转换肽及使用该转换肽的免疫测定法的制作方法

1.本公开涉及可用于利用免疫反应分析目标抗原物质的转换肽及使用该转换肽的免疫测定方法。


背景技术：

2.免疫测定已被应用于生物测试，例如生物技术领域中的各种免疫诊断测试或环境监测。免疫测定法的优点是能够利用抗原抗体反应的特异性定量分析特定的目标物质，并且具有比其他分析方法更高的灵敏度。
3.免疫测定可用于各种诊断，例如诊断癌症标记、传染病、甲状腺功能、贫血、过敏、妊娠、药物滥用和痛风。为了在各种类型抗原的诊断或分析中应用免疫测定，必需制备对每种抗原具有特异反应性的抗体。
4.然而，这种方法在检测最近迅速多样化的现代化疾病或者具有多个突变体的病毒方面存在局限性。特别是对于病毒，通常不可能找到与病毒具有特异性结合特性的抗体。
5.此外，在利用抗原-抗体反应时，可能需要进行将抗体结合至标记的额外步骤。如果标记与抗体之间的结合特性较差，可能会降低免疫测定分析的准确性或可靠性。
6.由于上述问题，还存在开发能够分别结合不同抗体的不同类型的标记的问题。


技术实现要素：

7.技术问题
8.本公开的一个目的在于提供可应用于电化学免疫测定方法的转换肽，其包括能够选择性且可逆地结合至结合抗体的fab区的肽化合物以及能够在检测样品溶液中被氧化和还原的化学标记。
9.本公开的另一个目的在于提供使用所述转换肽的免疫测定方法。
10.技术方案
11.根据本公开实施方案的转换肽包括：能够可逆地结合至结合抗体的肽化合物；以及与肽化合物结合的化学标记。
12.在一个实施方案中，肽化合物可选择性且可逆地结合至结合抗体的抗原结合片段(fab)区。
13.在一个实施方案中，肽化合物可具有能够特异性且可逆地结合至结合抗体的轻链或重链的第一至第四框架区(fr1、fr2、fr3和fr4)中一个或多个的氨基酸序列。
14.在一个实施方案中，所述肽化合物可包括选自以下的一种或多种：第一肽化合物，其具有与第二轻链可变框架区(vl-fr2)的氨基酸序列具有同源性的第一氨基酸序列；第二肽化合物，其具有与第三轻链可变框架区(vl-fr3)或第四轻链可变框架区(vl-fr4)的氨基酸序列具有同源性的第二氨基酸序列；第三肽化合物，其具有与第二重链可变框架区(vh-fr2)的氨基酸序列具有同源性的第三氨基酸序列；和第四肽化合物，其具有与第三重链可变框架区(vh-fr3)或第四重链可变框架区(vh-fr4)的氨基酸序列具有同源性的第四氨基
酸序列。
15.在一个实施方案中，肽化合物可包含14至20个氨基酸。
16.在一个实施方案中，肽化合物可具有1650da至2500da的分子量。
17.在一个实施方案中，化学标记可包括能够在样品溶液中被可逆地氧化或还原的物质。
18.在一个实施方案中，化学标记可包括选自以下中的一种或多种：二茂铁、二茂铁甲醇、二茂铁二甲醇、α-甲基二茂铁甲醇、亚铁氰化物离子、铁氰化物离子、六铵合钌离子、氢醌、抗坏血酸、多巴胺、二茂铁羧酸、二茂铁二羧酸和二茂铁醛。
19.根据本公开实施方案的免疫测定方法包括：第一步，将与转换肽结合的结合抗体固定化在基底上，或者将结合抗体固定化在基底上再将转换肽结合至结合抗体上；第二步，利用检测样品溶液处理结合抗体；以及第三步，处理后，通过对检测样品溶液进行电化学分析，定量分析检测样品溶液中与结合抗体特异性反应的目标抗原；其中所述转换肽包括具有能够选择性且可逆地结合至结合抗体的抗原结合片段(fab)区的氨基酸序列的肽化合物以及与肽化合物结合并能够在检测样品溶液中被氧化和还原的化学标记。
20.在一个实施方案中，在第二步中，当检测样品溶液中存在目标抗原时，如果目标抗原与结合抗体结合，则转换肽可根据已与结合抗体反应的目标抗原的量从结合抗体定量释放。
21.在一个实施方案中，电化学分析可通过选自以下的一种方法进行：电流滴定法、计时电流分析法、伏安法、循环伏安法、微分电位伏安法、计时电位分析法和极谱法。
22.在一个实施方案中，在第三步中，在从结合抗体释放的转换肽的化学标记与用于电流滴定法或伏安法的工作电极之间可发生氧化还原反应。
23.有益效果
24.根据本公开的转换肽及使用该转换肽的免疫测定方法，通过使用选择性且可逆地结合至结合抗体的fab区并具有化学标记的转换肽，可通过无需光学系统的电化学分析方法对目标抗原进行定量分析，从而实现分析装置的小型化并降低其成本，因此可应用于现场诊断的装置中。
附图说明
25.图1是用于解释根据本公开实施方案的转换肽的图。
