与肽的摩尔比，其中肽恰好包含两个cys残基如seq id no:1)优选为至少1:1(即，每对cys残留至少有一个过氧化氢分子)，任选为至少2:1，任选为至少3:1，和任选为至少4:1。过氧化氢与一对cys残基(例如与肽)的示例性摩尔比为约5:1。可替代地或附加地，可以任选地加入过氧化氢，直到不残留硫代羟基为止(例如，通过合适的测定法，例如埃尔曼试验测定)。
113.在本文所述的任何相应实施例中的一些，所述氧化步骤是通过使包含浓度为至少5毫克/毫升的肽的水溶液与过氧化氢接触来实现的(例如，根据本文所述涉及与过氧化氢接触的任何实施例)。在一些这样的实施例中，肽的浓度在5毫克/毫升至20毫克/毫升的范围内。在一些实施例中，肽的浓度在5毫克/毫升至15毫克/毫升的范围内。在一些实施例中，肽的浓度在5毫克/毫升至10毫克/毫升的范围内。肽的示例性浓度为约10毫克/毫升。
114.在本文所述的任何相应实施例中的一些，所述氧化步骤是通过使包含浓度为至少10毫克/毫升的肽的水溶液与过氧化氢接触来实现的(例如，根据本文所述涉及与过氧化氢接触的任何实施例)。在一些实施例中，肽的浓度在10毫克/毫升至20毫克/毫升的范围内。在一些实施例中，肽的浓度在10毫克/毫升至15毫克/毫升的范围内。
115.在本文描述的涉及使用水溶液进行氧化的任何实施例中的一些，水溶液是弱碱性的，例如碳酸氢铵(nh4hco3)的水溶液。碳酸氢铵的示例性浓度为约0.1m。
116.肽分离：
117.所述方法优选进一步包括分离根据本文所述的任何相应实施例获得的肽(例如，使用本文所述与偶联有关的任何实施例、本文所述涉及从树脂裂解肽的任何实施例以及本文所述关于二硫键形成的任何实施例的组合)可以任选地使用本领域中已知的任何合适的技术。
118.在本文所述的任何实施例中的一些，肽的分离包括色谱法，例如制备型高效液相色谱法(hplc)的至少一个步骤(例如，任选地一个或两个步骤)。在示例性实施例中，c18柱用于实现色谱法(例如，hplc)。
119.在本文所述的任何实施例中的一些，肽的分离包括将肽(例如，在本文所描述的hplc的至少一个步骤中)以每千克柱不超过40克肽(按柱的树脂重量计)的浓度加载在反相色谱柱(例如，c18柱)上。
120.在本文所述的任何实施例中的一些，肽的分离包括将肽(例如，在本文所描述的hplc的至少一个步骤中)以每千克柱至少4克肽(按柱的树脂重量计)的浓度加载在反相色谱柱(例如，c18柱)上。在一些这样的实施例中，加载浓度在每千克柱树脂4克肽至40克肽的范围内。在一些实施例中，加载浓度在每千克柱树脂4克肽至30克肽的范围内。在一些实施例中，加载浓度在每千克柱树脂4克肽至25克肽的范围内。
121.在本文所述的任何实施例中的一些，肽的分离包括将肽(例如，在本文所述的hplc的至少一个步骤中)以每千克柱至少10克肽(按柱的树脂重量计)的浓度加载在反相色谱柱(例如c18柱)上。在一些这样的实施例中，加载浓度在每千克柱树脂10克肽至40克肽的范围内。在一些实施例中，加载浓度在每千克柱树脂10克肽至30克肽的范围内。在一些实施例中，加载浓度在每千克柱树脂10克肽至25克肽的范围内。
122.在本文所述的任何实施例中的一些，肽的分离包括将肽(例如，在本文所述的hplc的至少一个步骤中)以每千克柱至少20克肽(按柱的树脂重量计)的浓度加载在反相色谱柱(例如c18柱)上。在一些这样的实施例中，加载浓度在每千克柱树脂20克肽至40克肽的范围内。在一些实施例中，加载浓度在每千克柱树脂20克肽至30克肽的范围内。在一些实施例中，加载浓度在每千克柱树脂20克肽至25克肽的范围内。
123.例如，使用缓冲溶液(例如，根据本文描述的任何相应实施例，与乙腈梯度组合)洗脱加载在柱上的肽(根据本文描述的任何相应实施例)。缓冲溶液的ph任选地在1.5至3、任
选地2.0至2.5、任选地约2.25的范围内。在一些实施例中，使用磷酸三乙铵(triethylammonium phosphate)缓冲液从柱中洗脱肽，例如，以至少约0.01m、或至少约0.03m、或至少约0.1m的浓度。在示例性实施例中，磷酸三乙铵(triethylammonium phosphate)的浓度约为0.1m。
124.任选地用乙腈梯度进行hplc柱的洗脱。梯度任选地包括以每分钟0.1％乙腈至每分钟2％乙腈范围内的速率(任选地随时间变化)增加乙腈浓度，例如每5-6分钟增加约1％和/或每分钟增加约1％。可替换地或附加地，梯度任选地包括将乙腈的浓度(例如，从0％)增加到10％至40％、或20％至30％、或至约25％的范围内的浓度。
125.示例性梯度(例如，使用根据本文描述的任何相应实施例的磷酸三乙铵(triethylammonium phosphate)缓冲液)包含约8分钟内的0％乙腈，约5分钟内从0％至约5％的乙腈(例如，每分钟约1％的速率)，和约120分钟内约5％至约25％乙腈(例如，每分钟约0.17％的速率)。
126.在任何相应实施例的一些中，将洗脱的肽第二次加载到柱上(根据本文描述的任何相应实施例)并例如使用缓冲溶液(例如与乙腈梯度组合，根据至本文描述的任何相应实施例)洗脱。乙酸缓冲液(例如，乙酸/乙酸铵)可以任选地用于从柱中洗脱肽(例如，为了获得乙酸盐形式的肽)，例如，浓度为至少约5mm、或至少约20mm、或至少约35mm。在示例性实施例中，乙酸盐的浓度为约35mm。
127.用于第二洗脱的示例性梯度(例如，使用根据本文描述的相应实施例中的任一个的乙酸缓冲液)包含0％乙腈持续8分钟，以及在110分钟内从0％至22％乙腈(每分钟0.2％的比率)。
128.所述方法任选进一步包括对通过色谱法获得的肽进行冷冻干燥(例如，根据本文描述的任何相应实施例)。任选地通过使用冷冻干燥托盘(例如，如本文所示例的)而不是烧瓶来促进大规模制程中的冷冻干燥。
129.在与冷冻干燥有关的任何实施例中的一些，所述方法进一步包括在冷冻干燥后研磨肽。研磨可以任选地借助珠粒(例如聚丙烯珠粒)进行，例如使用罐式研磨机。
130.如本文所举例说明的，这种研磨可以有利地提高肽的表观密度(也称为“致密化”)和/或易于处理(例如，在包装过程中)，特别是当研磨前的冷冻干燥的肽具有“蓬松”稠度时。
