多甲基化位点检测方法与流程

1.本技术涉及生物医药领域，具体的涉及一种多甲基化位点检测方法。


背景技术：

2.目前，dna甲基化是研究最为深入的表观遗传学机制，其与人类肿瘤发生密切相关。例如在健康人基因组中，cpg岛中的cpg位点通常是处于非甲基化状态。而当肿瘤发生时，抑癌基因cpg岛以外的cpg序列非甲基化程度增加，而cpg岛中的cpg则呈高度甲基化状态。
3.目前研究dna甲基化水平主要有以下几种方法：甲基化敏感的限制性内切酶(ms-re)法、甲基化特异性pcr(ms-pcr)法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(ms-hrm)法、结合重亚硫酸盐测序pcr(bsp)法或基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(massarray)法。然而，这些方法或者存在对检测所需的操作步骤、引物设计、仪器精密度等要求非常高的问题，或者存在无法获悉每个cpg位点甲基化信息的缺陷，还存在检测昂贵、繁琐和/或不利于临床大规模快速检测的问题。
4.因此目前亟需一种操作简单，重复性高；可应用于多种样本类型，各领域多位点dna甲基化检测法。


技术实现要素：

5.本技术提供了一种甲基化检测的方法，以及检测目的基因甲基化所需的引物对和试剂盒。本技术所述的方法至少具有选自下组的优势：1.简单快速，无需开盖，减少pcr产物的污染风险。2.特异性强，灵敏度高，一次可检测多个指标。3.多重检测(例如，对多个样本和/或多个甲基化基因位点同时进行检测)，结果判读清晰。4.适用但不局限于人类血液样本、血浆样本、ffpe样本、组织样本、粪便样本、尿液样本以及植物微生物样本。5.可应用于各领域多位点dna甲基化检测，包括但不限于癌症筛查、疾病诊断、科学研究。
6.一方面，本技术提供了一种甲基化检测的方法，其包括以下步骤：a)获得探针和特异性于目的基因的甲基化位点的pcr引物，其中所述pcr引物包括上游引物以及下游引物，所述下游引物的5’端带有标记；其中所述探针的5’端有氨基修饰，且所述探针的5’端与载体偶联；b)将所述上游引物与所述下游引物对样本进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；将所述pcr扩增产物与所述探针杂交，获得杂交产物；c)检测所述杂交产物的信号。
7.在某些实施方式中，所述目的基因包括肿瘤特异性基因。
8.在某些实施方式中，所述肿瘤包括结直肠癌、胃癌和/或胰腺癌。
9.在某些实施方式中，所述目的基因包括sept9、foxe1、vim、runx3、p16、rassfia、apc和/或nptx2。
10.在某些实施方式中，所述目的基因选自下组：
11.a)sept9、foxe1和vim；
12.b)runx3、p16和rassfia；和，
10min；
34.在某些实施方式中，所述方法还包括以下步骤：a)获得内参探针和非特异性于目的基因的甲基化位点的内参引物和内参探针，其中所述内参引物包括内参上游引物和内参下游引物，所述内参下游引物的5’端带有标记；其中所述内参探针的5’端有氨基修饰，且所述内参探针的5’端与载体偶联；b)将所述内参上游引物与所述内参下游引物对样本进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；将所述pcr扩增产物与所述内参探针杂交，获得杂交产物；c)检测所述杂交产物的信号。
35.在某些实施方式中，所述内参引物扩增β-actin。
36.在某些实施方式中，所述内参探针包含seq id no.5所示的核苷酸序列。
37.在某些实施方式中，所述内参上游引物包含seq id no.11所示的核苷酸序列；和/或，所述内参下游引物包含seq id no.12所示的核苷酸序列。
38.在某些实施方式中，所述样本中的dna经重亚硫酸盐处理和/或经酶学法转化。
39.在某些实施方式中，所述样本包括基因组dna、质粒dna、线粒体dna、游离dna、和/或合成dna。
40.在某些实施方式中，所述样本的来源包括细胞、组织、器官和/或样本。
41.在某些实施方式中，所述细胞、组织、器官和/或样本来源于微生物、植物、动物和/或人。
42.在某些实施方式中，所述样本来源于血液样本、血浆样本、ffpe样本、组织样本、粪便样本和/或尿液样本。
43.在某些实施方式中，所述细胞、组织、器官和/或受试者的样本来源于肿瘤患者，和/或，所述细胞、组织包括肿瘤细胞和/或肿瘤组织。
44.在某些实施方式中，所述方法还包括以下的步骤：d)根据所述荧光信号获得所述样本的甲基化修饰情况。
45.在某些实施方式中，所述检测包括使用液相芯片平台检测。
46.在某些实施方式中，所述pcr扩增产物中，所述生物素能够与链霉亲和素标记的荧光染料相结合而产生荧光信号。
47.在某些实施方式中，所述pcr扩增产物中，所述荧光标记能够产生荧光信号。
48.另一方面，本技术还提供引物对，其包含本技术所述的上游引物，和，本技术所述的下游引物。
49.另一方面，本技术还提供试剂盒，其包含本技术所述的上游引物，和/或，本技术所述的下游引物。
50.在某些实施方式中，所述的试剂盒包含本技术所述的探针。
51.本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本技术的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本技术的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本技术的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本技术所涉及发明的精神和范围。相应地，本技术的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
52.本技术所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本技术所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
53.图1显示的是本技术所述捕获磁珠偶联流程示意图。
54.图2显示的是本技术所述甲基化检测方法的流程示意图。
具体实施方式
55.以下由特定的具体实施例说明本技术发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本技术发明的其他优点及效果。
56.术语定义
57.在本技术中，术语“甲基化”通常是指dna上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基间的共价结合，胞嘧啶由此被修饰为5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mc)的过程。dna甲基化类型可分为:维持甲基化(maintenance dna methylation)和重新甲基化(de novo methylation)。维持甲基化是指在甲基转移酶的作用下，dna的半保留复制过程中，会在子链的相应的位置进行甲基化修饰的过程。重新甲基化是指在甲基转移酶的作用下，原来没有甲基化的dna双链上，进行甲基化的过程，之后由维持甲基化酶来维持稳定的dna甲基化状态。所述甲基化还可以包括形成n6-甲基嘌呤(n6-ma)及7-甲基鸟嘌呤(7-mg)。各种肿瘤中都普遍存在甲基化的异常改变，且异常的dna甲基化状态是肿瘤的重要特征之一。
58.在本技术中，术语“上游引物”通常是指作正义链(sense primer)。dna分子是双链，其中5
’‑3’
的链称作正链，3
’‑5’
方向的链称作负链。所述上游引物合成的链可以和所述正链的序列相同。所述上游引物合成的链可以和所述负链的序列互补。
59.在本技术中，术语“下游引物”通常是指反义链(antisense primer)，所述下游引物合成的链可以和所述负链的序列相同。所述下游引物合成的链可以和所述正链的序列互补。
60.在本技术中，术语“肿瘤特异性基因”通常是指肿瘤相关(taa)以及肿瘤特异性抗原(tsa)。例如，所述肿瘤特异性基因可以包括针对实体瘤和/或非实体瘤的特异性基因。本领域技术人员可以从数据库获得大量潜在的所述肿瘤特异性基因，例如tcga数据库(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)。所述肿瘤特异性基因可以包括疾病或效果的指示物的分子种类。
61.在本技术中，术语“结直肠癌”通常是指以小肠以下的肠道(即大肠(结肠)，包括盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠和直肠)的癌细胞为特征的医学状况，也可以包括癌前病变(pre-cancer)(又称为高危腺瘤)、早期和晚期癌症。此外，术语“结直肠癌”还可以包括以十二指肠和小肠(空肠、回肠)的癌细胞为特征的医学状况
62.在本技术中，术语“胃癌”通常是指胃或胃细胞的癌症。这些癌症可以是发生于胃的内层(粘膜)并且可以发生于胃的幽门部、胃体部或贲门部(下部、体部和上部)的腺癌。
63.在本技术中，术语“胰腺癌”通常是指来源于胰腺细胞的癌症。例如，所述胰腺癌可以是胰腺腺癌。胰腺癌的伴随症状可以是医学标准课本例如stedmen或pschyrembl中众所周知的。
64.在本技术中，术语“sept9”通常是指术语“sept9”通常是指septin 9基因，其可以包括人sept9基因。人septin9基因在genbank中的登录号为10801。
65.在本技术中，术语“foxe1”通常是指forkhead box e1基因，其可以包括人foxe1基因。人foxe1基因在genbank中的登录号为2304。
66.在本技术中，术语“vim”通常是指vimentin基因，其可以包括人vim基因。人vim基因在genbank中的登录号为7431。
67.在本技术中，术语“runx3”通常是指runx family transcription factor 3基因，其可以包括人runx3基因。人runx3基因在genbank中的登录号为864。
68.在本技术中，术语“p16”通常是指cyclin dependent kinase inhibitor 2a基因，其可以包括人p16基因。人p16基因在genbank中的登录号为1029。
