透皮疫苗

1.本发明涉及包含超声响应多肽颗粒的组合物。所述颗粒可以通过使用超声诱导的惯性空化透皮递送，并且可用作透皮疫苗组合物或透皮施用疫苗的载体。所述组合物可用于疫苗接种方法。


背景技术：

2.疫苗在当今社会中发挥着重要作用，特别是考虑到大流行的持续威胁以及对流感等已知传染病采取长期疫苗接种策略的需要。尽管许多疫苗是通过注射方式接种的，但这种注射方式存在一些缺点，如疼痛、针刺伤害、恐惧和依从性差。因此，透皮疫苗是一种有吸引力的选择，可以解决这些问题。
3.然而，透皮递送疫苗存在许多困难。已经试验的技术包含使用超声渗透皮肤，创建毛孔，随后添加的疫苗分子可以通过毛孔。然而，这并没有带来足够有效的递送。
4.微针辅助递送是一项已被研究的进一步技术。微针在皮肤上创建毛孔，旨在使疫苗分子能够通过所创建的毛孔穿过皮肤。使用微针的透皮给药已被用于给志愿者施用脊髓灰质炎疫苗，并在动物模型中研究卡介苗(bcg)疫苗。然而，它不适合递送高剂量的疫苗，并且可能与患者依从性较低有关。
5.尽管透皮疫苗接种取得了长足的发展，但尚未出现突破性技术来提供能够与当前广泛使用的注射竞争的简单而有效的技术。因此需要新的透皮疫苗接种技术。


技术实现要素：

6.本发明人开发了由多肽(例如蛋白质)制成的可生物降解的超声响应颗粒。所述颗粒响应于超声而产生惯性空化，这种特性提供了透皮施用颗粒和任何共同施用的物质的能力。将本发明的颗粒施用于皮肤，然后施加超声，产生足以驱动颗粒穿过皮肤并提供透皮给药的惯性空化效应。超声的使用还可以额外提供声孔效应(扩大皮肤毛孔)，但惯性空化产生的冲击波和/或微流效应显着增强了颗粒穿过皮肤的运动(超声导入)。
7.一段时间以来，超声响应颗粒一直被用于辅助向体内递送治疗或诊断药物。例如，药物可以与充当空化核的微泡共同施用。超声对微泡的作用导致由空化效应引起的短时微流爆发。这可以增加药物在靶位点的递送。
8.然而，微泡仅提供非常短的作用持续时间，空化持续不超过约30秒。它们也不适合透皮给药。
9.纳米颗粒空化剂也已被描述(wo 2015/075422)，其具有更长的作用持续时间和更小的尺寸，从而提供更大的效用。所述颗粒通过种子聚合形成杯形塑料颗粒，能够在杯的空腔中容纳气泡。这些颗粒已被用作可注射的空化剂。然而，所描述的颗粒是塑料的且不可生物降解。此外，还没有建议在透皮给药中使用此类颗粒。
10.本文所述的颗粒可以以适合透皮施用的亚微米尺寸生产，并且具有良好的作用持续时间，已发现在超声暴露后产生空化约10分钟的时间段。这些颗粒高度稳定，但也可生物
降解。因此，与已知的超声响应颗粒相比，这些颗粒具有许多优点，特别是，它们已被证明是有效的透皮递送。
11.本文描述的颗粒不仅可以透皮递送，它们本身也可以充当疫苗和/或佐剂，并且因此可以用作透皮施用的疫苗组合物。因此，本发明提供第一方面(1)：
12.1.透皮疫苗组合物，其包含多个多肽颗粒和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂，其中所述多个多肽颗粒适合于在暴露于超声时诱导空化，并且其中每个颗粒包含：
[0013]-多肽壳；和任选的
[0014]-核，其包含水不混溶液体和/或一种或多种佐剂；
[0015]
其中所述颗粒具有一个或多个表面凹痕。
[0016]
所述透皮疫苗组合物的颗粒可以在多肽壳中包含致病性抗原蛋白。令人惊讶的是，人们发现多肽壳中的蛋白质会产生显著的免疫应答，这表明作为疫苗使用时具有很高的功效。因此，根据本发明，在壳中具有抗原蛋白的颗粒能够对抗原蛋白产生免疫应答。此外，颗粒的核可以方便地包含佐剂，促进免疫应答的实现。或者，根据本发明的颗粒可以在壳中包含佐剂多肽，并且与疫苗一起施用。因此，所述颗粒可用作透皮给药疫苗，或作为诸如佐剂组合物等透皮给药疫苗的载体。
[0017]
本发明还提供以下方面：
[0018]
2.根据方面1所述的透皮疫苗组合物，其中所述多肽壳包含交联的多肽颗粒。
[0019]
3.根据方面1或2所述的透皮疫苗组合物，其中所述多肽包含致病性抗原蛋白和/或其中所述组合物还包含疫苗，优选dna或rna疫苗。
[0020]
4.根据前述方面中任一项所述的透皮疫苗组合物，其中所述核包含一种或多种佐剂。
[0021]
5.根据方面4所述的透皮疫苗组合物，其中所述一种或多种佐剂选自咪喹莫特和角鲨烯。
[0022]
6.根据前述方面中任一项的透皮疫苗组合物，其中所述多肽壳包含致病性抗原蛋白。
[0023]
7.根据方面6所述的透皮疫苗组合物，其中所述致病性抗原蛋白选自covid刺突蛋白(covid spike protein)、hepb表面抗原蛋白(hepb surface antigen protein)、血凝素(hemagglutinin)、流感神经氨酸酶(an influenza neuraminidase)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin)、肺炎球菌表面蛋白a(pneumococcal surface protein a)、奈瑟氏菌黏附因子a(neisserial adhesin a)、奈瑟菌肝素结合抗原(neisserial heparin binding antigen)、h因子结合蛋白(factor h binding protein)和hpv-16e6或e7融合蛋白。
[0024]
8.根据方面1至7中任一项所述的透皮疫苗组合物，其中所述多肽壳包含佐剂多肽。
[0025]
9.根据方面8所述的透皮疫苗组合物，其中所述佐剂多肽是选自非人白蛋白、sflt配体、细胞因子和趋化因子、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、肿瘤坏死因子(tnf)和粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)中的一种或多种多肽。
[0026]
10.根据方面1至9中任一项所述的透皮疫苗组合物，其中所述组合物还包含dna或rna疫苗。
[0027]
11.根据前述方面中任一项所述的透皮疫苗组合物，其中所述粒度为100nm至10000nm，优选200nm至1000nm。
[0028]
12.根据方面1至10中任一项所述的透皮疫苗组合物，其中所述粒度大于600nm，优选大于700nm，优选600nm至10000nm，优选700nm至10000nm，更优选700nm至1000nm。
[0029]
13.根据方面1至10中任一项所述的透皮疫苗组合物，其中所述粒度大于1000nm，优选1000nm至10000nm，优选在1000nm至5000nm。
[0030]
14.根据前述方面中任一项所述的透皮疫苗组合物，其中至少一个表面凹痕的横截面形成圆锥截面。
[0031]
15.根据前述方面中任一项所述的透皮疫苗组合物，其中至少一个表面凹痕的深度为至少10nm；和/或开口尺寸为至少50nm。
[0032]
16.根据前述方面中任一项所述的透皮疫苗组合物，其中所述颗粒包含一个或两个凹痕，所述凹痕的开口尺寸为所述粒度的20％或更大。
[0033]
17.根据前述方面中任一项所述的透皮疫苗组合物，其中所述多肽壳与选自肽、蛋白质、糖、纳米颗粒和核酸的一种或多种配体偶联。
[0034]
18.根据前述方面中任一项所述的透皮疫苗组合物，当所述颗粒悬浮在水中并经受1.8mpa和265khz的超声时，所述颗粒能够产生惯性空化。
[0035]
19.用于在暴露于超声时诱导空化的多肽颗粒，所述颗粒包含:
[0036]-多肽壳，其包含方面6或方面7所定义的致病性抗原蛋白；和任选的
[0037]-核，其包含水不混溶液体和/或一种或多种佐剂，所述佐剂如方面4或方面5所定义；
[0038]
其中所述颗粒具有一个或多个表面凹痕。
[0039]
20.用于在暴露于超声时诱导空化的多肽颗粒，所述颗粒包含:
[0040]-多肽壳，其中多肽壳任选地包含方面6或方面7所定义的致病性抗原蛋白；和
[0041]-核，其包含一种或多种佐剂和任选的水不混溶液体，其中所述佐剂如权利要求4中所定义；
[0042]
其中所述颗粒具有一个或多个表面凹痕。
[0043]
21.用于在暴露于超声时诱导空化的多肽颗粒，所述颗粒包含:
[0044]-多肽壳，其包含方面8或方面9所定义的佐剂多肽；和任选的
[0045]-核，其包含水不混溶液体和/或一种或多种佐剂，其中所述佐剂如方面4或方面5中所定义；
[0046]
其中，所述颗粒具有一个或多个表面凹痕，优选地，其中所述颗粒的粒度大于700nm。
[0047]
22.根据方面19或20所述的多肽颗粒，其中所述粒度为100nm至10000nm，优选200nm至1000nm。
[0048]
23.药物佐剂组合物，其包含多个如方面20或21所述的多肽颗粒以及一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂。
[0049]
24.根据方面19至21中任一项所述的多肽颗粒，或根据方面23所述的组合物，其中所述多肽颗粒如方面12至18中任一项所定义。
[0050]
25.制备如方面19所述的多肽颗粒的方法，包括：
[0051]-提供水不混溶相，其包含一种或多种挥发性组分、任选的一种或多种非挥发性组分、以及任选的一种或多种如方面4或方面5中所定义的佐剂；
[0052]-将所述水不混溶相与至少一种多肽的水溶液混合，其中所述至少一种多肽包含如方面6或方面7中所定义的致病性抗原蛋白；
[0053]-交联多肽以产生具有包含水不混溶相的核和包含至少一种多肽的壳的颗粒；和
[0054]-通过将颗粒置于减压条件下从核中去除挥发性组分，从而在颗粒中形成一个或多个凹痕。
[0055]
26.根据方面20所述的制备多肽颗粒的方法，包括：
[0056]-提供水不混溶相，其包含一种或多种挥发性组分、一种或多种如方面4或方面5中所定义的佐剂以及任选的一种或多种非挥发性组分；
[0057]-将所述水不混溶相与至少一种多肽的水溶液混合，其中所述至少一种多肽任选地包含如方面6或方面7中所定义的致病性抗原蛋白；
[0058]-交联蛋白质以产生具有包含水不混溶相的核和包含至少一种多肽的壳的颗粒；和
[0059]-通过将颗粒置于减压条件下从核中去除挥发性组分，从而在颗粒中形成一个或多个凹痕。
[0060]
27.根据方面21所述的制备多肽颗粒的方法，包括：
[0061]-提供水不混溶相，其包含一种或多种挥发性组分、任选的一种或多种非挥发性组分、以及任选的一种或多种如方面4或方面5中所定义的佐剂；
[0062]-将所述水不混溶相与至少一种多肽的水溶液混合，其中所述至少一种多肽包含如方面8或方面9中所定义的佐剂多肽；
[0063]-交联多肽以产生具有包含水不混溶相的核和包含至少一种多肽的壳的颗粒；和
[0064]-通过将颗粒置于减压条件下从核中去除挥发性组分，从而在颗粒中形成一个或多个凹痕。
[0065]
28.根据方面25至27中任一项所述的方法，其中水不混溶相中挥发性组分与非挥发性组分的比例为1:20至20:1。
[0066]
29.根据方面25至28中任一项所述的方法，其进一步包括：
[0067]-干燥所述颗粒；和
[0068]-任选地将颗粒重新悬浮在液体介质中。
[0069]
30.根据方面25至29中任一项所述的方法，其进一步包括：
[0070]-冻干所述颗粒；和
[0071]-任选地将颗粒重新悬浮在液体介质中；
[0072]
其中优选地，在干燥颗粒并将颗粒重新悬浮在液体介质中之后进行冻干和任选的重新悬浮。