26.图2是用于解释结合抗体的图。
27.图3a是用于解释根据本公开实施方案的免疫测定方案的流程图；图3b和3c是用于解释如图3a所示的免疫测定方法的一个实施方案的示意图。
28.图4a的图说明了用于确认l1肽和h2肽之间特异性相互作用以及l2肽和h1肽之间特异性相互作用的方法及其测量结果；图4b的图用于解释使用pymol软件分析l1肽和h2肽之间的特异性相互作用以及l2肽和h1肽之间的特异性相互作用。
29.图5的图说明了将分离并固定化在微孔板上的人、兔、山羊和小鼠的lgg和其它蛋白质(人乙型肝炎抗原、c-反应蛋白、蛋白-a、bsa)与实施例1中合成的荧光标记的四种肽化合物(h1、h2、l1、l2)分别反应后，在微孔板底部测量的荧光强度。
30.图6a的示意图说明了用木瓜蛋白酶(一种蛋白酶)分别处理与实施例1的四种肽结
合的抗体之前和之后的状态；图6b的图说明了经木瓜蛋白酶处理后在微孔板的底部(b)和溶液(s)中测量的荧光强度。
31.图7a的示意图用于解释使用实施例1的荧光标记的肽化合物的免疫测定方法；图7b和7c的图说明了溶液中和微孔板底部的荧光强度取决于抗原浓度，抗原浓度通过图7a所示的免疫测定方法测量得到。
32.图8a至8c是二茂铁标记的转换肽的分析结果。
33.图9a和9b的图分别说明了通过微分脉冲伏安法(dpa)对包含l1转换肽的样品溶液测量的电流值根据l1转换肽的浓度变化，并说明了通过微分脉冲伏安法(dpa)对包含h2转换肽的样品溶液测量的电流值根据h2转换肽的浓度变化。
34.图10示出了通过结合至本公开的l1和h2转换肽的结合抗体对人乙型肝炎抗原(hhbsag)进行一步免疫测定分析获得的结果。
35.图11a和11b的图说明了根据通过电化学免疫测定法、光学免疫测定法、化学发光免疫测定法和显色免疫测定法测量的抗原浓度的分析结果，其中电化学免疫测定法使用第一l1转换肽(末端结合有二茂铁的l1肽化合物)对包含hbsag抗原的检测样品溶液进行测量，光学免疫测定法使用第二转换肽(荧光标记的l1肽化合物)，化学发光免疫测定法使用常规elisa试剂盒，显色免疫测定法使用常规elisa试剂盒。
36.图12a和12b是通过bland-altman检验和passing-bablok回归分析对使用实施例2的肽化合物的常规免疫测定方法进行比较获得的图。
具体实施方式
37.在下文中，将参考附图详细描述本公开的示例性实施方案。本公开可以进行各种修改，并且具有多个示例性实施方案。因此，本公开的具体示例性实施方案将在附图中示出，并在说明书中详细描述。然而，应当理解，本公开不限于特定的公开的形式，而是包括不脱离本公开的范围和精神的所有修改、等同物和替换。在描述每个附图时，相似的附图标记用于表示相似的部件。在附图中，为了清楚描述本公开，结构的尺寸与实际尺寸相比被放大。
38.本文使用的术语仅旨在用于描述特定的示例性实施方案，而不限制本公开。单数形式包括复数形式，除非上下文另有明确说明。应当理解，本文使用的术语“包括(include)”或“具有(has)”指示本文描述的特征、数字、步骤、操作、组件或其组合的存在，但是不排除一个或多个其他特征、数字、步骤、操作、组件或其组合的存在或添加。
39.除非另有定义，否则应当理解，本文所用的所有术语，包括技术和科学术语，均具有与本公开所属领域普通技术人员通常所理解相同的含义。通常由词典使用和定义的术语应该被解释为具有与相关技术的上下文中相同的含义，并且不应该被解释为具有理想的或过于正式的含义，除非在本说明书中另有明确的定义。
40.图1是用于解释根据本公开实施方案的转换肽的图，图2是用于解释结合抗体的图。
41.参照图1和图2，根据本公开实施方案的转换肽100可以包括能够可逆地结合至结合抗体10的肽化合物110，以及结合至肽化合物110的化学标记120。转换肽100可以可逆地结合至与目标抗原特异性结合的结合抗体10，因此当目标抗原与结合抗体特异性结合时，
转换肽100可从结合抗体10定量释放。结果，包含目标抗原的测试样品的电化学特性可以通过从结合抗体10释放的转换肽100的化学标记120介导的氧化还原反应而改变。
42.结合抗体10是能够通过与特定抗原决定簇(例如目标抗原的表位)结合或反应来诱导免疫效应子机制的化合物。结合抗体可以是单特异性或多特异性的。
