与ActRIIA、ActRIIB和Fn14结合的多特异性抗体的制作方法

与actriia、actriib和fn14结合的多特异性抗体
技术领域
1.本发明涉及与actriia、actriib和fn14结合的多特异性抗体。


背景技术：

2.已知激活素受体2a型(actriia)及激活素受体2b型(actriib)为肌肉生长抑制素及激活素a的受体。通过对actriia及actriib的配体刺激，而将smad2及smad3磷酸化。已知磷酸化smad2/3与smad4形成复合体并与各种转录因子结合而控制基因表达(tsuchida k et al.、endocr j.2008、vol.55、p.11-21)。已知在骨骼肌中，actriia及actriib参与蛋白分解(morvan f et al.、proc natl acad sci usa.2017、vol.114、p.12448-12453)。
3.成纤维细胞生长因子诱导14(fn14：fibroblast growth factor-inducible 14)(也称为tnfrsf12a)是肿瘤坏死因子受体超家族的一员。另外，已知fn14还是tnf样细胞凋亡弱诱导因子(tweak：tnf-like weak inducer of apoptosis)的受体。对于fn14而言，存在通过tweak的结合而引发的tweak依赖性活化和在tweak不存在下引发的tweak非依赖性活化。已知tweak依赖性或非依赖性的fn14活化均活化nf-κb信号转导通路，控制细胞的增殖、移动、分化及细胞凋亡以及与血管新生、组织损伤、再生有关的炎症(winkles ja、nat rev drug discov.2008、vol.7、p.411-425)。据报道，在骨骼肌中，fn14在病态时表达上调，并且与骨骼肌萎缩有关(非专利文献1)。据报道，到目前为止已经开发出若干与fn14结合的抗体。已知这些抗体大多对于由tweak刺激引起的fn14活化具有拮抗活性(以下也简称为“拮抗活性”)，同时具有在tweak不存在下活化fn14的激动活性(以下也简称为“激动活性”)。例如，报道了小鼠单克隆抗体crcbt-06-002在人恶性黑素瘤来源细胞株a375细胞中抑制由tweak刺激引起的il-8产生的拮抗活性。但是，同时还报道了具有在tweak不存在下诱导由a375细胞产生il-8的激动活性(专利文献1)。近年还获知了具有拮抗活性、不具有激动活性的与fn14结合的抗体(专利文献2)。
4.据报道，除了actriia、actriib及fn14以外，还有若干因子与骨骼肌萎缩有关(非专利文献2)。肿瘤坏死因子(tnf)α经由tnf受体而参与骨骼肌蛋白的分解。糖皮质激素也同样经由糖皮质激素受体而参与骨骼肌蛋白分解。另外，通过抑制参与骨骼肌的蛋白同化的胰岛素样生长因子，骨骼肌会萎缩。
5.包涵体肌炎(sibm：sporadic inclusion body myositis)为慢性进行性肌病。可观察到以股四头肌、手指/腕屈肌为中心的肌萎缩和肌力下降。作为特征性所见，可观察到伴有镶边空泡的肌纤维的表现、单核细胞对非坏死纤维/肌内鞘的侵入、包围。随着进展，可观察到步行功能下降、吞咽障碍，使生活质量(qol：quality of life)显著下降。但是，目前对于sibm尚未建立起治疗方法(非专利文献3)。
6.到目前为止，正在实施多种肌肉生长抑制素抑制剂或者actriia及actriib抑制剂的针对肌病的临床试验。其中，作为actriia及actriib抑制抗体的比玛卢单抗(bimagrumab)(专利文献3)为开发程度最高的药剂，以sibm为对象实施了iib期/iii期试验。比玛卢单抗在iib期/iii期试验中观察到除脂肪体重的增加，但是作为主要评价项目的
6分钟步行距离未观察到改善(非专利文献4)。
7.sibm患者的骨骼肌中，可确认到smad2的磷酸化的升高，因此暗示了actriia及actriib刺激参与了肌萎缩(非专利文献5)。而且，据报道，sibm患者的骨骼肌中fn14的表达上调(非专利文献6)。但是，迄今为止，以抑制actriia及actriib以及fn14这两种路径为靶标的sibm治疗药尚无报道。
8.现有技术文献
9.专利文献
10.专利文献1：国际公开第2013/026099号
11.专利文献2：国际公开第2020/090892号
12.专利文献3：国际公开第2017/081624号
13.非专利文献
14.非专利文献1：sato s et al.、front immunol.(瑞)2014、vol.5、article 18
15.非专利文献2：bonald p et al.、dis model mech.(英)2013、vol.6、p.25-39
16.非专利文献3：naddaf e et al.、neurotherapeutics.(美)2018、vol.15、p.995-1005
17.非专利文献4：hanna mg et al.、lancet neurol.(英)2019、vol.18、p.834-844
18.非专利文献5：amato aa et al.、neurology.(美)2014、vol.83、p.2239-2246
19.非专利文献6：morosetti r et al.、am j pathol.(美)2012、vol.180、p.1603-1613


技术实现要素：

20.发明所要解决的问题
21.本发明的课题在于提供多特异性抗体，其与actriia、actriib和fn14结合而抑制actriia、actriib和fn14介导的肌萎缩作用，从而被期待预防或治疗包涵体肌炎等肌萎缩性疾病。
22.用于解决问题的方法
23.本发明人在制作多特异性抗体时非常有创意地反复进行了研究，结果制作了与actriia及actriib结合的多肽，该多肽包含：含有由序列号2的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的cdr1、由序列号2的氨基酸编号50至65的氨基酸序列构成的cdr2、及由序列号2的氨基酸编号98至105的氨基酸序列构成的cdr3的第一vhh；以及含有由序列号2的氨基酸编号172至176的氨基酸序列构成的cdr1、由序列号2的氨基酸编号195至210的氨基酸序列构成的cdr2、及由序列号2的氨基酸编号243至251的氨基酸序列构成的cdr3的第二vhh(实施例2)。进而，制作了该多肽的c末端借助肽接头连接于与人fn14结合的抗体的重链可变区的n末端的多特异性抗体(实施例3～4)。发现该多特异性抗体与actriia、actriib和fn14结合(实施例5)，抑制由肌肉生长抑制素刺激引起的smad磷酸化(实施例6)，抑制由tweak刺激引起的nf-κb活化(实施例7)，以及在tweak不存在下不会诱导nf-κb活化(实施例7)。根据这些结果，提供上述与actriia、actriib和fn14结合的多特异性抗体，从而完成了本发明。
24.根据本发明，例如提供以下的发明。
25.1.26.一种多特异性抗体，其是与actriia、actriib和fn14结合的多特异性抗体，
27.所述多特异性抗体包含：
28.(a)与actriia和actriib结合的含有第一vhh和第二vhh的多肽、以及
29.(b)与fn14结合的抗体或其抗原结合片段，
30.第一vhh含有由序列号2的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的cdr1、由序列号2的氨基酸编号50至65的氨基酸序列构成的cdr2、由序列号2的氨基酸编号98至105的氨基酸序列构成的cdr3，
31.第二vhh含有由序列号2的氨基酸编号172至176的氨基酸序列构成的cdr1、由序列号2的氨基酸编号195至210的氨基酸序列构成的cdr2、由序列号2的氨基酸编号243至251的氨基酸序列构成的cdr3，
32.(a)的多肽的c末端借助肽接头连接于与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的n末端。
33.2.34.根据[1]所述的多特异性抗体，其中，第一vhh由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成，第二vhh由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成。
[0035]
[3]
[0036]
根据[1]或[2]所述的多特异性抗体，其中，第一vhh的c末端借助肽接头连接于第二vhh的n末端。
[0037]
[4]
[0038]
根据[1]所述的多特异性抗体，其中，(a)的多肽由序列号2的氨基酸编号1至262的氨基酸序列构成。
[0039]
[5]
[0040]
根据[1]～[4]中任一项所述的多特异性抗体，其中，与fn14结合的抗体或其抗原结合片段包含：含有由序列号2的氨基酸编号303至307的氨基酸序列构成的cdr1、由序列号2的氨基酸编号322至338的氨基酸序列构成的cdr2、由序列号2的氨基酸编号371至379的氨基酸序列构成的cdr3的重链可变区；以及含有由序列号4的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的cdr1、由序列号4的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的cdr2、由序列号4的氨基酸编号89至97的氨基酸序列构成的cdr3的轻链可变区。
[0041]
[6]
[0042]
根据[1]～[4]中任一项所述的多特异性抗体，其中，与fn14结合的抗体或其抗原结合片段含有由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号4的氨基酸编号1至108的氨基酸序列构成的轻链可变区。
[0043]
[7]
[0044]
根据[1]～[6]中任一项所述的多特异性抗体，其含有与fn14结合的抗体，该与fn14结合的抗体含有具有l234a、l235a、m252y、s254t和t256e的氨基酸突变的重链恒定区。
[0045]
[8]
[0046]
根据[1]～[4]中任一项所述的多特异性抗体，其含有与fn14结合的抗体，该与fn14结合的抗体包含：含有由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区以及具有l234a、l235a、m252y、s254t和t256e的氨基酸突变的重链恒定区的重链；以及
含有由序列号4的氨基酸编号1至108的氨基酸序列构成的轻链可变区和轻链恒定区的轻链。
[0047]
[9]
[0048]
根据[1]～[4]中任一项所述的多特异性抗体，其含有与fn14结合的抗体，该与fn14结合的抗体含有由序列号2的氨基酸编号273至720的氨基酸序列构成的重链和由序列号4的氨基酸序列构成的轻链。
[0049]
[10]
[0050]
根据[1]所述的多特异性抗体，其含有由序列号2的氨基酸序列构成的多肽和由序列号4的氨基酸序列构成的轻链。
[0051]
[11]
[0052]
根据[1]～[10]中任一项所述的多特异性抗体，其接受过翻译后修饰。
[0053]
[12]
[0054]
一种多核苷酸，其含有编码[1]～[4]中任一项所述的多特异性抗体的(a)的多肽的碱基序列。
[0055]
[13]
[0056]
一种多核苷酸，其含有编码[5]～[9]中任一项所述的多特异性抗体的与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列。
[0057]
[14]
[0058]
一种多核苷酸，其含有编码[5]～[9]中任一项所述的多特异性抗体的与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列。
[0059]
[15]
[0060]
一种多核苷酸，其含有编码含有[1]～[9]中任一项所述的多特异性抗体的(a)的多肽和与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的多肽的碱基序列。
[0061]
[16]
[0062]
一种多核苷酸，其含有编码[10]所述的多特异性抗体的多肽的碱基序列。
[0063]
[17]
[0064]
一种多核苷酸，其含有编码[10]所述的多特异性抗体的轻链的碱基序列。
[0065]
[18]
[0066]
一种表达载体，其含有[12]～[15]中任一项所述的多核苷酸。
[0067]
[19]
[0068]
一种表达载体，其含有[14]和/或[15]所述的多核苷酸。
[0069]
[20]
[0070]
一种表达载体，其含有[16]和/或[17]所述的多核苷酸。
[0071]
[21]
[0072]
一种宿主细胞，其用[18]～[20]中任一项所述的含有多核苷酸的表达载体进行了转化。
[0073]
[22]
[0074]
一种宿主细胞，其用含有以下的(i)和(ii)的多核苷酸的表达载体进行了转化、或者用含有以下的(i)的多核苷酸的表达载体和/或含有以下的(ii)的多核苷酸的表达载体
进行了转化：
[0075]
(i)含有编码含有[1]～[9]中任一项所述的多特异性抗体的与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的多肽的碱基序列的多核苷酸；
[0076]
(ii)含有编码含有[1]～[9]中任一项所述的多特异性抗体的(a)的多肽和与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的多肽的碱基序列的多核苷酸。
[0077]
[23]
[0078]
一种宿主细胞，其选自由以下的(a)～(d)组成的组：
[0079]
(a)用包含含有编码[10]所述的多特异性抗体的多肽的碱基序列的多核苷酸和含有编码[10]所述的多特异性抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0080]
(b)用包含含有编码[10]所述的多特异性抗体的多肽的碱基序列的多核苷酸的表达载体和包含含有编码[10]所述的多特异性抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0081]
(c)用包含含有编码[10]所述的多特异性抗体的多肽的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
[0082]
(d)用包含含有编码[10]所述的多特异性抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0083]
[24]
[0084]
一种生产与actriia、actriib和fn14结合的多特异性抗体的方法，其包括下述步骤：培养用含有以下的(i)和(ii)的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞或用含有以下的(i)的多核苷酸的表达载体和含有以下的(ii)的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞，使其表达多特异性抗体：
[0085]
(i)含有编码含有[1]～[9]中任一项所述的多特异性抗体的与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的多肽的碱基序列的多核苷酸；
