丙酮酸羧化酶突变体及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物工程技术领域，具体地说，涉及丙酮酸羧化酶突变体及其应用。


背景技术：

2.核苷是一类糖苷的总称。核苷是核酸和核苷酸的组成成分。核苷是由d-核糖或d-z-脱氧核糖与嘧啶碱或嘌呤碱缩合而成。核苷一般为无色结晶，不溶于普通有机溶剂，易溶于热水，熔点为160～240℃。由d-核糖生成的核苷称核糖核苷，参与rna组成；由d-α-脱氧核糖生成的核苷称脱氧核糖核苷，参与dna组成。d-核糖与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶缩合生成相应的腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷，它们分别简称为腺苷(a)、鸟苷(g)、胞苷(c)、胸苷(t)和尿苷(u)。
3.鸟苷和肌苷在食品和医药行业有着广泛的作用。在食品领域，鸟苷和肌苷分别是鸟苷酸二钠和肌苷酸二钠的重要前体，而鸟苷酸二钠与肌苷酸二钠组合使用作为食品增鲜剂，广泛应用于鸡精、酱油等调味品中。在医药领域，鸟苷和肌苷可以作为多种抗病毒药物的医药中间体，如无环鸟苷、三氮唑核苷、三磷酸鸟苷钠等都需要鸟苷作为合成原料。肌苷是肌苷酸的重要前体，而肌苷酸可以作为合成腺苷酸(amp)和鸟苷酸(gmp)的前体，适用于各种原因引起的白细胞减少症、血小板减少症、各种心脏疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外还可治疗中心视网膜炎、视神经萎缩等。
4.目前，微生物发酵是生产核苷的主要方法，主要使用的微生物包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等。在生长菌株的选育与改造过程中，通过使用紫外诱变、硫酸二乙酯诱变育种，定向选育核苷高产菌株；或者根据细菌中核苷酸的代谢路径和调节机理，深入了解菌株遗传背景及菌株特性，通过代谢工程手段，有目的性地对菌株进行改造，以获得性状优良、能够高产核苷的生产菌株。但目前核苷菌种的发酵性能仍较差，核苷的转化率仍较低，不能满足大规模工业化生产的需求。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供丙酮酸羧化酶突变体及其应用。
6.为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种丙酮酸羧化酶突变体，编码丙酮酸羧化酶突变体的pyca基因包含其第一个碱基由t到g或a的突变。
7.本发明中，pyca基因来自芽孢杆菌属(bacillus)菌种，优选枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)或短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)。
8.进一步地，pyca基因来自枯草芽孢杆菌，其为：
9.i)seq id no:5所示的核苷酸序列；
10.ii)seq id no:5所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
markerless gene replacement method for b.amyloliquefaciens ll3 and its use in genome reduction and improvement of poly-γ-glutamic acid production[j]，applied microbiology and biotechnology,2014,98(21):8963-8973.zhang w,gao w,feng j,et al doi:10.1007/s00253-014-5824-2)经sali/psti双酶切、组装、转化等操作后得到重组质粒pksu-guab
l454f
。转化至b.a 836菌株(参见cn112574934a)中，用含2.5μg/ml氯霉素的lb平板在30℃下筛选转化子，将获得的转化子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布至含5μg/ml氯霉素的lb平板获得一次重组子；将一次重组子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含0.8μm 5-fu的lb平板筛选二次重组子，筛选获得guab
l454f
点突变菌株，获得的菌株为b.a 837。提取pbe43质粒(pbe43质粒为全基因合成，参考文献effects of overexpression of key enzyme genes on guanosine accumulation in bacillus amyloliquefaciens)，使用kpni/sali对质粒进行线性化，将突变的purr序列(简称r2，seq id no:2)及突变的tal序列(简称l5，seq id no:3)进行融合pcr，获得r2+l5片段，使用组装试剂盒连接至线性化的pbe43质粒中，构建获得质粒pbe43-r2+l5。将该质粒转化至b.a 837菌株中，得到出发菌株b.a8333。