43.在一个实施方案中，结合抗体10可包括抗体、抗体衍生物或其片段。结合抗体10可以是完整的免疫球蛋白分子，或者替代地，可以包括完整抗体的组分，例如fab、fab'、f(ab')2、fc、f(v)、n-聚糖结构、互补位等，或者至少一些组分。
44.在一个实施方案中，结合抗体可以是人抗体、非人抗体或人源化非人抗体。
45.人抗体可包括由人产生的抗体，或具有使用任何技术合成的氨基酸序列的合成抗体。人抗体的这一定义具体地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术产生，包括噬菌体展示文库。非人抗体可以是从各种物种来源获得的抗体，例如啮齿动物、兔子、牛、羊、猪、狗、非人哺乳动物或鸟类。非人抗体的“人源化”形式可以是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体可以是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被具有所需特异性、亲和力和/或结合容量的上述非人抗体(供体抗体)的高变区取代。在某些情况下，人免疫球蛋白的框架残基可能被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可包含不存在于受体抗体或供体抗体中的残基。可对抗体进行这些修饰以进一步改进抗体性能，例如结合亲和力。
46.在一个实施方案中，结合抗体10可以是抗体分子、免疫球蛋白分子、其片段或它们中一种或多种的聚集体。结合抗体10可具有能够特异性结合目标抗原的独特结构，并且每个结合抗体10可包括相同结构的两条轻链和相同结构的两条重链。重链和轻链可分别包括可变区和恒定区。重链和轻链的可变区可以结合形成抗原结合位点。在结合抗体10中，目标抗原中被蛋白酶(例如木瓜蛋白酶)结合的部分可以分离成抗体结合片段(fab)区和可结晶片段(fc)区，可结晶片段(fc)区是结晶的支柱部分，其中抗原结合位点可包括在抗体的抗体结合片段(fab)区中。
47.同时，重链和轻链的每个可变区可具有这样的结构，其中作为高变区(hvr)的三个互补决定区(cdr)和在结构上支撑互补决定区的四个框架区(fr)分别交替排列。每种抗体的互补决定区具有不同的氨基酸序列，因此可以特异性结合每种抗原，而框架区根据生物体的亚家族具有保守的氨基酸序列，因此属于相同亚家族的生物体的抗体具有相同或相似的氨基酸序列。
48.为了便于下文描述，在结合抗体10的轻链可变区中，从n端开始依次排列的四个框架区分别称为第一至第四轻链可变框架区(vl-fr1、vl-fr2、vl-fr3和vl-fr4)，分别位于第一至第四轻链可变框架区(vl-fr1、vl-fr2、vl-fr3和vl-fr4)之间并从n端开始依次排列的三个互补决定区分别称为第一至第三轻链可变互补决定区(vl-cdr1、vl-cdr2、vl-cdr3)。此外，在结合抗体10的重链可变区中，从n端开始依次排列的四个框架区分别称为第一至第四重链可变框架区(vh-fr1、vh-fr2、vh-fr3和vh-fr4)，分别位于第一至第四重链可变框架区(vh-fr1、vh-fr2、vh-fr3和vh-fr4)之间并从n端开始依次排列的三个互补决定区分别称为第一至第三重链可变互补决定区(vh-cdr1、vh-cdr2、vh-cdr3)。
49.肽化合物110可以具有能够选择性且可逆地结合至结合抗体10的抗原结合片段(fab)区的氨基酸序列。
50.在一个实施方案中，肽化合物110可具有能够特异性且可逆地结合至结合抗体10的轻链或重链的第一至第四框架区(fr1、fr2、fr3和fr4)中的一个或多个的氨基酸序列。例如，肽化合物110可包含与结合抗体10的轻链或重链的第一至第四框架区(fr1、fr2、fr3和fr4)中的一个或多个具有同源性的氨基酸序列。在这种情况下，肽化合物110可以可逆地结合至轻链或重链的第一至第四框架区(fr1、fr2、fr3和fr4)中的一个或多个。因此，当目标抗原与结合抗体10结合时，与结合抗体10结合的肽化合物10可以根据与结合抗体10结合的抗原的量从结合抗体10定量释放。