[0086]
(ii)含有编码含有[1]～[9]中任一项所述的多特异性抗体的(a)的多肽和与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的多肽的碱基序列的多核苷酸。
[0087]
[25]
[0088]
一种生产与actriia、actriib和fn14结合的多特异性抗体的方法，其包括培养选自由以下的(e)～(g)组成的组中的宿主细胞并使其表达多特异性抗体的步骤：
[0089]
(e)用包含含有编码[10]所述的多特异性抗体的多肽的碱基序列的多核苷酸和含有编码[10]所述的多特异性抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0090]
(f)用包含含有编码[10]所述的多特异性抗体的多肽的碱基序列的多核苷酸的表达载体和包含含有编码[10]所述的多特异性抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
[0091]
(g)用包含含有编码[10]所述的多特异性抗体的多肽的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞和用包含含有编码[10]所述的多特异性抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0092]
[26]
[0093]
一种多特异性抗体，其通过[24]所述的方法生产而得到。
[0094]
[27]
[0095]
一种多特异性抗体，其通过[25]所述的方法生产而得到。
[0096]
[28]
[0097]
一种药物组合物，其含有[1]～[11]、[26]和[27]中任一项所述的多特异性抗体、以及药学上可接受的赋形剂。
[0098]
[29]
[0099]
根据[28]所述的药物组合物，其为包涵体肌炎的预防或治疗用药物组合物。
[0100]
[30]
[0101]
一种预防或治疗包涵体肌炎的方法，其包括给予治疗有效量的[1]～[11]、[26]和[27]中任一项所述的多特异性抗体的步骤。
[0102]
[31]
[0103]
一种[1]～[11]、[26]和[27]中任一项所述的多特异性抗体，其用于预防或治疗包涵体肌炎。
[0104]
[32]
[0105]
[1]～[11]、[26]和[27]中任一项所述的多特异性抗体在制造包涵体肌炎的预防或治疗用药物组合物中的应用。
[0106]
发明效果
[0107]
本发明的多特异性抗体抑制由肌肉生长抑制素刺激引起的smad磷酸化、进而抑制由tweak刺激引起的fn14活化且不显示激动活性，从而可期待具有肌萎缩抑制作用，可能能够作为包涵体肌炎等肌萎缩性疾病的预防或治疗剂使用。
附图说明
[0108]
图1(a)示出actriia/hek293细胞中的对肌肉生长抑制素诱发smad3磷酸化的抑制作用(actriia抑制作用)，(b)示出actriib/hek293细胞中的对肌肉生长抑制素诱发smad3磷酸化的抑制作用(actriib抑制作用)。纵轴表示对由肌肉生长抑制素100ng/ml引起的smad3磷酸化的抑制率(将肌肉生长抑制素100ng/ml刺激条件下的测定值设为0％抑制，将肌肉生长抑制素不存在下的测定值设为100％抑制)。横轴表示抗体浓度(nmol/l)的对数。需要说明的是，数据表示2次试验(各试验以重复方式实施)的平均值。
[0109]
图2示出nf-κb/hek293细胞中的、(a)对tweak诱发nf-κb活化的拮抗活性及(b)对fn14的激动活性。(a)中，纵轴表示对由tweak100ng/ml引起的nf-κb活化的抑制率(将tweak100ng/ml刺激条件下的测定值设为0％抑制，将tweak不存在下的测定值设为100％抑制)，(b)中，纵轴表示将tweak100ng/ml刺激条件下的测定值设为100％、将tweak不存在下的测定值设为0％时的、tweak不存在下的评价抗体所带来的相对活化率。横轴表示抗体浓度(nmol/l)的对数。需要说明的是，数据表示2次试验(各试验以重复方式实施)的平均值。
[0110]
图3示出类固醇诱发肌病模型小鼠的开始给予类固醇及受试物质后14天的(a)股四头肌重量及(b)握力。(a)中，纵轴表示摘出股四头肌的实测重量(g)，(b)中，纵轴表示四肢握力(kg)。需要说明的是，数据表示各组10例的平均值
±
sem。＊p＜0.05相对于正常组、#p＜0.05相对于溶剂给予组、+p＜0.05相对于75e9(mfc)组、++p＜0.05相对于stf8-1(mfc)
组、&p＜0.05相对于75e9(mfc)+stf8-1(mfc)组、均为学生t检验。
[0111]
图4示出类固醇诱发肌病模型猴子的开始给予类固醇及受试物质后4周的股部除脂肪重量。纵轴表示利用基于双能x射线吸收测定法的骨密度测定装置测定的股部的除脂肪重量(g)。需要说明的是，正常组的数据表示2例的实测值及平均值，类固醇诱发肌病模型各组的数据表示各组3例的实测值及平均值
±
sem。＊p＜0.05相对于溶剂给予组、学生t检验。
具体实施方式
[0112]
以下对本发明进行详述。
[0113]
抗体存在igg、igm、iga、igd及ige这5个类。抗体分子的基本结构在各类中是共通的，由分子量5万～7万的重链和2万～3万的轻链构成。重链通常由含有约440个氨基酸的多肽链构成，各类具有特征性结构，与igg、igm、iga、igd、ige对应地称为igγ、igμ、igα、igδ、igε。进而，igg存在igg1、igg2、igg3、igg4的亚类，各自所对应的重链称为igγ1、igγ2、igγ3、igγ4。轻链通常由含有约220个氨基酸的多肽链构成，已知有λ型和κ型这2种，分别称为igλ、igκ。就抗体分子的基本结构的肽构成而言，各自相同的2条重链及2条轻链通过二硫键(s-s键)及非共价键而结合，分子量为15万～19万。2种轻链可与任一重链成对。各个抗体分子一般由2条相同的轻链和2条相同的重链形成。
[0114]
链内s-s键在重链中有四个(igμ、igε中有五个)、在轻链中有两个，每100～110个氨基酸残基形成一个环，该立体结构在各环之间是类似的，被称为结构单元或结构域。重链、轻链同样，对于位于n末端的结构域，即使是来自同种动物的同一类(亚类)的标准品，氨基酸序列也不恒定，被称为可变区，各结构域分别被称为重链可变区(vh)及轻链可变区(vl)。比可变区更靠c末端侧的氨基酸序列在各类或亚类中几乎恒定，被称为恒定区(就恒定区的各结构域而言，重链恒定区的n末端侧起分别表示为ch1、ch2、ch3，轻链恒定区表示为cl)。
[0115]
抗体的抗原结合部位由vh及vl构成，结合特异性分别取决于该部位的氨基酸序列。另一方面，与补体、各种fc受体表达细胞的结合之类的生物学活性则反映了各类ig的恒定区的结构差异。已知轻链、重链的可变区的可变性基本局限于存在于任一链中的3个小的超变区，将这些区域称为互补决定区(cdr；从n末端侧起分别为cdr1、cdr2、cdr3)。可变区的剩余部分被称为框架区(fr)，相对恒定。
[0116]
包含抗体的vh及vl的各种抗原结合片段也具有抗原结合活性，作为这样的代表性的抗原结合片段，可列举单链可变区片段(scfv)、fab、fab’、f(ab’)2。scfv是由通过接头连接的vh和vl构成的一价的抗体片段，fab是由轻链以及包含vh、ch1结构域和铰链区的一部分的重链片段构成的一价的抗体片段。fab’是由轻链以及包含vh、ch1结构域和铰链区的一部分的重链片段构成的一价的抗体片段，该铰链区的部分包含构成重链间s-s键的半胱氨酸残基。f(ab’)2片段是2个fab’片段通过铰链区中的重链间s-s键进行键合而成的二价的抗体片段。
[0117]
作为骆驼科动物(双峰骆驼、单峰骆驼、无峰驼、羊驼)来源的抗体，已知仅由轻链和ch1结构域缺损的重链构成的抗体(重链抗体)。重链抗体的可变区被称为variable domain of heavy chain of heavy chain antibody(vhh)，重链抗体的抗原结合部位仅由
vhh构成。vhh含有3个cdr，与抗原的结合特异性取决于cdr的氨基酸序列。
[0118]
本说明书中的“vhh”也包括将fr的氨基酸序列的一部分、大部分或全部置换为来自人免疫球蛋白分子的氨基酸序列的其人源化型(人源化vhh)。作为人源化的方法，没有特别限制，可参照例如国际公开第2006/122825号、美国专利第5225539号、美国专利第6180370号等来制作人源化抗体。
[0119]
本说明书中，“多特异性抗体”是指与2种以上的不同抗原结合的抗体。
[0120]
本说明书中，“肽接头”是指用于连接可变区之间的、可通过基因工程学方法导入的由1个以上的任意的氨基酸序列构成的多肽。
[0121]
＜本发明的多特异性抗体＞
[0122]
本发明提供以下的多特异性抗体(以下也称为“本发明的多特异性抗体”)：
[0123]
一种多特异性抗体，其是与actriia、actriib和fn14结合的多特异性抗体，
[0124]
所述多特异性抗体包含：
[0125]
(a)与actriia及actriib结合的含有第一vhh及第二vhh的多肽、以及
[0126]
(b)与fn14结合的抗体或其抗原结合片段，
[0127]
第一vhh含有由序列号2的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的cdr1、由序列号2的氨基酸编号50至65的氨基酸序列构成的cdr2、由序列号2的氨基酸编号98至105的氨基酸序列构成的cdr3，
[0128]
第二vhh含有由序列号2的氨基酸编号172至176的氨基酸序列构成的cdr1、由序列号2的氨基酸编号195至210的氨基酸序列构成的cdr2、由序列号2的氨基酸编号243至251的氨基酸序列构成的cdr3，
[0129]
(a)的多肽的c末端借助肽接头连接于与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的n末端。
[0130]
本发明的多特异性抗体的1个实施方式中，第一vhh及第二vhh为人源化vhh。本发明的多特异性抗体的1个实施方式中，第一vhh由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成，第二vhh由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成。
[0131]
本发明的多特异性抗体的(a)的多肽中，可以是第一vhh的c末端连接于第二vhh的n末端，可以是第二vhh的c末端连接于第一vhh的n末端。本发明的多特异性抗体的1个实施方式中，第一vhh的c末端连接于第二vhh的n末端。
[0132]
本发明的多特异性抗体的(a)的多肽中，第一vhh和第二vhh可以直接连接或者可以借助肽接头连接。本发明的多特异性抗体的1个实施方式中，第一vhh和第二vhh借助肽接头连接。
[0133]
本发明的多特异性抗体的1个实施方式中，第一vhh的c末端借助肽接头连接于第二vhh的n末端。本发明的多特异性抗体的1个实施方式中，第一vhh及第二vhh为人源化vhh，第一vhh的c末端借助肽接头连接于第二vhh的n末端。
[0134]
本发明的多特异性抗体的1个实施方式中，第一vhh由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成，第二vhh由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成，第一vhh的c末端借助肽接头连接于第二vhh的n末端。
[0135]
连接第一vhh和第二vhh的肽接头的长度没有特别限定，本领域技术人员可以根据目的适当选择。1个实施方式中，用5个氨基酸以上的肽接头连接第一vhh和第二vhh，1个实
施方式中，用5个氨基酸以上且35个氨基酸以下、5个氨基酸以上且30个氨基酸以下、5个氨基酸以上且25个氨基酸以下、10个氨基酸以上且25个氨基酸以下或15个氨基酸以上且25个氨基酸以下的肽接头连接第一vhh和第二vhh。
[0136]
作为肽接头，可列举例如：
[0137]
ser
[0138]
gly
·
ser
[0139]
gly
·
gly
·
ser
[0140]
ser
·
gly
·
gly
[0141]
gly
·
gly
·
gly
·
ser(序列号5)
[0142]
ser
·
gly
·
gly
·
gly(序列号6)
[0143]
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser(序列号7)
[0144]
ser
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly(序列号8)
[0145]
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser(序列号9)
[0146]
ser
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly(序列号10)
[0147]
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser(序列号11)
[0148]
ser
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly(序列号12)
[0149]
(gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser(序列号7))n[0150]
(ser
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly(序列号8))n[0151]
[n为1以上的整数]等。1个实施方式中，连接第一vhh和第二vhh的肽接头为(gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser(序列号7))n[n为1～5的整数]，1个实施方式中，连接第一vhh和第二vhh的肽接头为(gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser)5(序列号2的氨基酸编号117至141)。
[0152]
本发明的多特异性抗体的1个实施方式中，第一vhh及第二vhh为人源化vhh，第一vhh的c末端借助肽接头连接于第二vhh的n末端，连接该第一vhh和第二vhh的肽接头为(gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser)5(序列号2的氨基酸编号117至141)。
[0153]
本发明的多特异性抗体的1个实施方式中，(a)的多肽由序列号2的氨基酸编号1至262的氨基酸序列构成。
[0154]
本发明的多特异性抗体的1个实施方式中，与fn14结合的抗体或其抗原结合片段包含：含有由序列号2的氨基酸编号303至307的氨基酸序列构成的cdr1、由序列号2的氨基酸编号322至338的氨基酸序列构成的cdr2、由序列号2的氨基酸编号371至379的氨基酸序列构成的cdr3的重链可变区；以及含有由序列号4的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的cdr1、由序列号4的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的cdr2、由序列号4的氨基酸编号89至97的氨基酸序列构成的cdr3的轻链可变区。