69.在本技术中，术语“rassfia”通常是指ras association domain family member 1基因，其可以包括人rassfia基因。人rassfia基因在genbank中的登录号为11186。
70.在本技术中，术语“apc”通常是指apc regulator of wnt signaling pathway基因，其可以包括人apc基因。人apc基因在genbank中的登录号为324。
71.在本技术中，术语“nptx2”通常是指neuronal pentraxin 2基因，其可以包括人nptx2基因。人nptx2基因在genbank中的登录号为4885。
72.在本技术中，术语“下游特异性序列”通常是指所述下游引物中可以特异性扩增目的基因的甲基化位点的核苷酸序列。例如，所述下游特异性序列可以与目的基因的甲基化位点附近(即该甲基化位点的上游5’以及下游3’处的核苷酸)的dna序列的3
’‑5’
的链的序列具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或更多的)同源性。
73.在本技术中，术语“上游特异性序列”通常是指所述上游引物中可以特异性扩增目的基因的甲基化位点的核苷酸序列。例如，所述上游特异性序列可以与目的基因的甲基化位点附近(即该甲基化位点的上游5’以及下游3’处的核苷酸)的dna序列的5
’‑3’
的链的序列相具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或更多的)同源性。
74.在本技术中，术语“探针”通常是指通过设计或选择，含有允许其在所限定的严格性下特异性地杂交到目标核酸序列的特异性核苷酸序列的合成的或以生物方式产生的核酸(dna或rna)。用作检测探针的寡核苷酸序列可以标记有可检测的基团。各种标记基团可以是本领域已知的，例如放射性的、荧光性的、化学发光的或电化学发光的化合物。在本技术中，探针可例如在5’端进行了氨基修饰，从而可以与载体(例如磁珠)进行偶连。
75.在本技术中，术语“羟基修饰”通常是指使其包含羟基(例如游离的羟基)官能团的修饰方式。例如，所述羟基修饰包括使其至少在一端产生游离的羟基的修饰方式。
76.在本技术中，术语“氨基修饰”通常是指使其包含氨基(例如游离的氨基)官能团的修饰方式。例如，所述氨基修饰包括使其产生n端的氨基(例如n端游离的氨基)的修饰方式。
77.在本技术中，术语“标记”通常是指能够使pcr扩增产物被检测的记号。
78.在本技术中，术语“荧光标记”通常是指固有荧光的化合物、化学基团或组合物。所述荧光标记可以包括荧光团，所述荧光团可含有改变荧光团的溶解度、光谱特性或物理特性的取代基。本领域技术人员能够通过标记目的选择合适的荧光标记，例如，所述荧光标记可以包括fam(羧基荧光素)、cy3、hex(六氯-6-甲基荧光素)和/或tamra(6-羧基四甲基若丹明)。
79.在本技术中，术语“pcr”是通常是指一种方法，可以在不克隆或纯化的情况下，增加基因组dna混合物中靶序列片段的浓度。扩增靶序列的过程可以包括将两个大量过量的寡聚核苷酸引物引入到包含想要的靶序列的dna混合物中，随后在dna聚合酶存在的情况下进行精确顺序的热循环。两个引物可以互补于双链靶序列中相应的链。为了实现扩增，对混合物进行变性，然后引物退火至它们在靶分子内的互补序列。退火后，可以用聚合酶延伸引物，以便形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可以多次重复(即变性、退火和延伸构成一个“循环”；可以有很多“循环”)，以获得高浓度的想要的靶序列的扩增片段。想要的靶序列的扩增片段的长度可以是由引物相对于彼此的位置来确定的，因此，这个长度是可控参数。凭借该流程的重复性，该方法可以被称为“聚合酶链反应”(简称为pcr)。
80.在本技术中，术语“液相芯片系统”通常是指多功能悬浮点阵仪。所述液相芯片系统可以为multi-analyte suspension array、masa、flexible multi-analyte profiling或xmap。所述液相芯片系统可以进行蛋白质、核酸等生物大分子的检测。所述液相芯片系统的原理为悬浮在液相体系中的至少一种探针可以在结合目标分子后，在激光激活下产生不同的信号。所述液相芯片系统可以仅需少量样本进行检测，并且可以同时进行定性、定量检测。
81.在本技术中，术语“引物对”通常是指一对能够有效扩增模板dna的核苷酸序列。例如，所述引物对可以包括所述上游引物和所述下游引物。
82.发明详述
83.一方面，本技术提供了一种甲基化检测的方法，其包括以下步骤：a)获得探针和特异性于目的基因的甲基化位点的pcr引物，其中所述pcr引物包括上游引物以及下游引物，所述下游引物的5’端带有标记；其中所述探针的5’端有氨基修饰，且所述探针的5’端与载体偶联；b)将所述上游引物与所述下游引物对样本进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；将所述pcr扩增产物与所述探针杂交，获得杂交产物；c)检测所述杂交产物的信号。
84.本技术所述的甲基化检测方法，将目的基因的甲基化位点进行特异性扩增、扩增产物与载体的杂交这些步骤通过一轮pcr实现，从而简化了甲基化检测的繁琐步骤，例如减少了检测过程中涉及的样本开盖次数。此外，本技术所述的甲基化检测方法，适用于多来源样本(例如来源于不同的个体)和/或多个目的基因的甲基化位点同时检测，能够极大地提升检测效率。并且本技术所述的甲基化检测方法检测效果可靠，重复性好。
85.具体而言，在本技术中，所述下游引物则5’端可以带有标记(例如生物素标记或荧光标记)。可以使用所述上游引物和所述下游引物对样本(例如是已经经过重亚硫酸盐处理的样本)进行pcr 1轮扩增。则获得的扩增产物可以带有标记(例如生物素标记或荧光标记)。在本技术中，所述探针的5’端包括氨基修饰与载体(例如磁珠和/或微球)进行偶联，从而获得载体-探针偶联物。所述载体-探针偶联物可以与所述扩增产物杂交(例如通过所述探针中与所述扩增产物中的互补性序列而相互杂交)，获得杂交产物。所述杂交产物可以既包含偶联的载体(例如磁珠和/或微球)，又包含生物素标记或荧光标记。对于既包含偶联的载体(例如磁珠和/或微球)，又包含荧光标记的杂交产物，则可以直接检测其荧光信号，并通过荧光信号获得对应样本的甲基化检测结果；对于既包含偶联的载体(例如磁珠和/或微球)，又包含生物素标记的杂交产物，则可以利用链霉亲和素(sape)产生荧光信号，并通过荧光信号获得甲基化检测结果。
id no.18所示的核苷酸序列；且，所述下游引物可以包含seq id no.19所示的核苷酸序列；或者，所述上游引物可以包含seq id no.20所示的核苷酸序列；且，所述下游引物可以包含seq id no.21所示的核苷酸序列；或者，所述上游引物可以包含seq id no.23所示的核苷酸序列；且，所述下游引物可以包含seq id no.23所示的核苷酸序列；或者，所述上游引物可以包含seq id no.25所示的核苷酸序列；且，所述下游引物可以包含seq id no.26所示的核苷酸序列。
100.在本技术中，所述探针的5’端有氨基修饰，且所述探针的5’端与载体偶联。在本技术中，所述氨基修饰可以包括使所述探针的5’端具有氨基修饰功能基团，其中所述氨基修饰功能基团可以包含至少一个自由的氨基。
101.在本技术中，所述氨基修饰功能基团可以包含5’amino c6～c18。例如，所述氨基酸修饰功能基团可以包含5’氨基c6修饰和/或5’氨基c12修饰。例如，所述氨基修饰功能基团可以包含amino modifier c12。所述amino modifier c12可以具有如下的结构：
[0102][0103]
在本技术中，所述探针的浓度可以为约1μm-约3μm。例如，其浓度可以为约1.2μm-约3μm、约1.4μm-约3μm、约1.6μm-约3μm、约1.8μm-约3μm、约2.0μm-约3μm、约1μm-约2.8μm、约1μm-约2.5μm、约1.5μm-约3μm、约1.5μm-约2.5μm或约1.5μm-约2μm。
[0104]
在本技术中，所述探针可以与所述pcr扩增产物杂交获得杂交产物。例如，所述探针可以与所述pcr扩增产物中的至少部分序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的互补性而形成杂交产物。例如，所述探针可以与所述目的基因的甲基化位点相关序列中的至少部分序列具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的互补性而形成杂交产物。在本技术中，所述探针可以包含seq id no.1,4,6,13,16,17,24中任一项所示的核苷酸序列。
[0105]
在本技术中，所述载体与所述探针可以通过所述氨基修饰功能基团连接。例如，所述载体与所述探针可以通过所述氨基修饰功能基团中的氨基连接。
[0106]
在本技术中，所述载体可以包括固相载体和/或液相载体。在本技术中，所述固相载体可以包括芯片。在本技术中，所述液相载体可以包括磁珠和/或微球。所述磁珠和/或微球可以具有硅基材质。所述磁珠和/或微球可以具有羧基或氨基修饰。所述磁珠和/或微球可以选自德国miltenyi，美国dynabeads，德国magserion beads，法国ademtech的产品。所述磁珠和/或微球的粒径可以为约1-5μm。
[0107]
在本技术中，所述载体的表面可以具有羟基修饰。例如，所述载体可以通过羟基修饰功能基团中的羟基与所述探针所述氨基修饰功能基团中的氨基连接。
[0108]
在本技术中，步骤b)所述的pcr扩增的次数可以为1次。
[0109]
在本技术中，步骤b)所述的pcr扩增可以包括以下的反应步骤：预变性95℃2-5min，热循环95℃15-20s，52℃-60℃20-30s，72℃5-30s，30-45个循环，最后延伸72℃5-10min。例如，所述pcr扩增可以包括以下的反应步骤：预变性95℃2min，热循环95℃15s，58℃22s，72℃30s，40个循环，最后延伸72℃5min。例如，所述pcr扩增可以包括以下的反应步骤：预变性95℃2min，热循环95℃15s，60℃22s，72℃30s，35个循环，最后延伸72℃5min。例