51.在一个实施方案中，肽化合物110可包括选自以下的一种或多种：第一肽化合物l1，其具有与第二轻链可变框架区(vl-fr2)的氨基酸序列具有同源性的第一氨基酸序列；第二肽化合物l2，其具有与第三轻链可变框架区(vl-fr3)或第四轻链可变框架区(vl-fr4)的氨基酸序列具有同源性的第二氨基酸序列；第三肽化合物h1，其具有与第二重链可变框架区(vh-fr2)的氨基酸序列具有同源性的第三氨基酸序列；以及第四肽化合物h2，其具有与第三重链可变框架区(vh-fr3)或第四重链可变框架区(vh-fr4)的氨基酸序列具有同源性的第四氨基酸序列。
52.在结合抗体10中，第二轻链可变框架区(vl-fr2)和第三重链可变框架区(vh-fr3)或第四重链可变框架区(vh-fr4)彼此相邻并相互作用，第三轻链可变框架区(vl-fr3)或第四轻链可变框架区(vl-fr4)和第二重链可变框架区(vh-fr2)彼此相邻并相互作用。因此，第一肽化合物l1(具有与结合抗体10的第二轻链可变框架区(vl-fr2)具有同源性的第一氨基酸序列)可以选择性地与结合抗体10的第三重链可变框架区(vh-fr3)或第四重链可变框架区(vh-fr4)相互作用，第二肽化合物l2(具有与结合抗体10的第三轻链可变框架区(vl-fr3)或第四轻链可变框架区(vl-fr4)具有同源性的第二氨基酸序列)可以选择性地与结合抗体10的第二重链可变框架区(vh-fr2)相互作用，第三肽化合物h1(具有与结合抗体10的第二重链可变框架区(vh-fr2)具有同源性的第三氨基酸序列)可以选择性地与结合抗体10的第三轻链可变框架区(vl-fr3)或第四轻链可变框架区(vl-fr4)相互作用，第四肽化合物h2(具有与结合抗体10的第三重链可变框架区(vh-fr3)或第四重链可变框架区(vh-fr4)具有同源性的第四氨基酸序列)可以选择性地与结合抗体10的第二轻链可变框架区(vl-fr2)相互作用。
53.在一个实施方案中，当结合抗体10来源于属于包括人在内的动物亚科的生物体时，肽化合物110可包含约10至25个氨基酸，并且可具有约1600da至3000da的分子量。例如，肽化合物110可包含约14至20个氨基酸，并且可具有约1650da至2500da的分子量。在一个实施方案中，第一至第四肽化合物(l1、l2、h1、h2)可包含如下表1所示的氨基酸序列。
54.[表1]
[0055]
[0056]
同时，由于抗体的轻链和重链的框架区(fr1、fr2、fr3、fr4)具有根据生物体亚家族的保守氨基酸序列，所以肽化合物110通常可应用于源自属于相同亚家族的不同生物体物种的抗体。因此，即使肽化合物110是由山羊、小鼠、兔等的抗体合成，它可以表现出与上述人抗体相同的作用和效果。
[0057]
化学标记120可与肽化合物110结合，并可在检测样品中被可逆地氧化和还原。在一个实施方案中，化学标记120可包括选自以下中的一种或多种：二茂铁、二茂铁甲醇、二茂铁二甲醇、α-甲基二茂铁甲醇、亚铁氰化物离子、铁氰化物离子、六铵合钌离子、氢醌、抗坏血酸、多巴胺、二茂铁羧酸、二茂铁二羧酸和二茂铁醛。
[0058]
图3a是用于解释根据本公开实施方案的免疫测定方法的流程图；图3b和3c是用于解释如图3a所示的免疫测定方法的一个实施方案的示意图。
[0059]
参照图3a至3c，根据本公开实施方案的免疫测定方法包括：第一步(s110)，将与转换肽结合的结合抗体固定化在基底上，或者将结合抗体固定化在基底上再将转换肽结合至结合抗体；第二步(s120)，利用检测样品溶液处理结合抗体；以及第三步(s130)，处理后，通过对检测样品溶液进行电化学分析，定量分析检测样品溶液中的目标抗原。
[0060]
在第一步(s110)中，转换肽可包括具有能够选择性且可逆地结合至结合抗体的抗原结合片段(fab)区的氨基酸序列的肽化合物，以及结合至肽化合物且能够在检测样品溶液中被氧化和还原的化学标记。在一个实施方案中，使用参照图1和2描述的转换肽100作为转换肽。因此，将省略对其的重复描述。
[0061]
在一个实施方案中，在结合抗体和转换肽的情况下，可首先将结合抗体固定化在基底上，然后可将转换肽结合至固定化地结合抗体上。替代地，可以将转换肽结合至结合抗体，然后可将结合抗体固定化在基底上。
[0062]
将结合抗体固定化在基底上的方法不受特别限制。例如，结合抗体可直接结合至基底上，或者可通过接头化合物结合至并固定化在基底上。
[0063]
如上所述，转换肽可选择性且可逆地结合至结合抗体的抗原结合片段(fab)区。
[0064]
在第二步(s120)中，可将检测样品溶液施加于固定化在基底上的结合抗体。
[0065]