[0155]
本发明的多特异性抗体的1个实施方式中，与fn14结合的抗体或其抗原结合片段含有由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号4的氨基酸编号1至108的氨基酸序列构成的轻链可变区。
[0156]
本发明的多特异性抗体的1个实施方式中，与fn14结合的抗体的抗原结合片段是作为scfv、fab、fab’、或f(ab’)2的抗原结合片段。
[0157]
作为与fn14结合的抗体中的恒定区，可以选择任意亚类的恒定区(例如作为重链的igγ1、igγ2、igγ3或igγ4、作为轻链的igλ或igκ的恒定区)。1个实施方式中，与fn14结
合的抗体含有人igγ1恒定区作为重链恒定区、含有人igκ恒定区作为轻链恒定区。
[0158]
本说明书中使用的与抗体的恒定区中的氨基酸突变导入有关的残基编号基于eu索引(kabat et al.，1991，sequences of proteins of immunological interest，5th ed.，united states public health service，national institute of health，bethesda)。l234a是指人igγ1恒定区中的基于kabat等的eu索引的氨基酸第234位的亮氨酸被丙氨酸置换。l235a是指人igγ1恒定区中的基于kabat等的eu索引的氨基酸第235位的亮氨酸被丙氨酸置换。m252y是指人igγ1恒定区中的基于kabat等的eu索引的氨基酸第252位的甲硫氨酸被酪氨酸置换。s254t是指人igγ1恒定区中的基于kabat等的eu索引的氨基酸第254位的丝氨酸被苏氨酸置换。t256e是指人igγ1恒定区中的基于kabat等的eu索引的氨基酸第256位的苏氨酸被谷氨酸置换。
[0159]
1个实施方式中，本发明的多特异性抗体含有与fn14结合的抗体，该与fn14结合的抗体含有具有l234a、l235a、m252y、s254t及t256e的氨基酸突变的重链恒定区。作为具有l234a、l235a、m252y、s254t及t256e的氨基酸突变的恒定区，可列举例如由序列号2的氨基酸编号391至720的氨基酸序列构成的人igγ1恒定区。
[0160]
1个实施方式中，本发明的多特异性抗体含有与fn14结合的抗体，该与fn14结合的抗体包含：含有由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区及具有l234a、l235a、m252y、s254t及t256e的氨基酸突变的重链恒定区的重链；以及含有由序列号4的氨基酸编号1至108的氨基酸序列构成的轻链可变区及轻链恒定区的轻链。
[0161]
1个实施方式中，本发明的多特异性抗体含有与fn14结合的抗体，该与fn14结合的抗体含有由序列号2的氨基酸编号273至720所示的氨基酸序列构成的重链及由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链。
[0162]
本发明的多特异性抗体中，(a)的多肽的c末端借助肽接头连接于与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的n末端。所使用的肽接头的长度没有特别限定，本领域技术人员可以根据目的适当选择。1个实施方式中，用5个氨基酸以上的肽接头连接(a)的多肽和与fn14结合的抗体或其抗原结合片段，1个实施方式中，用5个氨基酸以上且35个氨基酸以下、5个氨基酸以上且30个氨基酸以下、5个氨基酸以上且25个氨基酸以下、5个氨基酸以上且20个氨基酸以下、或10个氨基酸以上且20个氨基酸以下的肽接头连接(a)的多肽和与fn14结合的抗体或其抗原结合片段。
[0163]
作为肽接头，可列举例如：
[0164]
ser
[0165]
gly
·
ser
[0166]
gly
·
gly
·
ser
[0167]
ser
·
gly
·
gly
[0168]
gly
·
gly
·
gly
·
ser(序列号5)
[0169]
ser
·
gly
·
gly
·
gly(序列号6)
[0170]
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser(序列号7)
[0171]
ser
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly(序列号8)
[0172]
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser(序列号9)
[0173]
ser
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly(序列号10)
[0174]
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser(序列号11)
[0175]
ser
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly(序列号12)
[0176]
(gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser(序列号7))n[0177]
(ser
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly(序列号8))n[0178]
[n为1以上的整数]等。1个实施方式中，连接(a)的多肽和与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的肽接头为(gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser(序列号7))n[n为1～5的整数]，1个实施方式中，连接(a)的多肽和与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的肽接头为(gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser)2(序列号2的氨基酸编号263至272)。
[0179]
本发明的多特异性抗体中，连接第一vhh和第二vhh的肽接头与连接(a)的多肽和与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的肽接头可以是相同的肽接头，也可以不同的肽接头。
[0180]
1个实施方式中，本发明的多特异性抗体为以下的多特异性抗体：
[0181]
一种多特异性抗体，其是与actriia、actriib和fn14结合的多特异性抗体，
[0182]
所述多特异性抗体包含：
[0183]
(a)与actriia及actriib结合的含有第一vhh及第二vhh的多肽、以及
[0184]
(b)与fn14结合的抗体或其抗原结合片段，
[0185]
第一vhh由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成，第二vhh由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成，
[0186]
与fn14结合的抗体或其抗原结合片段含有由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号4的氨基酸编号1至108的氨基酸序列构成的轻链可变区，
[0187]
(a)的多肽的c末端借助肽接头连接于与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的n末端。
[0188]
1个实施方式中，本发明的多特异性抗体为以下的多特异性抗体：
[0189]
一种多特异性抗体，其是与actriia、actriib和fn14结合的多特异性抗体，
[0190]
所述多特异性抗体包含：
[0191]
(a)与actriia及actriib结合的含有第一vhh及第二vhh的多肽、以及
[0192]
(b)与fn14结合的抗体，
[0193]
第一vhh由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成，第二vhh由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成，
[0194]
与fn14结合的抗体包含：含有由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区及具有l234a、l235a、m252y、s254t及t256e的氨基酸突变的重链恒定区的重链；以及含有由序列号4的氨基酸编号1至108的氨基酸序列构成的轻链可变区及轻链恒定区的轻链，
[0195]
(a)的多肽的c末端借助肽接头连接于与fn14结合的抗体的重链可变区的n末端。
[0196]
1个实施方式中，本发明的多特异性抗体为以下的多特异性抗体：
[0197]
一种多特异性抗体，其是与actriia、actriib和fn14结合的多特异性抗体，
[0198]
所述多特异性抗体包含：
[0199]
(a)与actriia及actriib结合的含有第一vhh及第二vhh的多肽、以及
[0200]
(b)与fn14结合的抗体，
[0201]
第一vhh由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成，第二vhh由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成，
[0202]
与fn14结合的抗体含有由序列号2的氨基酸编号273至720所示的氨基酸序列构成的重链及由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链，
[0203]
(a)的多肽的c末端借助肽接头连接于与fn14结合的抗体的重链可变区的n末端。
[0204]
1个实施方式中，本发明的多特异性抗体为以下的多特异性抗体：
[0205]
一种多特异性抗体，其是与actriia、actriib和fn14结合的多特异性抗体，
[0206]
所述多特异性抗体包含：
[0207]
(a)与actriia及actriib结合的含有第一vhh及第二vhh的多肽、以及
[0208]
(b)与fn14结合的抗体或其抗原结合片段，
[0209]
第一vhh由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成，第二vhh由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成，第一vhh的c末端借助肽接头连接于第二vhh的n末端，
[0210]
与fn14结合的抗体或其抗原结合片段含有由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号4的氨基酸编号1至108的氨基酸序列构成的轻链可变区，
[0211]
(a)的多肽的c末端借助肽接头连接于与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的n末端。
[0212]
1个实施方式中，本发明的多特异性抗体为以下的多特异性抗体：
[0213]
一种多特异性抗体，其是与actriia、actriib和fn14结合的多特异性抗体，
[0214]
所述多特异性抗体包含：
[0215]
(a)与actriia及actriib结合的含有第一vhh及第二vhh的多肽、以及
[0216]
(b)与fn14结合的抗体，
[0217]
第一vhh由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成，第二vhh由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成，第一vhh的c末端借助肽接头连接于第二vhh的n末端，
[0218]
与fn14结合的抗体包含：含有由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区及具有l234a、l235a、m252y、s254t及t256e的氨基酸突变的重链恒定区的重链；以及含有由序列号4的氨基酸编号1至108的氨基酸序列构成的轻链可变区及轻链恒定区的轻链，
[0219]
(a)的多肽的c末端借助肽接头连接于与fn14结合的抗体的重链可变区的n末端。
[0220]
1个实施方式中，本发明的多特异性抗体为以下的多特异性抗体：
[0221]
一种多特异性抗体，其是与actriia、actriib和fn14结合的多特异性抗体，
[0222]
所述多特异性抗体包含：
[0223]
(a)与actriia及actriib结合的含有第一vhh及第二vhh的多肽、以及
[0224]
(b)与fn14结合的抗体，
[0225]
第一vhh由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成，第二vhh由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成，第一vhh的c末端借助肽接头连接于第二vhh的n末
端，
[0226]
与fn14结合的抗体含有由序列号2的氨基酸编号273至720所示的氨基酸序列构成的重链及由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链，
[0227]
(a)的多肽的c末端借助肽接头连接于与fn14结合的抗体的重链可变区的n末端。
[0228]
1个实施方式中，本发明的多特异性抗体为以下的多特异性抗体：
[0229]
一种多特异性抗体，其是与actriia、actriib和fn14结合的多特异性抗体，
[0230]
所述多特异性抗体包含：
[0231]
(a)与actriia及actriib结合的含有第一vhh及第二vhh的多肽、以及
[0232]
(b)与fn14结合的抗体或其抗原结合片段，
[0233]
(a)的多肽由序列号2的氨基酸编号1至262的氨基酸序列构成，
[0234]
与fn14结合的抗体或其抗原结合片段含有由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号4的氨基酸编号1至108的氨基酸序列构成的轻链可变区，
[0235]
(a)的多肽的c末端借助肽接头连接于与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的n末端。
[0236]
1个实施方式中，本发明的多特异性抗体为以下的多特异性抗体：
[0237]
一种多特异性抗体，其是与actriia、actriib和fn14结合的多特异性抗体，
[0238]
所述多特异性抗体包含：
[0239]
(a)与actriia及actriib结合的含有第一vhh及第二vhh的多肽、以及
[0240]
(b)与fn14结合的抗体，
[0241]
(a)的多肽由序列号2的氨基酸编号1至262的氨基酸序列构成，
[0242]