131.附加的方法的实施例：
132.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述方法的特征在于以下特征中(i)-(vii)中的的至少一个、或至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个:
133.(i)使用二异丙基碳二亚胺(diisopropylcarbodiimide,dic)与氰基羟基亚氨基乙酸乙酯(ethyl cyanohydroxyiminoacetate)和/或n-羟基苯并三唑(n-hydroxybenzotriazole)的组合(例如根据本文所述的任何相应实施例)进行偶联；
134.(ii)通过使与树脂偶联的线性肽与包含三氟乙酸(trifluoroacetic acid,tfa)和清除剂的溶液接触来实现肽从树脂的裂解，所述清除剂为二硫苏糖醇(dithiothreitol,dtt)和/或二硫赤藓糖醇(dithioerythritol,dte)(例如，根据本文描述的任何相应实施例)；
135.(iii)所述方法还包括在裂解后沉淀游离的线性肽，而不在沉淀肽之前通过蒸发
浓缩游离的线性肽(例如，根据本文所述的任何相应实施例)；
136.(iv)所述氧化步骤包括使包含浓度至少5毫克/毫升的线性肽的水溶液与过氧化氢接触(例如，根据本文所述的任何相应实施例)；
137.(v)分离所述肽包括将所述环肽以每千克柱不超过40克环肽的浓度装载在反相色谱柱上，并从所述柱洗脱所述环肽(例如，根据本文所述的任何相应实施例)；
138.(vi)分离所述环肽包括冷冻干燥，并且所述方法进一步包括在冷冻干燥后研磨所述环肽(例如，根据本文所述的各个实施例中的任一个)；和/或
139.(vii)用于肽合成的树脂的取代度是至少0.3毫当量/克和/或树脂是rink ams树脂(例如，根据本文描述的任何相应实施例)。
140.在本文所述的任何实施例中的一些，所述方法至少包括上述特征(i)和(ii)(任选地与特征(iii)、(iv)、(v)、(vi)和/或(vii)中的至少一项组合),或至少包括上述特征(i)和(iii)(任选地与特征(iv)、(v)、(vi)和/或(vii)中的至少一项组合)，或至少包括上述特征(i)和(iv)(任选地与特征(v)、(vi)和/或(vii)中的至少一项组合)，或至少包括上述特征(i)和(v)(任选地与特征(vi)和/或(vii)中的至少一项组合)，或至少包括上述特征(i)和(vi)(可选地与特征(vii)组合)、或至少包括上述特性(i)与(vii)。
141.在本文所述的任何实施例中的一些，所述方法至少包括上述特征(ii)和(iii)(任选地与特征(iv)、(v)、(vi)和/或(vii)中的至少一项组合)，或至少包括上述特征(ii)和(iv)(任选地与特征(v)、(vi)和/或(vii)中的至少一项组合)，或至少包括上述特征(ii)和(v)(任选地与特征(vi)和/或(vii)中的至少一项组合)，或至少包括上述特征(ii)和(vi)(任选地与特征(vii)组合)，或至少包括上述特征(ii)和(vii)。
142.在本文所述的任何实施例中的一些，所述方法至少包括上述特征(iii)和(iv)(任选地与特征(v)、(vi)和/或(vii)中的至少一项组合)，或至少包括上述特征(ii)和(v)(任选地与特征(vi)和/或(vii)中的至少一项组合)，或至少包括上述特征(iii)和(vi)(任选地与特征(vii)组合)，或至少包括上述特征(iii)和(vii)。
143.在本文所述的任何实施例中的一些，所述方法至少包括上述特征(iv)和(v)(任选地与特征(vi)和/或(vii)中的至少之一项组合)，或至少包括上述特征(iv)和(vi)(任选地与特征(vii)组合)，或至少包括上述特征(iv)和(vii)。
144.在本文所述的任何实施例中的一些，所述方法包括至少上述特征(v)和(vi)(任选地与特征(vii)组合)，或至少包括上述特征(iv)和(vii)。
145.在本文所述的任何实施例中的一些，所述方法至少包括上述特征(vi)和(vii)。
146.肽的配方和用途：
147.根据本文所述的方法(根据任何相应的实施例)制备的肽可以任选地用于治疗可由肽治疗的病症。
148.根据本发明的一些实施例的一个目的，提供了根据本文所述的方法(根据任何相应的实施例)制备的肽在制备用于治疗可由肽治疗的病症的药物中的用途。
149.根据本发明的一些实施例的一个目的，提供了一种治疗可由肽治疗的病症的方法，所述方法包括将所述肽施用予需要的受试者，其中所述肽是根据本文描述的方法(根据任何相应的实施例)制备。
150.在本文描述的任何实施例中的一些(根据本文描述的任一目的)，所述肽是具有
seq id no:1的肽(或其类似物或衍生物)，并且所述治疗包括其中抑制cxcr4的任何治疗是有利。
151.预计在本技术到期的专利有效期内，将开发出许多相关的治疗方法，本文所用术语“病症”、“可由肽治疗的”和“抑制cxcr4的治疗是有利的”的范围旨在先验地包括所有这些新技术。
152.在本文所述的任何实施例中的一些(根据本文所述的任何目的)，肽是具有seq id no:1的肽(或其类似物或衍生物)，并且可由具有序列id no:1的肽(或其类似物或衍生物)治疗的病症是癌症或关节炎(例如，慢性类风湿性关节炎)，如美国专利号us 7423007所述(其内容通过引用并入本文中，特别是关于可由所述肽治疗的病症的内容)。
153.可通过具有seq id no:1(或其类似物或衍生物)的肽治疗(根据本文所述的任何方面)的病症的实例包括但不限于视网膜母细胞瘤和/或神经外胚层衍生的肿瘤，例如，专利合作条约申请公开wo 2012/095849中所述(其内容通过引用并入本文，特别是关于可由所述肽治疗的病症的内容)；大细胞肺癌，例如，专利合作条约申请公开wo 2013/160895中所述(其内容通过引用并入本文中，特别是关于可由所述肽治疗的病症的内容)；多发性骨髓瘤、微胶质瘤和/或神经胶质瘤，例如，专利合作条约申请公开wo 2008/075370中所述(其内容通过引用并入本文，特别是关于可由所述肽治疗的病症的内容)；乳腺癌症和/或胰腺癌症，例如，美国专利号us 7423007所述；血小板减少症，例如，专利合作条约申请公开wo 2010/146578中所述(其内容通过引用并入本文，特别是关于可由所述肽治疗的病症的内容)；骨髓抑制的风险，例如，专利合作条约申请公开wo 2008/075369中所述(其内容通过引用并入本文，特别是关于可由所述肽治疗的病症的内容)；以及hiv感染，例如，美国专利us 8435939中所述(其内容通过引用并入本文，特别是关于可由所述肽治疗的病症的内容)。