在一个实施方案中，当检测样品溶液中存在与结合抗体特异性反应的目标抗原时，如果将检测样品溶液施加于结合抗体，则目标抗原可与结合抗体结合，在这种情况下，转换肽可根据已与结合抗体反应的目标抗原的量从结合抗体定量释放。
[0066]
在第三步(s130)中，可通过将检测样品溶液包被在结合抗体上并在预定时间段过去后对检测样品溶液进行电化学分析，从而对检测样品溶液中的目标抗原进行定量分析。
[0067]
在一个实施方案中，如上所述，当目标抗原与结合抗体反应时，肽化合物可根据已与结合抗体反应的目标抗原的量从结合抗体定量释放。在这种情况下，处理后，检测样品溶液中转换肽的浓度增加，并且检测样品溶液的电化学特性可以通过氧化或还原转换肽的化学标记而改变。
[0068]
在一个实施方案中，对处理后的检测样品溶液的电化学分析没有特别限制。例如，电化学分析可使用例如以下方法进行：电流滴定法、计时电流分析法、伏安法、循环伏安法、微分电位伏安法、计时电位分析法和极谱法。
[0069]
在一个实施方案中，如图3a和3b所示，当转换肽的化学标记为二茂铁且通过微分电位伏安法进行电化学分析时，转换肽的二茂铁可通过将电子转移至工作电极而氧化为二
茂铁离子，由此检测样品溶液的电化学性质会被改变，进而参比电极和对电极之间流动的电流值会变化。处理后，检测样品溶液中包含的转换肽的浓度根据与结合抗体结合的目标抗原的量而变化，因此在本公开中可以通过测量电流值的变化来定量分析目标抗原。同时，二茂铁离子可以通过从工作电极接收电子而还原成二茂铁。
[0070]
根据本公开的转换肽及使用该转换肽的免疫测定方法，通过使用选择性且可逆地结合至结合抗体的fab区并具有化学标记的转换肽，可通过无需光学系统的电化学分析方法定量分析目标抗原，从而实现分析装置的小型化并降低成本，因此可应用于用于现场诊断的装置。
[0071]
在下文中，将详细描述本公开的具体实施例。然而，以下示例仅仅是本公开的一些实施例，并且本公开的范围不限于以下实施例。
[0072]
发明方式
[0073]
实施例1
[0074]
合成了表1所示的四种类型的肽(h1、h2、l1、l2)。具体地，合成具有与重链fr2区具有同源性的氨基酸序列的h1肽，合成具有与重链fr3或fr4区具有同源性的氨基酸序列的h2肽，合成具有与轻链fr2区具有同源性的氨基酸序列的l1肽，合成具有与轻链fr3或fr4区具有同源性的氨基酸序列的l2肽。
[0075]
h1肽化合物的吉布斯自由能变化(δg)为-17.91kcal/mol，h2肽为-17.19kcal/mol，l1肽为15.37kcal/mol，l2肽为-13.05kcal/mol。
[0076]
实验例1
[0077]
图4a的图示出了用于确认l1肽和h2肽之间特异性相互作用以及l2肽和h1肽之间特异性相互作用的方法及其测量结果；图4b的图用于解释使用pymol软件分析l1肽和h2肽之间的特异性相互作用以及l2肽和h1肽之间的特异性相互作用。这里，在l1肽和l2肽的末端修饰有第一荧光标记fam(λ
ex
＝488nm，λ
em
＝532nm)，在h1肽和h2肽的末端修饰有第二荧光标记tamra(λ
ex
＝532nm，λ
em
＝570nm)。同时，第一肽(l1或l2)通过聚对二甲苯h(parylene-h)的甲酰基和肽中赖氨酸残基的伯胺基之间的共价键固定化在聚对二甲苯h包被的微孔板上，将第二肽(h2或h1)与固定化的第一肽(l1或l2)孵育以使它们之间发生特异性相互作用。另一方面，可以看出，固定化第一肽(l1或l2)和与其孵育的第二肽(h2或h1)之间的特异性相互作用可以通过在微孔板的底部是否观察到具有来自修饰到第二肽的tamra的绿色荧光发射(λ
em
＝570nm)的fret效应来确定，并且当第一肽和第二肽之间发生特异性相互作用时，在微孔板底部观察到fret效应。
[0078]
参照图4a，通过改变l1肽的浓度观察l1肽与h2肽之间的相互作用，fret强度随着l1肽浓度的增加而增加。这些结果表明，l1肽和h2肽之间发生了特异性相互作用。
[0079]
此外，通过改变h1肽的浓度观察到h1肽和l2肽之间的相互作用，并且观察到fret强度随着h1肽浓度的增加而增加。这些结果还表明，h1肽和l2肽之间发生了特异性相互作用。
[0080]
由上述结果可知，l1肽选择性且可逆地结合至重链fr3或fr4区(相当于h2肽)，l2肽选择性且可逆地结合至重链fr2区(相当于h1肽)，h1肽选择性且可逆地结合至轻链fr3或fr4区(相当于l2肽)，h2肽选择性且可逆地结合至轻链fr2区(相当于l1肽)。