与fn14结合的抗体包含：含有由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区及具有l234a、l235a、m252y、s254t及t256e的氨基酸突变的重链恒定区的重链；以及含有由序列号4的氨基酸编号1至108的氨基酸序列构成的轻链可变区及轻链恒定区的轻链，
[0243]
(a)的多肽的c末端借助肽接头连接于与fn14结合的抗体的重链可变区的n末端。
[0244]
1个实施方式中，本发明的多特异性抗体为以下的多特异性抗体：
[0245]
一种多特异性抗体，其是与actriia、actriib和fn14结合的多特异性抗体，
[0246]
所述多特异性抗体包含：
[0247]
(a)与actriia及actriib结合的含有第一vhh及第二vhh的多肽、以及
[0248]
(b)与fn14结合的抗体，
[0249]
(a)的多肽由序列号2的氨基酸编号1至262的氨基酸序列构成，
[0250]
与fn14结合的抗体含有由序列号2的氨基酸编号273至720所示的氨基酸序列构成的重链及由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链，
[0251]
(a)的多肽的c末端借助肽接头连接于与fn14结合的抗体的重链可变区的n末端。
[0252]
1个实施方式中，本发明的多特异性抗体为含有由序列号2的氨基酸序列构成的多肽及由序列号4的氨基酸序列构成的轻链的多特异性抗体。
[0253]
已知在用细胞表达抗体时抗体在翻译后会受到修饰。作为翻译后修饰的例子，可列举利用羧肽酶的重链c末端的赖氨酸缺失、重链及轻链n末端的谷氨酰胺或谷氨酸的利用
焦谷氨酰化向焦谷氨酸的修饰、糖基化、氧化、脱酰胺化、糖化等，已知在各种抗体中发生这样的翻译后修饰(liu h et al.、j pharm sci.2008、vol.97、p.2426-2447)。
[0254]
本发明的多特异性抗体中也包括接受过翻译后修饰的多特异性抗体。1个实施方式中，本发明的多特异性抗体为接受过上述本发明的多特异性抗体的(a)的多肽的n末端的焦谷氨酰化和/或与fn14结合的抗体的重链c末端的赖氨酸缺失的多特异性抗体。本领域中已知这样的基于n末端的焦谷氨酰化或c末端赖氨酸缺失的翻译后修饰不会影响抗体的活性(lyubarskaya y et al.、anal biochem.2006、vol.348、p.24-39)。
[0255]
本领域技术人员能够基于本发明制作本发明的多特异性抗体与其它肽、蛋白质的融合体以及结合有修饰剂的修饰体，这些形态的多特异性抗体也包含在本发明的抗体中。关于融合中使用的其它肽、蛋白质，只要融合体与actriia、actriib和fn14结合就没有特别限定，可列举例如人血清白蛋白、各种标签肽、人工螺旋基序肽、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽s转移酶、各种毒素、其它能够促进多聚体化的肽或蛋白质等。关于修饰中使用的修饰剂，只要修饰体与actriia、actriib和fn14结合就没有特别限定，可列举例如聚乙二醇、糖链、磷脂、脂质体、低分子化合物等。1个实施方式中，本发明的多特异性抗体的修饰中使用的修饰剂为聚乙二醇。
[0256]
本发明的多特异性抗体含有与actriia及actriib结合的第一vhh及第二vhh、以及与fn14结合的抗体或抗原结合片段。本发明的多特异性抗体与actriia、actriib和fn14结合。是否与actriia、actriib或fn14结合这一点可以使用公知的结合活性测定方法来确认。作为测定结合活性的方法，可列举例如酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，elisa)等方法。使用elisa时，例如，将actriia、actriib或fn14蛋白固相化于elisa板，对其添加受试抗体并进行反应后，使被辣根过氧化物酶(hrp)等酶标记的抗igg抗体等二抗进行反应。反应后进行洗涤，然后通过使用检测其活性的试剂(例如在hrp标记的情况下，为tmb microwell peroxidase substrate(kirkegaard&perry laboratories公司、50-76-03))等的活性测定来鉴定二抗的结合，由此可以确认受试抗体是否与actriia、actriib或fn14结合。作为具体的评价方法，可以使用后述实施例5中记载的方法。
[0257]
本发明的多特异性抗体还包括不仅与人actriia、人actriib及人fn14结合、还与其它动物(小鼠、猴子等)来源的actriia、actriib和fn14结合的多特异性抗体。1个实施方式中，本发明的多特异性抗体与人actriia、人actriib及人fn14结合。
[0258]
本发明的多特异性抗体可以由本领域技术人员基于本说明书中公开的本发明的多特异性抗体的序列信息使用该领域中公知的方法容易地制作。本发明的多特异性抗体没有特别限定，例如可以按照后述的＜生产本发明的多特异性抗体的方法＞中记载的方法来制造。
[0259]
本发明的多特异性抗体可以在根据需要进一步纯化后按照常规方法制剂化，用于包涵体肌炎等肌萎缩性疾病的预防或治疗中。
[0260]
＜本发明的多核苷酸＞
[0261]
本发明另外提供以下的(1)～(4)的多核苷酸(也称为“本发明的多核苷酸”)：
[0262]
(1)含有编码本发明的多特异性抗体的含有第一vhh及第二vhh的多肽((a)的多肽)的碱基序列的多核苷酸；
[0263]
(2)含有编码本发明的多特异性抗体的与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重
链可变区的碱基序列的多核苷酸；
[0264]
(3)含有编码本发明的多特异性抗体的与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸；
[0265]
(4)含有编码含有本发明的多特异性抗体的含有第一vhh及第二vhh的多肽((a)的多肽)和与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的多肽的碱基序列的多核苷酸。
[0266]
1个实施方式中，(1)的多核苷酸为含有编码含有由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成的第一vhh及由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成的第二vhh的多肽的碱基序列的多核苷酸。1个实施方式中，(1)的多核苷酸为含有编码下述多肽的碱基序列的多核苷酸，所述多肽含有由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成的第一vhh及由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成的第二vhh，第一vhh的c末端借助肽接头连接于第二vhh的n末端。1个实施方式中，(1)的多核苷酸为含有编码由序列号2的氨基酸编号1至262的氨基酸序列构成的多肽的碱基序列的多核苷酸。
[0267]
1个实施方式中，(2)的多核苷酸为含有编码由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区的碱基序列的多核苷酸。1个实施方式中，(2)的多核苷酸为含有编码含有由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区及具有l234a、l235a、m252y、s254t及t256e的氨基酸突变的重链恒定区的重链的碱基序列的多核苷酸。1个实施方式中，(2)的多核苷酸为含有编码由序列号2的氨基酸编号273至720所示的氨基酸序列构成的重链的碱基序列的多核苷酸。
[0268]
1个实施方式中，(3)的多核苷酸为含有编码由序列号4的氨基酸编号1至108的氨基酸序列构成的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸。1个实施方式中，(3)的多核苷酸为含有编码含有由序列号4的氨基酸编号1至108的氨基酸序列构成的轻链可变区及轻链恒定区的轻链的碱基序列的多核苷酸。1个实施方式中，(3)的多核苷酸为含有编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸。
[0269]
1个实施方式中，(4)的多核苷酸为含有编码下述多肽的碱基序列的多核苷酸，所述多肽包含：含有由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成的第一vhh及由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成的第二vhh的多肽；以及与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区。1个实施方式中，(4)的多核苷酸为含有编码下述多肽的碱基序列的多核苷酸，所述多肽包含：含有由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成的第一vhh及由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成的第二vhh、并且第一vhh的c末端借助肽接头连接于第二vhh的n末端的多肽；以及与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区。1个实施方式中，(4)的多核苷酸为含有编码含有由序列号2的氨基酸编号1至262的氨基酸序列构成的多肽及与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的多肽的碱基序列的多核苷酸。
[0270]
1个实施方式中，(4)的多核苷酸为含有编码下述多肽的碱基序列的多核苷酸，所述多肽包含：含有由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成的第一vhh及由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成的第二vhh的多肽；以及由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区。1个实施方式中，(4)的多核苷酸为含有编码下述多肽的碱基序列的多核苷酸，所述多肽包含：含有由序列号2的氨基酸编号1至116的氨
基酸序列构成的第一vhh及由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成的第二vhh、并且第一vhh的c末端借助肽接头连接于第二vhh的n末端的多肽；以及由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区。1个实施方式中，(4)的多核苷酸为含有编码含有由序列号2的氨基酸编号1至262的氨基酸序列构成的多肽及由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区的多肽的碱基序列的多核苷酸。
[0271]
1个实施方式中，(4)的多核苷酸为含有编码下述多肽的碱基序列的多核苷酸，所述多肽包含：含有由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成的第一vhh及由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成的第二vhh的多肽；以及含有由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区及具有l234a、l235a、m252y、s254t及t256e的氨基酸突变的重链恒定区的重链。1个实施方式中，(4)的多核苷酸为含有编码下述多肽的碱基序列的多核苷酸，所述多肽包含：含有由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成的第一vhh及由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成的第二vhh、并且第一vhh的c末端借助肽接头连接于第二vhh的n末端的多肽；以及含有由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区及具有l234a、l235a、m252y、s254t及t256e的氨基酸突变的重链恒定区的重链。1个实施方式中，(4)的多核苷酸为含有编码下述多肽的碱基序列的多核苷酸，所述多肽包含：由序列号2的氨基酸编号1至262的氨基酸序列构成的多肽；以及含有由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区及具有l234a、l235a、m252y、s254t及t256e的氨基酸突变的重链恒定区的重链。
[0272]
1个实施方式中，(4)的多核苷酸为含有编码下述多肽的碱基序列的多核苷酸，所述多肽包含：含有由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成的第一vhh及由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成的第二vhh的多肽；以及由序列号2的氨基酸编号273至720所示的氨基酸序列构成的重链。1个实施方式中，(4)的多核苷酸为含有编码下述多肽的碱基序列的多核苷酸，所述多肽包含：含有由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成的第一vhh及由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成的第二vhh、并且第一vhh的c末端借助肽接头连接于第二vhh的n末端的多肽；以及由序列号2的氨基酸编号273至720所示的氨基酸序列构成的重链。1个实施方式中，(4)的多核苷酸为含有编码含有由序列号2的氨基酸编号1至262的氨基酸序列构成的多肽及由序列号2的氨基酸编号273至720所示的氨基酸序列构成的重链的多肽的碱基序列的多核苷酸。
[0273]
1个实施方式中，(4)的多核苷酸为含有编码由序列号2的氨基酸序列构成的多肽的碱基序列的多核苷酸。
[0274]
本发明的多核苷酸可以由本领域技术人员基于其碱基序列、使用该领域中公知的方法容易地制作。例如，本发明的多核苷酸可利用该领域中公知的基因合成方法来合成。作为这样的基因合成方法，可使用国际公开第90/07861中记载的抗体基因的合成方法等本领域技术人员公知的各种方法。
[0275]
＜本发明的表达载体＞
[0276]
本发明另外提供含有本发明的多核苷酸的表达载体(也称为“本发明的表达载体”)。1个实施方式中，本发明的表达载体含有＜本发明的多核苷酸＞项中记载的(1)～(4)的多核苷酸中的任意一者。作为本发明的表达载体中所含的多核苷酸的具体实施方式的例子，可列举关于＜本发明的多核苷酸＞项中记载的(1)～(4)的多核苷酸而记载的例子。
[0277]
1个实施方式中，本发明的表达载体含有(i)含有编码本发明的多特异性抗体的与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸、和/或(ii)含有编码含有本发明的多特异性抗体的含有第一vhh及第二vhh的多肽((a)的多肽)和与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的多肽的碱基序列的多核苷酸。