154.具有seq id no:1的肽的合适的类似物和衍生物描述于美国专利us 7423007和us 8435939以及专利合作条约申请公开wo 2008/075369、wo 2008/075370、wo 2010/146578、wo 2012/095849和wo 2013/160895(其各自的内容通过引用并入本文，特别是关于seq id no:1的类似物和衍生物的内容)。
155.本发明一些实施例的肽可以本身或以与合适的载体或赋形剂混合的药物组合物的形式施用于生物体。
156.如本文所用术语“药物组合物”是指本文所述的一种或多种活性成分与其他化学组分例如生理学上合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进化合物向生物体的施用。
157.如本文所用术语“活性成分”是指负责生物效应的肽。
158.在下文中，可以互换使用的术语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不会对生物体造成显着刺激并且不会消除所施用的化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。佐剂包含在这些术语之中。
159.如本文所用术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分的施用的惰性物质。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖类和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
160.用于药物配制和施用的技术可以在“《雷明顿的制药科学》，麦克出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州，最新版中找到，其通过引用并入本文。
161.合适的施用途径可以例如包括口服、直肠、经粘膜，尤其是经鼻、肠或肠胃外给药，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、心内，例如进入右心室或左心室腔，进入冠状动脉，静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
162.或者，可以以局部而非全身的方式施用药物组合物，例如，通过将药物组合物直接注射到患者的组织区域中。
163.本发明一些实施例的药物组合物可以通过本领域熟知的方法来制造，例如通过常规的混合、溶解、制粒、糖衣丸制作、磨细、乳化、包封、包埋或冷冻干燥方法。
164.因此，根据本发明的一些实施方案使用的药物组合物可以使用一种或多种包含赋形剂和助剂的生理学上可接受的载体以常规方式配制，其促进将活性成分加工成可药用的制剂。适当的制剂取决于所选择的给药途径。
165.对于注射，药物组合物的活性成分可以配制在水溶液中，优选配制在生理兼容的缓冲液中，例如hank’s溶液、ringer’s溶液或生理盐缓冲液。
166.对于经粘膜给药，在制剂中使用适合于待渗透屏障的渗透剂。这种渗透剂在本领域中通常是已知的。
167.对于口服给药，可以通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体组合来容易地配制药物组合物。此类载体使得药物组合物能够配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆剂、混悬剂等，以供患者口服摄取。
168.口服使用的药理学制剂可以使用固体赋形剂来制备，任选地研磨所得混合物，并加工颗粒混合物，如果需要的话添加合适的助剂，以获得片剂或糖衣丸核。合适的赋形剂特别是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(pvp)。如果需要，可以添加崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐例如藻酸钠。
169.糖衣丸芯具有合适的包衣。为此目的，可以使用浓糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将色素或颜料添加到片剂或糖衣丸包衣中以用于识别或表征活性化合物剂量的不同组合。
170.可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推入式胶囊以及由明胶和增塑剂例如甘油或山梨糖醇制成的软密封胶囊。推入式胶囊可含有与填充剂例如乳糖、粘合剂例如淀粉、润滑剂例如滑石粉或硬脂酸镁以及任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分可以溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以添加稳定剂。所有口服制剂的剂量应适合所选的给药途径。
171.对于口服给药，组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
172.对于通过鼻吸入给药，根据本发明的一些实施方案使用的活性成分以气溶胶喷雾形式从加压包或喷雾器方便地给药，并使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供输送计量的阀来确定。用于分配器的胶囊和盒，例如明胶，可以配制成含有所述化合物的粉末混合物和合适的粉末基质，例如乳糖或淀粉。
173.本文所述的药物组合物可以配制用于肠胃外给药，例如通过推注或连续输注。用