如，所述pcr扩增可以包括以下的反应步骤：预变性95℃2min，热循环95℃15s，59℃22s，72℃30s，37个循环，最后延伸72℃5min。
[0110]
在本技术中，所述方法还可以包括以下步骤：a)获得内参探针和非特异性于目的基因的甲基化位点的内参引物和内参探针，其中所述内参引物可以包括内参上游引物和内参下游引物，所述内参下游引物的5’端带有标记；其中所述内参探针的5’端有氨基修饰，且所述内参探针的5’端与载体偶联；b)将所述内参上游引物与所述内参下游引物对样本进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；将所述pcr扩增产物与所述内参探针杂交，获得杂交产物；c)检测所述杂交产物的信号。
[0111]
在本技术中，所述内参引物可以扩增β-actin。例如，所述内参探针可以包含seq id no.5所示的核苷酸序列。例如，所述内参上游引物可以包含seq id no.11所示的核苷酸序列；和/或，所述内参下游引物可以包含seq id no.12所示的核苷酸序列。
[0112]
在本技术中，所述样本中的dna可以经重亚硫酸盐处理和/或经酶学法转化。在本技术中，所述样本中的dna可以经重亚硫酸盐处理或酶学法转化。所述方法可以将所有未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，这些尿嘧啶会在随后的pcr扩增中变成胸腺嘧啶。而甲基化胞嘧啶在这个过程中保持不变。所述重亚硫酸盐处理或酶学法转化可以使用试剂盒实现。
[0113]
在本技术中，所述样本可以包括基因组dna、质粒dna、线粒体dna、游离dna、和/或合成dna。
[0114]
在本技术中，所述样本的来源可以包括细胞、组织、器官和/或样本。
[0115]
在本技术中，所述细胞、组织、器官和/或样本可以来源于微生物、植物、动物和/或人。
[0116]
在本技术中，所述样本可以来源于血液样本、血浆样本、ffpe样本、组织样本、粪便样本和/或尿液样本。
[0117]
在本技术中，所述细胞、组织、器官和/或受试者的样本可以来源于肿瘤患者，和/或，所述细胞、组织可以包括肿瘤细胞和/或肿瘤组织。例如，所述细胞、组织、器官和/或受试者的样本可以来源于肿瘤患者，和/或，所述细胞、组织包括肿瘤细胞和/或肿瘤组织。例如，所述肿瘤可以包括实体瘤和/或非实体瘤。本技术的方法可以适用于不同的的适应症患者和/或不同的从患者处获得的样本来源。
[0118]
在本技术中，所述方法还可以包括以下的步骤：d)根据所述荧光信号获得所述样本的甲基化修饰情况。
[0119]
在本技术中，步骤c)可以包括对所述包含所述载体和荧光标记的杂交产物(例如带有磁珠和/或微球-荧光标记的杂交产物)产生的荧光信号进行检测，并进行数据分析。
[0120]
在本技术中，步骤c)可以包括使对所述包含所述载体和荧光标记的杂交产物(例如带有磁珠和/或微球-生物素标记的杂交产物)产生的荧光信号进行检测，并进行数据分析。例如，可以使用链霉亲和素标记的荧光染料(sape)对所述带有磁珠和/或微球-生物素标记的杂交产物进行荧光标记。在本技术中，所述荧光标记的反应条件可以为在约25-约37℃条件下反应约10-约30min。
[0121]
在本技术中，所述检测可以包括使用液相芯片平台检测。
[0122]
在本技术中，所述pcr扩增产物中，所述生物素能够与链霉亲和素标记的荧光染料相结合而产生荧光信号。
[0123]
在本技术中，所述pcr扩增产物中，所述荧光标记能够产生荧光信号。
[0124]
在本技术中，可以使用生物素-链酶亲和素(或亲和素)系统来使得所述pcr扩增产物产生荧光信号。例如，所述磁珠和/或微球可以包被链酶亲和素，该磁珠和/或微球可与所述pcr扩增产物结合而产生荧光信号。在某些情况下，也可以使用其他不同的亲和结合伙伴来替代所述生物素-链酶亲和素(或亲和素)系统，例如，可以使用抗原/半抗原和抗体，或者酶和对应的底物。
[0125]
另一方面，本技术还提供引物对，其包含本技术所述的上游引物，和，本技术所述的下游引物。
[0126]
另一方面，本技术还提供试剂盒，其包含本技术所述的上游引物，和/或，本技术所述的下游引物。
[0127]
在本技术中，所述的试剂盒可以包含本技术所述的探针。本技术所述的试剂盒可以用于通过一轮pcr实现对一个以上的目的基因进行甲基化检测。本技术所述的试剂盒可以用于预测、诊断和/或评估样本的一种以上目的基因的甲基化水平。例如，可以用于预测、诊断和/或评估样本的健康状况(例如是否患有肿瘤、患有肿瘤种类和/或所患肿瘤的阶段)。例如，可以用于预测、诊断和/或评估样本患有结直肠癌、胃癌和/或胰腺癌的情况。
[0128]
在本技术中，所述探针、所述上游引物和/或所述下游引物可以分装在不同的独立包装中。
[0129]
在本技术中，所述试剂盒还可以包含为pcr扩增所需的任何试剂。例如，可以包括taq master mix。
[0130]
在本技术中，所述试剂盒还可以包含为样本收集和/或处理所需的任何试剂。例如，可以包括包含重亚硫酸盐的溶液。
[0131]
本技术还涉及以下的实施方式：
[0132]
1.一种甲基化检测的方法，其包括以下步骤：
[0133]
a)获得探针和特异性于目的基因的甲基化位点的pcr引物，其中所述pcr引物包括上游引物以及下游引物，所述下游引物的5’端带有标记；其中所述探针的5’端有氨基修饰，且所述探针的5’端与载体偶联；
[0134]
b)将所述上游引物与所述下游引物对样本进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；将所述pcr扩增产物与所述探针杂交，获得杂交产物；
[0135]
c)检测所述杂交产物的信号。
[0136]
2.根据实施方式1所述的方法，其中所述目的基因包括肿瘤特异性基因。
[0137]
3.根据实施方式2所述的方法，其中所述肿瘤包括结直肠癌、胃癌和/或胰腺癌。
[0138]
4.根据实施方式1-3中任一项所述的方法，其中所述目的基因包括sept9、foxe1、vim、runx3、p16、rassfia、apc和/或nptx2。
[0139]
5.根据实施方式1-4中任一项所述的方法，其中所述目的基因选自下组：
[0140]
a)sept9、foxe1和vim；
[0141]
b)runx3、p16和rassfia；和，
[0142]
c)apc和nptx2。
[0143]
6.根据实施方式1-5中任一项所述的方法，其中所述下游引物包含能够特异性扩增所述目的基因的甲基化位点的下游特异性序列。
[0144]
7.根据实施方式1-6中任一项所述的方法，其中所述下游引物包含seq id no.3,8，10,15,19,21,26,27中任一项所示的核苷酸序列。
[0145]
8.根据实施方式1-7中任一项所述的方法，其中所述下游引物的浓度为约1μm-约3μm。
[0146]
9.根据实施方式1-8中任一项所述的方法，其中所述上游引物包含能够特异性扩增所述目的基因的甲基化位点的上游特异性序列。
[0147]
10.根据实施方式1-9中任一项所述的方法，其中所述上游引物包含seq id no.2，7，9,14,18,20,23,25中任一项所示的核苷酸序列。
[0148]
11.根据实施方式1-10中任一项所述的方法，其中所述上游引物的浓度为约1μm-约3μm。
[0149]
12.根据实施方式1-11中任一项所述的方法，其中：
[0150]
所述上游引物包含seq id no.2所示的核苷酸序列；且，所述下游引物包含seq id no.3所示的核苷酸序列；或者，
[0151]
所述上游引物包含seq id no.7所示的核苷酸序列；且，所述下游引物包含seq id no.8所示的核苷酸序列；或者，
[0152]
所述上游引物包含seq id no.9所示的核苷酸序列；且，所述下游引物包含seq id no.10所示的核苷酸序列；或者，
[0153]
所述上游引物包含seq id no.14所示的核苷酸序列；且，所述下游引物包含seq id no.15所示的核苷酸序列；或者，
[0154]
所述上游引物包含seq id no.18所示的核苷酸序列；且，所述下游引物包含seq id no.19所示的核苷酸序列；或者，
[0155]
所述上游引物包含seq id no.20所示的核苷酸序列；且，所述下游引物包含seq id no.21所示的核苷酸序列；或者，
[0156]
所述上游引物包含seq id no.23所示的核苷酸序列；且，所述下游引物包含seq id no.23所示的核苷酸序列；或者，
[0157]
所述上游引物包含seq id no.25所示的核苷酸序列；且，所述下游引物包含seq id no.26所示的核苷酸序列。
[0158]
13.根据实施方式1-12中任一项所述的方法，其中所述氨基修饰包括使所述探针的5’端具有氨基修饰功能基团，其中所述氨基修饰功能基团包含至少一个自由的氨基。
[0159]
14.根据实施方式13所述的方法，其中所述氨基修饰功能基团包含5’amino c6～c18。
[0160]
15.根据实施方式1-14中任一项所述的方法，其中所述探针的浓度为约1μm-约3μm。
[0161]
16.根据实施方式1-15中任一项所述的方法，其中所述探针包含seq id no.1,4,6,13,16,17,24中任一项所示的核苷酸序列。
[0162]
17.根据实施方式1-16中任一项所述的方法，其中所述载体与所述探针通过所述氨基修饰功能基团连接。
[0163]
18.根据实施方式1-17中任一项所述的方法，其中所述载体与所述探针通过所述氨基修饰功能基团中的氨基连接。
[0164]
19.根据实施方式1-18中任一项所述的方法，其中所述载体包括磁珠和/或微球。
[0165]
20.根据实施方式1-19中任一项所述的方法，其中所述载体的表面具有羟基修饰。
[0166]
21.根据实施方式1-20中任一项所述的方法，其中所述标记能够直接或间接使所述pcr扩增产物显色。
[0167]
22.根据实施方式1-21中任一项所述的方法，其中所述标记与所述下游特异性序列的5’端直接或间接连接。
[0168]
23.根据实施方式1-22中任一项所述的方法，其中所述标记包括生物素标记和/或荧光标记。
[0169]