[0073]
31.根据方面25至30中任一项所述的方法，其进一步包括纯化颗粒的步骤。
[0074]
32.根据方面1至24中任一项所述的多肽颗粒或组合物，用于疫苗接种方法。
[0075]
33.根据方面32所述的多肽颗粒或组合物的用途，其中所述方法包括将所述多肽颗粒或组合物施用于皮肤、施加超声并诱导惯性空化，使得多肽颗粒或组合物透皮递送。
[0076]
34.根据方面32或33所述的多肽颗粒或组合物的用途，其中超声以100至500khz的
频率和0.5mpa至2.0mpa的峰值负压递送。
[0077]
35.根据方面32至34中任一项所述的多肽颗粒或组合物的用途，其中所述多肽颗粒或透皮疫苗组合物与dna或rna疫苗一起施用。
[0078]
36.根据方面1至24中任一项的多肽颗粒或组合物在制备用于疫苗接种方法的药物中的用途，特别是其中所述方法如方面33至35中任一项中所定义。
[0079]
37.对受试者进行疫苗接种的方法，其中所述方法包括向受试者施用预防有效量的根据方面1至24中任一项所述的多肽颗粒或组合物，特别是其中所述方法如方面33至35中任一项所述。
[0080]
附图简要说明
[0081]
图1是根据本发明的具有单个凹痕的颗粒的示意图。s表示粒径，d表示凹痕深度。p表示凹痕开口的尺寸，也称为开口直径。
[0082]
图2提供了用于制备本发明的超声响应颗粒的方法以及用于制备基本上球形的颗粒的方法的示例性示意图。
[0083]
图3a和3b显示了通过转盘共聚焦显微镜使用预先偶联有alexafluor 488nhs(图3a)和cy5nhs(图3b)的颗粒生成的z堆栈的3d重建；图3c显示了根据本发明的颗粒的扫描电子显微镜(sem)图像；图3d显示了根据本发明的颗粒的光学显微镜图像。图3e(i)显示了咪喹莫特的量与检测到的相应荧光峰面积(ex260nm-em340nm)的关系图；图3e(ii)显示了咪喹莫特的紫外吸光度曲线。
[0084]
图4显示了通过改变核内部挥发性组分的性质而产生的颗粒的平均直径(z-平均值(平均粒径))。
[0085]
图5显示了通过改变核内部挥发性组分的相对量而产生的颗粒的平均直径(z-平均值(平均粒径))。
[0086]
图6显示了四种压力设置下粒度对空化能力的影响。
[0087]
图7显示了在四种压力设置下核内挥发性组分百分比对空化能力的影响。
[0088]
图8显示了根据本发明产生的颗粒的持续惯性空化的代表性能量轨迹。
[0089]
图8a显示了在本发明颗粒和荧光素酶pdna的体内透皮递送过程中，pcd在1.7mpa下随时间检测到的能量。
[0090]
图9提供了体内空化实验中使用的超声硬件示意图。
[0091]
图10显示：(a)第7天elisa比较了在透皮和通过一系列注射递送由bsa制成的颗粒对bsa蛋白的免疫应答；(b)亲和力elisa法，定量产生的抗体的结合亲和力。
[0092]
图11提供了通过ivis成像定量的生物发光图，显示了编码荧光素酶的dna通过各种施用模式的递送程度，所述施用模式包含本文所述的dna与颗粒一起透皮施用。
[0093]
图12显示了用elisa定量测定天然西妥昔单抗蛋白和由西妥昔单抗产生的蛋白颗粒与egfr(天然受体)结合的结果。
[0094]
图13显示了通过各种给药模式施用covid刺突蛋白后21天后，针对covid刺突蛋白特异性的elisa结果。
[0095]
图14显示了超声方案2中使用的透皮递送设置的概述。
[0096]
图15显示了在处理后约22小时，在各种us压力(0.4mpa、1.5mpa、1.7mpa和2.0mpa)下，编码荧光素酶的dna与空化剂一起透皮递送后，通过ivis成像进行的生物发光测量。
[0097]
图16-19显示了在通过与空化剂一起透皮递送或皮内递送编码荧光素酶的dna后观察到的发光。图16显示了各种us压力(0.4mpa、1.5mpa、1.7mpa和2.0mpa)的结果。图17显示了不同us处理时间后观察到的发光。图18显示了不同处理时间的总声学传感器能量(tase)。
[0098]
图19显示了不同蛋白质颗粒剂量下观察到的发光。
[0099]
图20a显示了在通过与空化剂一起透皮施用或通过皮内给药递送编码荧光素酶的dna之后观察到的发光。图20b和20c分别显示了透皮组和皮内组在处理后约24小时通过ivis成像进行的生物发光测量。
[0100]
图21显示了在递送编码荧光素酶的dna后观察到的发光，其可以通过与空化剂一起在各种压力下透皮施用，或通过皮内施用。
[0101]
图22显示了通过透皮施用递送bsa空化剂后2分钟或24小时在皮肤中检测到的bsa。
[0102]
图23显示了通过elisa测量的给药后7天(图23a)或41天(图23b)产生的抗bsa抗体。
具体实施方式
[0103]
定义
[0104]
如本文所用，超声响应颗粒是当暴露于超声时产生响应，通常是空化响应的颗粒。适合于在暴露于超声时诱导(即能够诱导或适合于诱导)空化的颗粒是本文所述的超声响应颗粒。
[0105]
当流体中的气泡，例如与本发明的颗粒相关的气泡，由于外部输入(通常是声压)而改变尺寸或形状时，会发生空化。
[0106]
通常，颗粒在暴露于超声时会产生惯性空化响应。惯性空化是当流体中的气泡，例如与本发明的颗粒相关的气泡，在暴露于声压后生长并随后破裂时发生的效应。气泡破裂可能会在周围流体中引起冲击波和/或微流，并伴有宽带(而不是音调)声发射。惯性空化可以通过单元件或多元件检测器检测，包括用于常见医疗诊断的传统手持式超声阵列。惯性空化可被评估为在排除任何音调成分后，宽带噪声的存在程度可从背景中清晰辨别(例如，至少是背景均方根噪声的3倍)。如果对水中的颗粒混悬剂施加超声(例如在1.8mpa和265khz下)时存在宽带噪声(例如如上所述测量)，则认为颗粒会产生惯性空化响应。通过检测被动空化(pcd)水平，例如如图6所示，对于具有一定尺寸范围的颗粒展示惯性空化。
[0107]
本文定义的粒度是穿过颗粒的最大距离，即球形颗粒情况下的直径。尽管本文定义的颗粒形状不一定是球形的，但是粒度在本文中可以称为颗粒直径，并且这两个术语具有相同的含义。
[0108]
对于根据本发明的包含多个颗粒的组合物，粒度被定义为平均粒度。组合物内的平均粒度可以通过本领域技术人员已知的多种技术(malvern nanosight、beckman coulter粒度、动态光散射(dls))来测量。通常，平均粒度被定义为通过动态光散射(dls)测量的流体动力学直径。单个颗粒的粒度(图1中的s)可以通过扫描电子显微镜(sem)测量。
[0109]
如本文所用，凹痕是导致颗粒表面中出现空腔或凹陷的表面特征。凹痕在本文中也称为表面凹痕。通常，凹痕能够捕获或保留气泡。凹痕的深度如图1中的d所示，可以通过
显微镜(例如，sem或透射显微镜、tem)确定。任何凹痕的深度通常为至少约10nm，优选至少约20nm，更优选至少约50nm。凹痕具有开口，在部分球形凹痕的情况下，开口是颗粒表面处的凹痕的直径。开口如图1中的p所示。开口的尺寸在本文中被称为开口尺寸或开口直径，尽管开口的形状可以是圆形也可以不是圆形。
[0110]
壳厚度是多肽壳的平均厚度并且可以通过sem或tem测定。
[0111]
如本文所用，术语“多肽”是指全长蛋白质、蛋白质的一部分、以一串氨基酸为特征的肽。通常，多肽至少包含25、或30、或35、或40、或45、或50、或55或60个氨基酸。例如，多肽可以包含100个或更多个氨基酸。如本文所用，术语“蛋白质”是指全长蛋白质或蛋白质片段。
[0112]
本文所用，术语“片段”、“蛋白质片段”或“多肽片段”是指一串氨基酸或氨基酸序列，其长度通常相对于参考蛋白或多肽缩短，并且在共同部分上包含与参考蛋白质或多肽相同的氨基酸序列。在一些情况下，本文提及的片段可以是8或9至20、或25、或30、或35、或40、或45、或50个氨基酸。
[0113]
多肽壳是指由多肽形成的壳。通常，壳是基本上由一种或多种多肽组成的多肽壳。基本上由一种或多种多肽组成的多肽壳包含至少90％重量％、至少95％重量％、优选至少98重量％、例如至少99重量％、至少99.5重量％或至少99.9重量％的多肽。通常，壳包含交联的多肽颗粒。交联多肽颗粒能够形成稳定的壳结构。因此，颗粒不需要任何单独的基质来涂覆多肽，并且多肽本身形成颗粒的基础。这可以具有改善的生物降解性的优点。
[0114]
本文提及包含特定类型多肽的多肽壳意味着所述多肽在壳结构内交联。例如，包含致病性抗原蛋白的多肽颗粒包含在多肽壳内交联的致病性抗原蛋白质，即交联到壳中的多肽颗粒(其可以是壳中的其它致病性抗原，或交联到壳内的其它多肽颗粒)。类似地，包含佐剂蛋白的多肽颗粒包含在多肽壳内交联的佐剂蛋白。
[0115]
本文所用的术语“挥发性”是指物质在25℃时的蒸气压高于相同温度下水的蒸气压(水的蒸气压约为3kpa)。通常，挥发性物质或挥发性组分能够在室温(25℃)下蒸发。因此，本文所用的挥发性组分是液体，通常是有机溶剂，其在25℃下的蒸气压为至少3kpa，优选至少3.5kpa，例如至少5kpa、至少10kpa或至少15kpa。
[0116]
非挥发性表示物质在室温(25℃)下不蒸发或基本上不蒸发。因此，非挥发性组分通常是液体，例如油，其蒸汽压在25℃时不超过相同温度下的水(蒸汽压约为3kpa)。本文所用的非挥发性组分在25℃下的蒸气压通常小于3kpa，优选小于2.5kpa，例如小于2kpa。
[0117]
如本文所述，所述颗粒可用于受试者的疫苗接种方法。受试者是人类或动物受试者。一方面，待治疗的受试者是哺乳动物，特别是人类。然而，它可能是非人类。优选的非人类动物包含但不限于灵长类动物，例如狨猴或猴子，商业养殖的动物，例如马、牛、羊或猪，以及宠物，例如狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠、雪貂、沙鼠或仓鼠。
[0118]
本文所用的术语“疫苗接种”是指预防性治疗。通常以“预防有效量”施用，这足以产生临床反应或对个体显示出临床益处，例如，预防或延迟疾病或病症发作的有效量。
[0119]
本文所用的术语“透皮疫苗组合物”是指适合于透皮施用并且可用于对受试者进行疫苗接种的组合物。透皮疫苗组合物包含疫苗，即适合在受试者中诱导免疫应答的活性剂。疫苗可以例如是dna或rna疫苗或用于诱导针对病原体的免疫应答的抗原。例如，透皮疫苗组合物可以包含dna或rna疫苗和/或致病性抗原蛋白。所述疫苗可以是所述颗粒本身的
多肽壳的一部分、附着于所述颗粒的多肽壳的配体和/或可以作为所述组合物中的单独组分提供。透皮疫苗组合物可另外包含佐剂。
[0120]
本文所用的术语“佐剂”是指用于增强免疫调节的物质。佐剂包含小分子和基于蛋白质的物质，它们的作用是增强免疫应答，例如对疫苗的免疫应答。免疫刺激剂例如细胞因子和趋化因子是本文所用佐剂的实例。本文使用的术语“佐剂多肽”是能够充当佐剂的多肽。本文使用的术语“佐剂组合物”是包含佐剂并且任选地还可以含有疫苗的组合物。
[0121]
免疫调节多肽(或免疫调节蛋白)是在施用于受试者时诱导免疫应答的多肽(或蛋白)。通常，受试者是人并且蛋白质是在施用于人类受试者时诱导免疫应答的蛋白质。通常，免疫调节多肽(或免疫调节蛋白)的施用引起受试者产生针对该多肽(或蛋白)的抗体，尽管替代的免疫应答可能与产生抗体一起出现或代替产生抗体。
[0122]