于注射的制剂可以以单位剂量形式存在，例如在安瓿或多剂量容器中，任选地添加防腐剂。所述组合物可以是油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以包含配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
174.用于胃肠外给药的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂的水溶液。此外，活性成分的悬浮液可以制备为合适的油性或水基注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。含水注射悬浮液可能含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加活性成分溶解度的试剂，以允许制备高度浓缩的溶液。
175.或者，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前用合适的载体例如无菌、无热原的水基溶液配制。
176.本发明的一些实施例的药物组合物也可以配制成直肠组合物，例如栓剂或滞留灌肠剂，使用例如常规栓剂基质，例如可可脂或其他甘油酯。
177.适合在本发明的一些实施例的上下文中使用的药物组合物包括其中含有有效实现预期目的的量的活性成分的组合物。更具体地，治疗有效量是指有效预防、减轻或改善病症(例如，癌症或关节炎，如本文讨论的)的症状或延长所治疗的受试者的存活的肽的量。
178.治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细公开内容。
179.对于本发明方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量可以最初从体外和细胞培养测定中估计。例如，可以在动物模型中配制剂量以达到期望的浓度或效价。此类信息可用于更准确地确定人体的有效剂量。
180.本文描述的活性成分的毒性和治疗功效可以通过标准制药程序在体外、在细胞培养物或实验动物中测定。从这些体外和细胞培养测定以及动物研究中获得的数据可用于配制用于人类的一系列剂量。剂量可以根据所使用的剂型和所使用的给药途径而变化。确切的制剂、给药途径和剂量可以由医生根据患者的病情进行选择。(例如，参见fingl等人，1975年，《治疗学的药理学基础》，第1章第1页)。
181.剂量和间隔可以单独调整以提供足以诱导或抑制生物效应的活性成分水平(最小有效浓度，mec)。每种制剂的mec会有所不同，但可以根据体外数据进行估计。达到mec所需的剂量取决于个体特征和给药途径。检测分析可用于确定血浆浓度。
182.根据待治疗疾病的严重程度和反应性，给药可以是单次或多次给药，疗程从几天到几周，或者直到治愈或达到疾病状态的减轻。
183.当然，待施用的组合物的量将取决于所治疗的受试者、疾病的严重程度、施用方式、处方医师的判断等。
184.如果需要，本发明一些实施例的组合物可以存在于包装或分配器装置中，例如fda批准的试剂盒，其可以含有一种或多种含有活性成分的单位剂型。例如，包装可以包括金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可以附有用于给药的说明书。包装或分配器还可以容纳与容器相关的指示，这个指示的形式由监管药品生产、使用或销售的政府机构规定，这个指示反映了上述机构对组合物形式或人类或兽医管理的批准。例如，此类通知可能是美国食品和药物管理局批准的处方药标签或批准的产品说明书。还可以制备包含在兼容的药物载体中配制的本发明制剂的组合物，将其置于适当的容器中，并标记用于治疗指定
病症，如上文进一步详述。
185.附加定义
186.如本文所用术语“约”是指
±
20％。在本文描述的任何相应实施例中的一些中，术语“约”是指
±
10％。
187.如本文所用的术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包括(includes)”、“包含(including)”、“具有(having)”及其词形变化是指“包括但不限于”。
188.如本文所用的术语“由......组成”是指“包括但不限于”。
189.如本文所用的术语“基本上由......组成”是指组合物、方法或结构可包括额外的成分、步骤及/或部件，但只有当额外的成分、步骤及/或部件实质上不改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本特征及新特征。
190.本文所使用的单数型式“一”、“一个”及“所述”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。例如，本文所使用术语“一化合物”或“至少一种化合物”可以包括多个化合物，包括其混合物。
191.在整个本技术中，本发明的各种实施例可以以一个范围的型式存在。应当理解，以一范围型式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制。因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所数范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。
192.每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。本文所使用的术语，第一指示数字及第二指示数字“之间的范围”及第一指示数字“到”第二指示数字“的范围”在本文中可互换，并指包括第一指示数字及第二指示数字，及其间的所有分数及整数。
193.本文所使用术语“治疗”是指抑制、预防或阻止病理(疾病、病症或病况)的发展和/或引起病理的减轻、缓解或消退。本领域技术人员将理解，各种方法和测定可用于评估病理的发展，并且类似地，各种方法和测定可用于评估病理的减轻、缓解或消退。
194.如本文所用术语“预防”是指防止疾病、病症或病况在可能处于疾病风险但尚未被诊断患有此疾病的受试者中发生。
