一种抑制APP蛋白与Vav2蛋白的相互作用的多肽及其应用的制作方法

一种抑制app蛋白与vav2蛋白的相互作用的多肽及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种抑制app蛋白(淀粉样前体蛋白)与 vav2蛋白(rho家族小gtp酶的鸟苷酸交换因子(gef))的相互作用的多肽及其应用，尤其涉及该多肽在治疗阿尔兹海默症中的应用。


背景技术：

2.阿尔兹海默病(alzheimer’s disease，ad)，是一种导致人记忆力和认知能力逐步丧失的常见神经退行性疾病。研究表明，淀粉样前体蛋白(amyloid precursorprotein，app)是ad疾病发生发展过程中的关键蛋白，其病理剪切所产生的aβ淀粉样蛋白在大脑神经组织中沉积形成淀粉样斑块，是ad的重要病理特征。
3.目前虽然已经针对app蛋白或aβ淀粉样蛋白开发了多种治疗ad的药物，例如aβ-淀粉样蛋白裂解酶(具有将淀粉样前体蛋白app切割成aβ-淀粉样蛋白的功能)、抗aβ淀粉样抗体solanezumab(ly2062430)、抗aβ淀粉样抗体gantenerumab等，但多在iii期临床试验中出现失败，因此仍缺乏阿尔兹海默病的有效治疗手段。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明一个方面提供一种多肽，其能够特异性靶向抑制app蛋白与vav2蛋白的相互作用，所述多肽具有以下氨基酸序列通式：
5.x
0-x
1-yx2x3p-x46.其中x0表示穿膜序列，x1和x4分别表示由1个以上的相同或不同氨基酸残基连接而成的氨基酸序列；x2和x3分别表示1个任意的氨基酸残基；yx2x3p中的氨基酸残基y为磷酸化形式，且所述多肽能够特异性识别并结合vav2蛋白。
7.在一些实施方式中，在上述的氨基酸序列通式中，x1和x4分别表示由1-10个，可选为 1-5个，进一步可选为1-3个相同或不同的氨基酸残基连接而成的氨基酸序列。
8.在一些实施方式中，所述多肽具有以下氨基酸序列通式：x
0-x
1-yenp-x4。
9.在一些实施方式中，所述穿膜序列的氨基酸序列选自seq id no:9、seq id no:10、seqid no:11和seq id no:12中的任一种。
10.在一些实施方式中，所述多肽包含如seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7或seqid no:8所示的氨基酸序列。
11.在一些实施方式中，所述多肽的氨基酸序列如seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7 或seq id no:8所示。
12.本发明另一方面提供上述多肽在制备治疗阿尔兹海默病的药物或用于抑制app蛋白与 vav2蛋白的相互作用的抑制剂中的应用。基于此，本发明还提供一种治疗阿尔兹海默病的药物或用于抑制app蛋白与vav2蛋白的相互作用的抑制剂，其包含本发明提供的多肽作为活性成分。
13.基于以上技术方案提供的多肽能够与app蛋白特异性竞争结合vav2蛋白，因此能
够特异性抑制app蛋白与vav2蛋白的相互作用，由此能够避免由vav2蛋白的表达所诱导的app 蛋白的表达量增加，从而能够降低app蛋白的剪切产物aβ淀粉样蛋白的分泌量，进而能够避免aβ淀粉样蛋白在组织中的沉积，因此该多肽能够用于治疗ad。经实施例结果证明，本发明提供的多肽与vav2蛋白的亲和力高，结合常数约为1.0μm以下，优选为0.9μm以下，更优选为0.861μm以下，因此本发明提供的多肽能够有效地特异性抑制app蛋白与vav2蛋白的相互作用，能够用于制备治疗阿尔兹海默病的药物或用于抑制app蛋白与vav2蛋白的相互作用的抑制剂，为ad疾病的治疗提供新的靶点药物。
附图说明
14.图1为wb检测过表达vav2蛋白的20e2细胞中app蛋白的含量胶图(a幅所示)和定量分析柱状图(b幅所示)，*p《0.05；
15.图2为elisa检测过表达vav2蛋白的20e2细胞中分泌aβ40蛋白的含量及定量分析柱状图，*p《0.05；
16.图3为vav2蛋白经ni柱纯化后的sds-page图；
17.图4为使用本发明的一个实施例提供的多肽滴定vav2蛋白的核磁光谱图像；
18.图5为itc实验测定本发明的一个实施例提供的多肽与vav2蛋白的亲和力，其中a幅表示热量随配体滴入变化的实时曲线，b幅表示将原始数据热量进行积分并运用结合模型得到的亲和力(kd)曲线。
19.图6为本发明的一个实施例提供的多肽显著降低细胞中app蛋白及其剪切产物aβ40蛋白、c99蛋白和c83蛋白的含量情况，其中a幅表示western blotting检测胶图，b、c、d 幅分别表示细胞中app蛋白及其剪切产物c83蛋白和c99蛋白的相对定量结果，e幅表示上清培养液中aβ40蛋白的相对定量结果，*p《0.05。