[0278]
作为本发明的表达载体中所含的上述(i)及(ii)的多核苷酸的具体实施方式的例子，可列举关于＜本发明的多核苷酸＞项中记载的(3)及(4)的多核苷酸而记载的例子。
[0279]
1个实施方式中，作为本发明的表达载体，为包含含有编码由序列号2的氨基酸序列构成的多肽的碱基序列的多核苷酸的表达载体、包含含有编码由序列号4的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、或包含含有编码由序列号2的氨基酸序列构成的多肽的碱基序列的多核苷酸和含有编码由序列号4的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体。
[0280]
作为用于表达本发明的多核苷酸的表达载体，只要能够在真核细胞(例如动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母)和/或原核细胞(例如大肠杆菌)的各种宿主细胞中表达含有编码本发明的多特异性抗体的第一vhh的碱基序列的多核苷酸及含有编码该多特异性抗体的第二vhh的碱基序列的多核苷酸、并产生由这些编码的多肽，就没有特别限制。作为这样的表达载体，可列举例如质粒载体、病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒)等，可使用例如pee6.4、pee12.4等质粒载体。另外，还可以向ag-γ1、ag-κ(例如参照国际公开94/20632)等预先具有人ig恒定区基因的表达载体中导入可变区基因片段来表达抗体基因。
[0281]
本发明的表达载体可包含与本发明的多核苷酸以可发挥功能的方式连接的启动子。作为用于在动物细胞中表达本发明的多核苷酸的启动子，可列举例如cmv、rsv、sv40等病毒来源启动子、肌动蛋白启动子、ef(elongation factor，延伸因子)1α启动子、热休克启动子等。作为用于在细菌(例如埃希氏菌属菌)中表达的启动子，可列举例如trp启动子、lac启动子、λpl启动子、tac启动子等。另外，作为用于在酵母中表达的启动子，可列举例如gal1启动子、gal10启动子、ph05启动子、pgk启动子、gap启动子、adh启动子等。
[0282]
在使用动物细胞、昆虫细胞或酵母作为宿主细胞时，本发明的表达载体可包含起始密码子及终止密码子。这种情况下，本发明的表达载体可以包含增强子序列、编码本发明的多特异性抗体或其重链可变区或轻链可变区的基因的5’侧及3’侧的非翻译区域、分泌信号序列、剪接部、多聚腺苷酸化位点或可复制单元等。在使用大肠杆菌作为宿主细胞时，本发明的表达载体可包含起始密码子、终止密码子、终止区、及可复制单元。这种情况下，本发明的表达载体可根据目的而包含通常使用的选择标记(例如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因)。
[0283]
＜本发明的进行了转化的宿主细胞＞
[0284]
本发明另外提供用本发明的表达载体进行了转化的宿主细胞(也称为“本发明的进行了转化的宿主细胞”)。1个实施方式中，本发明的宿主细胞为用含有＜本发明的多核苷酸＞项中记载的(1)～(4)的多核苷酸中的任意一者的表达载体进行了转化的宿主细胞。作为该表达载体中所含的多核苷酸的具体实施方式的例子，可列举关于＜本发明的多核苷酸＞项中记载的(1)～(4)的多核苷酸而记载的例子。
[0285]
1个实施方式中，本发明的宿主细胞为用含有以下的(i)和/或(ii)的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、或者用含有以下的(i)的多核苷酸的表达载体和/或含有
以下的(ii)的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞：
[0286]
(i)含有编码本发明的多特异性抗体的与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸；
[0287]
(ii)含有编码含有本发明的多特异性抗体的含有第一vhh及第二vhh的多肽((a)的多肽)和与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的多肽的碱基序列的多核苷酸。
[0288]
作为本发明的宿主细胞中的上述(i)及(ii)的多核苷酸的具体实施方式的例子，可列举关于＜本发明的多核苷酸＞项中记载的(3)及(4)的多核苷酸而记载的例子。
[0289]
1个实施方式中，本发明的进行了转化的宿主细胞包括选自由以下的(a)～(d)组成的组中的、用本发明的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0290]
(a)用包含含有编码由序列号2的氨基酸序列构成的多肽的碱基序列的多核苷酸及含有编码由序列号4的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0291]
(b)用包含含有编码由序列号2的氨基酸序列构成的多肽的碱基序列的多核苷酸的表达载体及包含含有编码由序列号4的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0292]
(c)用包含含有编码由序列号2的氨基酸序列构成的多肽的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
[0293]
(d)用包含含有编码由序列号4的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0294]
作为所转化的宿主细胞，只要适合于所使用的表达载体、能够用该表达载体进行转化并表达多特异性抗体就没有特别限定。作为所转化的宿主细胞，可列举例如本发明的技术领域中通常使用的天然细胞或人工建立的细胞等各种细胞(例如动物细胞(例如cho-k1sv细胞)、昆虫细胞(例如sf9)、细菌(埃希氏菌属菌等)、酵母(酵母属、毕赤酵母属等)等)，可以使用例如cho细胞(cho-k1sv细胞、cho-dg44细胞等)、293细胞、ns0细胞等培养细胞。
[0295]
对宿主细胞进行转化的方法没有特别限定，可以使用例如磷酸钙法、电穿孔法等。
[0296]
＜生产本发明的多特异性抗体的方法＞
[0297]
本发明另外提供生产与actriia、actriib和fn14结合的多特异性抗体的方法((也称为“本发明的生产方法”))，其包括培养本发明的进行了转化的宿主细胞、使其表达多特异性抗体的步骤。
[0298]
1个实施方式中，本发明的生产方法包括培养用含有以下的(i)及(ii)的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞或用含有以下的(i)的多核苷酸的表达载体和含有以下的(ii)的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、使其产生多特异性抗体的步骤：
[0299]
(i)含有编码含有本发明的多特异性抗体的与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的多肽的碱基序列的多核苷酸；
[0300]
(ii)含有编码含有本发明的多特异性抗体的含有第一vhh及第二vhh的多肽((a)的多肽)和与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的多肽的碱基序列的多核苷酸。
[0301]
作为本发明的生产方法中的上述(i)及(ii)的多核苷酸的具体实施方式的例子，可列举关于＜本发明的多核苷酸＞项中记载的(3)及(4)的多核苷酸而记载的例子。
[0302]
1个实施方式中，本发明的生产方法包括：生产与actriia、actriib和fn14结合的多特异性抗体的方法，其包括培养选自由以下的(a)～(c)组成的组中的宿主细胞、使其表达多特异性抗体的步骤。
[0303]
(a)用包含含有编码由序列号2的氨基酸序列构成的多肽的碱基序列的多核苷酸及含有编码由序列号4的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0304]
(b)用包含含有编码由序列号2的氨基酸序列构成的多肽的碱基序列的多核苷酸的表达载体及包含含有编码由序列号4的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0305]
(c)用包含含有编码由序列号2的氨基酸序列构成的多肽的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、及用包含含有编码由序列号4的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0306]
进行了转化的宿主细胞的培养可以通过公知的方法进行。培养条件、例如温度、培养基的ph以及培养时间可适宜选择。在宿主细胞为动物细胞时，作为培养基，可以使用例如含有约5～20％的胎牛血清的mem培养基(eagle h、science.1959、vol.130、p.432-437)、dmem培养基(dulbecco r and freeman g、virology.1959、vol.8、p.396-397)、rpmi1640培养基(moore ge et al.、jama.1967、vol.199、p.519-524)、199培养基(morgan jf et al.、proc soc exp biol med.1950、vol.73、p.1-8)等。培养基的ph优选为约6～8，培养可根据需要在通气、搅拌的同时通常在约30～40℃进行约15～336小时。在宿主细胞为昆虫细胞时，作为培养基，可以使用例如含有胎牛血清的grace’s培养基(smith ge et al.、proc natl acad sci usa.1985、vol.82、p.8404-8408)等。培养基的ph优选为约5～8，培养可以根据需要在通气、搅拌的同时通常在约20～40℃进行约15～100小时。在宿主细胞为大肠杆菌或酵母时，作为培养基，例如含有营养源的液体培养基是适当的。营养培养基优选含有进行了转化的宿主细胞生长所需的碳源、无机氮源或有机氮源。作为碳源，可列举例如葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等，作为无机氮源或有机氮源，可列举例如铵盐类、硝酸盐类、氨基酸、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉提取物、大豆粕、马铃薯提取液等。可以根据期望包含其它营养素(例如无机盐(例如氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁)、维生素类等)、抗生素(例如四环素、新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素等)。培养基的ph优选为约5～8。在宿主细胞为大肠杆菌时，作为优选的培养基，可使用例如lb培养基、m9培养基(mol.clo.、cold spring harbor laboratory、2001、vol.3、a2.2)等。培养可根据需要在进行通气、搅拌的同时通常在约14～39℃进行约3～24小时。在宿主细胞为酵母时，作为培养基，可以使用例如burkholder最低培养基(bostian ka et al.、proc natl acad sci usa.1980、vol.77、p.4504-4508)等。培养可根据需要在进行通气、搅拌的同时通常在约20～35℃进行约14～144小时。通过上述培养，能够表达本发明的多特异性抗体。
[0307]
生产本发明的多特异性抗体的方法中，除了对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达多特异性抗体的步骤以外，可以还包括从该进行了转化的宿主细胞和/或培养上清中回收多特异性抗体、并进行例如分离或纯化的步骤。作为分离或纯化方法，可列
举例如：盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的方法；透析、超滤、凝胶过滤等利用分子量差异的方法；离子交换色谱、羟基磷灰石色谱等利用电荷的方法；亲和色谱等利用特异亲和性的方法；反相高效液相色谱等利用疏水性差异的方法；等电点电泳等利用等电点差异的方法等。例如，培养上清中蓄积的抗体可以通过各种色谱、例如使用蛋白a柱或蛋白g柱的柱色谱来纯化。
[0308]
本发明的多特异性抗体还包括通过生产本发明的多特异性抗体的方法生产的多特异性抗体。
[0309]
＜本发明的药物组合物＞
[0310]
本发明另外提供含有本发明的多特异性抗体及药学上可接受的赋形剂的药物组合物(也称为“本发明的药物组合物”)。本发明的药物组合物可以使用该领域中通常使用的赋形剂、即药剂用赋形剂、药剂用载体等按照通常使用的方法来制备。作为这些药物组合物的剂型的例子，可列举例如注射剂、点滴用剂等非经口剂，可以通过静脉内给药、皮下给药、及肌肉内给药等来给药。在制剂化时，可以在药学上可接受的范围内使用与这些剂型相应的赋形剂、载体、添加剂等。
[0311]
本发明的药物组合物可以含有通过本发明的多特异性抗体的翻译后修饰而产生的多特异性抗体。本发明的药物组合物可以含有多种本发明的多特异性抗体。1个实施方式中，本发明的药物组合物含有本发明的多特异性抗体、及通过该多特异性抗体的翻译后修饰而产生的多特异性抗体。1个实施方式中，通过翻译后修饰而产生的多特异性抗体包含(a)的多肽的n末端的焦谷氨酰化和/或与fn14结合的抗体(也简称为“fn14抗体”)的重链c末端赖氨酸的缺失。
[0312]
1个实施方式中，本发明的药物组合物含有本发明的多特异性抗体和/或通过该多特异性抗体的翻译后修饰而产生的多特异性抗体，本发明的多特异性抗体含有以下：
[0313]
(a)含有由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成的第一vhh及由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成的第二vhh的多肽；以及
[0314]
(b)含有由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号4的氨基酸编号1至108的氨基酸序列构成的轻链可变区的与fn14结合的抗体或其抗原结合片段。
[0315]
1个实施方式中，该翻译后修饰为(a)的多肽的n末端的焦谷氨酰化和/或fn14抗体的重链c末端赖氨酸的缺失。
[0316]
1个实施方式中，本发明的药物组合物含有本发明的多特异性抗体和/或通过该多特异性抗体的翻译后修饰而产生的多特异性抗体，本发明的多特异性抗体含有以下：
[0317]
(a)含有由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成的第一vhh及由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成的第二vhh的多肽；以及