195.如本文所用术语“受试者”包括哺乳动物，优选患有此病症的任何年龄的人类。优选地，这个术语涵盖有发生此病理的风险的个体。
196.如本文所用的术语「方法(method)」指的是用于完成一特定任务的方式(manner)，手段(means)，技术(technique)和程序(procedures)，包括但不限于，那些方式，手段，技术和程序，其是已知的，或是从已知的方式，手段，技术或程序很容易地被化学，药理，生物，生化及医学领域从业者所开发。
197.当提及特定序列表时，这种提及应理解为还包括基本上与其互补序列相对应的序列，包括由例如测序错误、克隆错误或导致碱基取代、碱基缺失或碱基添加的其他改变引起的微小序列变异，条件是这种变异的频率小于每50个核苷酸中的1个，或者，小于100个核苷酸中的1个，或者，小于200个核苷酸中的1个，或者，小于500个核苷酸中的1个，或者，小于1000个核苷酸中的1个，或者，小于5,000个核苷酸中的1个，或者，小于10,000个核苷酸中的1个。
198.应当理解的是，为了清楚起见，在单独的实施例的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施例的组合中提供。相反，为了简洁起见，在单个实施例的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供或者在本发明的任何其他描述的实施例中合适提供。在各种实施例的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施例的必要特征，除非所述实施例在没有那些组件的情况下不起作用。
199.如上所述以及如下面的权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施方式和目的将在以下实施例中寻求实验支持。
200.实施例：
201.现在参考以下实施例，其连同以上描述以非限制的方式说明了本发明的一些实施方式。
202.参考例1：
203.根据美国专利号us 7,423,007固相合成bl-8040：
204.使用美国专利号us 7,423,007中描述的以下程序来制备551毫克的环肽bl-8040(seq id no：1)。
205.通过固相合成制备环肽bl-8040，其中从c端氨基酸开始到n端氨基酸结束，重复固相合成反应步骤14次以构建整个肽。每种氨基酸添加分两步进行：第一步包括从添加到肽序列的最后一个氨基酸的n末端(或当添加第一个氨基酸时从树脂中)去除fmoc保护基，然后将连续的氨基酸连接到树脂上的肽的延长部分。在树脂上添加到肽中的最后一个残基是不含fmoc基团的4-氟苯甲酰基。
206.树脂：
207.所述树脂是2.94克fmoc-rink酰胺树脂，具有0.34毫摩尔/克取代度，即1毫摩尔。
208.fmoc保护基团的去除：
209.使用20％哌啶的二甲基甲酰胺(dmf)溶液从n端(添加到肽序列的最后一个氨基酸)或树脂去除fmoc保护基团。
210.氨基酸的附着：
211.使用二异丙基碳二亚胺(diisopropylcarbodiimide,dic)与dmf中的hobt(n-羟基苯并三唑)组合，将氨基酸以适当的氨基酸衍生物的形式偶联。cys、arg、tyr和lys(d-lys或l-lys)分别被保护为cys(trt)、arg(pbf)、tyr(t-bu)和lys(boc)(d-或l-)。在最后一步中，偶联4-氟苯甲酸(4-fluorobenzoic acid)而不是氨基酸。氨基酸(或4-氟苯甲酸)的使用量为2.5当量。
212.使用kaiser等人的茚三酮测试对缩合反应进行过程监控。[肛门生物化学1970,34:595-598]。
[0213]
裂解和脱保护：
[0214]
通过在间甲酚(100当量)和乙二硫醇(300当量)存在下，在25℃下用270毫升1m tmsbr-硫代苯甲醚/三氟乙酸(trifluoroacetic acid,tfa)混合物处理3小时，从树脂上裂解肽(1mmol)并去除保护基团。
[0215]
通过过滤分离树脂并用tfa(5毫升)洗涤两次。
[0216]
将滤液和洗涤溶液的混合物进行真空浓缩。
[0217]
然后将肽与300毫升水冷的无水乙醚混合，通过离心沉降和倾析分离所得沉淀物。
[0218]
将粗产物用冷乙醚洗涤，溶解在500毫升1n乙酸中，并用蒸馏水稀释至2.5l。
[0219]
氧化环化：
[0220]
粗直链肽的稀水溶液通过浓氨水调节至ph 7.5，并通过通风空气氧化进行氧化。
[0221]
制备型高效液相色谱：
[0222]
环化步骤完成后获得的溶液通过使用乙腈和水在制备型hplc c18柱(cosmosil
tm
5c18-ar-ii)上分离进行纯化并使用0.1n乙酸通过凝胶过滤色谱法(sephadex
tm
g-15)洗脱。
[0223]
获得了一种具有单峰的多肽，并将其冷冻干燥。
[0224]
纯度通过hplc确认。
[0225]
产量为551.5毫克(19.4％)。
[0226]
实施例1：
[0227]
bl-8040的大规模相合成：
[0228]
环状肽bl-8040是通过大规模(825mmol)固相合成制备的，其中固相合成反应步骤重复14次以构建整个肽，从c-端氨基酸开始，到n-端氨基酸结束。每个氨基酸的添加分两步进行：第一步包括从添加到肽序列的最后一个氨基酸的n-端(或当添加第一个氨基酸时从树脂)去除fmoc保护基团，然后将连续的氨基酸连接到树脂上的肽的延长部分。在树脂上添加到肽中的最后一个残基是不含fmoc基团的4-氟苯甲酰基。
[0229]
最终产量为468克(25％)
[0230]
树脂：
[0231]
所述树脂是取代度在0.3至0.6毫当量/克范围内的fmoc-rink ams树脂。
[0232]
fmoc保护基团的去除：
[0233]
使用20％哌啶的二甲基甲酰胺(dmf)溶液(每克初始树脂10毫升)从n-端(添加到肽序列的最后一个氨基酸)或树脂除去fmoc保护基团。在下一个氨基酸反应之前，用dmf洗涤除去了哌啶溶液，这通过测试洗涤液的ph值来证实。
[0234]
氨基酸的附着：
[0235]