[0081]
参照图4b，通过pymol分析h1-l2肽之间的氢键和h2-l1肽之间的氢键的结果可知，
在h1-l2肽之间，(1)在谷氨酰胺(h1肽的残基编号9)和酪氨酸(l2肽的残基编号3)之间发现长度为的氢键，(2)在l2肽的肽键羰基和h1肽的肽键缺电子氢之间发现长度为的氢键；在h2-l1肽之间，在(1)氨基酸之间(相互作用i)、(2)肽键之间(相互作用ii、iii)和(3)氨基酸和肽键之间(相互作用iv)发现四个长度为至的氢键。氢键的数量表明h1-l2肽之间的相互作用强于h2-l1肽之间的相互作用，而吉布斯自由能变化的相似值表明肽化合物与igg的结合亲和力相近。
[0082]
图5的图说明了将分离并固定化在微孔板上的人、兔、山羊和小鼠的lgg和其它蛋白质(人乙型肝炎抗原、c-反应蛋白、蛋白-a、bsa)与实施例1中合成的荧光标记的四种肽化合物(h1、h2、l1、l2)分别反应后，在微孔板底部测量的荧光强度。
[0083]
参照图5，仅有人、兔、山羊和小鼠的igg显示出显著高的荧光强度，其它抗原性蛋白显示基线水平的荧光。这些结果表明实施例1的肽与抗体选择性结合。
[0084]
图6a的示意图说明了用木瓜蛋白酶(一种蛋白酶)分别处理与实施例1的四种肽结合的抗体之前和之后的状态；图6b的图说明了经木瓜蛋白酶处理后在微孔板的底部(b)和溶液(s)中测量的荧光强度。在本实验的情况下，将抗体(兔抗hrp抗体)固定化在微孔板上后，通过用荧光标记的转换肽处理来诱导抗体和转换肽之间的结合，去除未结合的转换肽，然后通过添加木瓜蛋白酶(一种蛋白酶)从固定化的抗体水解fab区。
[0085]
参照图6a，在木瓜蛋白酶反应之后，由于荧光标记的转换肽结合至抗体的fab区，所以预期在微孔板底部(b)处的荧光会降低；并且由于与转换肽结合的fab区被水解并溶解到溶液中，所以预期溶液中的荧光会增加。图6b的图表证明了该预测是正确的。
[0086]
参见图6b，在所有四种转换肽(h1、h2、l1、l2)中，与木瓜蛋白酶处理之前相比，经木瓜蛋白酶处理之后，微孔板底部(b)的荧光降低，而溶液中(s)的荧光增加。具体而言，对于微孔板底部的荧光强度，分别评估为h1肽减少了84.3％，h2肽减少了58.7％，l1肽减少了84.8％，l2肽减少了72.5％。此外，对于溶液中的荧光强度，分别评估为h1肽增加了2184％，h2肽增加了2356％，l1肽增加了1032％，l2肽增加了2452％。
[0087]
从上述结果可以看出，实施例1的四种转换肽均与抗体的fab区结合。
[0088]
下表2显示了评估实施例1的四种肽化合物(h1、h2、l1、l2)与不同动物(兔、小鼠和山羊)的抗体的结合特性结果。这些结果是将荧光标记的转换肽结合至固定化在微孔板上的抗体，去除未反应的转换肽，然后分别与目标抗原(crp用于兔igg、hcg用于小鼠igg、hrp用于兔igg、hbsag用于山羊igg)反应后测得的荧光强度值。
[0089]
[表2]
[0090][0091][0092]
参照表2，在经对应抗原处理后的溶液中，测量到各固定化抗体(igg)的荧光强度在微孔板底部降低而在溶液中提高。具体而言，在兔抗hrp抗体的情况下，对于h1、l1、h2和l2肽，微孔板底部的荧光强度分别降低12.3％、12.7％、14.8％和25.5％，溶液中的荧光强度分别增加746％、357％、698％和597％。在山羊抗hbsag抗体的情况下，对于h1、l1、h2和l2肽，微孔板底部的荧光强度分别降低41.1％、48.7％、63.9％和35.2％，溶液中的荧光强度
分别增加410％、638％、412％和574％。
[0093]
这些结果表明，在实施例1中合成的四种肽化合物不仅能够与固定化抗体(igg)结合，而不管来源动物的物种如何，而且由于实施例1的四种肽化合物中的每种与抗体的可逆性结合，当抗原与抗体的结合口袋结合时，它们也能从抗体中定量释放。
[0094]
图7a的示意图用于解释使用实施例1的荧光标记的肽化合物的免疫测定方法；图7b和7c的图说明了溶液中和微孔板底部的荧光强度取决于抗原浓度，该抗原浓度通过图7a所示的免疫测定方法测量得到。在该实验中，来自固定化在微孔板上的兔抗hrp抗体用作结合抗体，hrp用作抗原。
[0095]