非免疫调节多肽(或非免疫调节蛋白)是在施用时不引起免疫应答的多肽(或蛋白)。通常，这种多肽或蛋白质是在受试者体内天然存在的多肽或蛋白质。在人类受试者中，非免疫调节蛋白的实例是人血清白蛋白。更普遍地，人血液蛋白是非免疫调节蛋白的实例，包含胰岛素、球蛋白和血红蛋白。
[0123]
超声响应多肽颗粒
[0124]
本发明的多肽颗粒是超声响应颗粒。当在流体存在的情况下暴露于超声时，颗粒能够产生空化响应。通常它们会产生惯性空化。因此，当本发明的颗粒存在于流体中时，例如配制成凝胶或洗剂，或存在于体内时，暴露于超声将导致该流体内的惯性空化。
[0125]
颗粒具有一个或多个凹痕(即表面凹陷或空腔)，这提供了它们的超声响应特性。不限制本发明，目前理解颗粒表面中的凹痕或空腔能够捕获或保留气泡。暴露在超声下时，气泡长大然后破裂，引起惯性空化效应。因此，颗粒具有一个或多个能够在暴露于超声时引起惯性空化的凹痕。一方面，本发明提供了本文所述的颗粒，其包含捕获在颗粒上的凹痕处的气泡。例如，气泡可以包含空气或氧气。
[0126]
通常，当悬浮在水中并在1.8mpa和265khz的超声作用下，颗粒能够引起惯性空化，例如在1.2mpa和265khz下。如上所述，颗粒引起惯性空化的能力可以通过发射信号中宽带噪声的存在来评估。优选地，当颗粒悬浮在水中并在1mpa和500khz的超声作用下时，颗粒能够产生惯性空化。
[0127]
所述颗粒的平均粒度通常为100nm至10000nm，优选1000nm或更小的粒度的纳米颗粒。优选地，所述粒度为100nm至8000nm、优选100nm至5000nm、更优选100nm至1000nm。例如，粒度优选为200nm至1000nm，例如200nm至700nm，例如500nm左右。优选地，包含一种或多种本发明颗粒的组合物的平均粒度为100nm至10000nm，优选100nm至8000nm，优选100nm至5000nm，优选100nm至1000nm，更优选200nm至1000nm，例如200nm至700nm，例如500nm左右。例如，可以通过粒度过滤来控制粒度。
[0128]
一方面，所述颗粒的粒度大于500nm，优选大于600nm，例如600nm至10000nm，例如600nm至8000nm，优选600nm至5000nm或700nm至1000nm。在组合物的情况下，平均粒度可以大于500nm，优选大于600nm，例如600nm至10000nm，例如600nm至8000nm，优选600nm至5000nm或700nm至1000nm。
[0129]
在一个实施方案中，在多肽壳中包含佐剂多肽的颗粒的粒度大于600nm，例如600nm至10000nm，例如600nm至8000nm，优选600nm至5000nm或700nm至1000nm。在组合物的
情况下，平均粒度可以大于500nm，优选大于600nm，例如600nm至10000nm，例如600nm至8000nm，优选600nm至5000nm或700nm至1000nm。
[0130]
通常，颗粒包含单个凹痕或包含两个凹痕(在后一种情况下，它们通常近似环形形状，在颗粒的相对侧上包含两个凹痕)。还可以存在更小的颗粒特征，例如表面粗糙度，其中特征的开口尺寸为50nm或更小、优选20nm或更小、更优选10nm或更小。然而，通常，颗粒具有一或两个开口尺寸为50nm或更大的凹痕。
[0131]
凹痕的形式可以变化，只要凹痕颗粒能够引起惯性空化(例如，凹痕能够在其空腔内捕获或保持气泡)。通常，能够引起惯性空化的凹痕的开口尺寸为至少50nm或至少100nm。开口例如为10至500nm，例如50至300nm或100至300nm。在圆形开口的情况下，本文所指的凹痕的开口尺寸涉及颗粒表面处的开口的直径。在空腔在开口处具有非圆形横截面的情况下，开口尺寸是跨越颗粒表面处的开口的最大尺寸。
[0132]
凹痕开口的尺寸可以根据粒度而变化。例如，凹痕的开口的尺寸(直径)可以是粒度(直径)的至少10％，例如是粒度(直径)的至少20％，优选粒度(直径)的至少40％。颗粒中凹痕或空腔的开口尺寸(直径)(其绝对尺寸或与粒度相比的相对尺寸)可以通过成像，例如通过扫描电镜或原子力显微镜来确定。
[0133]
通常，能够引起惯性空化的凹痕的深度为至少10nm，例如至少50nm或至少100nm。例如，一个或多个凹痕的深度可能为10nm至250nm。一个或多个凹痕的深度可以是例如粒度的至少10％，例如粒度的至少20％或至少25％。颗粒中凹痕或空腔的深度(其绝对尺寸或与粒度相比的相对尺寸)可以通过成像，例如通过扫描电镜或原子力显微镜来确定。
[0134]
通常，至少一个凹痕的横截面形成圆锥截面。
[0135]
在一个实施方案中，颗粒具有包含一种非挥发性、水不混溶组分或其混合物的核(下文称为“水不混溶核”)。非挥发性组分(也称为水不混溶液体)的含量占颗粒的比例可能变化很大。例如，颗粒可包含0.1重量％至70重量％的非挥发性组分和30重量％至99.9重量％的多肽壳。非挥发性组分通常是油。非挥发性组分的性质不受特别限制并且可以使用任何生物相容性的、药学上可接受的油或其混合物。合适的组分包含葵花籽油、橄榄油、大豆油、椰子油、红花油、棉籽油、芝麻油、橙油、柠檬烯油、聚乙二醇、油酸、角鲨烯或其他非挥发性有机溶剂，以及这些油中的两种或两种以上的组合。在一个实施方案中，非挥发性组分是葵花籽油、橄榄油、大豆油、椰子油、红花油、棉籽油、芝麻油、橙油、柠檬烯油、聚乙二醇或其他非挥发性有机溶剂，以及这些油中的两种或更多种的组合。优选葵花籽油、橄榄油或这些油的组合。生物相容性的、药学上可接受的油通常本身不具有药学活性。在一个实施方案中，非挥发性组分是佐剂。合适的佐剂是非挥发性油型佐剂，例如本文所述的那些。
[0136]
一方面，水不混溶核基本上由一种或多种非挥发性组分组成或由一种或多种非挥发性组分组成。例如，在一个实施方案中，水不混溶核基本上由药学上可接受的赋形剂的一种或混合物组成，或由药学上可接受的赋形剂的一种或混合物组成，所述赋形剂是生物相容性的药学上可接受的油，通常是上面列出的生物相容性的药学上可接受的油。在本实施方案的一个优选方面，水不混溶核基本上由葵花籽油、橄榄油或这些油的组合组成，优选地由葵花籽油、橄榄油或这些油的组合组成。在本文中，表述“基本上由......组成”是指参照核的总重量，水不混溶核通常含有不超过5重量％(例如不超过2重量％，或不超过1重量％，优选不超过0.5重量％，更优选不超过0.1重量％或0.01重量％)的其他物质，例如非挥发性
组分以外的物质。因此，水不混溶性核可包含至少95重量％，优选至少98重量％、99重量％，更优选至少99.5重量％或99.9重量％，最优选至少99.99重量％的一种或多种药学上可接受的赋形剂，其是生物相容的、药学上可接受的油。生物相容性的、药学上可接受的油通常是非药学活性的，并且优选选自上文列出的那些油。
[0137]
在一个实施方案中，颗粒的核包含一种或多种佐剂。一种或多种佐剂可以例如是选自可溶于油基溶剂的佐剂的一种或多种。合适的实例包含铝盐如明矾、氢氧化铝或磷酸铝、钙盐(例如氢氧化磷酸钙)、铁盐、锌盐、酰化酪氨酸的不溶性混悬剂、酰化糖、阳离子或阴离子衍生的糖、聚磷腈、可生物降解微球、单磷酰脂质a(mpl)、脂多糖、脂质a衍生物(例如毒性降低的)、3-o-脱酰基mpl[3d-mpl]、洗涤剂，例如quil a、皂素、qs21、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂(difco laboratories，detroit，密歇根州)、默克佐剂65(merck and company,inc.，rahway，n.j.)、as-2(smith-kline beecham，费城，pa.)、cpg寡核苷酸、油，例如角鲨烯、矿物油，例如石蜡油、食品油，例如石蜡油佐剂65(源自花生油)、细菌产品，例如灭活的细菌，选自百日咳杆菌(bordatella pertussis)、牛分枝杆菌(mycobacterium bovis)、类毒素、生物粘附剂和粘膜粘附剂、微粒、脂质体、聚氧乙烯醚制剂、聚氧乙烯酯制剂、胞壁酰肽或咪唑喹诺酮化合物(例如咪喹莫特及其同系物)。适合用作佐剂的人免疫调节剂包含细胞因子，例如白细胞介素(例如il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-7、il-12等)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、肿瘤坏死因子(tnf)、粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。这些免疫调节剂是可掺入核的佐剂的进一步实例。在一个具体的实施方案中，核包含咪唑并喹诺酮化合物，例如咪喹莫特。在一个实施方案中，佐剂是咪喹莫特或角鲨烯或其混合物。
[0138]
在一个实施方案中，颗粒的核不包含与水不混溶的液体，或者与水不混溶的液体仅以少量存在，例如以足以稳定或溶解任何佐剂的量存在。通常，在本实施方案中，与颗粒总重量相比，水不混溶液体的存在量不超过10重量％，例如不超过5重量％。在本实施方案中，颗粒的核可以包含一种或多种佐剂，其可以固体或液体形式存在于核中，或者它们可以溶解在少量水不混溶液体中或与少量水不混溶液体混合(例如，与颗粒的总重量相比，最多10重量％，或最多5重量％的水不混溶液体)。核中还可以提供一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
[0139]
已发现该实施方案的颗粒不具有或具有少量水不混溶液体，对超声特别敏感。因此，当暴露于超声时，它们有效地产生惯性空化。
[0140]
当颗粒的核不包含与水不混溶的液体或佐剂时，颗粒的核可以是中空的。或者，多肽壳可以延伸至颗粒的核(换言之，多肽壳也形成颗粒的核；或者颗粒可以被认为不具有单独的核)。在该实施方案中，提及颗粒的“核”是指颗粒的中心部分，无论该中心部分是中空的还是由延伸至颗粒中心的多肽壳形成。
[0141]
在一个实施方案中，颗粒基本上由多肽组成或由多肽组成(或其基本上由本文所述的多肽壳组成)。在本文中，“基本上由......组成”表示颗粒由至少95重量％、优选至少98重量％、99重量％、更优选至少99.5重量％或99.9重量％并且最优选至少99.99重量％的多肽(或本文所述的多肽壳)组成。
[0142]
在一个实施方案中，颗粒的核不包含任何诊断或治疗成分。在一个实施方案中，颗粒的核不包含佐剂。当核不包含治疗或诊断组分和/或佐剂时，通常，此类组分以不超过痕
量存在，即其以不足以具有任何药物作用的量存在。通常，与颗粒重量相比，这种组分的存在量不超过0.1重量％，例如不超过0.01重量％。
[0143]
所述颗粒具有多肽壳，通常围绕核的周围。当核中不存在与水不混溶的液体或其他组分时，例如，颗粒可以具有中空核，或者多肽壳可以延伸至颗粒的核，即颗粒仅由多肽壳形成。多肽的性质不受特别限制并且可以使用多种不同的多肽。
[0144]
通常，多肽壳包含具有两个或更多个半胱氨酸残基的多肽。这使得多肽能够形成二硫交联键以产生多肽壳。优选地，所述多肽包含至少4个半胱氨酸残基，例如至少10个半胱氨酸残基。更多数量的半胱氨酸残基，特别是在多肽表面可接近的半胱氨酸残基，在多肽壳中产生更大程度的交联，这反过来可以为结构提供更大的稳定性。半胱氨酸残基天然存在于许多蛋白质中。然而，半胱氨酸残基可以被引入多肽链，例如通过基因工程技术。
[0145]
多肽壳通常包含分子量至少5kd、优选至少10kd的多肽。具有不同分子量的多种多肽可用于形成多肽壳。因此，多肽的分子量通常为5至80kd，优选为10至50kd。