使用二异丙基碳二亚胺(di isopropylcarbodi imide,dic)与hobt(n-羟基苯并三唑)组合作为活化剂，以合适的氨基酸衍生物的形式偶联氨基酸。cys、arg、tyr和lys(d-lys或l-lys)分别被保护为cys(trt)、arg(pbf)、tyr(t-bu)和lys(boc)(d-或l-)。在最后的步骤中，将4-氟苯甲酸(4-fluorobenzoic acid)而不是氨基酸偶联。氨基酸(或4-氟苯甲酸)、dic和hobt量的计算是基于两倍过量的取代和批量。
[0236]
在每个循环结束时使用茚三酮和四氯苯醌测试进行过程中监测，以评估偶联步骤。阴性测试结果表明不存在游离氨基(完全偶联)。如果测试呈阳性，表明存在未反应的氨基(偶联不完全)，则可以延长偶联反应，或者可以对受保护的氨基酸衍生物进行重新偶联。
[0237]
合成循环完成后，用dmf/异丙醇(1:1)溶液洗涤树脂-肽并用氮气干燥。
[0238]
裂解和脱保护：
[0239]
进行裂解以将肽分子从其支持性树脂上分离并去除保护基。用含有5％水的95％三氟乙酸(trifluoroacetic acid,tfa)和50毫克/毫升二硫赤藓糖醇(dithioerythritol,dte)作为清除剂(每克树脂10毫升基于tfa的裂解溶液)在环境温度下进行酸解反应，例如3.25-3.5小时。
[0240]
然后过滤树脂并用tfa冲洗两次，以完成肽的提取。
[0241]
在真空下，在旋转蒸发器中(约35℃)将肽溶液的体积减少至原始体积的约30-35％。
[0242]
然后用叔丁基甲基醚(tert-butyl methyl ether,mtbe)/己烷(60:40v/v)的冷冻混合物(-10
±
5℃)以每克树脂32毫升的体积沉淀肽。
[0243]
粗产物通过过滤分离，用mtbe洗涤，并在氮气流下在过滤器上干燥以除去大部分溶剂。
[0244]
然后将获得的粗(直链)肽溶解在90％乙酸中，将获得的溶液分布在冻干烧瓶中，外壳冷冻并在多支管冻干机上冷冻干燥。
[0245]
通过rp-hplc分析肽的纯度，并通过质谱分析确认其同一性。
[0246]
氧化环化：
[0247]
粗直链肽通过在0.1m碳酸氢铵(nh4hco3)溶液中用过氧化氢氧化环化，如下：
[0248]
将粗直链肽以10毫克/毫升的浓度溶解在0.1m nh4hco3中，并加入等体积的0.1m nh4hco3以将肽稀释至5毫克/毫升浓度。
[0249]
然后在25-30分钟的时间内向肽溶液中滴加1.5％过氧化氢的水溶液(过量5倍)。使用埃尔曼试验监测反应，以确认不存在游离巯基。
[0250]
反应完成后，通过加入纯tfa将反应混合物酸化至ph 2-3，所得溶液“原样”用于teap(磷酸三乙铵)纯化步骤。
[0251]
第一次制备型hplc柱(teap纯化)：
[0252]
环化步骤完成后获得的溶液在制备型rp-hplc c18柱上通过分离纯化，10μm，daisogel
tm
,装载约2.4l溶液，每千克树脂含有约11.7克粗制肽。
[0253]
使用0.1m磷酸三乙铵(triethylammonium phosphate,teap)缓冲液(ph 2.25)和乙腈(acn)梯度洗脱肽。梯度如下：0％乙腈8分钟，5分钟内从0％乙腈到5％乙腈(每分钟1％的速率)，120分钟内从5％乙腈到25％乙腈(每分钟0.17％的速率)。
[0254]
收集洗脱组分、取样并通过hplc进行测试，以确定哪些组分纯度足够(≥95％)，可以合并用于第二个色谱纯化步骤。第一次rp-hplc纯化中不符合纯度验收标准的亲水性和疏水性组分将被保留，并可进行重新处理，以最大限度地提高总产量。
[0255]
第二次制备型hplc柱(乙酸纯化)：
[0256]
合并从teap注射中获得的纯化组分，用水1:1稀释，并在10μm，daisogel
tm
c18柱上分离肽，以每千克树脂约2.7l的体积加载，并用35mm乙酸缓冲液和乙腈梯度洗脱。梯度如下：0％乙腈8分钟，110分钟内从0％乙腈到22％乙腈(每分钟0.2％的速率)。在加载肽后和开始洗脱梯度之前用四倍柱体积的0.1m乙酸铵洗涤柱以获得乙酸盐形式的肽。
[0257]
通过230nm处的紫外吸收来监测组分收集。收集洗脱组分、取样并通过hplc进行测试，以确定哪些组分纯度足以合并。仅合并符合过程控制标准的组分(hplc纯度≥98％，无未知杂质≥0.14％)。将每个色谱循环的汇集组分作为子批次冷冻干燥。第二次rp-hplc纯化中不符合纯度验收标准的亲水性和疏水性组分将被保留，并可进行重新处理以最大化总产率。
[0258]
湿式混样和冷冻干燥：
[0259]
所有符合纯化材料过程控制标准的子批次均在浓度约为50g/l的纯化水中进行重组。在冷冻干燥之前，将所得溶液在0.2μm pvdf过滤器上过滤。在1200毫升冷冻干燥烧瓶中进行冷冻，每个烧瓶中填充大约相等体积的100毫升，以获得每个烧瓶5克的纯化的肽，然后在冷凝器温度《-60℃和真空度《500毫托的干冰/ipa浴中进行外壳冷冻。进行65至85小时的冷冻。
[0260]
冷冻干燥后，取样品用于测量乙酸盐含量。如果不在规定的11％至15％范围内，可将原料药重新悬浮在水中并重复冷冻干燥。
[0261]
致密化：
[0262]
将冷冻干燥材料放置在带有聚丙烯“研磨”珠的聚乙烯瓶中，并将瓶子放置在罐式研磨机上20
±
5分钟。这种操作通过增加表观密度来消除“蓬松感”，并有助于在包装过程中轻松处理散装药物。
[0263]
包装及贮存：
[0264]
最终的原料药被包装在配有聚四氟乙烯线聚丙烯盖的iii型去热原琥珀色玻璃瓶中。包装在受控湿度环境(15％至30％相对湿度)下进行，以减少水分的吸收。将瓶子放置在铝层压袋中，并在两种包装材料之间放置干燥剂作为辅助容器。然后将bl-8040原料药储存在-20
±
5℃下。
[0265]
实施例2：
[0266]
改良的bl-8040大规模固相合成：
[0267]
环状肽bl-8040是通过大规模固相合成(例如，至少约500克产物)制备的，其中固相合成反应步骤重复14次以构建整个肽，从c-端氨基酸开始，到n-端氨基酸结束。每个氨基酸的添加分两步进行：第一步包括从添加到肽序列的最后一个氨基酸的n-端(或当添加第一个氨基酸时从树脂)去除fmoc保护基团，然后将连续的氨基酸连接到树脂上的肽的延长部分。要添加到树脂上的肽中的最后一个残基是4-氟苯甲酰基，其不包含fmoc基团。在图1中描述了根据一些实施例的固相合成的步骤。