具体实施方式
20.针对现有技术中仍缺乏针对ad的有效治疗手段和靶向药物，本发明在发现的vav2蛋白的过表达能够显著增加细胞中app蛋白的含量与aβ淀粉样蛋白(例如aβ40)的分泌量的基础上，提供一种能够特异性结合vav2蛋白的多肽，进而抑制细胞中app蛋白与vav2蛋白的相互作用，由此能够降低由vav2蛋白的表达所诱导的app蛋白含量及其剪切产物aβ淀粉样蛋白的分泌量，进而能够用于靶向治疗ad。基于此，本发明还提供了用于治疗ad的药物，或者用于特异性抑制app蛋白与vav2蛋白的相互作用的抑制剂。
21.在一些实施例中，本发明提供的多肽具有以下氨基酸序列通式：
22.x
0-x
1-yx2x3p-x423.其中x0表示穿膜序列，x1和x4分别表示由1个以上的相同或不同氨基酸残基连接而成的氨基酸序列；x2和x3分别表示1个任意的氨基酸残基；yx2x3p中的氨基酸残基y为磷酸化形式，且所述多肽能够特异性识别并结合vav2蛋白。
24.在本发明中，提供的多肽能够特异性抑制app蛋白与vav2蛋白的相互作用的原因可能是：该多肽中特征序列yx2x3p(其中氨基酸残基y被磷酸化)的存在使得该多肽与vav2蛋白特异性结合，进而使得该多肽能够与app蛋白竞争结合vav2蛋白，从而能够特异性抑制 app蛋白与vav2蛋白的相互作用。但本发明不排除其他可能的原因。
25.在一些实施例中，在以通式x
0-x
1-yx2x3p-x4表示的多肽中，x1和x4均分别可以表示为由1-10个，可选为1-5个，进一步可选为1-3个相同或不同的氨基酸残基连接而成的氨基酸序列。其中具有较短长度的多肽更容易合成，并且当将其作为药物使用时更容易穿膜进入细胞中以发挥作用。
26.在一些实施例中，本发明提供的多肽的氨基酸序列通式为：x
0-x
1-yenp-x4。
27.在一些实施例中，本发明提供的多肽中可以使用本领域常规使用的穿膜序列，例如选自 seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11和seq id no:12中的任一种。
28.在一些实施例中，本发明提供的多肽包含如seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7 或seq id no:8所示的氨基酸序列。
29.在一些实施例中，本发明提供的多肽的氨基酸序列如seq id no:5、seq id no:6、seqid no:7或seq id no:8所示。
30.在一些实施例中，本发明提供的多肽可用于制备治疗阿尔兹海默病的药物或用于抑制 app蛋白与vav2蛋白的相互作用的抑制剂。
31.在一些实施例中，本发明提供一种治疗阿尔兹海默病的药物或用于抑制app蛋白与vav2 蛋白的相互作用的抑制剂，其以本发明提供的多肽作为活性成分。
32.以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应当理解的是，具体实施例仅用于进一步说明本发明，而不是用于限制本发明的内容。
33.下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《molecular cloning:a laboratory manual》sambrook，j.，russell，david w.， molecular cloning:a laboratory manual，3rd edition，2001，ny，cold spring harbor)。
34.实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购买得到。
35.以下实施例中涉及的序列均可使用已有技术合成，其中涉及的多肽可通过化学合成法合成。
36.实施例1：vav2蛋白与app蛋白的相互作用
37.1.1、使用dmem培养基(含有10％fbs，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素)培养稳定表达全长app695蛋白的hek293细胞20e2(zhengyu zhu等人，effect of orexin-a onmitochondrial biogenesis,mitophagy and structure in hek293-appswe cell model of alzheimer'sdisease，clinical and experimental pharmacology and physiology，2020.10.20， https://doi.org/10.1111/1440-1681.13424)，37℃孵箱培养，间隔48小时传代，收获5-25代的细胞用于以下实验。