[0146]
通常，多肽壳包含蛋白质。当多肽壳包含蛋白质时，本发明的颗粒通常具有该蛋白质功能的附加功能，例如为血红蛋白携带氧，或胰岛素改变葡萄糖代谢。这进一步意味着，空化过程完成后，整个颗粒可能会被代谢。在一个实施方案中，多肽壳包含人血蛋白(包含其片段)。合适的蛋白质的实例包含白蛋白、胰岛素、球蛋白和血红蛋白。其中，优选白蛋白、胰岛素和球蛋白。在此实施方案的一个优选方面，多肽壳包含血清白蛋白，优选人血清白蛋白。人血清白蛋白和其他血液蛋白是非免疫调节性的，即它们在施用于人类时不会引起免疫应答。因此，当多肽壳本身不旨在产生免疫调节反应时例如，当佐剂存在于水不混溶核中并且不需要进一步的免疫调节反应时，它们是有益的。
[0147]
在一个实施方案中，多肽壳包含一种或多种非免疫调节多肽，通常为一种或多种非免疫调节蛋白，即在施用于人类时不引起免疫应答的一种或多种多肽或蛋白。优选地，在该实施方案中，多肽壳含有不超过5重量％、优选不超过1重量％的免疫调节蛋白，更优选地，多肽壳不包含免疫调节蛋白。优选地，在该实施方案中，多肽壳包含一种或多种人血液蛋白，特别是白蛋白、胰岛素、球蛋白和血红蛋白中的一种或多种，优选人血清白蛋白。更优选地，在该实施方案中，多肽壳基本上由、特别是由一种或多种人类血液蛋白组成，特别是白蛋白、胰岛素、球蛋白和血红蛋白中的一种或多种。优选地，多肽壳基本上由人血清白蛋白组成，特别是由人血清白蛋白组成。
[0148]
在另一个实施方案中，多肽壳包含能够产生免疫应答的多肽，通常是致病性抗原蛋白和/或佐剂蛋白。在一个实施方案中，多肽壳包含至少一种致病性抗原蛋白。致病性抗原蛋白可以是全长蛋白或其片段。合适的抗原蛋白的实例包含病毒蛋白或寄生蛋白的片段。例如，抗原可以来自选自cal09(流感病毒)、冠状病毒(例如β冠状病毒科或sars-cov-2)、乙型肝炎、百日咳杆菌、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、脑膜炎球菌、人乳头状瘤病毒(hpv)或疟原虫(plasmodium sporozoites)的病原体。在本实施方案中，优选地，多肽壳包含能够产生免疫应答(例如，至少一种致病抗原)的多肽，其重量与壳中的总多肽相比不小于1重量％，例如约10重量％。
[0149]
在一个优选的方面，抗原蛋白是病毒刺突蛋白，优选sars-cov-2蛋白的刺突蛋白(例如sars-cov-2s1亚基蛋白(rbd))。另一方面，抗原是环子孢子蛋白(csp)，是子孢子寄生虫的分泌表面蛋白。在进一步的方面，抗原是hepb表面抗原蛋白(hbsag)。在另一方面，抗原
与流感病毒相关并且选自血凝素和/或流感神经氨酸酶。另一方面，抗原是丝状血凝素(百日咳)。另一方面，抗原是肺炎球菌表面蛋白a(pspa)。另一方面，抗原选自奈瑟氏菌黏附因子a(nada)、奈瑟菌肝素结合抗原(nhba)和/或因子h结合蛋白(fhbp)。另一方面，抗原是hpv-16e6/e7融合蛋白。也可以使用这些蛋白质中任意一种的片段或基因修饰版本。
[0150]
颗粒的多肽壳可以包含两种或更多种不同的抗原蛋白。例如，同一病原体的两种或更多种不同抗原蛋白，或者不同病原体的两种或更多种抗原。可替代地或另外，根据本发明的组合物可包含两种或更多种不同的颗粒，其中所述颗粒在其多肽壳中包含不同的抗原蛋白。在这种情况下，组合物可以包含具有相同病原体的两种或更多种不同抗原蛋白和/或不同病原体的两种或更多种抗原的颗粒。
[0151]
在另一个实施方案中，多肽壳包含佐剂多肽，使得多肽壳可以充当佐剂，增加疫苗的免疫调节作用。合适的佐剂多肽的实例包含非人白蛋白(例如牛血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、卵清蛋白)、sflt配体、细胞因子和趋化因子，例如白细胞介素(例如il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-7、il-12等)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、肿瘤坏死因子(tnf)、粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。卵清蛋白是优选的佐剂蛋白。可以使用两种或两种以上这种蛋白质的组合。通常，在多肽壳包含佐剂多肽的情况下，本发明的疫苗组合物还包含单独的疫苗，例如rna或dna疫苗。
[0152]
多肽壳可包含单一多肽或两种或更多种不同多肽的混合物。例如，多肽壳可以包含两种或更多种不同的致病性抗原蛋白。或者，多肽壳可包含两种或更多种不同的佐剂多肽。此外，多肽壳可包含一种或多种致病性抗原蛋白和一种或多种佐剂多肽。优选地，多肽壳包含单一多肽(即，多肽壳包含单一类型的多肽，包含其片段，并且不包含两种或更多种不同多肽的组合)。在进一步的实施方案中，多肽壳包含一种或多种致病性抗原蛋白、任选的一种或多种佐剂蛋白、以及任选的一种或多种另外的多肽。另外的多肽可以是非免疫调节性的，例如，人血清白蛋白。
[0153]
多肽壳任选地与一个或多个配体偶联。例如，多肽壳可以与选自肽、蛋白质、糖、纳米颗粒和核酸的一种或多种配体偶联。标记部分也可以与多肽壳偶联。出于多种原因，通常使用与蛋白质的偶联。例如，可以通过与聚糖(糖)或具有特定所需性质的其他蛋白质(例如抗原)偶联来修饰蛋白质的性质。在一个实施方案中，多肽壳与一种或多种佐剂偶联。合适的佐剂包含铝盐，例如明矾、氢氧化铝或磷酸铝，但也可以是钙盐(例如氢氧化磷酸钙)、铁盐或锌盐，或者可以是酰化酪氨酸或酰化糖的不溶性混悬剂，或可以是阳离子或阴离子衍生的糖、聚磷腈、可生物降解微球、单磷酰脂质a(mpl)、脂多糖、脂质a衍生物(例如毒性降低的)、3-o-脱酰基mpl[3d-mpl]、洗涤剂，例如quil a、皂素、qs21、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂(difco laboratories，detroit，密歇根州)、默克佐剂65(merck and company,inc.，rahway，n.j.)、as-2(smith-kline beecham，费城,pa.)、cpg寡核苷酸、油，例如角鲨烯、矿物油，例如石蜡油、食品油，例如石蜡油佐剂65(源自花生油)、例如灭活的细菌，选自百日咳杆菌、牛分枝杆菌、类毒素、生物粘附剂和粘膜粘附剂、微粒、脂质体、聚氧乙烯醚制剂、聚氧乙烯酯制剂、胞壁酰肽或咪唑喹诺酮化合物(例如咪夸莫特及其同系物)。适合用作佐剂的人免疫调节剂包含细胞因子，例如白细胞介素(例如il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-7、il-12等)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、肿瘤坏死因子(tnf)、粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。此类佐剂可被修饰以包含合适的结合位点以能够与多肽壳偶联。
[0154]
在本发明中可采用的与蛋白质偶联的常见技术是将赖氨酸残基靶定在蛋白质表面上。因此，具有与胺(例如，nhs)反应的基团的配体可以与多肽壳上的赖氨酸偶联。然而，可以采用替代的偶联化学。
[0155]
配体可在颗粒形成后与多肽壳偶联。或者，配体可以在颗粒形成之前与多肽偶联。
[0156]
多肽颗粒的壳厚度通常为至少10nm，优选至少20nm，例如约30至40nm。例如，多肽壳厚度可以为10至100nm，优选20至60nm。多肽纳米颗粒壳的厚度可以通过冷冻切片和tem成像来确定。
[0157]
本发明的颗粒高度稳定并且可以作为在水溶液中的混悬剂或以固体形式储存。例如，颗粒可以在4℃下保存至少几个月。
[0158]
合成
[0159]
本发明的多肽颗粒可通过两步工艺制备，该两步工艺涉及(a)获得具有多肽壳和水不混溶核的颗粒，所述核包含一种或多种挥发性组分、任选的一种或多种非挥发性组分和任选的一种或多种佐剂，以及(b)从核中去除挥发性组分以产生具有超声响应特性的所需具有凹痕的颗粒。
[0160]
因此，本发明提供了生产根据本发明的多肽颗粒的方法，包括：
[0161]-提供水不混溶相，其包含一种或多种挥发性组分、任选的一种或多种非挥发性组分、以及任选的一种或多种佐剂；
[0162]-将所述水不混溶相与至少一种多肽的水溶液混合，其中多肽任选地包含致病性抗原蛋白和/或佐剂蛋白，从而提供双相组合物；
[0163]-交联所述多肽以产生具有包含水不混溶相的核和包含至少一种多肽的壳的颗粒；和
[0164]-通过将颗粒置于减压条件下，从核中去除挥发性组分，从而在颗粒中形成一个或多个凹痕。
[0165]
通常通过首先产生双相组合物来制备颗粒，所述双相组合物包含(1)水不混溶相，所述水不混溶相包含一种或多种挥发性组分、任选的一种或多种非挥发性组分和任选的一种或多种佐剂；以及(2)包含存在于多肽壳中的多肽或多肽混合物的水相。水溶液通常包含至少约0.05重量/体积％的多肽，例如至少约0.5％、优选至少约1重量/体积％的多肽。通常，多肽浓度不高于约25重量/体积％，例如不高于约15重量/体积％，优选不高于约10重量/体积％。因此，水相中多肽的合适浓度为0.5至15重量/体积％，优选1至10重量/体积％，更优选约5重量/体积％。
[0166]
双相混合物中水不混溶相与水相的体积比通常约为1:5至3:1，例如1:4至1:1，例如约1:3。
[0167]
水不混溶相包含一种或多种挥发性组分。挥发性组分的性质没有特别限制，但通常选择使得该挥发性组分或每种挥发性组分是(a)与水不混溶，通常是挥发性有机组分，例如挥发性有机溶剂，并且(b)在减压步骤中容易除去。因此，通常，该挥发性组分或每种挥发性组分在25℃下的蒸气压大于相同温度下水的蒸气压。通常，该挥发性组分或每种挥发性组分在25℃时的蒸气压为至少3kpa、优选至少3.5kpa、例如至少5kpa、至少10kpa或至少15kpa。合适的挥发性组分包含环己烷、己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丙酯和甲苯，例如己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丙酯和甲苯。环己烷是优选的挥发性组分。可以使用这些组分
中的两种或更多种的混合物。挥发性组分最初可用作任何存在的佐剂的溶剂，使得佐剂在挥发性组分中的溶液用于制备本发明的颗粒。所使用的任何药学上可接受的赋形剂也可以溶解在水不混溶组分中。
[0168]
在下一步之前，双相混合物可以在升高的温度下保持一段时间。例如，双相混合物可以在约37℃下孵育长达2小时，例如约1小时。
[0169]
然后，将包含水不混溶相和水相的双相混合物置于引起多肽交联的条件下，通常通过交联多肽中的半胱氨酸残基。所使用的条件也可以使混合物乳化。通常，例如，交联是通过使双相混合物均质化来实现的，例如通过施加高压和/或高剪切应力条件。优选地，使用超声进行均质化。在另一个优选的实施方案中，通过高剪切混合进行均质化。高剪切应力导致多肽交联，特别是通过连接多肽链内的半胱氨酸基团。应当理解，均质化条件可以氧化半胱氨酸残基上的巯基，或破坏现有的二硫键，从而允许新的二硫键形成并产生交联的壳结构。水不混溶相保持物理地捕获在交联的多肽壳内，从而提供所需的核-壳结构。通过均质化步骤产生的颗粒通常是基本上球形的。