[0029]
丙酮酸激酶在ncbi上的参考序列编号为np_390796.1。
[0030]
第五方面，本发明提供按照所述方法构建得到的核苷生产菌株。
[0031]
第六方面，本发明提供一种生产核苷的方法，所述方法包括如下步骤：
[0032]
1)培养所述核苷生产菌株，以获得微生物的培养物；
[0033]
2)从步骤1)中获得的所述培养物中收集所产生的核苷。
[0034]
所述核苷包括腺苷、肌苷、鸟苷及其对应的核苷衍生物，如次黄嘌呤、肌苷酸、鸟嘌呤、鸟苷酸、核黄素、二乙酰鸟苷酸等。
[0035]
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
[0036]
丙酮酸激酶第101位氨基酸由苏氨酸(t)突变为赖氨酸(k)、精氨酸(r)或脯氨酸(p)后，腺苷、肌苷产量均有提升，尤其以苏氨酸(t)突变为赖氨酸(k)后效果最好。丙酮酸激酶突变菌株pyk
t101k
与出发菌株a1相比，腺苷产量由1.3g/l提高到2.1g/l最高；丙酮酸激酶突变菌株pyk
t101r
与出发菌株a1相比，肌苷产量由0.6g/l提高到1.1g/l最好。
[0037]
丙酮酸羧化酶基因的第一位碱基由t突变为g或a后，腺苷、腺苷产量均有提升，尤其以t突变为a后效果最好。突变体对枯草芽孢杆菌腺苷、肌苷产量提升有正效果，突变体pyca
t1a
工程菌株腺苷产量由1.3g/l提高到2.5g/l最优，突变体pyca
a1g
工程菌株肌苷产量由0.6g/l提高到1.3g/l最优。
[0038]
丙酮酸羧化酶突变体与丙酮酸激酶突变体叠加，对腺苷、肌苷产量提升有正效果，突变体pyca
t1a
叠加pyk
t101k
工程菌株腺苷产量由1.3g/l提高到3.4g/l最高，突变体pyca
t1g
叠加pyk
t101k
工程菌株肌苷产量由0.6g/l提高到1.8g/l最高。
[0039]
丙酮酸羧化酶突变体对解淀粉芽孢杆菌鸟苷、肌苷产量提升有正效果，突变体pyca
t1a
工程菌株鸟苷产量由9.8g/l提高到17.1g/l最优，突变体pyca
t1g
工程菌株肌苷产量由1.0g/l提高到1.6g/l最优。
具体实施方式
[0040]
本发明旨在提供一种利用微生物生产嘌呤核苷的方法，以及能够高效率生产嘌呤
核苷的新微生物。
[0041]
研究发现，经过修饰枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的丙酮酸激酶(由pyk基因编码)和/或丙酮酸羧化酶(由pyca基因编码)，使得微生物能够高效率地生成核苷，并成功创制出能够高效生产核苷的新微生物，从而完成本发明。
[0042]
本发明采用如下技术方案：
[0043]
本发明提供一种枯草芽孢杆菌，其细胞内由pyk基因编码的丙酮酸激酶(在ncbi上的参考序列编号为np_390796.1)的第101位氨基酸由苏氨酸(t)突变为苏氨酸之外的其他氨基酸，优选赖氨酸(k)、精氨酸(r)或脯氨酸(p)，分别记为pyk
t101k
、pyk
t101r
、pyk
t101p
；和/或，其细胞内编码丙酮酸羧化酶(在ncbi上的参考序列编号为np_389369.1)的pyca基因(在ncbi上的参考序列编号为gene id:935920)其第一位碱基由t突变为g或a，分别记为pyca
t1g
、pyca
t1a
。
[0044]
pyk基因编码的丙酮酸激酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸，该过程伴随着1分子adp的消耗，同时产生1分子atp。本发明通过对pyk基因修饰，实现了对丙酮酸激酶的突变，使得所述微生物产生核苷的能力与未修饰的菌株相比增强，最终提高了核苷的产量。
[0045]
pyca基因编码的丙酮酸羧化酶，催化丙酮酸和hco
3-羧化反应生成草酰乙酸，该过程伴随着1分子atp的消耗，同时产生1分子adp。本发明通过对pyca基因修饰，实现了对丙酮酸羧化酶的突变，使得所述微生物产生核苷的能力与未修饰的菌株相比增强，最终提高了核苷的产量。
[0046]
本发明所用的枯草芽孢杆菌出发菌株为bacillus subtilis a1(简称a1)，参见cn201910599510.8。
[0047]
本发明还提供一种解淀粉芽孢杆菌，其细胞内编码丙酮酸羧化酶(在ncbi上的参考序列编号为cbi42686.1)的pyca基因(在ncbi上的参考序列位置为bamf_1560)其第一位碱基由t突变为g或a。
[0048]
本发明通过对pyca基因修饰，实现了对丙酮酸羧化酶的突变，使得所述微生物产生核苷的能力与未修饰的菌株相比增强，最终提高了核苷的产量。
[0049]
本发明所用的解淀粉芽孢杆菌出发菌株为bacillus amyloliquefaciens 8333(简称b.a8333)，具体构建方法参见cn202111266398.x。
[0050]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrook j&russell dw,molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0051]