24.根据实施方式1-23中任一项所述的方法，其中步骤b)所述的pcr扩增的次数为1次。
[0170]
25.根据实施方式1-24中任一项所述的方法，其中步骤b)所述的pcr扩增包括以下的反应步骤：预变性95℃2-5min，热循环95℃15-20s，52℃-60℃20-30s，72℃5-30s，30-45个循环，最后延伸72℃5-10min；
[0171]
26.根据实施方式1-25中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：
[0172]
a)获得内参探针和非特异性于目的基因的甲基化位点的内参引物和内参探针，其中所述内参引物包括内参上游引物和内参下游引物，所述内参下游引物的5’端带有标记；其中所述内参探针的5’端有氨基修饰，且所述内参探针的5’端与载体偶联；
[0173]
b)将所述内参上游引物与所述内参下游引物对样本进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；将所述pcr扩增产物与所述内参探针杂交，获得杂交产物；
[0174]
c)检测所述杂交产物的信号。
[0175]
27.根据实施方式26所述的方法，其中所述内参引物扩增β-actin。
[0176]
28.根据实施方式26-27中任一项所述的方法，其中所述内参探针包含seq id no.5所示的核苷酸序列。
[0177]
29.根据实施方式26-28中任一项所述的方法，其中所述内参上游引物包含seq id no.11所示的核苷酸序列；和/或，所述内参下游引物包含seq id no.12所示的核苷酸序列。
[0178]
30.根据实施方式1-29中任一项所述的方法，其中所述样本中的dna经重亚硫酸盐处理和/或经酶学法转化。
[0179]
31.根据实施方式1-30中任一项所述的方法，其中所述样本包括基因组dna、质粒dna、线粒体dna、游离dna、和/或合成dna。
[0180]
32.根据实施方式1-31中任一项所述的方法，其中所述样本的来源包括细胞、组织、器官和/或样本。
[0181]
33.根据实施方式32所述的方法，其中所述细胞、组织、器官和/或样本来源于微生物、植物、动物和/或人。
[0182]
34.根据实施方式1-32中任一项所述的方法，其中所述样本来源于血液样本、血浆样本、ffpe样本、组织样本、粪便样本和/或尿液样本。
[0183]
35.根据实施方式33-34中任一项所述的方法，其中所述细胞、组织、器官和/或受试者的样本来源于肿瘤患者，和/或，所述细胞、组织包括肿瘤细胞和/或肿瘤组织。
[0184]
36.根据实施方式1-35中任一项所述的方法，其还包括以下的步骤：
[0185]
d)根据所述荧光信号获得所述样本的甲基化修饰情况。
[0186]
37.根据实施方式36所述的方法，其中所述检测包括使用液相芯片平台检测。
[0187]
38.根据实施方式23-37中任一项所述的方法，其中所述pcr扩增产物中，所述生物素能够与链霉亲和素标记的荧光染料相结合而产生荧光信号。
[0188]
39.根据实施方式23-37中任一项所述的方法，其中所述pcr扩增产物中，所述荧光标记能够产生荧光信号。
[0189]
40.引物对，其包含实施方式1-39中任一项所述的上游引物，和，实施方式1-39中任一项所述的下游引物。
[0190]
41.试剂盒，其包含实施方式1-39中任一项所述的上游引物，和/或，实施方式1-39中任一项所述的下游引物。
[0191]
42.根据实施方式41所述的试剂盒，其包含实施方式1-39中任一项所述的探针。
[0192]
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本技术的甲基化检测方法和用途等，而不用于限制本技术发明的范围。
[0193]
实施例
[0194]
实施例1磁珠探针偶联
[0195]
1.本实施例采用的探针由金斯瑞生物科技公司合成。试剂mes(2-(n-吗啉)乙磺酸)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma m3671)。edac n'-(乙基亚胺基亚甲基)-n，n-二甲基-1，3-丙二胺单盐酸盐购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma e7750)。tween-20(吐温-20)购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8220)。sds(十二烷基硫酸钠)购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio s8010)。ph8.0的te溶液：物质组成是10mm tris-hcl、1mm edta。
[0196]
2.针对待检测区域核酸序列设计特异性单链dna探针，5'末端行进amino modifier c12修饰，目的在于探针氨基与微珠羟基偶联。
[0197]
探针序列长度为30-45bp，tm值为75-90℃
[0198]
探针序列如下：
[0199]
tz-vim 5'amino modifier c12-tacgcgtttttttgtcgtgcgtttgcggagtagcg-3'(seq id no.1)
[0200]
探针用纯水稀释至0.1nanomole，备用。
[0201]
3.微珠为luminex公司的表面羟基修饰的magplex磁珠，适用于luminex公司的magpix或luminex100/200液相悬浮芯片系统。也可采用其他羟基表面修饰的磁珠及其他液相芯片系统，在此不做限定。
[0202]
4.偶联步骤
[0203]
1)取未偶联的magplex磁珠1.25
×
106个，加入到1.5ml离心管中，放在磁力架磁吸2min，吸弃上清。
[0204]
2)加入10μl 0.1m mes，ph 4.5，充分振荡混匀，超声20s。
[0205]
3)继续在离心管中加入2μl探针(0.1nanomole)，涡旋混匀。
[0206]
4)新鲜配制10mg/ml edac，取0.75μl加入上述离心管，涡旋混匀，避光放置30min。
[0207]
5)再次加入新鲜配制的10mg/ml edac，取0.75μl加入上述离心管，涡旋混匀，避光放置30min。
[0208]
6)加入1ml体积百分比为0.02％tween-20至上述离心管中，放在磁力架磁吸2min，
吸弃上清。
[0209]
7)加入1ml体积百分比为0.1％sds溶液放在磁力架磁吸2min，吸弃上清。
[0210]
8)加入50μl ph8.0的te溶液(其中物质组成是10mm tris-hcl、1mm edta)涡旋混匀，得到偶联好的磁珠-探针偶联物。
[0211]
使用血细胞计数器计数微珠数量，如需保存，应在2～8℃避光保存。
[0212]
实施例2检测特异性分析
[0213]
1.本实施例采用的引物由金斯瑞生物科技公司合成，含有m-vim，m-sept9，m-foxe1，β-actin甲基化位点目的区域和nc(不含甲基化位点目的区域)质粒由金唯智生物科技有限公司合成；2
×
taq master mix(所需的taq酶、dntp混合物，mgcl2以及反应缓冲液预先配制成2倍浓度的混合物)所需试剂购自takala公司(takala，rr001b)；sape原液购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(life technologies，s-866)；tmac(四甲基氯化铵溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma t3411)；sarkosyl solution(十二烷基肌氨酸钠溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma l7414)；tris-hcl盐酸三(羟甲基)氨基甲烷购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8230)；triton x-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8200)；edta(乙二胺四乙酸)购自赛国生物科技有限责任公司(biofroxx 1340gr500)；tris(三羟甲基氨基甲烷)购自赛国生物科技有限责任公司(biofroxx 1115gr500)；nacl(氯化钠)购自天大化学试剂。
[0214]
ph8.0的te溶液：物质组成是10mm tris-hcl、1mm edta。
[0215]
2.引物探针设计及合成
[0216]
pcr引物针对甲基化位点设计，引物的纯度应达到电泳级(page)或hplc级，引物序列长度为18-35bp，tm值为50-60℃，下游引物5'端进行生物素修饰。
[0217]
上游引物：vim-m-f 5'-atgttacgcgtttttttgtc-3'(seq id no.2)
[0218]
下游引物：vim-m-r 5'-biotin-aactccaccttctcgttaatac-3'(seq id no.3)
[0219]
其中biotin表示生物素修饰。
[0220]
引物干粉分别加入te ph8.0溶解，使引物的浓度为2.5μm。
[0221]
3.标准品和阴性参照品合成
[0222]
m-vim，m-sept9，m-foxe1，m-β-actin甲基化位点目的区域标准品和nc阴性对照标准品干粉分别加无酶水溶解后，稀释至10
15
拷贝/ml，10倍梯度稀释标准品，均取10
10
拷贝/ml作为标准品模板，使用m-vim，m-sept9，m-foxe1，m-β-actin分别检测vim磁珠-探针偶联物和vim引物的特异性。
[0223]
4.特异性分析
[0224]
1)m-vim，m-sept9，m-foxe1，m-β-actin甲基化位点目的区域标准品，nc阴性标准品，按照上述要求稀释作为待测模板，按照下述步骤进行检测：
[0225]
2)本实施例pcr扩增体系如表1所示：
[0226]
表1.实施例2特异性分析中的10μl pcr扩增体系
[0227]
成分体积pcr引物(2.5μm)0.8μl2
×
taq master mix5μl待测模板2μl
ddh2o至10μl
[0228]