[0170]
实现均质化的方法的一个实施例是将超声探头放置在水相和水不混溶相的界面处，并施加低频超声。可以以大约50％的振幅施加超声。例如，可以施加超声至少1分钟，例如约3分钟。例如，使用qsonica q125超声探头(频率：20khz；功率：125瓦)以50％振幅持续3分钟实现颗粒形成。
[0171]
实现均质化的另一种方法是使用流体动力空化，它使用高压将液体泵入狭窄的孔口。当液体通过孔口时流速增加，并且通过孔口后速度随后降低，导致空化核生长然后塌陷。将流体动力学空化应用于双相混合物可能会引起半胱氨酸残基的交联和/或乳化，从而导致颗粒的形成。流体动力剪切是另一种替代方法，它可以产生相同的活性氧，减少/氧化导致颗粒形成的半胱氨酸残基。例如，该方法可包含通过高剪切混合形成预乳液，然后使该预乳液通过流体动力剪切微流化器，例如在7000psi至40000psi(约50至约275mpa)、通常10000至30000psi(约70至约200mpa)、例如约20000psi(约140mpa)的压力下。也可以使用其他超声处理方法。例如，可以使用肿瘤匀质器。
[0172]
通过这种均质化方法产生的具有水不混溶核和多肽壳的球形颗粒在本领域中是已知的，并且先前已经描述了它们的合成方法(参见suslick k.s.和m.w.grimstaff，美国化学学会会刊，1990，112(21)，p7807-7809，其内容通过引用并入本文)。本发明的颗粒可以通过这样的技术或其他超声处理方法来制备，例如us5439686中描述的那些，其内容通过引用并入本文。
[0173]
在产生多肽壳之后，本发明的颗粒经历去除挥发性组分的步骤，导致颗粒变形并因此产生所需的具有凹痕的结构。挥发性组分的去除可以在减压条件下进行。例如，该步骤可以使用真空蛋白质浓缩器例如speed vac
tm
(thermo scientific)来进行，但也可以使用其他仪器，例如旋转蒸发仪。减压条件通常施加至少30分钟，优选至少1小时。例如，可以施加减压2至16小时。冻干(冷冻干燥)可用作去除挥发性溶剂的替代方法。在一些实施方案中，采用这些方法的组合。
[0174]
存在于水不混溶相中的挥发性组分的性质和量影响粒径并且可以用作控制所产生粒径的因素。挥发性组分的量也会影响颗粒的变形，从而影响任何凹痕的大小。一般而言，挥发性组分的量越大，预期产生的凹痕尺寸越大。由于气泡被困在凹痕空腔内的可能性
发生变化，凹痕尺寸的变化也可能与凹痕颗粒产生的空化效应有关。
[0175]
当在水不混相中同时使用挥发性和非挥发性组分时，可通过改变水不混相中非挥发性组分和挥发性组分的相对量来改变挥发性组分的量。通常，(a)任选地含有溶解的佐剂的挥发性组分与(b)非挥发性组分的体积比为约1:20至20:1，优选约1:4至15:1，例如约1:3至3:1，更优选约0.5:1至2:1(1:2至2:1)，最优选约1:1。通常需要至少1:20的挥发性与非挥发性组分的最小体积比(约5％非挥发性组分)，以在从核中去除挥发性组分时实现颗粒中的凹痕。已发现，在水不混相中，挥发物含量至少为40体积％，优选为45体积％至55体积％，优选约为50体积％(或1:1)，可提供改善的空化性能。
[0176]
在另一个优选实施方案中，水不混溶相中挥发性与非挥发性组分的比例通常为约1:20至20:1，优选约1:4至15:1，例如约1:1至15:1，更优选约5:1至10:1。
[0177]
或者，水不混溶相可基本上不包含非挥发性组分，或可不存在非挥发性组分。因此，可以存在不超过5体积％，例如不超过2体积％、1％或0.5体积％的非挥发性组分，例如不超过0.1体积％或0.01体积％的非挥发性组分。
[0178]
当使用时，存在于水不混溶相中的佐剂的量可以变化并且取决于试剂的性质。例如，佐剂在挥发性组分中的存在量可以为0.1ug至1mg/ml，通常为0.5至100ug/ml，例如1至10ug/ml。一旦产生，存在于颗粒核中的佐剂的量可以通过改变挥发性组分中试剂的浓度来控制。
[0179]
本发明的方法还可以包括以下步骤：
[0180]-干燥颗粒；和
[0181]-任选地将颗粒重新悬浮在液体介质中。
[0182]
干燥步骤可通过蒸发进行，例如在减压和/或温和加热的情况下。例如，该步骤可以使用温度设定至高达约40℃的旋转蒸发仪来进行。通常，干燥步骤与挥发性组分的蒸发步骤相结合，但继续减压(和任选地温和加热)条件下进行较长时间并通过使用温和加热，以蒸发水以提供固体产品。因此，例如，可以通过施加减压条件和在高达40℃下加热直到产生固体来进行挥发性组分的去除和干燥。
[0183]
然后优选将颗粒重新悬浮在液体介质中，通常是水或水溶液例如缓冲液。重新悬浮可以为颗粒提供改善的长期稳定性，因此优选在储存之前将它们重新悬浮。然而，颗粒也可以以固体形式储存并在使用前重新悬浮。干燥和重新悬浮可能有助于将气泡捕获在颗粒上的任何凹痕中，从而提供改进的惯性空化响应。
[0184]
该方法可以替代地或另外地包括：
[0185]-冻干颗粒；以及
[0186]-任选地将颗粒重新悬浮在液体介质中。
[0187]
冻干可用于除去挥发性溶剂并干燥颗粒，例如以与前述旋转蒸发类似的方式。因此，冻干被用作溶剂去除/干燥方法的替代方法，如上所述。或者，冻干可以在通过另一种方法除去溶剂之后进行，并且任选地在如上所述的干燥之后进行。
[0188]
通常，将颗粒重新悬浮在液体介质中，通常是水或水溶液，例如缓冲液。重新悬浮可以为颗粒提供改善的长期稳定性，因此优选在储存之前将它们重新悬浮。然而，颗粒也可以以固体(冻干)形式储存并在使用前重新悬浮。冻干和重新悬浮可以进一步帮助将气泡捕获在颗粒上的任何凹痕中，这提供了改进的惯性空化响应。经干燥和重新悬浮、随后冻干和
重新悬浮的颗粒已经证明了特别改进的空化响应。
[0189]
干燥和/或冻干的步骤可以用本文描述的任何颗粒进行。然而，在一个优选的实施方案中，当颗粒通过使用核中仅含有挥发性组分(即，挥发性组分蒸发后的最终颗粒在核中不包含水不混溶液体)生产时，或者当颗粒使用低比例，约10体积％、通常小于10体积％、优选小于5体积％、例如小于1体积％或小于0.1体积％的水不混溶相中的非挥发性组分(使得最终颗粒具有包含少量非挥发性组分，例如与总颗粒相比约10体积％、小于10wt％、优选小于5wt％的核)生产时，优选将颗粒干燥和/或冻干。最优选地，将这些颗粒干燥、重新悬浮，然后冻干。还更优选地，将这些颗粒干燥、重新悬浮、冻干并再次重新悬浮。
[0190]
颗粒可以通过合适的方式纯化和/或进行筛分过滤。例如，可以通过任何合适的方法，例如通过透析，例如通过具有适当大小(例如1m da)截留分子量的透析过滤器透析，将颗粒与残余油、溶剂和蛋白质分离。尺寸过滤和/或离心也可用于限制颗粒的最大尺寸。纯化可以在挥发性组分蒸发之后、干燥和重新悬浮之后、或者在冻干和重新悬浮之后进行。
[0191]
颗粒可以悬浮在液体介质中以供储存或使用，液体介质例如水或水溶液，任选地缓冲溶液。
[0192]
组合物
[0193]
本发明提供了一种组合物，通常是药物组合物，其包含一种或多种本文所述的多肽颗粒。含有疫苗的组合物在本文中称为疫苗组合物(特别是透皮疫苗组合物)。含有佐剂但不含疫苗的组合物在本文中被称为佐剂组合物。本发明提供了用于透皮施用的透皮疫苗组合物和佐剂组合物。组合物可以单独包含多个多肽颗粒，或者颗粒可以与一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂一起提供。通常，与载体或稀释剂一起提供的组合物含有至多85重量％的本发明颗粒。更典型地，这样的组合物含有至多50重量％的本发明的颗粒。优选的药物组合物是无菌且无热原的。
[0194]
本发明的组合物可以包含一种或多种不同类型的根据本发明的颗粒。例如，组合物可包含具有第一类型多肽壳的第一颗粒和具有第二(不同)类型多肽壳的第二颗粒。因此，例如，所述组合物可包含含有与相同病原体相关的两种或多种不同抗原蛋白的两种或多种颗粒的颗粒。可替代地或另外，所述组合物可包含包含致病性抗原蛋白的颗粒和包含佐剂的单独颗粒。可替代地或另外，所述组合物可包含含有与不同抗原相关的抗原蛋白的颗粒，使得所述组合物可用于为受试者接种针对两种或更多种不同病原体的疫苗。通常，本发明的组合物包含单一类型的颗粒。
[0195]
所述组合物可以包含颗粒，颗粒本身包含佐剂。可替代地或另外，组合物中可包含另外的佐剂。合适的另外的佐剂包含铝盐，例如明矾、氢氧化铝或磷酸铝，但也可以是钙盐(例如氢氧化磷酸钙)、铁盐或锌盐，或者可以是酰化酪氨酸或酰化糖的不溶性混悬剂，或者可以是阳离子或阴离子衍生的糖、聚磷腈、可生物降解微球、单磷酰脂质a(mpl)、脂多糖、脂质a衍生物(例如毒性降低的)、3-o-脱酰基mpl[3d-mpl]、洗涤剂，例如quil a、皂素、qs21、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂(difco laboratories，detroit，密歇根州)、默克佐剂65(merck and company,inc.，rahway，n.j.)、as-2(smith-kline beecham，费城,pa.)、cpg寡核苷酸、油，例如角鲨烯、矿物油，例如石蜡油、食品油，例如石蜡油佐剂65(源自花生油)、细菌产品，例如灭活的细菌，选自百日咳杆菌、牛分枝杆菌、类毒素、生物粘附剂和粘膜粘附剂、微粒、脂质体、聚氧乙烯醚制剂、聚氧乙烯酯制剂、胞壁酰肽或咪唑喹诺酮化合物(例如
咪喹莫特及其同系物)。适合用作佐剂的人免疫调节剂包含细胞因子，例如白细胞介素(例如il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-7、il-12等)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、肿瘤坏死因子(tnf)、粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。
[0196]
透皮疫苗组合物可包含颗粒，其本身包含致病性抗原蛋白(例如在多肽壳中或作为连接至多肽壳的配体)。可替代地或另外，组合物中可包含单独的疫苗。单独的疫苗可以是致病性抗原蛋白或dna或rna疫苗。优选地，所述透皮疫苗组合物包含在多肽壳中含有致病抗原蛋白的颗粒和/或所述组合物进一步包含dna或rna疫苗。
[0197]
组合物中的颗粒可以基本上是单分散的。例如，它们的多分散性指数为0.20或更小，例如0.19或更小、0.18或更小、0.17或更小、0.16或更小、或者0.15或更小。颗粒的更大单分散性可以提供对空化的更大控制，从而改善声学调谐(acoustic tuning)。多分散性可以通过dls测定。
[0198]
在一个实施方案中，与载体或稀释剂一起提供的组合物是液体分散体。通常，水(优选无菌水)用作液体分散体的稀释剂。
[0199]
本发明的颗粒可以透皮施用，例如作为凝胶。用于透皮施用的凝胶可以包含选自醇例如乙醇或丙醇、甘油、丙二醇或聚乙二醇的稀释剂。凝胶还可以包含防腐剂并且可以包含水或缓冲溶液。可以掺入渗透增强剂，例如脂肪酸、脂肪醇、尿素、亚砜、氮酮、吡咯烷酮、精油、萜烯和萜类化合物。或者，用于透皮递送的凝胶可以配制为囊泡(proniosome)或微乳液凝胶。
[0200]
施用
[0201]