[0268]
树脂：
[0269]
树脂是fmoc-rink ams树脂，其取代度在0.6至0.9毫当量/克的范围内(与如上所述的0.6毫当量/克或更小相反)。
[0270]
fmoc保护基团的去除：
[0271]
使用20％哌啶的二甲基甲酰胺(dmf)溶液(每克初始树脂约8毫升)从n-端(添加到肽序列的最后一个氨基酸)或树脂去除fmoc保护基团。在下一个氨基酸反应之前，用dmf洗涤可去除哌啶溶液，这一点通过测试洗涤液的ph值来确认。
[0272]
氨基酸的附着：
[0273]
使用二异丙基碳二亚胺(diisopropylcarbodiimide,dic)与氰基羟基亚氨基乙酸乙酯(与如上所述的hobt相反)组合作为活化剂，以合适的氨基酸衍生物的形式偶联氨基酸。cys、arg、tyr和lys(d-lys或l-lys)分别被保护为cys(trt)、arg(pbf)、tyr(t-bu)和lys(boc)(d-或l-)。在最后的步骤中，将4-氟苯甲酸(4-fluorobenzoic acid)而不是氨基酸偶联。氨基酸(或4-氟苯甲酸)、dic(diisopropylcarbodiimide)和氰基羟基亚氨基乙酸乙酯(ethyl cyanohydroxyiminoacetate)的量的计算是基于两倍过量的取代和批量大小。
[0274]
在每个循环结束时使用茚三酮和四氯苯醌测试进行过程中监测，以评估偶联步
骤。阴性测试结果表明不存在游离氨基(完全偶联)。如果测试为阳性，表明氨基的反应未完全(不完全偶联)，则可以延长偶联反应，可以进行受保护的氨基酸衍生物的再偶联，或者可以进行乙酰化(封端)，例如，在二异丙基乙胺(diea)存在下使用乙酸酐。
[0275]
合成循环完成后，用dmf/异丙醇(1∶1)溶液洗涤树脂-肽，并用氮气干燥。
[0276]
裂解和脱保护：
[0277]
进行裂解以使肽分子与其支持树脂分离并除去保护基团。酸解反应用95％三氟乙酸(trifluoroacetic acid,tfa)、5％水和50毫克/毫升清除剂(每克树脂10毫升基于tfa的裂解溶液)在环境温度下进行例如3.25-3.5小时。清除剂是二硫苏糖醇(dithiothreitol,dtt)，与实施例1中所述的二硫赤藓糖醇(dithioerythritol,dte)或对比例1中所述的乙二硫醇不同
[0278]
然后过滤树脂并用tfa冲洗两次，以完成肽的提取。
[0279]
(与实施例1相反，在此阶段没有进行肽溶液体积的减少。)
[0280]
然后用叔丁基甲基醚(tert-butyl methyl ether,mtbe)/己烷(60:49v/v)的冷冻混合物(-10
±
5℃)以每克树脂45毫升的体积(而不是实施例1中所述的每克32毫升)沉淀肽。
[0281]
通过过滤分离粗产物，用mtbe洗涤并在氮气流下在过滤器上干燥以除去大部分溶剂。
[0282]
然后将获得的粗制(直链)肽在真空下干燥或用乙酸溶解并冷冻干燥(例如，如实施例1中所述)。
[0283]
任选地通过rp-hplc分析肽的纯度和/或通过质谱分析分析肽的身份。
[0284]
氧化的环化：
[0285]
粗制线性肽通过在0.1m碳酸氢铵(nh4hco3)溶液中用1.5％过氧化氢氧化环化，肽浓度为10毫克/毫升。与实施例1相反，在25分钟至30分钟的时间内，肽没有进一步稀释至5毫克/毫升。使用埃尔曼测试监测反应以确认不存在游离的巯基。
[0286]
反应完成后，通过加入纯tfa将反应混合物酸化至ph 2-3，所得溶液“原样”用于teap(磷酸三乙基铵)纯化步骤。
[0287]
第一次制备型hplc柱(teap纯化)：
[0288]
环化步骤完成后获得的溶液在制备型rp-hplc c18柱上通过分离纯化，10μm，daisogel
tm
,装载约2.4l溶液，每千克树脂含有约20至约25克粗制肽(与实施例1中所述的约11.7克粗制肽/千克树脂相对)。
[0289]
使用0.1m磷酸三乙铵(triethylammonium phosphate,teap)缓冲液(ph 2.25)和乙腈(acn)梯度洗脱肽。
[0290]
收集洗脱组分、取样并通过hplc进行测试，以确定哪些组分纯度足够(≥95％)，可以合并用于第二次色谱纯化步骤。第一次rp-hplc纯化中不符合纯度验收标准的亲水性和疏水性组分将被保留，并可进行重新处理，以最大限度地提高总产量。
[0291]
第二次制备型hplc柱(乙酸纯化)：
[0292]
将从teap注射中获得的纯化组分合并，用水1:1稀释，并在10μm、daisogel
tm
c18柱上分离肽，并用35mm乙酸基缓冲液和乙腈梯度洗脱。在加载肽之后和开始洗脱梯度之前，用四倍柱体积的0.1m乙酸铵洗涤柱以获得醋酸盐形式的肽。
[0293]
通过230nm处的紫外吸收来监测组分收集。收集洗脱组分、取样并通过hplc进行测试，以确定哪些组分纯度足以合并。仅合并符合过程控制标准的组分(hplc纯度≥98％，无未知杂质≥0.14％)。将每个色谱循环的汇集组分作为子批次冷冻干燥。第二次rp-hplc纯化中不符合纯度验收标准的亲水性和疏水性组分将被保留，并可进行重新处理以最大化总产率。
[0294]
湿式混样和冷冻干燥：
[0295]
所有符合纯化材料过程控制标准的子批次均在浓度约为50g/l的纯化水中进行重组。在冷冻干燥之前，将所得溶液在0.2μm pvdf过滤器上过滤。
[0296]
在≤150毫托的真空下(例如，持续约89小时)，在冷冻干燥托盘(例如，每个托盘约1.0至约1.2升)中进行冷冻干燥，而不是如实施例1中所述的烧瓶。托盘的使用可以增强对过程的控制，促进更高的规模和/或减少过程控制。
[0297]
冷冻干燥后，取出样品用于测量乙酸盐含量。如果不在规定的11-15％范围内，则将原料药任选地重新悬浮在水中并重复冷冻干燥。
[0298]
致密化：
[0299]
根据实施例1中描述的程序，任选地对冷冻干燥材料进行致密化。
[0300]