混合后震荡均匀，瞬时离心，置于bio-rad t100上进行pcr反应，反应程序如下：
[0229][0230]
3)杂交：取2μl步骤2)pcr产物，加入33μl 1.5
×
杂交缓冲液(4.5m tmac，0.15％sarkosyl solution，75mm tris-hcl，6mm edta，ph8.0)，杂交磁珠混合液(luminex，microspheres)4μl(磁珠-探针偶联物数量为2500个/反应)，水11μl混合后震荡均匀。按如下条件设置pcr仪并进行反应：96℃90s，58℃60min。
[0231]
4)显色：制备sape混合液，包括sape原液1.875μl；1
×
tm杂交液(0.2m nacl，0.1m tris，0.08％triton x-100，ph 8.0)125μl。将步骤3)杂交产物从pcr仪取下后立即置于磁力板(v&p scientific，vp771ld-4cs)上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入配制好的sape混合液25μl，封膜后震荡混匀20s。按如下条件设置pcr仪并进行反应：37℃，15min。反应结束后将96孔板立即置于磁力板上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入1
×
tm杂交液50μl，震荡混匀20s，之后置于磁力板30-60s后弃去上清，重复1次。最后分别向每个反应孔中加入1
×
tm杂交液75μl，震荡混匀20s。
[0232]
5)液相芯片平台检测：步骤4)得到的产物使用luminex200液相芯片平台进行检测，检测操作步骤及参数设置按照luminex200操作说明书操作。
[0233]
6)检测结果判定：样本检测结果与阴性标准品结果进行比对，如果某一基因的检测数值大于或等于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因为阳性，如果样本某一基因的检测数值小于阴性标准品数值的三倍，则判定为阴性。
[0234]
5.检测结果如表2所示，m-vim，m-sept9，m-foxe1，m-β-actin为甲基化位点的目的区域标准品，nc为阴性标准品。
[0235]
表2磁珠-探针偶联物特异性检测结果
[0236]
位点样本b66_vim66(1,b9)m-sept97167(1,c9)m-foxe185.568(1,d9)m-β-actin7469(1,e9)m-vim272690(1,f9)nc62
[0237]
可见，本检测方法vim引物和磁珠-探针偶联物能够特异性的区分m-vim标准品，说明该方法特异性较好。
[0238]
实施例3多重检测分析
[0239]
1.本实施例采用的引物和探针由金斯瑞生物科技公司合成；所述阳性和阴性标准品为经重亚硫酸盐转化后的人类甲基化dna和人类非甲基化dna(zymoesearch，d5014)购自
zymo research生物公司(zymo research，d5014)；粪便dna样本提取由本实验室自配试剂进行提取；2
×
taq master mix(所需的taq酶、dntp混合物；mgcl2以及反应缓冲液预先配制成2倍浓度的混合物)所需试剂购自takala公司(takala，rr001b)；sape原液购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(life technologies，s-866)，tmac(四甲基氯化铵溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma t3411)；sarkosyl solution(十二烷基肌氨酸钠溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma l7414)；tris-hcl盐酸三(羟甲基)氨基甲烷，购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8230)；triton x-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8200)；edta(乙二胺四乙酸)购自赛国生物科技有限责任公司(biofroxx 1340gr500)；tris(三羟甲基氨基甲烷)购自赛国生物科技有限责任公司(biofroxx 1115gr500)；nacl(氯化钠)购自天大化学试剂。
[0240]
2.按照实施例1说明的方法，进行探针设计及合成，序列如下
[0241]
tz-sept9 5'amino modifier c12-tcggtttttatattcgtttatatttggtcgtagcggggcgttcgg-3'(seq id no.4)；
[0242]
tz-β-actin 5'amino modifier c12-tcgtggtggtgaagttgtagtcgcgttcggtgagg-3'(seq id no.5)；
[0243]
tz-foxe1 5'amino modifier c12-cgtctcgtcggggttcgggcgtatttttttaggtaggcgagacg-3'(seq id no.6)。
[0244]
按照实施例1说明的方法进行磁珠-探针偶联，将偶联的磁珠-探针偶联物进行细胞计数器计数微珠数量，用te ph8.0，配成杂交磁珠-探针混合液。
[0245]
3.按照实施例2说明的方法，进行引物设计及合成，序列如下：
[0246]
上游引物：sept9-m-f 5'-ttttcgttatggttcggttt-3'(seq id no.7)
[0247]
下游引物:sept9-m-r 5'biotin-ctaaaaaacaatcctaaacacac-3'(seq id no.8)
[0248]
上游引物：foxe1-m-f 5'-tttgttcgtttttcgattgttc-3'(seq id no.9)
[0249]
下游引物:foxe1-m-r 5'biotin-taacgctataaaactcctaccgc-3’(seq id no.10)
[0250]
内参基因引物:
[0251]
上游引物：β-actin-m-f 5'-tttaatgttacgtacgatttttc-3'(seq id no.11)
[0252]
下游引物：β-actin-m-r 5'biotin-gtaggatggtatggggga-3'(seq id no.12)。
[0253]
其中biotin表示生物素修饰。
[0254]
引物干粉分别加入te ph8.0溶解，配成pcr引物混合液，使每对引物的浓度为2.5μm。
[0255]
4.样本的提取：自配试剂提取粪便样本dna，对5个人类结直肠癌粪便样本和5个健康人粪便样本进行dna提取。
[0256]
5.使用经重亚硫酸盐转化后的人类甲基化dna和人类非甲基化dna(zymo research，d5014)作为阳性和阴性标准品，经重亚硫酸盐转化后的人类组织dna样本作为待测样本。
[0257]
6.多重检测
[0258]
本实施例pcr扩增体系如下表3所示：
[0259]
表3.实施例3多重检测中的10μl pcr扩增体系
[0260]
成分体积
pcr引物混合液(2.5μm)0.8μl2
×
taq酶mix5μl转化后dna模板2μlddh2o至10μl
[0261]
混合后震荡均匀，瞬时离心，置于bio-rad t100上进行pcr反应，反应程序如下：
[0262][0263]
2)杂交：取2μl步骤1)pcr产物，加入33μl 1.5
×
杂交缓冲液(4.5m tmac，0.15％sarkosyl solution，75mm tris-hcl，6mm edta，ph8.0)，杂交磁珠-探针混合液(luminex，microspheres)4μl(每种磁珠-探针偶联物数量为2500个/反应)，水11μl混合后震荡均匀。按如下条件设置pcr仪并进行反应：96℃90s，58℃60min。
[0264]
3)显色：制备sape混合液，包括sape原液5.25μl；1
×
tm杂交液(0.2m nacl，0.1m tris，0.08％triton x-100，ph 8.0)350μl。将步骤2)杂交产物从pcr仪取下后立即置于磁力板(v&p scientific，vp771ld-4cs)上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入配制好的sape混合液25μl，封膜后震荡混匀20s。按如下条件设置pcr仪并进行反应：37℃，15min。反应结束后将96孔板立即置于磁力板上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入1
×
tm杂交液50μl，震荡混匀20s，之后置于磁力板30-60s后弃去上清，重复1次。最后分别向每个反应孔中加入1
×
tm杂交液75μl，震荡混匀20s。
[0265]
4)液相芯片平台检测：步骤3)得到的产物使用luminex200液相芯片平台进行检测，检测操作步骤及参数设置按照luminex200操作说明书操作。
[0266]
5)检测结果判定：样本检测结果与阴性标准品结果进行比对，如果某一基因的检测数值大于或等于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因为阳性，如果样本一基因的检测数值小于阴性标准品数值的三倍，则判定为阴性。
[0267]
7.实验结果如表4所示，nc为阴性对照，pc为阳性对照。
[0268]
表4.本实施例结直肠癌样本多重检测结果
[0269][0270]
检测结果中，阳性对照几个位点的检测结果均大于其对应nc值的3倍，证明该方法可以同时进行多个位点的检测；5个患者样本均有不少于2个位点为阳性，而对照均为阴性，证明该方法能够较好地将结直肠癌样本区分出来。
[0271]
实施例4磁珠探针偶联
[0272]