本发明的颗粒或组合物通常施用于皮肤区域，并向该区域提供超声以产生颗粒的惯性空化响应。
[0202]
超声通常以100至1000khz、优选100至500khz、例如200至300khz的频率递送，任选地，占空比(dc)为1％至20％，优选5％至20％，例如5％至15％。通常，所递送的超声的脉冲重复频率(prf)为0.01至100hz、优选0.1至100hz、例如1至50hz，优选5至20hz。通常，在0.5mpa至3.0mpa的峰值负压(pnp)、优选0.5mpa至2.0mpa、例如1.0至2.0mpa、或1.5至1.8mpa的pnp下提供超声。
[0203]
特别优选的超声条件是1.0至2.0mpa和100至500khz，例如1.8mpa和265khz。
[0204]
超声施加持续时间为10秒至15分钟、通常30秒至10分钟、优选1至5分钟。特别优选的处理时间为1至3分钟，最优选约2分钟。
[0205]
对施用于皮肤的颗粒制剂施加超声可以在制剂内引起惯性空化，从而有助于颗粒和任何共同施用的试剂(例如共同施用的疫苗)的透皮递送。超声以前曾被用来辅助药物的透皮递送。然而，之前的工作主要集中在使用超声来渗透皮肤，并且通过其他方式，例如通过弹道递送(ballistic delivery)来递送颗粒。相反，本发明仅通过将颗粒以合适的制剂(例如凝胶)施用并在该部位提供超声就能够使颗粒穿过皮肤。小尺寸颗粒和惯性空化引起的微流效应相结合，推动颗粒与任何共同递送的试剂一起穿过相对不渗透的角质层，从而提供有效的透皮递送。
[0206]
本文提供的实施例证明了通过透皮递送成功施用本发明的颗粒。颗粒与编码荧光素酶的dna一起施用，施用后的发光测量提供了透皮给药成功程度的指示(见图11)。发光与直接注射dna所达到的发光效果相当。
[0207]
颗粒的用途
[0208]
本发明的颗粒和组合物可以用于疫苗接种方法。本发明的颗粒引发针对掺入多肽壳中的多肽的抗体的能力为疫苗接种方法中的使用提供了特别的益处。颗粒可以可替代地或另外提供单独的疫苗，例如rna或dna疫苗。
[0209]
因此，本发明提供了本文所述的用于疫苗接种方法的颗粒或组合物。还提供了一种疫苗接种方法，包括向受试者施用有效量的本文所述的颗粒或组合物。还提供了本文所述的颗粒或组合物在制备用于疫苗接种方法的药物中的用途。
[0210]
本身作为疫苗产生免疫效果的颗粒可以与佐剂一起提供和/或颗粒本身可以另外包含佐剂。一方面，所述颗粒在颗粒的水不混溶核中包含佐剂。然而，考虑到颗粒增强的免疫效果，在疫苗接种方法中使用颗粒的优点是无需施用佐剂即可实现足够的免疫效果。
[0211]
在本发明的替代实施方案中，颗粒与(或者本发明的透皮疫苗组合物可以包含)疫苗一起施用，例如(核糖)核酸疫苗。在一些实施方案中，核酸疫苗是rna或dna疫苗。在该实施方案中，本发明的颗粒通常包含佐剂。
[0212]
当在疫苗接种方法中使用佐剂时，佐剂可以与本发明的颗粒分开提供(即以单独的组合物)，它可以与颗粒在相同的组合物中提供(但不是作为颗粒本身的一部分)，或者佐剂可以掺入颗粒本身。这些方法中的两种或两种以上可以结合使用。
[0213]
当佐剂存在于颗粒本身时，它可以包含在与水不混溶核内，和/或佐剂多肽可以包含在多肽壳内，和/或佐剂可以作为与本发明的颗粒的多肽壳偶联的配体提供。
[0214]
在本发明的一个具体方面，本发明的多肽颗粒或组合物包含佐剂(其可以存在于水不混溶核中、多肽壳中和/或作为与多肽壳偶联的配体)并且所述颗粒与疫苗一起施用，或者所述组合物包含疫苗，例如(核糖)核酸疫苗，特别是rna或dna疫苗。优选地，本发明的多肽颗粒或组合物具有包含本文所述的佐剂多肽的多肽壳，并且颗粒或组合物与疫苗一起施用，例如(核糖)核酸疫苗，特别是rna或dna疫苗。
[0215]
因此，本发明还提供了组合物或试剂盒，其包含本发明的颗粒，以及疫苗，例如(核糖)核酸疫苗，通常是rna或dna疫苗。颗粒通常包含佐剂，优选地，颗粒具有包含佐剂多肽的多肽壳。
[0216]
剂量
[0217]
本发明的颗粒的剂量可以根据各种参数，特别是根据所使用的物质；接受治疗的个体人的年龄、体重和状况；以及所需的治疗方案来确定。例如，每个剂量中颗粒的量可以选择为诱导免疫应答的量。医生将能够确定任何特定个体所需的剂量。该剂量可以作为单剂量提供或者可以作为多剂量提供，例如以规则间隔服用，例如2、3或4剂。通常，基于多肽的治疗以1pg至1mg、更典型地1pg至10μg的范围施用用于颗粒介导的递送，以及1μg至1mg、更典型地1至100μg、更典型地5至50μg施用以用于其他途径。通常，预计每个剂量将包括0.01至3mg的多肽。特定治疗的最佳剂量可以通过涉及观察受试者免疫应答的研究来确定。
[0218]
实施例
[0219]
颗粒合成
[0220]
根据方案a制备超声响应颗粒如下：
[0221]
将3ml的50mg/ml蛋白质溶液用1ml含有油和任选的挥发性组分以及在某些情况下还含有添加剂的水不混溶溶液覆盖，以产生双相溶液。将双相混合物密封在玻璃瓶中并在
37℃的培养箱中放置1小时。
[0222]
然后将超声探头放置在两层的界面处，并使用qsonica q125以50％振幅施加125瓦的低频超声3分钟。这产生了颗粒的乳液，其中包含含有水不混溶的混合物的核和蛋白质壳。
[0223]
然后使用speedvac
tm
蛋白质浓缩器在减压下除去颗粒核的挥发性溶剂成分，以提供含有颗粒的溶液。
[0224]
然后通过在1m da分子量过滤器中透析24至48小时，将所得具有凹痕的颗粒与残油、溶剂和蛋白质分离。
[0225]
还根据修改后的方案b制备颗粒。方案b与方案a相同，不同之处在于蛋白质的浓度较低，为666ul水中0.5mg蛋白质，然后用333ul的油/挥发性溶剂层覆盖。
[0226]
还根据修改后的方案c生产颗粒：
[0227]
将3ml的50mg/ml的蛋白质溶液用1ml水不混溶的溶液覆盖以产生双相溶液。将双相混合物密封在玻璃瓶中并在37℃的培养箱中放置1小时。
[0228]
然后将超声探头放置在两层的界面处，并使用qsonica q125以50％振幅施加125瓦的低频超声3分钟。这产生了颗粒的乳液，其中包含含有水不混溶混合物的核和蛋白质壳。
[0229]
然后通过在40℃下旋转蒸发48小时在减压下除去颗粒核的挥发性溶剂组分以提供固体颗粒。
[0230]
颗粒重新悬浮在水中。然后将一些颗粒冷冻干燥48小时，然后再次重新悬浮在水中。
[0231]
制备了以下颗粒：
[0232]
表1
[0233][0234]
使用的牛血清白蛋白(bsa)纯度》99％，sigma a7638。
[0235]
使用的covid刺突蛋白为sars-cov-2，si，rbd，cambridge bioscience，230-30162-1000
[0236]
*添加的试剂量或浓度是在整个水不混溶核中的量/浓度。
[0237]
颗粒分析和颗粒表面化学改性
[0238]
在颗粒与荧光团偶联后，通过动态光散射(dls)、扫描电子显微镜(sem)和转盘共聚焦显微镜对颗粒进行分析。
[0239]
扫描电镜分析
[0240]
仪器：
[0241]
使用zeiss sigma 300场发射枪扫描电子显微镜(feg-sem)进行扫描电子显微镜(sem)分析。
[0242]
方法：
[0243]
通常将原液稀释为1/1000。将其用1％戊二醛固定2小时，并将10ul添加到黑色碳带上并在成像前涂金。
[0244]
转盘共聚焦显微镜
[0245]
仪器：
[0246]
使用andor dragonfly转盘共聚焦显微镜生成高分辨率z堆栈，然后将其编译成蛋白质颗粒的3d重建。
[0247]
方法：
[0248]
颗粒与n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)或alexafluor tm 488n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)反应1小时。使用10kda分子量盒透析16小时用于在成像之前去除残留的未偶联染料。
[0249]
动态光散射
[0250]
仪器：
[0251]
使用dls(zetasizernano，malvern)和红色激光测量尺寸分布。每个样品均经过大约10次运行的3次测量进行测试。
[0252]
方法：
[0253]
用millipore水将10ul如上所述制备的颗粒样品稀释至1ml并在标准1ml比色皿中进行分析。
[0254]
图3a至3b和图3c分别通过3d共聚焦显微镜和扫描电镜显示了前述实施例1的颗粒。配体通过nhs-赖氨酸偶联成功地与颗粒偶联，并通过共聚焦显微镜观察颗粒，如图3a所示。
[0255]
可以看到颗粒具有凹痕结构，这与颗粒在凹痕中捕获气泡的能力相一致。颗粒有一个或两个主要的凹痕。
[0256]
该实验还证实，在形成颗粒后，蛋白质保留了进行标准蛋白质偶联反应的能力，在这种情况下，与靶向赖氨酸残基的化学反应。两种不同的赖氨酸反应染料偶联后，颗粒发出荧光。
[0257]
图3d显示了使用光学显微镜观察的根据实施例18(经过冷冻干燥和在水中重悬)的颗粒。
[0258]
将化合物添加到油核中
[0259]
实施例1a表明，在合成过程中溶解在油层中的化合物被掺入颗粒的油核中。
[0260]
按照前述实施例1中所述的方案a来制备颗粒，但在应用超声形成颗粒之前，将300ug尼罗红油溶性荧光团掺入油层中。通过透析从颗粒中除去任何残留的荧光团。
[0261]
使用荧光共焦显微镜对颗粒进行成像。这证实了颗粒核内存在尼罗红。
[0262]
实施例1b描述了含有佐剂咪喹莫特的颗粒的制备。咪喹莫特以1mg/ml的浓度包含在三氯甲烷挥发性组分中，并在颗粒制备前与葵花籽油混合。根据标准方案a制备蛋白质颗粒。
[0263]
纯化的蛋白质颗粒用β巯基乙醇和蛋白酶k在60℃消化1小时，使蛋白壳破裂并释放内核。然后通过uplc分析核含量以确认咪喹莫特的存在。uplc分析基本上按照balireddi
等人(hournal of chrom science，第57卷，第3期，2019年3月，第249-257页)所述的方法进行。
[0264]
uplc分析证实了咪喹莫特的存在，如图3e所示。图3e(i)显示了咪喹莫特标准曲线和颗粒核中检测到的咪喹莫特的量。检测到的含量超过1ug/ml。图3e(ii)显示了紫外吸光度曲线，其对应于咪喹莫特的特征吸光度曲线。
[0265]
挥发性组分对颗粒大小的影响
[0266]
在实施例3至6中，挥发性组分的性质发生了变化，以确定其对粒度的影响。结果如图4所示，表明挥发性组分的变化可以用来改变粒度。同样，在实施例7至10中，挥发性组分的量也发生了变化，并研究了粒度的变化。结果如图5所示。挥发性组分的增加通常会导致粒度的减小。
[0267]
多肽的变化，任选地在油核中添加佐剂
[0268]
如实施例14至17中所述，实现了蛋白质的变化以将各种不同的蛋白质结合到颗粒中。具体地，实施例14展示了在多肽壳中制备具有佐剂蛋白卵清蛋白的颗粒，而实施例16展示了在多肽壳中具有致病性抗原蛋白、covid刺突蛋白的颗粒的制造。
[0269]
实施例16a展示了具有covid刺突蛋白作为多肽壳并且还在水不混溶核中具有佐剂的颗粒的制备。本实施例中采用方案b，并修改如下：
[0270]
将咪喹莫特以0.5mg/ml的浓度溶解在三氯甲烷中。然后将7ul(1：50稀释)添加到326ul己烷/油层中以提供总体积为333ul的油层。然后将该油层覆盖在covid刺突蛋白溶液上以提供双相混合物。根据方案b制备颗粒。因此，所得颗粒混悬剂中咪喹莫特的最大含量为1ug/100ul。