[0318]
(b)包含含有由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区及具有l234a、l235a、m252y、s254t及t256e的氨基酸突变的重链恒定区的重链、以及含有由序列号4的氨基酸编号1至108的氨基酸序列构成的轻链可变区及轻链恒定区的轻链的与fn14结合的抗体。
[0319]
1个实施方式中，该翻译后修饰为(a)的多肽的n末端的焦谷氨酰化和/或fn14抗体的重链c末端赖氨酸的缺失。
[0320]
1个实施方式中，本发明的药物组合物含有本发明的多特异性抗体和/或通过该多特异性抗体的翻译后修饰而产生的多特异性抗体，本发明的多特异性抗体含有以下：
[0321]
(a)含有由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成的第一vhh及由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成的第二vhh的多肽；以及
[0322]
(b)含有由序列号2的氨基酸编号273至720所示的氨基酸序列构成的重链及由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的与fn14结合的抗体。
[0323]
1个实施方式中，该翻译后修饰为(a)的多肽的n末端的焦谷氨酰化和/或fn14抗体的重链c末端赖氨酸的缺失。
[0324]
1个实施方式中，本发明的药物组合物含有本发明的多特异性抗体和/或通过该多特异性抗体的翻译后修饰而产生的多特异性抗体，本发明的多特异性抗体含有以下：
[0325]
(a)含有由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成的第一vhh及由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成的第二vhh、并且第一vhh的c末端借助肽接头连接于第二vhh的n末端的多肽；以及
[0326]
(b)含有由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号4的氨基酸编号1至108的氨基酸序列构成的轻链可变区的与fn14结合的抗体或其抗原结合片段。
[0327]
1个实施方式中，该翻译后修饰为(a)的多肽的n末端的焦谷氨酰化和/或fn14抗体的重链c末端赖氨酸的缺失。
[0328]
1个实施方式中，本发明的药物组合物含有本发明的多特异性抗体和/或通过该多特异性抗体的翻译后修饰而产生的多特异性抗体，本发明的多特异性抗体含有以下：
[0329]
(a)含有由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成的第一vhh及由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成的第二vhh、并且第一vhh的c末端借助肽接头连接于第二vhh的n末端的多肽；以及
[0330]
(b)包含含有由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区及具有l234a、l235a、m252y、s254t及t256e的氨基酸突变的重链恒定区的重链、以及含有由序列号4的氨基酸编号1至108的氨基酸序列构成的轻链可变区及轻链恒定区的轻链的与fn14结合的抗体。
[0331]
1个实施方式中，该翻译后修饰为(a)的多肽的n末端的焦谷氨酰化和/或fn14抗体的重链c末端赖氨酸的缺失。
[0332]
1个实施方式中，本发明的药物组合物含有本发明的多特异性抗体和/或通过该多特异性抗体的翻译后修饰而产生的多特异性抗体，本发明的多特异性抗体含有以下：
[0333]
(a)含有由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成的第一vhh及由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成的第二vhh、并且第一vhh的c末端借助肽接头连接于第二vhh的n末端的多肽；以及
[0334]
(b)含有由序列号2的氨基酸编号273至720所示的氨基酸序列构成的重链及由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的与fn14结合的抗体。
[0335]
1个实施方式中，该翻译后修饰为(a)的多肽的n末端的焦谷氨酰化和/或fn14抗体的重链c末端赖氨酸的缺失。
[0336]
1个实施方式中，本发明的药物组合物含有本发明的多特异性抗体和/或通过该多
特异性抗体的翻译后修饰而产生的多特异性抗体，本发明的多特异性抗体含有以下：
[0337]
(a)由序列号2的氨基酸编号1至262的氨基酸序列构成的多肽；以及
[0338]
(b)包含含有由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区及由序列号4的氨基酸编号1至108的氨基酸序列构成的轻链可变区的与fn14结合的抗体、或含有其抗原结合片段的与fn14结合的抗体。
[0339]
1个实施方式中，该翻译后修饰为(a)的多肽的n末端的焦谷氨酰化和/或fn14抗体的重链c末端赖氨酸的缺失。
[0340]
1个实施方式中，本发明的药物组合物含有本发明的多特异性抗体和/或通过该多特异性抗体的翻译后修饰而产生的多特异性抗体，本发明的多特异性抗体含有以下：
[0341]
(a)由序列号2的氨基酸编号1至262的氨基酸序列构成的多肽；以及
[0342]
(b)包含含有由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区及具有l234a、l235a、m252y、s254t及t256e的氨基酸突变的重链恒定区的重链、以及含有由序列号4的氨基酸编号1至108的氨基酸序列构成的轻链可变区及轻链恒定区的轻链的与fn14结合的抗体。
[0343]
1个实施方式中，该翻译后修饰为(a)的多肽的n末端的焦谷氨酰化和/或fn14抗体的重链c末端赖氨酸的缺失。
[0344]
1个实施方式中，本发明的药物组合物含有本发明的多特异性抗体和/或通过该多特异性抗体的翻译后修饰而产生的多特异性抗体，本发明的多特异性抗体含有以下：
[0345]
(a)由序列号2的氨基酸编号1至262的氨基酸序列构成的多肽；以及
[0346]
(b)含有由序列号2的氨基酸编号273至720所示的氨基酸序列构成的重链及由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的与fn14结合的抗体。
[0347]
1个实施方式中，该翻译后修饰为(a)的多肽的n末端的焦谷氨酰化和/或fn14抗体的重链c末端赖氨酸的缺失。
[0348]
1个实施方式中，本发明的药物组合物为含有本发明的多特异性抗体和/或通过该多特异性抗体的翻译后修饰而产生的多特异性抗体、并且本发明的多特异性抗体含有由序列号2的氨基酸序列构成的多肽及由序列号4的氨基酸序列构成的轻链的药物组合物。1个实施方式中，该翻译后修饰为(a)的多肽的n末端的焦谷氨酰化和/或fn14抗体的重链c末端赖氨酸的缺失。
[0349]
1个实施方式中，本发明的药物组合物含有下述(c)～(f)中的1种或2种以上的多特异性抗体：
[0350]
(c)含有由序列号2的氨基酸编号1至719的氨基酸序列构成的多肽及由序列号4所示的氨基酸序列构成的多肽的多特异性抗体。
[0351]
(d)含有由序列号2所示的氨基酸序列构成、并且序列号2的氨基酸编号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的多肽及由序列号4所示的氨基酸序列构成的多肽的多特异性抗体。
[0352]
(e)含有由序列号2的氨基酸编号1至719的氨基酸序列构成、并且序列号2的氨基酸编号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的多肽及由序列号4所示的氨基酸序列构成的多肽的多特异性抗体。
[0353]
(f)含有由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽及由序列号4所示的氨基酸序列构成的多肽的多特异性抗体。
[0354]
在上述制剂化时，本发明的多特异性抗体的添加量根据患者的症状程度、年龄、所使用的制剂的剂型、或抗体的结合效价等而不同，例如，可以以给药时为0.001mg/kg～100mg/kg左右的方式来使用。
[0355]
本发明的药物组合物可以作为actriia、actriib、fn14参与疾病形成的疾病、例如包涵体肌炎的预防或治疗剂来使用。
[0356]
本发明包括包涵体肌炎的预防或治疗用药物组合物，其含有本发明的多特异性抗体。另外，本发明包括预防或治疗包涵体肌炎的方法，其包括给予治疗有效量的本发明的多特异性抗体的步骤。另外，本发明包括本发明的多特异性抗体，其用于包涵体肌炎的预防或治疗。进而，本发明包括本发明的多特异性抗体在制造包涵体肌炎的预防或治疗用药物组合物中的应用。
[0357]
＜与actriia及actriib结合的多肽＞
[0358]
本发明另外提供以下的与actriia及actriib结合的多肽(以下也称为“本发明的actriia/b结合肽”)：
[0359]
一种与actriia及actriib结合的多肽，其含有与actriia及actriib结合的第一vhh及第二vhh，
[0360]
第一vhh含有由序列号2的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的cdr1、由序列号2的氨基酸编号50至65的氨基酸序列构成的cdr2、及由序列号2的氨基酸编号98至105的氨基酸序列构成的cdr3，
[0361]
第二vhh含有由序列号2的氨基酸编号172至176的氨基酸序列构成的cdr1、由序列号2的氨基酸编号195至210的氨基酸序列构成的cdr2、及由序列号2的氨基酸编号243至251的氨基酸序列构成的cdr3。
[0362]
1个实施方式中，第一vhh及第二vhh为人源化vhh。1个实施方式中，第一vhh由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成，第二vhh由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成。
[0363]
本发明的actriia/b结合肽中，可以是第一vhh的c末端连接于第二vhh的n末端，可以是第二vhh的c末端连接于第一vhh的n末端。1个实施方式中，第一vhh的c末端连接于第二vhh的n末端。
[0364]
本发明的actriia/b结合肽中，第一vhh和第二vhh可以直接连接或借助肽接头连接。1个实施方式中，第一vhh和第二vhh借助肽接头连接。
[0365]
1个实施方式中，第一vhh的c末端借助肽接头连接于第二vhh的n末端。1个实施方式中，第一vhh及第二vhh为人源化vhh，第一vhh的c末端借助肽接头连接于第二vhh的n末端。
[0366]
1个实施方式中，第一vhh由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成，第二vhh由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成，第一vhh的c末端借助肽接头连接于第二vhh的n末端。
[0367]
连接第一vhh和第二vhh的肽接头没有特别限定，例如，可以使用在＜本发明的多特异性抗体＞项中作为连接第一vhh和第二vhh的肽接头例示的肽接头。1个实施方式中，连接第一vhh和第二vhh的肽接头为(gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser(序列号7))n[n为1～5的整数]，1个实施方式中，连接第一vhh和第二vhh的肽接头为(gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser)5(序
列号2的氨基酸编号117至141)。
[0368]
1个实施方式中，第一vhh及第二vhh为人源化vhh，第一vhh的c末端借助肽接头连接于第二vhh的n末端，连接该第一vhh和第二vhh的肽接头为(gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser)5(序列号2的氨基酸编号117至141)。1个实施方式中，本发明的actriia/b结合肽由序列号2的氨基酸编号1至262的氨基酸序列构成。
[0369]
本领域技术人员能够基于本发明制作本发明的actriia/b结合肽与其它肽、蛋白质的融合体，还能够制作结合有修饰剂的修饰体，这些融合体及修饰体也包含在本发明的actriia/b结合肽中。关于融合中使用的其它肽、蛋白质，只要融合体与actriia、actriib结合就没有特别限定，可列举例如抗体或其抗原结合片段、人血清白蛋白、各种标签肽、人工螺旋基序肽、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽s转移酶、各种毒素、其它能够促进多聚体化的肽或蛋白质等。关于修饰中使用的修饰剂，只要修饰体与actriia及actriib结合就没有特别限定，可列举例如聚乙二醇、糖链、磷脂、脂质体、低分子化合物等。1个实施方式中，本发明的actriia/b结合肽的修饰中使用的修饰剂为聚乙二醇。
[0370]
本发明的actriia/b结合肽、其融合体及修饰体可以由本领域技术人员基于vhh的序列信息、融合体中使用的其它肽或蛋白质(例如抗体)、修饰体中使用的修饰剂的信息使用该领域中公知的方法容易地制作。本发明的actriia/b结合肽没有特别限定，例如可以按照＜生产本发明的多特异性抗体的方法＞项中记载的方法来生产。
[0371]
为了进一步理解本发明而在此提供要参照的特定实施例，但是这些是作为例示目的，不是对本发明进行限定。
[0372]
实施例
[0373]
关于使用市售的试剂盒或试剂等的部分，只要没有特别声明则按照所附的规程来进行实验。
[0374]
实施例1：单个vhh的获得
[0375]
本发明人为了获得以actriib的胞外结构域为靶标的vhh，将含有actriib的胞外结构域的蛋白多次免疫于羊驼。免疫结束后从羊驼采血，从该采血样品中分离羊驼外周血淋巴细胞，按照公知的方法(miyazaki n et al.、j biochem.2015、vol.158、p.205-215)构建噬菌体展示用免疫文库。使用噬菌体展示的针对actriib的胞外结构域的生物淘选将含有actriib的胞外结构域的蛋白质、向cho细胞中导入人actriib基因(ncbi登录号：nm＿001106.4)而成的稳定表达细胞株(以下称为actriib/cho细胞)、及向hek293细胞中导入人actriib基因(ncbi登录号：nm＿001106.4)而成的稳定表达细胞株(以下称为actriib/hek293细胞)为对象而实施。以含有actriib的胞外结构域的蛋白质为对象的生物淘选按照公知的方法(miyazaki n et al.、j biochem.2015、vol.158、p.205-215)来进行。以actriib/cho细胞或actriib/hek293细胞为对象的生物淘选中，将噬菌体文库和各细胞混合并重复进行数次洗涤操作后，用酸从噬菌体