1.本实施例采用的探针由金斯瑞生物科技公司合成。试剂mes(2-(n-吗啉)乙磺酸)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma m3671)。edac n'-(乙基亚胺基亚甲基)-n，n-二甲基-1，3-丙二胺单盐酸盐购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma e7750)。tween-20(吐温-20)购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8220)sds(十二烷基硫酸钠)购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio s8010)。ph8.0的te溶液：物质组成是10mm tris-hcl、1mm edta。
[0273]
2.针对待检测区域核酸序列设计特异性单链dna探针，5'末端行进amino modifier c12修饰，目的在于探针氨基与微珠羟基偶联。
[0274]
探针序列长度为20-45bp，tm值为75-85℃
[0275]
探针序列如下：
[0276]
tz-runx3 5'amino modifier c12-tagcggtcgttagggcgtc g ggtaggcggag-3'(seq id no.13)
[0277]
探针用纯水稀释至0.1nanomole，备用。
[0278]
3.微珠为luminex公司的表面羟基修饰的magplex磁珠，适用于luminex公司的magpix或luminex100/200液相悬浮芯片系统。也可采用其他羟基表面修饰的磁珠及其他液相芯片系统，在此不做限定。
[0279]
4.偶联步骤
[0280]
1)取未偶联的magplex磁珠1.25
×
106个，加入到1.5ml离心管中，放在磁力架磁吸2min，吸弃上清。
[0281]
2)加入10μl 0.1m mes，ph 4.5，充分振荡混匀，超声20s。
[0282]
3)继续在离心管中加入2μl探针(0.1nanomole)，涡旋混匀。
[0283]
4)新鲜配制10mg/ml edac，取0.75μl加入上述离心管，涡旋混匀，避光放置30min。
[0284]
5)再次加入新鲜配制的10mg/ml edac，取0.75μl加入上述离心管，涡旋混匀，避光放置30min。
[0285]
6)加入1ml体积百分比为0.02％tween-20至上述离心管中，放在磁力架磁吸2min，吸弃上清。
[0286]
7)加入1ml体积百分比为0.1％sds溶液放在磁力架磁吸2min，吸弃上清。
[0287]
8)加入50μl ph8.0的te溶液(其中物质组成是10mm tris-hcl、1mm edta)涡旋混匀，得到偶联好的磁珠-探针偶联物。
[0288]
使用血细胞计数器计数微珠数量，如需保存，应在2～8℃避光保存。
[0289]
实施例5检测特异性分析
[0290]
1.本实施例采用的引物由金斯瑞生物科技公司合成，含有m-p16，m-rassf1a，m-runx3，β-actin甲基化位点目的区域和nc(不含甲基化位点目的区域)质粒由金唯智生物科技有限公司合成；2
×
taq master mix(所需的taq酶、dntp混合物，mgcl2以及反应缓冲液预先配制成2倍浓度的混合物)所需试剂购自takala公司(takala，rr001b)；sape原液购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(life technologies，s-866)；tmac(四甲基氯化铵溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma t3411)；sarkosyl solution(十二烷基肌氨酸钠溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma l7414)；tris-hcl盐酸三(羟甲基)氨基甲烷购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8230)；triton x-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8200)；edta(乙二胺四乙酸)购自赛国生物科技有限责任公司(biofroxx 1340gr500)；tris(三羟甲基氨基甲烷)购自赛国生物科技有限责任公司(biofroxx 1115gr500)；nacl(氯化钠)购自天大化学试剂。
[0291]
ph8.0的te溶液：物质组成是10mm tris-hcl、1mm edta。
[0292]
2.引物探针设计及合成
[0293]
pcr引物针对甲基化位点设计，引物的纯度应达到电泳级(page)或hplc级，引物序列长度为18-35bp，tm值为50-70℃，下游引物5'端进行生物素修饰。
[0294]
上游引物：runx3-m-f 5'-ataatagcggtcgttagggcgtcg-3'(seq id no.14)
[0295]
下游引物：runx3-m-r 5'-biotin-gcttctactttcccgcttctcgcg-3'(seq id no.15)
[0296]
其中biotin表示生物素修饰。
[0297]
引物干粉分别加入te ph8.0溶解，使引物的浓度为2.5μm。
[0298]
3.标准品和阴性参照品合成
[0299]
m-p16，m-rassf1a，m-runx3，m-β-actin甲基化位点目的区域标准品和nc阴性对照标准品干粉分别加无酶水溶解后，稀释至10
15
拷贝/ml，10倍梯度稀释标准品，均取10
10
拷贝/ml作为标准品模板，使用m-p16，m-rassf1a，m-runx3，m-β-actin分别检测runx3磁珠-探针偶联物和runx3引物的特异性。
[0300]
4.特异性分析
[0301]
1)m-p16，m-rassf1a，m-runx3，m-β-actin甲基化位点目的区域标准品，nc阴性标准品，按照上述要求稀释作为待测模板，按照下述步骤进行检测：
[0302]
2)本实施例pcr扩增体系如表5所示：
[0303]
表5.实施例4特异性分析中的10μl pcr扩增体系
[0304]
[0305][0306]
混合后震荡均匀，瞬时离心，置于bio-rad t100上进行pcr反应，反应程序如下：
[0307][0308]
3)杂交：取2μl步骤2)pcr产物，加入33μl 1.5
×
杂交缓冲液(4.5m tmac，0.15％sarkosyl solution，75mm tris-hcl，6mm edta，ph8.0)，杂交磁珠混合液(luminex，microspheres)4μl(磁珠-探针偶联物数量为2500个/反应)，水11μl混合后震荡均匀。按如下条件设置pcr仪并进行反应：96℃90s，58℃60min。
[0309]
4)显色：制备sape混合液，包括sape原液1.875μl；1
×
tm杂交液(0.2m nacl，0.1m tris，0.08％triton x-100，ph 8.0)125μl。将步骤3)杂交产物从pcr仪取下后立即置于磁力板(v&p scientific，vp771ld-4cs)上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入配制好的sape混合液25μl，封膜后震荡混匀20s。按如下条件设置pcr仪并进行反应：37℃，15min。反应结束后将96孔板立即置于磁力板上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入1
×
tm杂交液50μl，震荡混匀20s，之后置于磁力板30-60s后弃去上清，重复1次。最后分别向每个反应孔中加入1
×
tm杂交液75μl，震荡混匀20s。
[0310]
5)液相芯片平台检测：步骤4)得到的产物使用luminex200液相芯片平台进行检测，检测操作步骤及参数设置按照luminex200操作说明书操作。
[0311]
6)检测结果判定：样本检测结果与阴性标准品结果进行比对，如果某一基因的检测数值大于或等于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因为阳性，如果样本某一基因的检测数值小于阴性标准品数值的三倍，则判定为阴性。
[0312]
5.检测结果如表6所示，m-p16，m-rassf1a，m-runx3，m-β-actin为甲基化位点的目的区域标准品，nc为阴性标准品。
[0313]
表6磁珠-探针偶联物特异性检测结果
[0314][0315][0316]
可见，本检测方法runx3引物和磁珠-探针偶联物能够特异性的区分m-runx3标准
品，说明该方法特异性较好。
[0317]
实施例6多重检测分析
[0318]
1.本实施例采用的引物和探针由金斯瑞生物科技公司合成；阳性和阴性标准品为经重亚硫酸盐转化后的人类甲基化dna和人类非甲基化dna(zymoesearch，d5014)购自zymo research生物公司(zymo research，d5014)；组织提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司生产的血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(tiangen,dp304)；2
×
taq master mix(所需的taq酶、dntp混合物；mgcl2以及反应缓冲液预先配制成2倍浓度的混合物)所需试剂购自takala公司(takala，rr001b)；sape原液购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(life technologies，s-866)，tmac(四甲基氯化铵溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma t3411)；sarkosyl solution(十二烷基肌氨酸钠溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma l7414)；tris-hcl盐酸三(羟甲基)氨基甲烷，购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8230)；triton x-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8200)；edta(乙二胺四乙酸)购自赛国生物科技有限责任公司(biofroxx 1340gr500)；tris(三羟甲基氨基甲烷)购自赛国生物科技有限责任公司(biofroxx 1115gr500)；nacl(氯化钠)购自天大化学试剂。