以下实施例中涉及的丙酮酸激酶的氨基酸序列如seq id no:4所示，丙酮酸激酶突变体pyk
t101k
的氨基酸序列如seq id no:5所示，丙酮酸激酶突变体pyk
t101r
的氨基酸序列如seq id no:6所示，丙酮酸激酶突变体pyk
t101p
的氨基酸序列如seq id no:7所示，编码枯草芽孢杆菌来源的丙酮酸羧化酶的核苷酸序列如seq id no:8所示，编码枯草芽孢杆菌来源的丙酮酸羧化酶突变体pyca
t1g
的核苷酸序列如seq id no:9所示，编码枯草芽孢杆菌来源的丙酮酸羧化酶突变体pyca
t1a
的核苷酸序列如seq id no:10所示，编码解淀粉芽孢杆菌来源的丙酮酸羧化酶的核苷酸序列如seq id no:11所示，编码解淀粉芽孢杆菌来源的丙酮酸羧化酶突变体pyca
t1g
的核苷酸序列如seq id no:12所示，编码解淀粉芽孢杆菌来源的丙酮酸羧化酶突变体pyca
t1a
的核苷酸序列如seq id no:13所示。
[0052]
以下实施例中所用引物如表1所示：
[0053]
表1
[0054]
引物名称引物序列(5
′‑3′
)pyk
t101k-up-1fggttctccgagtgctgctgacpyk
t101k-up-1rcatatgtcactgaaattttatctgttgttcctacaacctcgtccapyk
t101k-dn-2ftggacgaggttgtaggaacaacagataaaatttcagtgacatatgpyk
t101k-dn-2racaggtttgcccagcgcgttgpyk
t101r-up-1rcatatgtcactgaaattttatctcttgttcctacaacctcgtccapyk
t101r-dn-2ftggacgaggttgtaggaacaagagataaaatttcagtgacatatgpyk
t101p-up-1rcatatgtcactgaaattttatctggtgttcctacaacctcgtccapyk
t101p-dn-2ftggacgaggttgtaggaacaccagataaaatttcagtgacatatgpyca
t1g-up-1ftcatcaggtttgcaagtgatcpyca
t1g-up-1ractttttgtatcgattgctgagacacacttttctcccccttacccgaapyca
t1g-dn-2fttcgggtaagggggagaaaagtgtgtctcagcaatcgatacaaaaagtpyca
t1g-dn-2rgcgaggctttaatgatgatcggpyca
t1a-up-1ractttttgtatcgattgctgagacatacttttctcccccttacccgaapyca
t1a-dn-2fttcgggtaagggggagaaaagtatgtctcagcaatcgatacaaaaagtpyca
t1g-up-3fcggcctcggtctcggagaaagpyca
t1g-up-3ractttttgtatcgattgctgagacacacttttctcccccttacccgaapyca
t1g-dn-4fttaggccaagggggagaaaagtgtgtcacaacaatccatccaaaaagpyca
t1g-dn-4rgttcctgacgattctcattccpyca
t1a-up-3rctttttggatggattgttgtgacatacttttctcccccttggcctaapyca
t1a-dn-4fttaggccaagggggagaaaagtatgtcacaacaatccatccaaaaag
[0055]
实施例1构建丙酮酸激酶突变菌株a1-pyk
t101k
[0056]
以菌株b.subtilis a1基因组为模板，引物pyk
t101k-up-1f/pyk
t101k-up-1r和pyk
t101k-dn-2f/pyk
t101k-dn-2r，使用phusion超保真聚合酶(new england biolabs)扩增出2个片段。用引物pyk
t101k-up-1f/pyk
t101k-dn-2r将2个片段融合，获得重组片段。将重组片段与pksu质粒(pksu质粒由南开大学王淑芳教授惠赠，参见a markerless gene replacement method for b.amyloliquefaciens ll3 and its use in genome reduction and improvement of poly-γ-glutamic acid production[j]，applied microbiology and biotechnology,2014,98(21):8963-8973.zhang w,gao w,feng j,et al doi:10.1007/s00253-014-5824-2)组装、转化等操作后得到重组质粒pksu-pyk
t101k