参照图7a至图7c，作为随抗原hrp浓度由0.3μm变化至100μm进行免疫测定的结果，对于四种转换肽(h1、h2、l1、l2)，观察到溶液中的荧光强度根据抗原(hrp)浓度而增加。
[0096]
h1肽、h2肽、l1肽和l2肽的平衡解离常数估计为1.65μm、3.11μm、3.29μm和1.48μm，并且每种转换肽的解离常数的差异意味着每种转换肽对于每种抗原具有不同的检测面积。对于hrp抗原，h1肽在hrp浓度区的反应最为线性。这些结果表明，转换肽根据抗原的结合量从固定化抗体中释放，并且在使用转换肽的一步免疫测定中，可以基于溶液中的荧光强度定量分析抗原。
[0097]
同时，图7c示出了在所有四种转换肽中，微孔板底部的荧光强度根据抗原的浓度而降低。这些结果表明，转换肽根据抗原的量从抗体中定量释放，并且通过溶液中以及微孔板底部的荧光强度变化可以定量分析抗原。
[0098]
实施例2
[0099]
通过将二茂铁结合至l1、l2、h1和h2肽化合物中的每个的末端，合成了转换肽。这里，二茂铁通过羧基结合至肽化合物的每个末端，如下表3所示。
[0100]
[表3]
[0101][0102]
实验例2
[0103]
图8a至8c是二茂铁标记的转换肽的分析结果。
[0104]
图8a是通过动态激光散射(dls)对本公开转换肽的流体动力学半径进行比较获得的结果。参考图8a可证明，在单色激光下使用散射光的强度测量来进行dls，与l1肽或h2肽结合的结合抗体的流体动力学半径小于与l2肽或h1肽结合的结合抗体的流体动力学半径。这些转换肽的流体动力学半径的差异表明标记的二茂铁和电极表面之间的接触可能受到空间位阻，这取决于转换肽之间的结合关系。
[0105]
因此，为了分析四种转换肽的几何差异，模拟了转换肽的三维结构，结果如图8b所示。参照图8b，可以确认l1肽和h2肽比l2肽和h1肽具有更多的氢键，并且偶极矩方向更接近二茂铁的方向。因此，l1肽和h2肽可能具有紧密的三维结构，并具有更多分子内氢键。
[0106]
图8c是通过在cv分析中测量本公开转换肽的扩散系数(dox)获得的图。参照图8c，l1肽和h2肽表现出比h1肽和l2肽相对更高的扩散系数。因此，二茂铁标记的l1肽和h2肽可能是电化学免疫分析的最佳探针。
[0107]
图9a和9b的图分别说明了通过微分脉冲伏安法(dpa)对包含l1转换肽的样品溶液测量的电流值根据l1转换肽的浓度变化，并说明了通过微分脉冲伏安法(dpa)对包含h2转换肽的样品溶液测量的电流值根据h2转换肽的浓度变化。在本文中，热解碳电极用作工作电极。
[0108]
参照图9a可见，通过dpa方法测量的电流值根据l1转换肽的浓度而变化。这表明可以使用l1转换肽通过基于dpa的免疫测定方法来定量分析抗原。参照图9b可见，通过dpa方法测量的电流值根据h2转换肽的浓度而变化。这表明可以使用h2转换肽通过基于dpa的免疫测定方法来定量分析抗原。
[0109]
此外，可以确认，l1转换肽的检测限(lod)为5.9nm，h2转换肽的检测限为10nm。因此，l1和h2转换肽可用于电化学免疫测定的定量分析。
[0110]
图10是通过结合至本公开的l1和h2转换肽的结合抗体对人乙型肝炎抗原(hhbsag)进行一步免疫测定分析获得的结果。
[0111]
参照图10证明了，当使用h2转换肽时，无法对hhbsag进行免疫测定，而当使用l1转换肽时，对hhbsag进行免疫测定是可能的。这个结果是因为l1转换肽紧密结合在抗原结合位点附近，而h2转换肽的结合位点相对远离抗原结合位点。因此，选择l1转换肽用于hhbsag免疫测定是理想的。
[0112]
图11a和11b的图示出了根据通过电化学免疫测定法、光学免疫测定法、化学发光免疫测定法和显色免疫测定法测量的抗原浓度的分析结果，其中电化学免疫测定法使用第一l1转换肽(末端结合有二茂铁的l1肽化合物)对包含hbsag抗原的检测样品溶液进行测量，光学免疫测定法使用第二转换肽(荧光标记的l1肽化合物)，化学发光免疫测定法使用常规elisa试剂盒，显色免疫测定法使用常规elisa试剂盒。使用第一l1转换肽的电化学免疫测定法结果，通过在用固定化在基底上并与l1转换肽结合的抗hbsag抗体处理含有hbsag抗原的检测样品溶液后，通过微分脉冲伏安法(dpa)对检测样品溶液进行测量得到。
[0113]