[0271]
颗粒的体外空化
[0272]
所有惯性空化测量均在0.5mhz频率、1000周期脉冲长度和100ms脉冲重复周期下进行，驱动压力如下所示。
[0273]
首先，为了表征在不同尺寸颗粒的空化能力，将根据前述实施例1制备的颗粒通过200nm和450nm过滤器过滤，然后评估惯性空化。在0.5mpa、1.0mpa、1.5mpa和2.0mpa驱动压力下评估被动空化检测(pcd)水平。图6给出了未经过尺寸过滤的颗粒(所有尺寸)和通过200nm和450nm过滤器过滤的颗粒在30秒曝光期间的平均pcd水平。在所有颗粒中都检测到空化现象。
[0274]
还使用根据前述实施例18产生的颗粒证实了惯性空化。将颗粒暴露于181mvpp(相当于1.2mpa的峰值压力)下5分钟。图8显示了持续惯性空化的典型能量轨迹。
[0275]
还使用根据以上实施例18生产的颗粒证明了惯性空化。颗粒暴露于1.4m pa、1.7mpa和2.1mpa至少300秒。在冷冻干燥之前和之后对颗粒进行了研究。使用水作为对照。所有颗粒在所有条件下均观察到空化现象。在1.4mpa下，干燥但非冻干颗粒的空化时间少于20秒，但冻干颗粒的空化时间超过150秒。在1.7mpa下，对于干燥但非冻干的颗粒，观察到空化大约100秒，但对于冻干颗粒，观察到空化超过150秒。在2.1mpa下，对于干燥但非冻干的颗粒，观察到空化大约200秒，但对于冻干颗粒，观察到空化超过300秒。
[0276]
核挥发性组分百分比对空化能力的影响
[0277]
前述实施例11至13描述了以与实施例1相同的方式制备颗粒，但使用不同量的挥发性组分己烷。进行实验以确定改变挥发性溶剂的比例(以及颗粒中凹痕的潜在深度)是否
会影响颗粒的空化能力。以与前述相同的方式研究空化，结果如图7所示。改变挥发性组分(以及凹痕深度)对颗粒的空化势有显着影响。尽管在所有挥发物含量水平下均检测到空化，但50体积％挥发物对于所得颗粒的空化而言是最佳的。
[0278]
颗粒保留其来源蛋白质功能的能力
[0279]
本研究的目的是评估颗粒形成后保留与受体保持功能结合的能力。
[0280]
使用1m da分子量过滤器将在多肽壳中含有西妥昔单抗的实施例17的颗粒(根据如上所述的方案a制备)透析48小时以除去任何游离的(非颗粒结合的)西妥昔单抗。采用针对蛋白质egfr(西妥昔单抗经过验证的结合靶点)特异性的elisa，比较等量(mg/mg)天然西妥昔单抗蛋白质与西妥昔单抗颗粒的结合效率。
[0281]
结果如图12所示。图12表明由西妥昔单抗组成的颗粒保留了结合egfr的能力。这支持这样的理解：形成多肽壳一部分的抗原蛋白或佐剂蛋白能够在颗粒形成后保持其治疗功效。在该实验中，与天然西妥昔单抗相比，结合水平降低被认为与颗粒的空间位阻以及缺乏优化有关。
[0282]
体内空化超声方法
[0283]
下面描述的实验中的体内透皮颗粒空化是通过使用源换能器(117d-01，sonic concepts，美国)来启动空化来进行的。该换能器配有有机玻璃耦合锥(用于有效地将超声从声源传输到治疗靶点)，充满脱气水并覆盖声学透明的聚酯薄膜塑料。耦合锥的形状被设计成与聚焦超声束的壳对齐。将含有颗粒溶液的制剂支架放置在小鼠皮肤上，并将源换能器放置在其顶部，并放置聚酯薄膜塑料声学窗口以防止空气进入声学路径。充当无源声学检测器(pcd)的单元件球形聚焦超声换能器同轴位于源换能器内部，以记录空化信号。pcd信号通过2.0mhz高通滤波器，并由前置放大器(sr445a，斯坦福研究系统公司，美国)以25的相对增益进行放大。然后通过12位数字示波器(handyscope hs3100mhz，tiepie engineering，the netherlands)对信号进行数字化和实时监测，并将数据保存在外部硬盘驱动器(便携式ssd t5，三星，韩国)上(图2)。这种特定的空化检测设置已记录在gray等人的ieee trans中，uffc 65(2)2018，第258-267页。该设置示意性描述于图9中。
[0284]
透皮颗粒递送和体内空化
[0285]
将本发明的颗粒施用于小鼠，研究颗粒的透皮给药。通过透皮给药和超声给药，对所递送的蛋白质的免疫应答用于评估通过透皮给药随后超声的颗粒的成功递送。
[0286]
实验用8只小鼠，每只小鼠分别接受两种不同的颗粒制剂，每侧腹部各施用一种。因此，共进行了16项实验，具体如下：
[0287]
第1组：4
×
蛋白质颗粒+us
[0288]
第2组：3
×
蛋白质颗粒，不us
[0289]
第3组：3
×
蛋白质皮下注射
[0290]
第4组：3
×
蛋白质皮内注射
[0291]
第5组：3
×
蛋白质肌肉注射
[0292]
所使用的蛋白质颗粒是根据前述实施例1制备的颗粒。通过直接施加到小鼠胁腹(施加或不施加超声(us))或通过注射(如上所述)将颗粒施用于每只小鼠。所施用的各成分的总蛋白质含量为9mg。值得注意的是，对于注射，整个9mg的蛋白质被递送到小鼠，而对于透皮给药，仅递送9mg蛋白质的一小部分。在使用超声的情况下，按照前述“体内空化超声方
法”中讨论的进行。暴露时间为10分钟。
[0293]
在以指定方式为每组施用颗粒后，通过进行elisa分析来确定对bsa蛋白的免疫应答，以研究递送后对bsa的免疫应答。
[0294]
结果如图10a所示。透皮组(第1组)对bsa的免疫应答与注射组相当，表明通过透皮途径成功递送bsa，并成功产生对所施用蛋白质的免疫应答。图10(b)还显示透皮组产生的颗粒具有最高的亲合力。
[0295]
通过蛋白质颗粒的空化作用透皮递送编码荧光素酶的dna
[0296]
将根据本发明的颗粒或根据wo 2015/075442生产的聚合物颗粒施用于小鼠胁腹。实验用8只小鼠，每只小鼠分别接受两种不同的颗粒制剂，每侧腹部各施用一种。因此，共进行了16项实验，具体如下：
[0297]
·4×
蛋白质颗粒+dna luc(10分钟us暴露)
[0298]
·4×
蛋白质颗粒+dna luc(2分钟us暴露)
[0299]
·4×
聚合物颗粒+dna luc(10分钟us暴露)
[0300]
·4×
蛋白质颗粒+dna luc(10分钟，不us，假手术组(sham))
[0301]
所使用的蛋白质颗粒是根据前述实施例1制备的颗粒。聚合物颗粒按照wo 2015/075422生产。所有样品均以milliq水提供。蛋白颗粒为9mg蛋白，1.8ml milliq水。所有样品含有50μg编码荧光素酶的dna。将颗粒/dna直接应用于每只小鼠的腹部(施加或不施加超声)。超声(us)使用前述“体内空化超声方法”中描述的方法，用于指定的暴露时间。
[0302]
通过施用后荧光素酶的存在来评估成功的透皮递送。图11显示了每种给药模式后的生物发光测量，并将其与直接注射(通过肌内、皮内或皮下注射)编码荧光素酶的dna后产生的生物发光进行比较。注射溶液与用于透皮给药的蛋白质颗粒溶液相同。
[0303]
当与目前的金标准空化剂(聚合物颗粒)相比时，使用包含dna和本发明的颗粒的组合物透皮施用dna在所有情况下都产生可比的或显着更强的发光。
[0304]
实施例18的颗粒也与萤光素酶pdna一起通过相同的方法透皮施用。图8a显示了在体内透皮递送荧光素酶pdna期间pcd在1.7mpa下随时间检测到的能量。在三个不同的时间点绘制频域，表明惯性空化占主导地位。使用2mhz高通滤波器从无源空化探测器获取声发射数据，因此在频谱图上看不到低于2mhz的信号。
[0305]
透皮疫苗
[0306]
本实验的目的是确定本发明的包含抗原蛋白(covidl9刺突蛋白)并在油核内含有佐剂咪喹莫特的颗粒可以增强免疫应答，并与非咪喹莫特颗粒、天然蛋白或与咪喹莫特共同注射的天然蛋白进行比较。给小鼠施用如下所述的组合物。每只小鼠接受两种单独的颗粒制剂，一种应用于每侧。所使用的制剂如下。所有制剂均在pbs中配制:
[0307]
·
pbs皮内(id)注射
[0308]
·
covidl9蛋白(5ug)id注射
[0309]
·
covidl9蛋白(5ug)+咪喹莫特(0.1ug)id注射
[0310]
·
covidl9蛋白颗粒(实施例16，具有凹痕的颗粒)(提供5ug蛋白)id注射
[0311]
·
带有咪喹莫特核的covidl 9蛋白颗粒(实施例16a，具有凹痕的颗粒)(提供5ug蛋白和0.lug咪喹莫特)id注射
[0312]
·
带有咪喹莫特核的covidl 9蛋白质颗粒(实施例16a，具有凹痕的颗粒)(提供
5ug蛋白质和0.1ug咪喹莫特)透皮+10分钟超声暴露
[0313]
使用的covid刺突蛋白是sars-cov-2，si，rbd，剑桥生物科学，230-30162-1000。蛋白质或者以天然形式使用，或者制备成根据以上实施例16或16a制备的颗粒。通过直接施用于小鼠胁腹或通过如上所述的皮内注射将前述组合物施用于每只小鼠。所给予的各成分的总蛋白质含量为5ug。值得注意的是，对于注射，将全部5ug蛋白递送至小鼠，而对于透皮给药，仅递送5ug蛋白质的一小部分。相关样品的咪喹莫特总含量为0.1g。无论咪喹莫特包含在颗粒的核中还是单独提供，都存在相同量的咪喹莫特。在使用超声的情况下，按照前述“体内空化超声方法”中讨论的进行。
[0314]
施用蛋白质后每隔一定时间对小鼠血清进行取样。使用针对covid刺突蛋白rbd结构域的elisa测定来评估抗体的产生。图13显示第21天elisa测定的结果。具有咪喹莫特核的蛋白质颗粒比皮内递送的天然刺突蛋白产生更高水平的抗体。鉴于预计通过该途径递送的蛋白质量较低，但免疫应答水平较高是令人惊讶的。
[0315]
超声方法方案2
[0316]
下面描述的实验中的体内透皮颗粒空化是通过使用源换能器(117d-01，sonic concepts，美国)来启动空化来进行的。该换能器配有有机玻璃耦合锥(用于有效地将超声从声源传输到治疗靶点)，充满脱气水并覆盖声学透明的聚酯薄膜塑料。耦合锥的形状被设计成与聚焦超声束的壳对齐。将有机玻璃支架放置在耦合锥上，其中包含制剂支架并为麻醉鼻锥和小鼠提供空间。耦合锥充满脱气水，并且床将降低到耦合锥上。用发夹固定小鼠的颈背，并将皮瓣放置在制剂支架上。皮瓣通过放置在皮瓣顶部的吸声器固定。充当无源声学检测器(pcd)的单元件球形聚焦超声换能器同轴位于源换能器内部，以记录空化信号。pcd信号通过1.8mhz高通滤波器，并通过脉冲接收器(dpr300超声波脉冲器/接收器，jsr ultrasonics，imaginant，美国)以23的相对增益进行放大。然后将信号数字化并通过一个12位数字示波器(handyscope hs3 100mhz，tiepie engineering，荷兰)并将数据保存在外部硬盘驱动器(便携式ssd t5，三星，韩国)上(图14)。
[0317]
条件优化
[0318]
为了优化颗粒透皮递送的条件，进行了四项实验(下文为o1至o4)。在每种情况下，本发明的颗粒是根据实施例20(ex 20)的颗粒，其已被冷冻干燥并重新悬浮。在指定的不同条件下将颗粒施加到小鼠颈背上。为了研究有效递送，同时施用dna荧光素酶。
[0319]
所有样品均以超纯水(milliq水)提供。蛋白质颗粒以1.8ml milliq中的90mg蛋白质形式提供。所有样品均含有指定浓度的编码荧光素酶的dna。通过将颗粒/dna直接施用于小鼠颈背(施加或不施加超声)，或通过皮内施用(如所指示的)，将颗粒/dna施用于每只小鼠。使用上面“超声方法方案2”中描述的方法，在指定的暴露时间和指定的压力下施加超声(us)。