。转化至b.subtilis a1菌株中，用含2.5μg/ml氯霉素的lb平板在30℃下筛选转化子，将获得的转化子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布至含5μg/ml氯霉素的lb平板获得一次重组子；将一次重组子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含0.8μm 5-fu的lb平板筛选二次重组子，筛选获得pyk
t101k
点突变菌株，命名为b.subtilis a1-pyk
t101k
，以下简称a1-pyk
t101k
。
[0057]
实施例2构建丙酮酸激酶突变菌株a1-pyk
t101r
[0058]
以菌株b.subtilis a1基因组为模板，引物pyk
t101k-up-1f/pyk
t101r-up-1r和
pyk
t101r-dn-2f/pyk
t101k-dn-2r，使用phusion超保真聚合酶(new england biolabs)扩增出2个片段。用引物pyk
t101k-up-1f/pyk
t101k-dn-2r将2个片段融合，获得重组片段。将重组片段与pksu质粒组装、转化等操作后得到重组质粒pksu-pyk
t101r
。转化至b.subtilis a1菌株中，用含2.5μg/ml氯霉素的lb平板在30℃下筛选转化子，将获得的转化子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布至含5μg/ml氯霉素的lb平板获得一次重组子；将一次重组子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含0.8μm 5-fu的lb平板筛选二次重组子，筛选获得pyk
t101r
点突变菌株，命名为b.subtilis a1-pyk
t101r
，以下简称a1-pyk
t101r
。
[0059]
实施例3构建丙酮酸激酶突变菌株a1-pyk
t101p
[0060]
以菌株b.subtilis a1基因组为模板，引物pyk
t101k-up-1f/pyk
t101p-up-1r和pyk
t101p-dn-2f/pyk
t101k-dn-2r，使用phusion超保真聚合酶(new england biolabs)扩增出2个片段。用引物pyk
t101k-up-1f/pyk
t101k-dn-2r将2个片段融合，获得重组片段。将重组片段与pksu质粒组装、转化等操作后得到重组质粒pksu-pyk
t101p
。转化至b.subtilis a1菌株中，用含2.5μg/ml氯霉素的lb平板在30℃下筛选转化子，将获得的转化子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布至含5μg/ml氯霉素的lb平板获得一次重组子；将一次重组子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含0.8μm 5-fu的lb平板筛选二次重组子，筛选获得pyk
t101p
点突变菌株，命名为b.subtilis a1-pyk
t101p
，以下简称a1-pyk
t101p
。
[0061]
实施例4构建丙酮酸羧化酶突变菌株a1-pyca
t1g
[0062]
以菌株b.subtilis a1基因组为模板，引物pyca
t1g-up-1f/pyca
t1g-up-1r和pyca
t1g-dn-2f/pyca
t1g-dn-2r，使用phusion超保真聚合酶(new england biolabs)扩增出2个片段。用引物pyca
t1g-up-1f/pyca
r1g-dn-2r将2个片段融合，获得重组片段。将重组片段与pksu质粒组装、转化等操作后得到重组质粒pksu-pyca
t1g
。转化至b.subtilis a1菌株中，用含2.5μg/ml氯霉素的lb平板在30℃下筛选转化子，将获得的转化子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布至含5μg/ml氯霉素的lb平板获得一次重组子；将一次重组子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含0.8μm 5-fu的lb平板筛选二次重组子，筛选获得pyca
t1g
点突变菌株，命名为b.subtilis a1-pyca
t1g
，以下简称a1-pyca
t1g
。
[0063]
实施例5构建丙酮酸羧化酶突变菌株a1-pyca
t1a
[0064]
以菌株b.subtilis a1基因组为模板，引物pyca
t1g-up-1f/pyca
t1a-up-1r和pyca
t1a-dn-2f/pyca
t1g-dn-2r，使用phusion超保真聚合酶(new england biolabs)扩增出2个片段。用引物pyca
t1g-up-1f/pyca
t1g-dn-2r将2个片段融合，获得重组片段。将重组片段与pksu质粒组装、转化等操作后得到重组质粒pksu-pyca
t1a
。转化至b.subtilis a1菌株中，用含2.5μg/ml氯霉素的lb平板在30℃下筛选转化子，将获得的转化子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布至含5μg/ml氯霉素的lb平板获得一次重组子；将一次重组子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含0.8μm 5-fu的lb平板筛选二次重组子，筛选获得pyca