38.1.2、将携带人源vav2蛋白(uniprotkb-p52735)表达基因(其核苷酸序列如seq id no:1 所示)的pcmv5-vav2重组质粒(由苏州金唯智生物科技有限公司合成)和空载体(pcmv5) 分别转染上述步骤1.1培养获得的20e2细胞，转染后48小时，分别收获细胞与上清培养液。
39.1.3、将步骤1.2中收获的细胞经离心去除培养液后，用预冷的pbs buffer清洗一遍，加入添加有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(roche applied science)的ripa裂解液裂解细胞，具体为在10cm的培养皿中使用500μl裂解液。用细胞铲将细胞刮下，置于1.5ml的ep管中，然后置于冰上裂解30分钟。高速离心(14000rpm，15分钟)，小心吸去上清，进行western blotting 检测，其中使用anti-myc tag mab(cell signaling，danvers，ma)抗体检测vav2蛋白，使用anti-app mab(cell signaling，danvers，ma)抗体检测app蛋白，使用anti-βactin mab (sigma-aldrich)抗体检测内参βactin蛋白，检测使用li-cor odyssey imaging system，定量使用imagej software。
40.结果如图1所示，其中a幅表示vav2蛋白、app蛋白和内参βactin蛋白的westernblotting检测结果，b幅表示分别转染pcmv5-vav2重组质粒和空载体pcmv5(con)的细胞中app蛋白的相对定量结果。由图1可见相对于转染了空载体pcmv5(con)的细胞，在转染pcmv5-vav2重组质粒的细胞中vav2蛋白的过表达显著增加了细胞中app蛋白的含量。
41.1.4、步骤1.2中收获的上清培养液中aβ40蛋白的含量测定使用aβ1
–
40elisa kit (cloud-clone corp，wuhan，china)按照使用说明进行。
42.结果如图2所示，可见相对于转染了空载体pcmv5(con)的细胞，在转染pcmv5-vav2 重组质粒的细胞中vav2蛋白的过表达也显著增加了细胞上清培养液中aβ40蛋白的分泌量。
43.综上结果所示，细胞中vav2蛋白的过表达能够显著增加细胞中app蛋白的含量和上清培养液中aβ40的分泌量，即vav2是调控细胞中aβ40蛋白含量的潜在靶点蛋白，其能够促进细胞显著上调app蛋白的含量，并与app蛋白相互作用(例如参与调控app蛋白的胞内运输、剪切和降解等过程)进而上调细胞的aβ40蛋白的分泌量。
44.实施例2：人重组vav2原核表达载体的构建、表达与纯化
45.2.1、以pcmv5-vav2重组质粒为模板，利用如下所示的上下游pcr引物和按照如下所示的pcr反应程序得到pcmv5-vav2重组质粒中的vav2结合结构域基因，其核苷酸序列如 seq id no:2所示。
46.pcr引物序列如下：
47.上游引物(vav2-up)：
[0048]5′‑
gggaattccatatgagccggccgccatcccg-3
′
(seq id no:3)，其中下划线部分为限制性内切酶位点ndei；
[0049]
下游引物(vav2-dn)：
[0050]3′‑
acccctacaagtcccgggaataactcgagcgg-5
′
(seq id no:4)，其中下划线部分为限制性内切酶位点xhoⅰ；
[0051]
pcr反应程序：第1步、预变性，温度95℃5min；第2步、变性，温度95℃30s；3、退火温度60℃30s；第4步、延伸温度72℃，1min。从第2到4步重复35个循环，天根琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pcr产物。
[0052]
2.2、将步骤2.1得到的vav2结合结构域基因片段亚克隆到含有his标签的pet28a表达载体(购自苏州金唯智生物科技有限公司)中，具体为使用ndeⅰ和xhoⅰ双酶切pcr回收产物和pet28a载体，37℃酶切6h，使用天根琼脂糖凝胶回收试剂盒回收酶切后质粒，使用天根离心柱型普通dna产物回收试剂盒回收酶切后基因片段；之后，使用连接酶(takara 连接试剂盒16℃水浴连接2h)连接双酶切的基因片段与线性化的载体，得到pet28a-vav2 基因
表达载体，反应结果体系直接转化感受态大肠杆菌dh5α细胞，菌落pcr检测阳性重组子，并送交上海生工测序。
[0053]
2.3、将步骤2.2测序正确的转化子过夜培养物，以4％接种量，转接新鲜配制的含有卡那霉素(100μg/ml)的
15
n为唯一氮源的m9培养基中，37℃，210rpm振荡培养，大约4小时左右，测定其od