[0320]
大约24小时后，使用体内成像系统(ivis，perkinelmer，美国)评估发光。将100μl 15.8mg/ml pierce
tm d-荧光素(thermofisher scientific，美国)注射到尾静脉中。注射后3.5分钟对小鼠进行成像并成像30秒。图像使用living(美国)进行治疗。以数字方式选择治疗区域并确定总通量(光子/秒)和平均辐射率(光子/秒/cm2/sr)。
[0321]
o1-压力优化:
[0322]
组标签组大小给药1颗粒us压力cmv-luc pdnaus处理时间
a14us实施例200.4mpa142ug5minb14us实施例201.5mpa142ug5minc14us实施例201.7mpa142ug5mind14us实施例202.0mpa142ug5minf14id无-142ug-[0323]
1-us＝使用指定超声压力的超声递送；id＝皮内；cm-luc pdna＝pdna(pgl4.50[luc2/cmv/hygro]vector(promega,usa))；注射给药时，整个142ug的dna被递送，而透皮给药时，只递送一小部分。
[0324]
通过施用后荧光素酶的产生来评估成功的透皮给药和dna表达。图15显示了治疗后约22小时通过ivis成像对0.4mpa、1.5mpa、1.7mpa和2.0mpa组(前述a至d组)进行的生物发光测量。在所有压力下均可观察到成功的递送，最佳递送压力为1.5至1.7mpa。图16显示了在递送编码荧光素酶的dna后观察到的发光。同样，所有组均成功给药，1.5-2.0mpa的给药效果与皮内给药相似，而且给药的一致性更强。
[0325]
o2-时间优化
[0326]
组标签组大小给药1颗粒us压力cmv-luc pdnaus处理时间a24us实施例201.7mpa142ug10minb24us实施例201.7mpa142ug5minc24us实施例201.7mpa142ug2mind24us实施例201.7mpa142ug1min
[0327]
通过施用后荧光素酶的产生来评估成功的透皮递送。图17显示了不同处理时间后约24小时后观察到的发光。所有组均可成功递送，最佳递送时间为2分钟。皮肤损伤可能发生在较长的治疗时间，因为更多的超声暴露会增加能量沉积。
[0328]
分析pcd检测到的空化信号以确定总声学传感器能量(tase)，定义为：
[0329][0330]
总之，计算了在时间窗口内测量的电压的均方根。为了计算总功率，将电压的均方根平方并除以阻抗，估计为50ω。将其乘以实际脉冲时间来估计每个脉冲的总能量。将每个脉冲的估计能量相加即可得到总声学传感器能量(tase)。这表明可以检测到至少长达10分钟的持续空化(图18)。
[0331]
o3-颗粒剂量
[0332][0333]
通过施用后荧光素酶的产生来评估成功的透皮递送和dna表达。图19显示了在大约24小时后在所有情况下观察到的发光，对于存在的实施例20的颗粒的全浓度或50％稀释浓度，递送显着增加。
[0334]
o4-与皮内给药的比较
[0335][0336]
每只小鼠的颈背右侧均接受超声处理，并在侧腹皮内注射。24小时后处死小鼠。
[0337]
图20a显示了在递送编码荧光素酶的dna之后观察到的发光。根据本发明的透皮递送实现了与皮内递送相似的效果，并且具有更大的一致性。图20b和20c显示分别在透皮(a4组)和皮内(b4组)组治疗后约24小时通过ivis成像进行的生物发光测量。
[0338]
颗粒制备的替代方案
[0339]
颗粒是根据修改后的方案d制备的：
[0340]
将6ml的50mg/ml蛋白质溶液与2ml水不混溶组分覆盖以产生双相溶液。挥发性/非挥发性组分的性质和比例如下表所示。
[0341]
使用高剪切混合器形成预乳液，然后在20000psi(138mpa)的压力下通过流体动力剪切微流化装置。
[0342]
然后将颗粒冷冻干燥48小时，然后再次重新悬浮在水中。根据此方案d可以制备以下颗粒：
[0343][0344]
根据实施例21产生的颗粒通过透皮给药施用至小鼠，如上面的实施例o1至o4所述。治疗条件为:
[0345]
组标签组大小给药1颗粒us压力cmv-luc pdnaus处理时间a54us实施例211.7mpa90ug cmv-luc2minb54us实施例211.2mpa90ug cmv-luc2minc54us实施例210.8mpa90ug cmv-luc2mind54id无 90ug cmv-luc [0346]
图21显示了在递送编码荧光素酶的dna后观察到的发光。这些颗粒在所有压力下都能可靠地递送，其中1.2mpa和1.7mpa是最佳压力。
[0347]
定量蛋白质递送量和抗体反应
[0348]
进行实验以确定向小鼠透皮施用颗粒后递送的bsa量。将已冷冻干燥并重悬的实
施例20的颗粒或实施例21的颗粒在如下指定的不同条件下施用于小鼠颈背。
[0349]
所有样品均在milliq中提供。所有涂在皮肤上的溶液均含有90mg bsa(1.8ml 50mg/ml溶液)。编码荧光素酶的dna按指示共同给药。在指定的暴露时间和指定的压力下，将颗粒/dna直接施用于每只小鼠，并使用前述“超声方法方案2”中描述的方法应用超声。
[0350][0351]
治疗后2分钟或24小时在皮肤中检测到bsa。前述a6至e6组的结果如图22所示。根据实施例20(ex 20)和实施例21(ex 21)的颗粒向皮肤递送相似量的蛋白质。收获经处理的皮肤。将皮肤样品切成小块，并将荧光素酶细胞培养裂解5x试剂(promega)添加到皮肤样品中至200pl/25mg皮肤的浓度。样品经历冻融循环，然后在c管(miltenyi biotec)中用gentlemacs解离器(miltenyi biotec,德国)均质化。然后使用牛血清白蛋白(bsa)elisa试剂盒(abbexa，美国)对bsa的量进行定量。
[0352]
24小时后蛋白质没有明显清除。
[0353]
在对前述f6组施用90mg bsa后检测小鼠中抗bsa抗体的产生，并与g6组通过皮内递送(100ul)施用进行比较。图23a和b显示了施用后7或41天产生的抗bsa抗体，如通过elisa测量的。尽管使用超声技术向每只小鼠递送的蛋白质要少得多，但皮内递送却实现了类似的抗体反应。

技术特征：
1.透皮疫苗组合物，其包含多个多肽颗粒和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂，其中所述多个多肽颗粒适合于在暴露于超声时诱导空化，并且其中每个颗粒包含：-多肽壳；和任选的-核，其包含水不混溶液体和/或一种或多种佐剂；其中所述颗粒具有一个或多个表面凹痕。2.根据权利要求1所述的透皮疫苗组合物，其中所述多肽壳包含交联的多肽颗粒。3.根据权利要求1或2所述的透皮疫苗组合物，其中所述多肽包含致病性抗原蛋白和/或其中所述组合物还包含疫苗，优选dna或rna疫苗。4.根据前述权利要求中任一项所述的透皮疫苗组合物，其中所述核包含一种或多种佐剂，其中所述一种或多种佐剂优选地选自咪喹莫特和角鲨烯。5.根据前述权利要求中任一项所述的透皮疫苗组合物，其中所述多肽包含致病性抗原蛋白，优选地，其中所述致病性抗原蛋白选自covid刺突蛋白、hepb表面抗原蛋白、血凝素、流感神经氨酸酶、丝状血凝素、肺炎球菌表面蛋白a、奈瑟氏菌黏附因子a、奈瑟菌肝素结合抗原、h因子结合蛋白和hpv-16e6或e7融合蛋白。6.根据权利要求1至5中任一项所述的透皮疫苗组合物，其中所述多肽包含佐剂多肽，优选地，其中所述佐剂多肽是选自非人白蛋白、sflt配体、细胞因子和趋化因子、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、肿瘤坏死因子(tnf)和粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)中一种或多种多肽。7.根据权利要求1至6中任一项所述的透皮疫苗组合物，其中所述组合物还包含dna或rna疫苗。8.根据前述权利要求中任一项所述的透皮疫苗组合物，其中所述颗粒的粒度为100nm至10000nm，优选200nm至1000nm。9.根据前述权利要求中任一项所述的透皮疫苗组合物，其中至少一个表面凹痕的横截面形成圆锥截面；和/或其中至少一个表面凹痕的深度为至少10nm；和/或其中所述颗粒包含一个或两个凹痕，其开口尺寸为粒度的20％或更大。10.根据前述权利要求中任一项所述的透皮疫苗组合物，其中，当所述组合物暴露于1.8mpa和265khz的超声时，所述多肽颗粒能够产生惯性空化。11.用于在暴露于超声时诱导空化的多肽颗粒，所述颗粒包含：-多肽壳，其包含权利要求5所定义的致病性抗原蛋白和/或权利要求6所定义的佐剂多肽；和任选的-核，其包含水不混溶液体和/或一种或多种佐剂，所述佐剂如权利要求4中所定义；其中所述颗粒具有一个或多个表面凹痕。12.用于在暴露于超声时诱导空化的多肽颗粒，所述颗粒包含：-多肽壳，其中多肽壳任选地包含权利要求5所定义的致病性抗原蛋白；和-核，其包含一种或多种佐剂和任选的水不混溶液体，其中所述佐剂如权利要求4中所定义；其中所述颗粒具有一个或多个表面凹痕。13.药物佐剂组合物，其包含多个根据权利要求12所述的多肽颗粒以及一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂。14.制备如权利要求11或12所述的多肽颗粒的方法，包括：
‑
提供水不混溶相，其包含一种或多种挥发性组分、任选的一种或多种非挥发性组分以及任选的一种或多种如权利要求4所定义的佐剂，任选地，其中水不混溶相中挥发性组分与非挥发性组分的比例为1:20至20:1；-将所述水不混溶相与至少一种多肽的水溶液混合，其中所述至少一种多肽任选地包含如权利要求4所定义的致病性抗原蛋白和/或如权利要求6所定义的佐剂多肽；-交联所述多肽以产生具有包含水不混溶相的核和包含至少一种多肽的壳的颗粒；-通过将颗粒置于减压条件下从核中去除挥发性组分，从而在颗粒中形成一个或多个凹痕；以及任选地，-纯化颗粒。15.根据权利要求14所述的方法，其进一步包括：-干燥所述颗粒；和-任选地将颗粒重新悬浮在液体介质中；并且其中所述方法还可以进一步包括：-冻干所述颗粒；和-任选地将颗粒重新悬浮在液体介质中；其中优选地，在干燥颗粒并将颗粒重新悬浮在液体介质中之后进行冻干和任选的重新悬浮。16.根据权利要求1至13中任一项所述的多肽颗粒或组合物，用于疫苗接种方法中，(a)其中所述方法优选包括将所述多肽颗粒或组合物施用于皮肤、施加超声并诱导惯性空化，使得多肽颗粒或组合物透皮递送，其中超声优选以100至500khz的频率和0.5mpa至2.0mpa的峰值负压递送；和/或(b)其中所述多肽颗粒或透皮疫苗组合物优选与dna或rna疫苗一起施用。

技术总结
本发明描述了包含具有多肽壳的超声响应颗粒的透皮疫苗。颗粒的表面有一个或多个凹痕，所述凹痕通常能够捕获气泡。所述颗粒在暴露于超声时能够产生惯性空化。颗粒可以透皮递送，并且可以在颗粒结构内包含抗原蛋白和/或佐剂。因此，颗粒在使用透皮递送途径的疫苗接种方法中是有用的。种方法中是有用的。种方法中是有用的。


技术研发人员：乔安娜
受保护的技术使用者：牛津大学创新有限公司
技术研发日：2022.01.31
技术公布日：2023/9/23