t1a
点突变菌株，命名为b.subtilis a1-pyca
t1a
，以下简称a1-pyca
t1a
。
[0065]
实施例6构建丙酮酸羧化酶突变菌株a1-pyk
t101k-pyca
t1g
[0066]
以菌株b.subtilis a1基因组为模板，引物pyca
t1g-up-1f/pyca
t1g-up-1r和pyca
t1g-dn-2f/pyca
t1g-dn-2r，使用phusion超保真聚合酶(new england biolabs)扩增出2个片段。用引物pyca
t1g-up-1f/pyca
t1g-dn-2r将2个片段融合，获得重组片段。将重组片段与pksu质粒组装、转化等操作后得到重组质粒pksu-pyca
t1g
。转化至b.subtilis a1-pyk
t101k
菌株中，用含2.5μg/ml氯霉素的lb平板在30℃下筛选转化子，将获得的转化子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布至含5μg/ml氯霉素的lb平板获得一次重组子；将一次重组子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含0.8μm 5-fu的lb平板筛选二次重组子，筛选获得pyca
t1g
点突变菌株，命名为b.subtilis a1-pyk
t101k-pyca
t1g
，以下简称a1-pyk
t101k-pyca
t1g
。
[0067]
实施例7构建丙酮酸羧化酶突变菌株a1-pyk
t101k-pyca
t1a
[0068]
以菌株b.subtilis a1基因组为模板，引物pyca
t1g-up-1f/pyca
t1a-up-1r和pyca
t1a-dn-2f/pyca
t1g-dn-2r，使用phusion超保真聚合酶(new england biolabs)扩增出2个片段。用引物pyca
t1g-up-1f/pyca
t1g-dn-2r将2个片段融合，获得重组片段。将重组片段与pksu质粒组装、转化等操作后得到重组质粒pksu-pyca
t1a
。转化至b.subtilis a1-pyk
t101k
菌株中，用含2.5μg/ml氯霉素的lb平板在30℃下筛选转化子，将获得的转化子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布至含5μg/ml氯霉素的lb平板获得一次重组子；将一次重组子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含0.8μm 5-fu的lb平板筛选二次重组子，筛选获得pyca
t1a
点突变菌株，命名为b.subtilis a1-pyk
t101k-pyca
t1a
，以下简称a1-pyk
t101k-pyca
t1a
。
[0069]
实施例8构建丙酮酸羧化酶突变菌株8333-pyca
t1g
[0070]
以菌株bacillus amyloliquefaciens 8333基因组为模板，引物pyca
t1g-up-3f/pyca
t1g-up-3r和pyca
t1g-dn-4f/pyca
t1g-dn-4r，使用phusion超保真聚合酶(new england biolabs)扩增出2个片段。用引物pyca
t1g-up-3f/pyca
t1g-dn-4r将2个片段融合，获得重组片段。将重组片段与pksu质粒组装、转化等操作后得到重组质粒pksu-pyca
t1g
。转化至bacillus amyloliquefaciens 8333菌株中，用含2.5μg/ml氯霉素的lb平板在30℃下筛选转化子，将获得的转化子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布至含5μg/ml氯霉素的lb平板获得一次重组子；将一次重组子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含0.8μm 5-fu的lb平板筛选二次重组子，筛选获得pyca
t1g
点突变菌株，命名为bacillus amyloliquefaciens 8333-pyca
t1g
，以下简称8333-pyca
t1g
。
[0071]
实施例9构建丙酮酸羧化酶突变菌株8333-pyca
t1a
[0072]
以菌株bacillus amyloliquefaciens 8333基因组为模板，引物pyca
t1g-up-3f/pyca
t1a-up-3r和pyca
t1a-dn-4f/pyca
t1g-dn-4r，使用phusion超保真聚合酶(new england biolabs)扩增出2个片段。用引物pyca
t1g-up-3f/pyca
t1g-dn-4r将2个片段融合，获得重组片段。将重组片段与pksu质粒组装、转化等操作后得到重组质粒pksu-pyca
t1a