600
，达到0.8-1.0时，加入0.1％iptg诱导蛋白表达，25℃诱导8小时，收集菌体并重悬于裂解液中(20mm tris，500mm nacl，ph 8.0)，超声裂解破碎细胞，离心收集上清液，镍柱亲和层析纯化目的蛋白，将纯化得到的his融合蛋白
15
n-vav2进行凝血酶 (thrombin)酶切，酶切条件为：温度为4℃，边透析边酶切，透析缓冲液为20mm tris， 300mm nacl，5mmβ-me，ph 7.5-8.0，切割12-24小时。
[0054]
2.4、利用镍柱亲和层析和分子排阻层析进一步纯化得到
15
n-vav2蛋白，纯化结果经 sds-page电泳检测，凝胶电泳结果如图3，可见纯化得到了纯度较高的
15
n-vav2标记蛋白。透析置换缓冲液(20mm tris，130mm nacl，5mm dtt，ph 7.2)进行浓缩，浓缩后测定浓度并冻存于-80℃。
[0055]
实施例3：多肽与vav2蛋白的滴定实验
[0056]
3.1、化学合成氨基酸序列如seq id no:5所示的多肽，在该多肽中具有识别vav2蛋白并与其特异性结合的序列yx2x3p(其中x2和x3分别表示任意氨基酸残基，并且氨基酸残基y被磷酸化)，将该多肽命名为多肽pn，该合成步骤由上海生工完成。使用核磁buffer (20mm tris，130mm nacl，5mm dtt，ph 7.2)溶解设计合成的多肽pn，终浓度为8mm，使用naoh校准ph值为7.2。
[0057]
3.2、将实施例2冻存的
15
n-vav2标记蛋白使用核磁buffer调整浓度到0.1mm，并加入 10％d2o。在滴定实验中，将
15
n-vav2标记蛋白和多肽pn分别按照摩尔浓度比为1:0、1:0.25、 1:0.5、1:1、1:2和1:3分别混合。并对每个混合样品在布鲁克600兆nmr谱仪记录2d 1
h-15
nhsqc，温度为298k。数据处理使用sparky3(goddard and kneller，university of california， san francisco)。
[0058]
nmr检测的多肽pn与vav2蛋白的滴定结果如图4所示，可见随着多肽pn加入比例的增加，
15
n-vav2蛋白部分氨基酸残基的化学位移发生连续变化，并且当
15
n-vav2标记蛋白和多肽pn的摩尔浓度比为1:2和1:3时，
15
n-vav2蛋白部分氨基酸残基的化学位移基本上不再发生变化，表明多肽pn与vav2蛋白能够特异性结合，并且两者之间有很强的相互作用，在
15
n-vav2标记蛋白和多肽pn的摩尔浓度比为1:3时即达到饱和。
[0059]
按照以上方法，也进行了氨基酸序列如seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8所示的多肽与
15
n-vav2标记蛋白的滴定实验，结果也证明氨基酸序列如seq id no:6、seq idno:7和seq id no:8所示的多肽均能够特异性结合vav2蛋白，并具有较强的相互作用。
[0060]
实施例4：多肽pn与vav2蛋白的亲和力
[0061]
该实施例中使用peaq-itc titration calorimeter(microcal，northampton，ma)仪器，在温度298k条件下，测定多肽pn与vav2蛋白的亲和力。具体为在实验组中，将0.75mm 的多肽逐渐滴入30μm的vav2蛋白(实施例2制备)中，仪器记录热量变化。对照组中使用同样的多肽滴入buffer(20mm tris，130mm nacl，ph 7.2)中，记录热量变化。最终数据使用microcal peaq-itc软件的单点结合模式进行处理分析。
[0062]
结果如图5所示，其中a幅表示热量随配体滴入变化的实时曲线，b幅表示将原始数
据热量进行积分并运用结合模型得到亲和力(kd)。由图5可知，多肽pn与vav2蛋白的结合常数约为0.861μm，证明多肽pn与vav2蛋白之间有较强的结合作用。
[0063]
按照以上方法，也检测了氨基酸序列如seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8所示的多肽与vav2蛋白的亲和力，结果也证明氨基酸序列如seq id no:6、seq id no:7和 seq id no:8所示的多肽均与vav2蛋白之间具有较强的结合作用，结合常数均在1.0μm以下，甚至在0.861μm以下。
[0064]
实施例5：多肽pn对细胞中app蛋白及其剪切产物aβ40蛋白、c83蛋白和c99蛋白的含量调控效果
[0065]