·
细胞复合体中溶出结合于细胞的噬菌体，通过上述方法获得结合于各细胞的噬菌体。通过上述生物淘选，获得多种与actriib的胞外结构域结合的噬菌体。从获得的噬菌体中克隆编码vhh的基因，进行序列确定。
[0376]
实施例2：串联vhh的获得
[0377]
构建多个将编码实施例1中得到的vhh中的任意2个vhh的基因用编码由gly及ser构成的各种长度的肽接头(也称为gs接头)的基因连接而成的噬菌体展示用文库，与实施例
1同样地实施生物淘选。使用噬菌体展示的、针对actriia的胞外结构域及actriib的胞外结构域的生物淘选以含有actriia的胞外结构域的蛋白质、含有actriib的胞外结构域的蛋白质、向cho细胞中导入人actriia基因(ncbi登录号：ab529011.1)而成的稳定表达细胞株(以下称为actriia/cho细胞)、及actriib/cho细胞为对象而实施。对多个串联vhh进行评价的结果是，获得了与actriia的胞外结构域及actriib的胞外结构域结合的串联vhh。将该串联vhh称为75e9。然后仿照国际公开第2006/122825号等的例子将串联vhh75e9人源化。将其称为人源化串联vhh75e9。
[0378]
将人源化串联vhh75e9的氨基酸序列示于序列号2的氨基酸编号1至262。序列号2的氨基酸编号1至262所示的人源化串联vhh75e9中的第一vhh由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成，第二vhh由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成。
[0379]
人源化串联vhh75e9的第一vhh的cdr1、cdr2、cdr3分别由序列号2的氨基酸编号31至35、50至65、98至105的氨基酸序列构成。人源化串联vhh75e9的第二vhh的cdr1、cdr2、cdr3分别由序列号2的氨基酸编号172至176、195至210、243至251的氨基酸序列构成。
[0380]
实施例3：抗fn14抗体的获得
[0381]
本发明人为了获得在细胞表面上表达的与人fn14结合的抗体，按照国际公开第2020/090892号的实施例1进行了含有人fn14的胞外结构域的人fc融合蛋白的制备及向jurkat细胞中导入人fn14基因(ncbi登录号：nm＿016639)而成的稳定表达细胞株(以下称为fn14/jurkat细胞)的构建，用于免疫及筛选。然后，使用人单克隆抗体开发技术“velocimmune”(velocimmune antibody technology：regeneron公司(美国专利6596541号))小鼠制作抗体。通过velocimmune技术得到的抗体为具有人抗体的可变区和小鼠抗体的恒定区的抗体。对于velocimmune小鼠，与引发免疫反应的佐剂一起交替地免疫从上述所制作的含有人fn14的胞外结构域的人fc融合蛋白中使用fabricator(sigma公司、77661)切割除去人fc区而得的人fn14蛋白和fn14/jurkat细胞。将按照常规方法从经免疫的小鼠的淋巴结采集的淋巴细胞与小鼠来源骨髓瘤细胞sp2/0-ag14(atcc：crl-1581)进行细胞融合而制作杂交瘤，进行单克隆化。筛选产生与人fn14和fn14/jurkat细胞结合、且抑制由tweak刺激引起的nf-κb活化(以下，后述实施例中，称为tweak诱发nf-κb活化)的抗体的杂交瘤。然后从该杂交瘤中克隆编码抗体的重链及轻链的基因，进行序列确定。在编码该抗体的重链可变区的基因(相当于编码序列号2的氨基酸编号273至390的碱基序列)的3’侧连接编码具有l234a及l235a的氨基酸突变的人igγ1恒定区的基因(序列号13)、在5’侧连接编码信号序列的基因(whittle n et al.、protein eng.1987、vol.1、p.499-505)后插入到gs载体pee6.4(lonza公司)中。将序列号13翻译为氨基酸而得的序列为序列号14。另外，在编码该抗体的轻链可变区的基因(相当于编码序列号4的氨基酸编号1至108的碱基序列)的5’侧连接编码上述信号序列的基因，并且在3’侧连接编码人κ链的恒定区的基因(相当于编码序列号4的氨基酸编号109至214的碱基序列)，插入到gs载体pee12.4(lonza公司)中。由这些gs载体构建插入了重链和轻链这两个基因的double-gene载体(以下称为dgv)。从转染了该载体的cho-k1sv细胞的培养上清中，按照常规方法纯化抗体。将该抗体称为stf8-1。
[0382]
stf8-1的重链可变区由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成。stf8-1的轻链可变区由序列号4的氨基酸编号1至108的氨基酸序列构成。
[0383]
stf8-1的重链可变区的cdr1、cdr2、cdr3分别由序列号2的氨基酸编号303至307、
322至338、371至379的氨基酸序列构成。stf8-1的轻链可变区的cdr1、cdr2、cdr3分别由序列号4的氨基酸编号24至34、50至56、89至97的氨基酸序列构成。
[0384]
实施例4：人源化75e9stf8-1的制作
[0385]
将依次连接有编码上述信号序列的基因、编码人源化串联vhh75e9的基因(相当于序列号1的碱基编号1至786)、编码gs接头的基因(相当于序列号1的碱基编号787至816)、编码stf8-1的重链可变区的基因(相当于序列号1的碱基编号817至1170)、及编码具有l234a及l235a的氨基酸突变和m252y、s254t、t256e的氨基酸突变(国际公开第2002/060919号)的人igγ1恒定区的基因(相当于序列号1的碱基编号1171至2160)而成的多核苷酸插入到gs载体pee6.4(lonza公司)中。另外，在stf8-1的轻链可变区基因(相当于序列号3的碱基编号1至324)的5’侧连接编码上述信号序列的基因，并且在3’侧连接编码人κ链的恒定区的基因(相当于序列号3的碱基编号325至642)，插入到gs载体pee12.4(lonza公司)中。由这些gs载体构建插入了重链和轻链这两个基因的dgv。从转染了该载体的cho-k1sv细胞的培养上清中，按照常规方法纯化抗体。将该抗体称为人源化75e9stf8-1。
[0386]
实施例5：人源化75e9stf8-1的结合活性评价
[0387]
评价实施例4中得到的人源化75e9stf8-1与actriia、actriib和fn14的结合活性。将actriia-his(lifespan biosciences公司、ls-g39063)、actriib-his(lifespan biosciences公司、ls-g38834)及实施例3中制备的含有人fn14的胞外结构域的人fc融合蛋白分别用磷酸缓冲生理盐水(pbs)稀释为1μg/ml，向maxisorp384孔透明平板(nunc公司、464718)的每1孔中分别添加15μl，在4℃下孵育一晚而固相化。次日除去固相液，用添加了0.05％ tween20的tris缓冲生理盐水(tbs-t)洗涤。然后每1孔中添加50μl含有20％ blocking one(
ナカライテスク
公司、03953-95)的pbs，在室温下静置1小时后，用tbs-t洗涤。将人源化75e9stf8-1从最高浓度30μg/ml起通过12等级、4倍公比的稀释而制作稀释系列，每1孔中添加20μl。作为稀释液，使用含有5％blocking one的tbs-t。在室温下孵育1小时后，用tbs-t洗涤。每1孔中添加20μl作为检测抗体的、用稀释液(含有5％blocking one的tbs-t)稀释4000倍的山羊抗人κ,小鼠ads-hrp(goat anti-human kappa，mouse ads-hrp)(southernbiotech、2061-05)。在室温下孵育1.5小时后，用tbs-t洗涤，添加tmb+substrate-chromogen(dako社、s159985)并静置后，加入1m硫酸使反应停止，用infinite(注册商标)200pro(tecan)测定450nm的吸光度。
[0388]
其结果是，人源化75e9stf8-1与actriia-his(ec50＝5.03ng/ml)、actriib-his(ec50＝9.24ng/ml)及含有人fn14的胞外结构域的人fc融合蛋白(ec50＝23.3ng/ml)均结合。
[0389]
实施例6：人源化75e9stf8-1的smad磷酸化抑制评价
[0390]
评价人源化75e9stf8-1对actriia及actriib的肌肉生长抑制素诱发smad3磷酸化的抑制作用。评价中使用向hek293细胞中导入人actriia基因(ncbi登录号：ab529011.1)而成的稳定表达细胞株(以下称为actriia/hek293细胞)及actriib/hek293细胞。
[0391]
将actriia/hek293细胞或actriib/hek293细胞用含有10％胎牛血清的dmem(sigma公司、d6429)悬浮至2
×
105个细胞/ml，以每1孔100μl播种于i型胶原包被的96孔板(iwaki公司、4860-010)。将其在设定为37℃、5％co2的co2培养箱中培养一晚。培养后将培养基离心除去，向各孔中分别加入80μl含有2％胎牛血清的dmem。将其在与上述相同条件的
co2培养箱中培养一晚。对于人源化75e9stf8-1，在actriia/hek293细胞中，从最高浓度300nmol/l起通过8等级、约3倍公比的稀释而制作稀释系列并向每1孔中添加10μl，在actriib/hek293细胞中，从最高浓度1000nmol/l起通过8等级、约3倍公比的稀释而制作稀释系列并向每1孔中添加10μl。另外，作为对照，添加相同稀释系列的比玛卢单抗。作为稀释溶剂，使用含有2％胎牛血清的dmem。将其在与上述相同条件的co2培养箱中培养15分钟。之后向每1孔中以最终浓度100ng/ml的方式添加10μl用含有2％胎牛血清的dmem制备的肌肉生长抑制素(peprotech公司、120-00)。在与上述相同条件的co2培养箱中培养1小时后，将培养基离心除去，向每1孔中添加50μl alphalisa(注册商标)surefire(注册商标)ultra
tm smad3(p-ser423/425)分析试剂盒(perkinelmer公司、alsu-psm3)内的裂解缓冲液，在室温下搅拌10分钟而使细胞溶解。使用上述试剂盒检测细胞溶解液中的磷酸化smad3。结果以将肌肉生长抑制素100ng/ml刺激条件下的测定值设为0％抑制、将肌肉生长抑制素不存在下的测定值设为100％抑制的抑制率来示出。肌肉生长抑制素不存在下的测定通过添加培养基来代替肌肉生长抑制素而实施。需要说明的是，数据表示2次试验(各试验以重复方式实施)的平均值。
[0392]
其结果是，人源化75e9stf8-1在actriia/hek293细胞及actriib/hek293细胞中抑制由肌肉生长抑制素诱导的smad3磷酸化(图1)。
[0393]
实施例7：人源化75e9stf8-1的拮抗活性评价及激动活性评价
[0394]
fn14在tweak存在下或不存在下被活化时，作为下游信号的nf-κb被活化。为了评价人源化75e9stf8-1的拮抗活性，以该信号为指标评价人fn14的tweak诱发nf-κb活化的抑制作用。另外，作为人源化75e9stf8-1的激动活性评价，评价tweak不存在下的nf-κb活化作用。具体而言，通过报告基因分析来评价tweak存在下或不存在下人源化75e9stf8-1对nf-κb活化的作用。制作稳定导入了整合有nf-κb转录应答序列的荧光素酶报告基因载体pgl4.32(promega公司、e8491)的hek293细胞(以下称为nf-κb/hek293细胞)，用于评价。
[0395]
将nf-κb/hek293细胞用含有10％胎牛血清的dmem(sigma公司、d6429)悬浮至1.25x105个细胞/ml，以每1孔80μl播种于透明底的白色96孔板(corning公司、3610)。将其在设定为37℃、5％co2的co2培养箱中培养2小时。对于人源化75e9stf8-1，用上述培养基制作稀释系列后，每1孔中添加10μl。关于各孔内的最终浓度，拮抗活性评价中设为从最高浓度100nmol/l起11等级(约3倍公比)，激动活性评价中设为从最高浓度300nmol/l起11等级(约3倍公比)。另外，作为对照，添加相同稀释系列的stf8-1。拮抗活性评价中，向各孔中添加10μl用上述培养基制备的tweak(peprotech公司、310-06)，使最终浓度为100ng/ml。激动活性评价中，向各孔中添加10μl上述培养基。在37℃、5％co2下培养一晚后，使用荧光素酶测定试剂one-glo
tm
荧光素酶分析系统(promega公司、e6120)测定荧光素酶表达量，由此对nf-κb活化进行定量化。关于结果，在拮抗活性评价中，以将tweak100ng/ml刺激条件下的测定值设为0％抑制、将tweak不存在下的测定值设为100％抑制的抑制率示出，在激动活性评价中，以将tweak100ng/ml刺激条件下的测定值设为100％、将tweak不存在下的测定值设为0％的活化率示出。tweak不存在下的测定通过添加培养基来代替tweak而实施。需要说明的是，数据表示2次试验(各试验以重复方式实施)的平均值。
[0396]
其结果是，人源化75e9stf8-1完全抑制由100ng/ml的tweak引起的fn14介导的nf-κb活化。另外，人源化75e9stf8-1没有诱导tweak不存在下的nf-κb活化(图2)。因此确认，人
源化75e9stf8-1具有拮抗活性、但不具有激动活性。
[0397]
实施例8：小鼠体内药效评价中使用的抗体的制备和功能评价
[0398]
为了小鼠体内药效评价，基于人源化串联vhh75e9、stf8-1及人源化75e9stf8-1的氨基酸序列，分别制备75e9(mfc)、stf8-1(mfc)和75e9stf8-1(mfc)。75e9(mfc)为在实施例2的串联vhh的75e9的c末端连接小鼠igg1重链恒定区的hinge、ch2及ch3而得的抗体(序列号15)。stf8-1(mfc)为将实施例3的stf8-1的恒定区与重链、轻链一起置换为小鼠恒定区的抗体(将stf8-1(mfc)的重链示于序列号16，将stf8-1(mfc)的轻链示于序列号17)。75e9stf8-1(mfc)为由在实施例2的75e9的c末端借助肽接头(gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser(序列号7))2连接stf8-1(mfc)重链的n末端而成的多肽(序列号18)及stf8-1(mfc)的轻链构成的抗体。
[0399]
75e9stf8-1(mfc)的第一vhh的cdr1、cdr2、cdr3及75e9stf8-1(mfc)的第二vhh的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别与人源化75e9stf8-1的第一vhh的cdr1、cdr2、cdr3及人源化75e9stf8-1的第二vhh的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列相同。进而，75e9stf8-1(mfc)中所含的stf8-1(mfc)的重链可变区及轻链可变区分别与人源化75e9stf8-1中所含的stf8-1的重链可变区及轻链可变区相同。