。转化至bacillus amyloliquefaciens 8333菌株中，用含2.5μg/ml氯霉素的lb平板在30℃下筛选转化子，将获得的转化子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布至含5μg/ml氯霉素的lb平板获得一次重组子；将一次重组子接到5ml lb液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含0.8μm 5-fu的lb平板筛选二次重组子，筛选获得
pyca
t1a
点突变菌株，命名为bacillus amyloliquefaciens 8333-pyca
t1a
，以下简称8333-pyca
t1a
。
[0073]
实施例10枯草芽孢杆菌工程菌株产苷性能验证
[0074]
1.培养基：
[0075]
(1)种子培养基配方(g/l)：葡萄糖20，酵母粉5，玉米浆干粉5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.01，ph 7.0～7.2，121℃下灭菌20min。
[0076]
(2)发酵培养基配方(g/l)：葡萄糖60，酵母粉3.5，磷酸二氢钾3，硫酸铵25，硫酸锰0.01，硫酸镁5，味精10，玉米浆干粉15，碳酸钙25，ph 7.0～7.2，121℃下灭菌20min。
[0077]
2.培养方法
[0078]
(1)将菌株三区划线lb平板，37℃过夜培养；
[0079]
(2)挑取单菌落接种至30ml种子培养基中，110rpm，36℃培养7～8h；
[0080]
(3)按10％(v/v)接种量转接至30ml发酵培养基中，摇床转速120rpm，36℃培养36h；
[0081]
3.检测与结果
[0082]
使用高效液相色谱仪(hplc)对发酵液中的核苷进行检测，结果见表2。
[0083]
表2摇瓶发酵生成能力评估结果(三次重复均值)
[0084][0085][0086]
注：*表示与出发菌株相比具有显著差异(p＜0.01)。
[0087]
由以上实验结果可知，丙酮酸激酶突变体对枯草芽孢杆菌腺苷、肌苷产量提升有正效果，突变体pyk
t101k
工程菌株腺苷产量由1.3g/l提高到2.1g/l最优，突变体pyk
t101r
工程菌株肌苷产量由0.6g/l提高到1.1g/l最优。
[0088]
丙酮酸羧化酶突变体对枯草芽孢杆菌腺苷、肌苷产量提升有正效果，突变体pyca
t1a
工程菌株腺苷产量由1.3g/l提高到2.5g/l最优，突变体pyca
t1g
工程菌株肌苷产量由0.6g/l提高到1.3g/l最优。
[0089]
丙酮酸羧化酶突变体与丙酮酸激酶突变体叠加，对枯草芽孢杆菌腺苷、肌苷产量提升有正效果，突变体pyca
t1a
叠加pyk
t101k
工程菌株腺苷产量由1.3g/l提高到3.4g/l最高，突变体pyca
t1g
叠加pyk
t101k
工程菌株肌苷产量由0.6g/l提高到1.8g/l最高。
[0090]
实施例11解淀粉芽孢杆菌工程菌株产苷性能验证
[0091]
1.培养基：
[0092]
(1)种子培养基配方(g/l)：葡萄糖20，酵母粉5，玉米浆干粉5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.01，ph 7.0～7.2，121℃下灭菌20min。
[0093]
(2)发酵培养基配方(g/l)：葡萄糖120，酵母粉3.5，磷酸二氢钾3，硫酸铵25，硫酸锰0.01，硫酸镁5，味精10，玉米浆干粉15，碳酸钙25，ph 7.0～7.2，121℃下灭菌20min。
[0094]
2.培养方法
[0095]
(1)将甘油保存的菌种划线lb平板，37℃过夜培养出单克隆。
[0096]
(2)挑取单菌落接种至30ml种子培养基中，110rpm，37℃培养7～8h。
[0097]
(3)按10％(v/v)接种量转接至30ml发酵培养基中，摇床转速130rpm，35℃培养70h。
[0098]
3.检测与结果
[0099]
使用高效液相色谱仪(hplc)对发酵液中的核苷进行检测，结果见表3。
[0100]
表3摇瓶发酵产鸟苷及肌苷评估结果(三次重复均值)
[0101]
菌株鸟苷产量(g/l)肌苷产量(g/l)b.a 83339.81.08333-pyca
t1g
15.3*1.6*8333-pyca
t1a
17.1*1.5*
[0102]
注：*表示与出发菌株相比具有显著差异(p＜0.01)。
[0103]
由以上实验结果可知，丙酮酸羧化酶突变体对解淀粉芽孢杆菌鸟苷、肌苷产量提升有正效果，突变体pyca
t1a
工程菌株鸟苷产量由9.8g/l提高到17.1g/l最优，突变体pyca
t1g
工程菌株肌苷产量由1.0g/l提高到1.6g/l最优。
[0104]
本发明提供的丙酮酸激酶突变体和/或丙酮酸羧化酶突变体，以及丙酮酸激酶和/或丙酮酸羧化酶突变菌株对目标产物腺苷或鸟苷、肌苷产量的提升具有显著的促进作用。该丙酮酸激酶突变体和/或丙酮酸羧化酶突变体，及其重组微生物为产腺苷或鸟苷、肌苷及以其为前体的衍生物的生产菌株的构建提供借鉴。
[0105]
本发明菌株的构建，其步骤的前后顺序不限定，本领域技术人员按照本发明公开的内容达到本发明的目的均属于本发明的保护范围。
[0106]
本发明中的菌株代号如a1-pyk