[0319]
2.按照实施例1说明的方法，进行探针设计及合成，序列如下
[0320]
tz-p16 5'amino modifier c12-gagggtggggcggatcgcgtgcgttcg-3'(seq id no.16)
[0321]
tz-β-actin 5'amino modifier c12tcgtggtggtgaagttgtagtcgcgttcggtgagg-3'(seq id no.5)
[0322]
tz-rassf1a 5'amino modifier c12-tggtattcgttgggcg cgttgggaag-3'(seq id no.17)。
[0323]
按照实施例1说明的方法进行磁珠-探针偶联，将偶联的磁珠-探针偶联物进行细胞计数器计数微珠数量，用te ph8.0，配成杂交磁珠-探针混合液。
[0324]
3.按照实施例2说明的方法，进行引物设计及合成，序列如下：
[0325]
上游引物：p16-m-f 5'-attagagggtggggcggatcgc-3'(seq id no.18)
[0326]
下游引物:p16-m-r 5'biotin-accccgaaccgcgaccgtaa-3'(seq id no.19)
[0327]
上游引物：rassf1a-m-f 5'-gttggtattcgttgggcgc-3'(seq id no.20)
[0328]
下游引物:rassf1a-m-r 5'biotin-aactaccgtataaaattacacgcg-3’(seq id no.21)
[0329]
内参基因引物:
[0330]
上游引物：β-actin-m-f 5'-tttaatgttacgtacgatttttc-3'(seq id no.11)
[0331]
下游引物：β-actin-m-r 5'biotin-gtaggatggtatggggga-3'(seq id no.12)。
[0332]
其中biotin表示生物素修饰。
[0333]
引物干粉分别加入te ph8.0溶解，配成pcr引物混合液，使每对引物的浓度为2.5μm。
[0334]
4.组织样本的提取：天根生化科技(北京)有限公司生产的血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(dp304)，按照说明书方法，对5个人类胃癌组织样本和5个非胃癌样本组织进行dna提取。
[0335]
5.使用经重亚硫酸盐转化后的人类甲基化dna和人类非甲基化dna(zymo research，d5014)作为阳性和阴性标准品，经重亚硫酸盐转化后的人类组织dna样本作为待测样本。
[0336]
6.多重检测
[0337]
1)本实施例pcr扩增体系如下表7所示：
[0338]
表7.实施例6多重检测中的10μl pcr扩增体系
[0339]
成分体积pcr引物混合液(2.5μm)0.8μl2
×
taq酶mix5μl转化后dna模板2μlddh2o至10μl
[0340]
混合后震荡均匀，瞬时离心，置于bio-rad t100上进行pcr反应，反应程序如下：
[0341][0342]
2)杂交：取2μl步骤1)pcr产物，加入33μl 1.5
×
杂交缓冲液(4.5m tmac，0.15％sarkosyl solution，75mm tris-hcl，6mm edta，ph8.0)，杂交磁珠-探针混合液(luminex，microspheres)4μl(每种磁珠-探针偶联物数量为2500个/反应)，水11μl混合后震荡均匀。按如下条件设置pcr仪并进行反应：96℃90s，58℃60min。
[0343]
3)显色：制备sape混合液，包括sape原液5.25μl；1
×
tm杂交液(0.2m nacl，0.1m tris，0.08％triton x-100，ph 8.0)350μl。将步骤2)杂交产物从pcr仪取下后立即置于磁力板(v&p scientific，vp771ld-4cs)上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入配制好的sape混合液25μl，封膜后震荡混匀20s。按如下条件设置pcr仪并进行反应：37℃，15min。反应结束后将96孔板立即置于磁力板上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入1
×
tm杂交液50μl，震荡混匀20s，之后置于磁力板30-60s后弃去上清，重复1次。最后分别向每个反应孔中加入1
×
tm杂交液75μl，震荡混匀20s。
[0344]
4)液相芯片平台检测：步骤3)得到的产物使用luminex200液相芯片平台进行检测，检测操作步骤及参数设置按照luminex200操作说明书操作。
[0345]
5)检测结果判定：样本检测结果与阴性标准品结果进行比对，如果某一基因的检测数值大于或等于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因为阳性，如果样本一基因的检测数值小于阴性标准品数值的三倍，则判定为阴性。
[0346]
7.实验结果如表8所示，nc为阴性对照，pc为阳性对照。
[0347]
表8实施例6胃癌样本多重检测结果
[0348]
位点样本b39_runx3b55_p16b66_β-actinb72_rassf1a
1(1，a1)c116821071640410.52(1，31)c2517.51248881943(1，c1)c318751558.513483714(1，d1)c417361491477400.55(1，e1)c5144640611732576(1，f1)h181112.54221017(1，f1)h290.589.58671128(1，g1)h36788722659(1，a2)h4147.5131853.58310(1，b2)h5901721244187.511(1，c2)pc207016001994.5146912(1，d2)nc73.578766013(1，e2)h7988.58468
[0349]
检测结果中，阳性对照几个位点的检测结果均大于其对应nc值的3倍，证明该方法可以同时进行多个位点的检测；5个患者样本均有不少于2个位点为阳性，而对照均为阴性，证明该方法能够较好地将胃癌样本区分出来。
[0350]
实施例7磁珠探针偶联
[0351]
1.本实施例采用的探针由金斯瑞生物科技公司合成。试剂mes(2-(n-吗啉)乙磺酸)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma m3671)。edacn
′‑
(乙基亚胺基亚甲基)-n，n-二甲基-1，3-丙二胺单盐酸盐购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma e7750)。tween-20(吐温-20)购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8220)。sds(十二烷基硫酸钠)购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio s8010)。ph8.0的te溶液：物质组成是10mm tris-hcl、1mm edta。
[0352]
2.针对待检测区域核酸序列设计特异性单链dna探针，5'末端行进amino modifier c12修饰，目的在于探针氨基与微珠羟基偶联。
[0353]
探针序列长度为20-45bp，tm值为75-90℃
[0354]
探针序列如下：
[0355]
nptx2 5'amino modifier c12-cgcgatcggtgcggttgtgagacggtgatcgcg-3'(seq id no.22)
[0356]
探针用纯水稀释至0.1nanomole，备用。
[0357]
3.微珠为luminex公司的表面羟基修饰的magplex磁珠，适用于luminex公司的magpix或luminex100/200液相悬浮芯片系统。也可采用其他羟基表面修饰的磁珠及其他液相芯片系统，在此不做限定。
[0358]
4.偶联步骤
[0359]
1)取未偶联的magplex磁珠1.25
×
106个，加入到1.5ml离心管中，放在磁力架磁吸2min，吸弃上清。
[0360]
2)加入10μl 0.1m mes，ph 4.5，充分振荡混匀，超声20s。
[0361]
3)继续在离心管中加入2μl探针(0.1nanomole)，涡旋混匀。
[0362]
4)新鲜配制10mg/ml edac，取0.75μl加入上述离心管，涡旋混匀，避光放置30min。
[0363]
5)再次加入新鲜配制的10mg/ml edac，取0.75μl加入上述离心管，涡旋混匀，避光放置30min。
[0364]
6)加入1ml体积百分比为0.02％tween-20至上述离心管中，放在磁力架磁吸2min，吸弃上清。
[0365]
7)加入1ml体积百分比为0.1％sds溶液放在磁力架磁吸2min，吸弃上清。
[0366]
8)加入50μl ph8.0的te溶液(其中物质组成是10mm tris-hcl、1mm edta)涡旋混匀，得到偶联好的磁珠-探针偶联物。
[0367]
使用血细胞计数器计数微珠数量，如需保存，应在2～8℃避光保存。
[0368]
实施例8检测特异性分析
[0369]
1.本实施例采用的引物由金斯瑞生物科技公司合成，含有m-apc，m-nptx2，，β-actin甲基化位点目的区域和nc(不含甲基化位点目的区域)质粒由金唯智生物科技有限公司合成；2
×