[0400]
进行实施例6中记载的功能评价，确认75e9(mfc)及75e9stf8-1(mfc)具有smad磷酸化抑制活性。另外，进行实施例7中记载的功能评价，确认stf8-1(mfc)及75e9stf8-1(mfc)具有拮抗活性，75e9stf8-1(mfc)无激动活性。
[0401]
实施例9：对类固醇诱发肌病模型小鼠的体内药效评价
[0402]
在小鼠中以肌重量及握力为指标评价对肌萎缩和肌功能的体内药效。作为肌萎缩模型动物，使用通过持续给予类固醇而形成的类固醇诱发肌病模型(sim模型)，在连续给予受试物质后第14天测定四肢握力及摘出股四头肌重量。
[0403]
测定小鼠的体重及握力，以体重及握力在组间均等的方式以各组10只进行分组。组构成设定为1个正常组、5个sim模型组的总计6组，5个sim模型组设为溶剂给予组、75e9(mfc)组、stf8-1(mfc)组、75e9(mfc)+stf8-1(mfc)组、75e9stf8-1(mfc)组。sim模型组中，通过自由饮水而持续饮水给予皮质酮(以100μg/ml的浓度溶解于混合有1％乙醇的过滤水中)14天，从而诱发肌萎缩。需要说明的是，正常组自由饮用过滤水。从开始给予皮质酮当天起，开始给予受试物质1及受试物质2。各组的受试物质给予的详细情况示于表1。需要说明的是，75e9stf8-1(mfc)组的用量设为与各个单独给予组的给予量同等程度的摩尔浓度。在开始给予受试物质后14天，利用小动物握力测定装置(melquest公司、gpm-100)实施握力测定。然后，在麻醉下对小鼠放血而处死，摘出股四头肌并测定重量。
[0404]
[表1]
[0405][0406]
其结果是，75e9(mfc)或stf8-1(mfc)部分抑制sim模型的骨骼肌萎缩及握力下降。进而，与各个单独给予的情况相比，通过75e9(mfc)和stf8-1(mfc)的混合处置，显示出显著强的骨骼肌萎缩抑制作用及握力下降抑制作用。另外，与75e9(mfc)和stf8-1(mfc)的混合处置相比，75e9stf8-1(mfc)显示出显著强的骨骼肌萎缩抑制作用及握力下降抑制作用(图3)。
[0407]
实施例10：对类固醇诱发肌病模型猴子的体内药效评价
[0408]
在类固醇诱发肌病模型的食蟹猴中评价给予受试物质后4周时对于股部除脂肪重量的体内药效。需要说明的是，除脂肪重量为除脂肪以外的肌肉、骨骼、血液等的总重量，已知与骨骼肌量相关(walowski co et al.、nutrients.2020、vol.12、755)。
[0409]
利用基于双能x射线吸收测定法的骨密度测定装置(hologic公司、discovery c)测定食蟹猴的股部除脂肪重量，以在组间均等的方式分为4组。组构成设定为正常组(n＝2)、3个sim模型组(各组n＝3)的总计4组，3个sim模型组为溶剂给予组、人源化75e9stf8-1组及比玛卢单抗组。sim模型组中，以1天2次、4-5天/周向背部皮下给予泼尼松龙(30mg/3ml/kg)，从而诱发肌萎缩。正常组中，同样地向背部皮下给予生理盐水。正常组及溶剂给予组中受试物质为pbs，人源化75e9stf8-1组中受试物质为人源化75e9stf8-1 40mg/2.4ml/kg，比玛卢单抗组中受试物质为比玛卢单抗30mg/2.4ml/kg，在泼尼松龙给予首日进行静脉内给予。给予用量设为与人源化75e9stf8-1和比玛卢单抗的给予摩尔数同等程度。在给予受试物质后4周实施股部除脂肪重量测定。在左右各股部测定除脂肪重量，将其平均值作为个体的测定值。
[0410]
其结果是，在sim模型猴子中，人源化75e9stf8-1组的股部除脂肪重量与溶剂给予组的股部除脂肪重量相比显著更重。比玛卢单抗组与溶剂给予组相比未见显著差异(图4)。
[0411]
产业上的可利用性
[0412]
本发明的多特异性抗体在人actriia、人actriib及人fn14参与疾病形成的各种疾病的预防或治疗中有用。另外，本发明的多核苷酸、表达载体、进行了转化的宿主细胞及生产抗体的方法被期待在生产上述多特异性抗体中有用。
[0413]
序列表自由文本
[0414]
以下的序列表的数字标题＜223＞中记载“人工序列”的说明。具体而言，序列表的序列号1所示的碱基序列为编码含有多特异性抗体的第一vhh、该多特异性抗体的第二vhh及该多特异性抗体的与fn14结合的抗体的重链的多肽的碱基序列，序列号3所示的碱基序列为编码该多特异性抗体的与fn14结合的抗体的轻链的碱基序列。序列号2所示的氨基酸序列为由序列号1编码的含有该多特异性抗体的第一vhh、该多特异性抗体的第二vhh、及该多特异性抗体的与fn14结合的抗体的重链的多肽，序列号4所示的氨基酸序列为由序列号3编码的该多特异性抗体的与fn14结合的抗体的轻链的氨基酸序列。序列号5～12为例示性的肽接头的氨基酸序列。序列号13所示的碱基序列为编码与fn14结合的抗体的重链的碱基序列，序列号14所示的氨基酸序列为由序列号13的碱基序列编码的氨基酸序列。序列号15所示的氨基酸序列为在串联vhh的c末端连接有小鼠恒定区的抗体的氨基酸序列。序列号16所示的氨基酸序列为与fn14结合的抗体的重链的氨基酸序列，序列号17所示的氨基酸序列为与fn14结合的抗体的轻链的氨基酸序列。序列号18所示的氨基酸序列为含有串联vhh及与fn14结合的抗体的重链的多肽。

技术特征：
1.一种多特异性抗体，其是与actriia、actriib和fn14结合的多特异性抗体，所述多特异性抗体包含：(a)与actriia和actriib结合的含有第一vhh和第二vhh的多肽、以及(b)与fn14结合的抗体或其抗原结合片段，第一vhh含有由序列号2的氨基酸编号31至35的氨基酸序列构成的cdr1、由序列号2的氨基酸编号50至65的氨基酸序列构成的cdr2、由序列号2的氨基酸编号98至105的氨基酸序列构成的cdr3，第二vhh含有由序列号2的氨基酸编号172至176的氨基酸序列构成的cdr1、由序列号2的氨基酸编号195至210的氨基酸序列构成的cdr2、由序列号2的氨基酸编号243至251的氨基酸序列构成的cdr3，(a)的多肽的c末端借助肽接头连接于与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的n末端。2.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中，第一vhh由序列号2的氨基酸编号1至116的氨基酸序列构成，第二vhh由序列号2的氨基酸编号142至262的氨基酸序列构成。3.根据权利要求1或2所述的多特异性抗体，其中，第一vhh的c末端借助肽接头连接于第二vhh的n末端。4.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中，(a)的多肽由序列号2的氨基酸编号1至262的氨基酸序列构成。5.根据权利要求1～4中任一项所述的多特异性抗体，其中，与fn14结合的抗体或其抗原结合片段包含：含有由序列号2的氨基酸编号303至307的氨基酸序列构成的cdr1、由序列号2的氨基酸编号322至338的氨基酸序列构成的cdr2、由序列号2的氨基酸编号371至379的氨基酸序列构成的cdr3的重链可变区；以及含有由序列号4的氨基酸编号24至34的氨基酸序列构成的cdr1、由序列号4的氨基酸编号50至56的氨基酸序列构成的cdr2、由序列号4的氨基酸编号89至97的氨基酸序列构成的cdr3的轻链可变区。6.根据权利要求1～4中任一项所述的多特异性抗体，其中，与fn14结合的抗体或其抗原结合片段含有由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区以及由序列号4的氨基酸编号1至108的氨基酸序列构成的轻链可变区。7.根据权利要求1～6中任一项所述的多特异性抗体，其含有与fn14结合的抗体，该与fn14结合的抗体含有具有l234a、l235a、m252y、s254t和t256e的氨基酸突变的重链恒定区。8.根据权利要求1～4中任一项所述的多特异性抗体，其含有与fn14结合的抗体，该与fn14结合的抗体包含：含有由序列号2的氨基酸编号273至390的氨基酸序列构成的重链可变区以及具有l234a、l235a、m252y、s254t和t256e的氨基酸突变的重链恒定区的重链；以及含有由序列号4的氨基酸编号1至108的氨基酸序列构成的轻链可变区和轻链恒定区的轻链。9.根据权利要求1～4中任一项所述的多特异性抗体，其含有与fn14结合的抗体，该与fn14结合的抗体含有由序列号2的氨基酸编号273至720的氨基酸序列构成的重链和由序列号4的氨基酸序列构成的轻链。10.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其含有由序列号2的氨基酸序列构成的多肽和由序列号4的氨基酸序列构成的轻链。11.根据权利要求1～10中任一项所述的多特异性抗体，其接受过翻译后修饰。
12.一种多核苷酸，其含有编码权利要求1～4中任一项所述的多特异性抗体的(a)的多肽的碱基序列。13.一种多核苷酸，其含有编码权利要求5～9中任一项所述的多特异性抗体的与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列。14.一种多核苷酸，其含有编码权利要求5～9中任一项所述的多特异性抗体的与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列。15.一种多核苷酸，其含有编码包含权利要求1～9中任一项所述的多特异性抗体的(a)的多肽和与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的多肽的碱基序列。16.一种多核苷酸，其含有编码权利要求10所述的多特异性抗体的多肽的碱基序列。17.一种多核苷酸，其含有编码权利要求10所述的多特异性抗体的轻链的碱基序列。18.一种表达载体，其含有权利要求12～15中任一项所述的多核苷酸。19.一种表达载体，其含有权利要求14和/或权利要求15所述的多核苷酸。20.一种表达载体，其含有权利要求16和/或权利要求17所述的多核苷酸。21.一种宿主细胞，其用权利要求18～20中任一项所述的含有多核苷酸的表达载体进行了转化。22.一种宿主细胞，其用含有以下的(i)和/或(ii)的多核苷酸的表达载体进行了转化、或者用含有以下的(i)的多核苷酸的表达载体和/或含有以下的(ii)的多核苷酸的表达载体进行了转化：(i)含有编码包含权利要求1～9中任一项所述的多特异性抗体的与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的多肽的碱基序列的多核苷酸；(ii)含有编码包含权利要求1～9中任一项所述的多特异性抗体的(a)的多肽和与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的多肽的碱基序列的多核苷酸。23.一种宿主细胞，其选自由以下的(a)～(d)组成的组：(a)用包含含有编码权利要求10所述的多特异性抗体的多肽的碱基序列的多核苷酸和含有编码权利要求10所述的多特异性抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；(b)用包含含有编码权利要求10所述的多特异性抗体的多肽的碱基序列的多核苷酸的表达载体和包含含有编码权利要求10所述的多特异性抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；(c)用包含含有编码权利要求10所述的多特异性抗体的多肽的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及(d)用包含含有编码权利要求10所述的多特异性抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。24.一种生产与actriia、actriib和fn14结合的多特异性抗体的方法，其包括下述步骤：培养用含有以下的(i)和(ii)的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞或用含有以下的(i)的多核苷酸的表达载体和含有以下的(ii)的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞，使其表达多特异性抗体：(i)含有编码包含权利要求1～9中任一项所述的多特异性抗体的与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的多肽的碱基序列的多核苷酸；
(ii)含有编码包含权利要求1～9中任一项所述的多特异性抗体的(a)的多肽和与fn14结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的多肽的碱基序列的多核苷酸。25.一种生产与actriia、actriib和fn14结合的多特异性抗体的方法，其包括培养选自由以下的(e)～(g)组成的组中的宿主细胞并使其表达多特异性抗体的步骤：(e)用包含含有编码权利要求10所述的多特异性抗体的多肽的碱基序列的多核苷酸和含有编码权利要求10所述的多特异性抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；(f)用包含含有编码权利要求10所述的多特异性抗体的多肽的碱基序列的多核苷酸的表达载体和包含含有编码权利要求10所述的多特异性抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及(g)用包含含有编码权利要求10所述的多特异性抗体的多肽的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞以及用包含含有编码权利要求10所述的多特异性抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。26.一种多特异性抗体，其通过权利要求24所述的方法生产而得到。27.一种多特异性抗体，其通过权利要求25所述的方法生产而得到。28.一种药物组合物，其含有权利要求1～11、26和27中任一项所述的多特异性抗体、以及药学上可接受的赋形剂。29.根据权利要求28所述的药物组合物，其为包涵体肌炎的预防或治疗用药物组合物。30.一种预防或治疗包涵体肌炎的方法，其包括给予治疗有效量的权利要求1～11、26和27中任一项所述的多特异性抗体的步骤。31.根据权利要求1～11、26和27中任一项所述的多特异性抗体，其用于预防或治疗包涵体肌炎。32.根据权利要求1～11、26和27中任一项所述的多特异性抗体在制造包涵体肌炎的预防或治疗用药物组合物中的应用。

技术总结
本发明提供通过与ActRIIA、ActRIIB和Fn14结合而抑制ActRIIA、ActRIIB和Fn14介导的肌萎缩作用、从而预防或治疗包涵体肌炎等肌萎缩性疾病的多特异性抗体。本发明人对多特异性抗体进行了研究，提供了含有由序列号2的氨基酸序列构成的多肽和由序列号4的氨基酸序列构成的多肽的多特异性抗体。多肽的多特异性抗体。


技术研发人员：权利要求书3页说明书30页序列表22页附图4页
受保护的技术使用者：安斯泰来制药株式会社
技术研发日：2022.01.12
技术公布日：2023/9/23