包装及贮存：
[0301]
最终原料药任选地根据实施例1中描述的程序进行包装和/或储存。
[0302]
虽然本发明结合其具体实施例而被描述，显而易见的是，许多替代、修改及变化对于那些本领域的技术人员将是显而易见的。因此，其意在包括落入所附权利要求书的范围内的所有替代、修改及变化。
[0303]
申请人的用意是，本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都将通过引用整体并入说明书中，就好像每个单独的出版物、专利或专利申请在引用时都被具体地和单独地指出，其将通过引用并入本文一样。此外，所引用的或指出的任何参考文献不应被解释为承认这些参考文献可作为本发明的现有技术。本技术中标题部分在本文中用于使本说明书容易理解，而不应被解释为必要的限制。再者，本技术的任何优先权文件通过引用的方式全部并入本文。

技术特征：
1.一种大规模制备具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：(a)通过固相肽合成将多个氨基酸和4-氟苯甲酸顺序偶联至树脂，从而获得偶联至所述树脂的线性肽；(b)将所述线性肽从所述树脂上裂解，从而获得游离的线性肽；(c)将所述线性肽的半胱氨酸残基氧化，形成分子内二硫键，从而在溶液中获得具有seq id no:1的环肽；以及(d)分离具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐；其中：(i)所述偶联步骤是使用二异丙基碳二亚胺(dic)与氰基羟基亚氨基乙酸乙酯和/或n-羟基苯并三唑组合进行的；(ii)所述裂解步骤是通过使与所述树脂偶联的所述线性肽与包含三氟乙酸(tfa)和清除剂的溶液接触来实现的，所述清除剂选自二硫赤藓糖醇(dte)和二硫苏糖醇(dtt)所组成的群组中；(iii)所述方法进一步包括在所述裂解步骤后沉淀所述游离的线性肽，而不在所述沉淀前通过蒸发浓缩所述游离的线性肽；(iv)所述氧化步骤是通过使包含浓度为至少5毫克/毫升的所述线性肽的水溶液与过氧化氢接触来实现的；(v)所述分离步骤包括以不超过40克环肽/每千克柱的浓度将所述环肽加载到反相色谱柱上，并从所述柱洗脱所述环肽；(vi)所述分离具有seq id no:1的环肽的步骤包括冷冻干燥，并且所述方法进一步包括在所述冷冻干燥之后研磨所述环肽；和/或(vii)所述树脂的取代度为至少0.3毫当量/克和/或所述树脂为rink氨基甲基苯乙烯树脂。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述偶联步骤使用二异丙基碳二亚胺(dic)与氰基羟基亚氨基乙酸乙酯和/或n-羟基苯并三唑组合来实现。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述dic和所述氰基羟基亚氨基乙酸乙酯和/或n-羟基苯并三唑以约两倍的摩尔过量使用。4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于：包含所述清除剂的所述溶液中的所述清除剂的浓度在10毫克/毫升至500毫克/毫升的范围内。5.如权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于：所述裂解步骤是通过使与所述树脂偶联的所述线性肽与包含三氟乙酸(tfa)和清除剂的溶液接触来实现的，所述清除剂选自二硫赤藓糖醇(dte)和二硫苏糖醇(dtt)所组成的群组中。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述溶液中二硫苏糖醇的浓度约为50毫克/毫升。7.如权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于：所述方法进一步包括在所述裂解步骤后沉淀所述游离的线性肽，而不在所述沉淀前通过蒸发浓缩所述游离的线性肽。8.如权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于：所述沉淀通过加入叔丁基甲基醚(mtbe)和己烷的混合物来实现，所述混合物的体积为每克所述树脂约45毫升所述混合物。
9.如权利要求1至8任一项所述的方法，其特征在于：所述氧化步骤通过使所述线性肽与过氧化氢接触来实现。10.如权利要求9所述的封装构造，其特征在于：所述接触通过使包含浓度至少5毫克/毫升的所述线性肽的水溶液与过氧化氢接触来实现。11.如权利要求1至10任一项所述的方法，其特征在于：所述分离步骤包括以不超过40克环肽/每千克柱的浓度将所述环肽加载到反相色谱柱上，并从所述柱洗脱所述环肽。12.如权利要求1至11任一项所述的方法，其特征在于：所述柱为c18柱。13.如权利要求1至12任一项所述的方法，其特征在于：所述洗脱用磷酸三乙铵溶液进行。14.如权利要求1至13任一项所述的方法，其特征在于：所述分离具有seq id no:1的环肽的步骤包括冷冻干燥，并且所述方法进一步包括在所述冷冻干燥之后研磨所述环肽。15.如权利要求1至14任一项所述的方法，其特征在于：所述树脂的取代度为至少0.3毫当量/克和/或所述树脂为rink氨基甲基苯乙烯树脂。

技术总结
公开一种大规模制备环肽的方法，包括线性肽的固相肽合成并将其从树脂中裂解；氧化半胱氨酸残基以形成分子内二硫键；以及分离环肽，其中：(i)偶联步骤使用二异丙基碳二亚胺和氰基羟基亚氨基乙酸乙酯和/或N-羟基苯并三唑；(ii)裂解步骤包括使所述肽与包含TFA和二硫赤藓糖醇和/或二硫苏糖醇(DTT)的溶液接触；(iii)肽在裂解步骤后沉淀，而无需通过蒸发预先浓缩肽；(iv)氧化步骤包括使包含至少5毫克/毫升肽的水溶液与过氧化氢接触；(v)分离步骤包括将肽以高达40克/每千克柱的浓度加载到反相色谱柱上，并从柱上洗脱；(vi)分离步骤包括冷冻干燥，然后研磨肽；和/或(vii)树脂的取代度为至少0.3毫当量/克，和/或树脂为Rink氨基甲基苯乙烯树脂。甲基苯乙烯树脂。


技术研发人员：埃夫拉特
受保护的技术使用者：百欧林纳克斯有限公司
技术研发日：2021.12.29
技术公布日：2023/9/23