参照图11a和11b可见，使用第一l1转换肽的电化学免疫测定法能够在与基于常规市售elisa试剂盒的免疫测定法相似的范围内进行测量，而且就检测限(lod)而言，使用第一l1转换肽的电化学免疫测定法比其他方法更灵敏。
[0114]
图12a和12b是通过bland-altman检验和passing-bablok回归分析对使用实施例2的肽化合物的常规免疫测定方法进行比较获得的图。
[0115]
参照图12a，bland-altman检验表明，本公开的一步免疫测定法与elisa的结果相同，且分布在95％的置信范围内(
±
1.96σ)。如图12b所示，作为passing-bablok回归分析的结果，两种方法的结果分布在95％的置信水平内，并且斯皮尔曼(spearman)相关系数(ρ)计算为0.975(p《0.0001)。由于斯皮尔曼(spearman)相关系数(ρ)为0.5或更高，表明两种方法之间具有高度相关性，因此两种统计分析的结果表明基于本公开转换肽的elisa和免疫测定的结果相近。因此，这表明使用本公开的转换肽，基于表面抗原(hbsag)检测来诊断人乙型肝炎是可能的。
[0116]
尽管上文已公开了本公开的示例性实施例，但本领域技术人员应理解，在不脱离
权利要求所描述的本公开的范围和精神的情况下，可以对本公开进行各种修改和改变。

技术特征：
1.一种转换肽，包括：能够可逆地结合至结合抗体的肽化合物；和与所述肽化合物结合的化学标记。2.根据权利要求1所述的转换肽，其中所述肽化合物选择性且可逆地结合至结合抗体的抗原结合片段(fab)区。3.根据权利要求1所述的转换肽，其中所述肽化合物具有能够特异性且可逆地结合至结合抗体的轻链或重链的第一框架区至第四框架区(fr1、fr2、fr3和fr4)中一个或多个的氨基酸序列。4.根据权利要求3所述的转换肽，其中所述肽化合物包括选自以下的一种或多种：第一肽化合物，其具有与第二轻链可变框架区(vl-fr2)的氨基酸序列具有同源性的第一氨基酸序列；第二肽化合物，其具有与第三轻链可变框架区(vl-fr3)或第四轻链可变框架区(vl-fr4)的氨基酸序列具有同源性的第二氨基酸序列；第三肽化合物，其具有与第二重链可变框架区(vh-fr2)的氨基酸序列具有同源性的第三氨基酸序列；和第四肽化合物，其具有与第三重链可变框架区(vh-fr3)或第四重链可变框架区(vh-fr4)的氨基酸序列具有同源性的第四氨基酸序列。5.根据权利要求4所述的转换肽，其中所述肽化合物包含14至20个氨基酸。6.根据权利要求5所述的转换肽，其中所述肽化合物的分子量为1650da至2500da。7.根据权利要求1所述的转换肽，其中所述化学标记化学标记包括能够在样品溶液中被可逆地氧化或还原的物质。8.根据权利要求7所述的转换肽，其中所述化学标记包括选自以下中的一种或多种：二茂铁、二茂铁甲醇、二茂铁二甲醇、α-甲基二茂铁甲醇、亚铁氰化物离子、铁氰化物离子、六铵合钌离子、氢醌、抗坏血酸、多巴胺、二茂铁羧酸、二茂铁二羧酸和二茂铁醛。9.一种免疫测定方法，包括：第一步，将与转换肽结合的结合抗体固定化在基底上，或者将结合抗体固定化在基底上再将转换肽结合至结合抗体上；第二步，利用检测样品溶液处理结合抗体；以及第三步，处理后，通过对检测样品溶液进行电化学分析，定量分析检测样品溶液中与结合抗体特异性反应的目标抗原；其中所述转换肽包括具有能够选择性且可逆地结合至结合抗体的抗原结合片段(fab)区的氨基酸序列的肽化合物以及与肽化合物结合并能够在检测样品溶液中被氧化和还原的化学标记。10.根据权利要求9所述的免疫测定方法，其中，在第二步中，当检测样品溶液中存在目标抗原时，如果目标抗原与结合抗体结合，转换肽根据已与结合抗体反应的目标抗原的量从结合抗体定量释放。11.根据权利要求10所述的免疫测定方法，其中，所述电化学分析通过选自以下的一种方法进行：电流滴定法、计时电流分析法、伏安法、循环伏安法、微分电位伏安法、计时电位分析法和极谱法。12.根据权利要求11所述的免疫测定方法，其中，在第三步中，在从结合抗体释放的转换肽的化学标记与用于电流滴定法或伏安法的工作电极之间发生氧化还原反应。

技术总结
本发明公开了可用于电化学免疫测定的转换肽。该转换肽包括：能够可逆地结合至结合抗体的肽化合物；以及引入肽化合物中的化学标记。记。记。


技术研发人员：边在哲
受保护的技术使用者：光行科技株式会社
技术研发日：2022.01.18
技术公布日：2023/9/23