t101k
、a1-pyk
t101r
、a1-pyk
t101p
等是为了方便描述，但不应理解为对本发明的限定。上述方法构建的包含有枯草芽孢杆菌丙酮酸激酶突变pyk
t101k
、pyk
t101r
、pyk
t101p
，和/或丙酮酸羧化酶突变pyca
t1a
、pyca
t1g
等工程菌，及包含有解淀粉芽孢杆菌丙酮酸羧化酶突变pyca
t1a
、pyca
t1g
等工程菌的用途，包括但是不局限于腺苷、鸟苷、肌苷。
[0107]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.丙酮酸羧化酶突变体，其特征在于，编码丙酮酸羧化酶突变体的pyca基因包含其第一个碱基由t到g或a的突变；其中，pyca基因来自芽孢杆菌属(bacillus)菌种。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，pyca基因来自枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)或短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)。3.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于，pyca基因来自枯草芽孢杆菌，其为：i)seq id no:5所示的核苷酸序列；ii)seq id no:5所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；iii)在严格条件下与seq id no:5所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1
×
sspe或含0.1％sds的0.1
×
ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或者，pyca基因来自解淀粉芽孢杆菌，其为：a)seq id no:8所示的核苷酸序列；b)seq id no:8所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；c)在严格条件下与seq id no:8所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1
×
sspe或含0.1％sds的0.1
×
ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；d)与a)、b)或c)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。4.编码权利要求1-3任一项所述突变体的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料；所述生物材料为重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。5.编码权利要求1-3任一项所述突变体的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料的以下任一应用：(1)用于核苷的发酵生产；(2)用于提高核苷的发酵产量；(3)用于构建产核苷的基因工程菌。6.核苷生产菌株的构建方法，其特征在于，利用基因工程手段，在具有核苷生产能力的微生物基因组中引入突变，使其编码丙酮酸羧化酶的pyca基因包含第一个碱基由t到g或a的突变；或者，利用基因工程手段，在具有核苷生产能力的微生物基因组中引入突变，使其编码丙酮酸羧化酶的pyca基因包含第一个碱基由t到g或a的突变，并且使其编码的丙酮酸激酶包含t101k、t101r或t101p突变位点；其中，所述微生物为芽孢杆菌属(bacillus)菌种；丙酮酸激酶在ncbi上的参考序列编号为np_390796.1。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述微生物为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或短小芽孢杆菌。8.按照权利要求6或7所述方法构建得到的核苷生产菌株。9.一种生产核苷的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1)培养权利要求8所述菌株，以获得微生物的培养物；2)从步骤1)中获得的所述培养物中收集所产生的核苷。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述核苷包括腺苷、肌苷、鸟苷及其对应的核苷衍生物。

技术总结
本发明提供丙酮酸羧化酶突变体及其应用。将芽孢杆菌属微生物中丙酮酸羧化酶基因的第一位碱基由T突变为G或A后，腺苷、肌苷产量均有提升，尤其以T突变为A后效果最好。突变体对枯草芽孢杆菌腺苷、肌苷产量提升有正效果，突变体pycA


技术研发人员：吴涛 薛婷莉 栾明月 姚佳琪 胡丹 张庆帅
受保护的技术使用者：廊坊梅花生物技术开发有限公司
技术研发日：2022.03.15
技术公布日：2023/9/23