使用100μm的多肽pn(实施例3中合成)分别处理上述实施例1培养的20e2细胞或转染pcmv5-vav2的20e2细胞48小时。随后收获细胞及上清培养液，使用上述实施例1中的方法分别检测细胞中app蛋白及其剪切产物c99蛋白、c83蛋白的含量，以及上清培养液中 app蛋白的剪切产物aβ40蛋白的分泌量。
[0066]
结果如图6所示，其中a幅表示app蛋白及其剪切产物c99蛋白、c83蛋白及aβ40蛋白的western blotting检测结果，b、c、d幅分别表示细胞中app蛋白及其剪切产物c83蛋白、c99蛋白的相对定量结果，e幅表示上清培养液中app蛋白的剪切产物aβ40蛋白的相对定量结果。由图6可见，多肽pn的加入对对照组20e2细胞中的app蛋白及其剪切产物 c83蛋白的含量，以及对转染pcmv5-vav2的20e2细胞中由过表达的vav2蛋白诱导的app 蛋白及其剪切产物c99蛋白、c83蛋白含量都有显著的下调作用，即能够显著降低细胞中app 蛋白的含量，同时也能够显著降低对照组20e2细胞和转染pcmv5-vav2的20e2细胞的上清培养液中app蛋白的剪切产物aβ40蛋白的分泌量，进而可以避免aβ40蛋白在组织中的沉积。
[0067]
按照以上方法，也检测了氨基酸序列如seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8所示的多肽对细胞中app蛋白及其剪切产物aβ40蛋白、c83蛋白和c99蛋白的含量调控效果，结果也证明氨基酸序列如seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8所示的多肽均能够明显降低细胞中app蛋白的含量，同时也能够明显降低对照组20e2细胞和转染pcmv5-vav2 的20e2细胞的上清培养液中app蛋白的剪切产物aβ40蛋白的分泌量。
[0068]
综上所述，本发明提供的多肽能够以高的亲和力与vav2蛋白结合，由此能够与细胞中 app蛋白竞争结合vav2蛋白，从而能够降低由细胞中的vav2蛋白的表达诱导的app蛋白的表达增加，进而能够降低细胞中的app蛋白含量，由此能够降低app蛋白的剪切产物c99、 c83及aβ40的分泌量，进而可以避免aβ40蛋白在组织中的沉积。因此，本发明提供的能够抑制app蛋白与vav2蛋白的相互作用的多肽能够用于制备治疗阿尔兹海默病的药物或用于抑制app蛋白与vav2蛋白的相互作用的抑制剂。
[0069]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种多肽，所述多肽具有以下氨基酸序列通式：x
0-x
1-yx2x3p-x4其中x0表示穿膜序列，x1和x4分别表示由1个以上的相同或不同氨基酸残基连接而成的氨基酸序列；x2和x3分别表示1个任意的氨基酸残基；yx2x3p中的氨基酸残基y为磷酸化形式，且所述多肽能够特异性识别并结合vav2蛋白。2.根据权利要求1所述的多肽，其中x1和x4分别表示由1-10个，可选为1-5个，进一步可选为1-3个相同或不同的氨基酸残基连接而成的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽具有以下氨基酸序列通式：x
0-x
1-yenp-x4。4.根据权利要求1-3中任一项所述的多肽，其中所述穿膜序列的氨基酸序列选自seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11和seq id no:12中的任一种。5.根据权利要求1-4中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含如seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7或seq id no:8所示的氨基酸序列。6.根据权利要求5所述的多肽，其氨基酸序列如seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7或seq id no:8所示。7.权利要求1-6中任一项所述的多肽在制备治疗阿尔兹海默病的药物或用于抑制app蛋白与vav2蛋白的相互作用的抑制剂中的应用。8.一种治疗阿尔兹海默病的药物，其包含权利要求1-6中任一项所述的多肽作为活性成分。9.一种用于抑制app蛋白与vav2蛋白的相互作用的抑制剂，其包含权利要求1-6中任一项所述的多肽作为活性成分。

技术总结
本发明公开一种抑制APP蛋白与Vav2蛋白的相互作用的多肽及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明提供的多肽具有以下氨基酸序列通式：X


技术研发人员：王俊峰 张尤佳 吴勃 葛亮 赵宏鑫 唐欢 曹玉飞
受保护的技术使用者：合肥中科长木生物科技有限公司
技术研发日：2022.03.14
技术公布日：2023/9/23