taq master mix(所需的taq酶、dntp混合物，mgcl2以及反应缓冲液预先配制成2倍浓度的混合物)所需试剂购自takala公司(takala，rr001b)；sape原液购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(life technologies，s-866)；tmac(四甲基氯化铵溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma t3411)；sarkosyl solution(十二烷基肌氨酸钠溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma l7414)；tris-hcl盐酸三(羟甲基)氨基甲烷购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8230)；triton x-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8200)；edta(乙二胺四乙酸)购自赛国生物科技有限责任公司(biofroxx 1340gr500)；tris(三羟甲基氨基甲烷)购自赛国生物科技有限责任公司(biofroxx 1115gr500)；nacl(氯化钠)购自天大化学试剂。ph8.0的te溶液：物质组成是10mm tris-hcl、1mm edta。
[0370]
2.引物探针设计及合成
[0371]
pcr引物针对甲基化位点设计，引物的纯度应达到电泳级(page)或hplc级，引物序列长度为15-30bp，tm值为50-65℃，下游引物5'端进行生物素修饰。
[0372]
上游引物：nptx2-m-f 5'-ttcggtaggttagagtgt c-3'(seq id no.23)
[0373]
下游引物：nptx2-m-r 5'-biotin-ctatcgtctcgaaaatcgcgc-3'(seq id no.27)
[0374]
其中biotin表示生物素修饰。
[0375]
引物干粉分别加入te ph8.0溶解，使引物的浓度为2.5μm。
[0376]
3.标准品和阴性参照品合成
[0377]
m-apc，m-nptx2，β-actin甲基化位点目的区域标准品和nc阴性对照标准品干粉分别加无酶水溶解后，稀释至10
15
拷贝/ml，10倍梯度稀释标准品，均取10
10
拷贝/ml作为标准品模板，使用m-apc，m-nptx2，，β-actin分别检测nptx2磁珠-探针偶联物和nptx2引物的特异性。
[0378]
4.特异性分析
[0379]
1)m-apc，m-nptx2，β-actin甲基化位点目的区域标准品，nc阴性标准品，按照上述要求稀释作为待测模板，按照下述步骤进行检测：
[0380]
2)本实施例pcr扩增体系如表9所示：
[0381]
表9.实施例9特异性分析中的10μl pcr扩增体系
[0382][0383][0384]
混合后震荡均匀，瞬时离心，置于bio-rad t100上进行pcr反应，反应程序如下：
[0385][0386]
3)杂交：取2μl步骤2)pcr产物，加入33μl 1.5
×
杂交缓冲液(4.5m tmac，0.15％sarkosyl solution，75mm tris-hcl，6mm edta，ph8.0)，杂交磁珠混合液(luminex，microspheres)4μl(磁珠-探针偶联物数量为2500个/反应)，水11μl混合后震荡均匀。按如下条件设置pcr仪并进行反应：96℃90s，58℃60min。
[0387]
4)显色：制备sape混合液，包括sape原液1.875μl；1
×
tm杂交液(0.2m nacl，0.1m tris，0.08％triton x-100，ph 8.0)125μl。将步骤3)杂交产物从pcr仪取下后立即置于磁力板(v&p scientific，vp771ld-4cs)上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入配制好的sape混合液25μl，封膜后震荡混匀20s。按如下条件设置pcr仪并进行反应：37℃，15min。反应结束后将96孔板立即置于磁力板上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入1
×
tm杂交液50μl，震荡混匀20s，之后置于磁力板30-60s后弃去上清，重复1次。最后分别向每个反应孔中加入1
×
tm杂交液75μl，震荡混匀20s。
[0388]
5)液相芯片平台检测：步骤4)得到的产物使用luminex200液相芯片平台进行检测，检测操作步骤及参数设置按照luminex200操作说明书操作。
[0389]
6)检测结果判定：样本检测结果与阴性标准品结果进行比对，如果某一基因的检测数值大于或等于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因为阳性，如果样本某一基因的检测数值小于阴性标准品数值的三倍，则判定为阴性。
[0390]
5.检测结果如表10所示，m-apc，m-nptx2，β-actin为甲基化位点的目的区域标准品，nc为阴性标准品。
[0391]
表10磁珠-探针偶联物特异性检测结果
[0392][0393]
[0394]
可见，本检测方法nptx2引物和磁珠-探针偶联物能够特异性的区分nptx2标准品，说明该方法特异性较好。
[0395]
实施例9多重检测分析
[0396]
1.本实施例采用的引物和探针由金斯瑞生物科技公司合成；阴性标准品为经重亚硫酸盐转化人类非甲基化dna，购自zymo research生物公司(zymo research，d5014)；血液dna样本提取购自qiagen公司(qiagen，55114)；2
×
taq master mix(所需的taq酶、dntp混合物；mgcl2以及反应缓冲液预先配制成2倍浓度的混合物)所需试剂购自takala公司(takala，rr001b)；sape原液购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(life technologies，s-866)，tmac(四甲基氯化铵溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma t3411)；sarkosyl solution(十二烷基肌氨酸钠溶液)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(sigma l7414)；tris-hcl盐酸三(羟甲基)氨基甲烷，购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8230)；triton x-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)购自北京索莱宝科技有限公司(solarbio t8200)；edta(乙二胺四乙酸)购自赛国生物科技有限责任公司(biofroxx 1340gr500)；tris(三羟甲基氨基甲烷)购自赛国生物科技有限责任公司(biofroxx 1115gr500)；nacl(氯化钠)购自天大化学试剂。
[0397]
2.按照实施例1说明的方法，进行探针设计及合成，序列如下
[0398]
tz-apc 5'amino modifier c12-cgcgatcgttggatgcggaatcgcg-3'(seq id no.24)
[0399]
tz-β-actin 5'amino modifier c12-tcgtggtggtgaagttgtagtcgcgttcggtgagg-3'(seq id no.5)
[0400]
按照实施例1说明的方法进行磁珠-探针偶联，将偶联的磁珠-探针偶联物进行细胞计数器计数微珠数量，用te ph8.0，配成杂交磁珠-探针混合液。
[0401]
3.按照实施例2说明的方法，进行引物设计及合成，序列如下：
[0402]
上游引物：apc-m-f 5'-attgcggagtgcgggtc-3'(seq id no.25)
[0403]
下游引物:apc-m-r 5'biotin-aatcgacgaactcccgacg-3'(seq id no.26)
[0404]
内参基因引物:
[0405]
上游引物：β-actin-m-f 5'-tttaatgttacgtacgatttttc-3'(seq id no.11)
[0406]
下游引物：β-actin-m-r 5'biotin-gtaggatggtatggggga-3'(seq id no.12)。
[0407]
其中biotin表示生物素修饰。
[0408]
引物干粉分别加入te ph8.0溶解，配成pcr引物混合液，使每对引物的浓度为2.5μm。
[0409]
4.血液样本的提取：qiagen公司生产的游离核酸dna提取试剂盒(55114)，按照说明书方法，对3个胰腺癌样本和5个健康血液样本进行dna提取
[0410]
5.使用经重亚硫酸盐转化后的人类甲基化dna和人类非甲基化dna(zymo research，d5014)作为阳性和阴性标准品，经重亚硫酸盐转化后的人类组织dna样本作为待测样本。
[0411]
6.多重检测
[0412]
1)本实施例pcr扩增体系如下表11所示：
[0413]
表11实施例9多重检测中的10μl pcr扩增体系
[0414]
成分体积pcr引物混合液(2.5μm)0.8μl2
×
taq酶mix5μl转化后dna模板2μlddh2o至10μl
[0415]
混合后震荡均匀，瞬时离心，置于bio-rad t100上进行pcr反应，反应程序如下：
[0416][0417]
2)杂交：取2μl步骤1)pcr产物，加入33μl 1.5
×
杂交缓冲液(4.5m tmac，0.15％sarkosyl solution，75mm tris-hcl，6mm edta，ph8.0)，杂交磁珠-探针混合液(luminex，microspheres)4μl(每种磁珠-探针偶联物数量为2500个/反应)，水11μl混合后震荡均匀。按如下条件设置pcr仪并进行反应：96℃90s，58℃60min。
[0418]
3)显色：制备sape混合液，包括sape原液5.25μl；1
×
tm杂交液(0.2m nacl，0.1m tris，0.08％triton x-100，ph 8.0)350μl。将步骤2)杂交产物从pcr仪取下后立即置于磁力板(v&p scientific，vp771ld-4cs)上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入配制好的sape混合液25μl，封膜后震荡混匀20s。按如下条件设置pcr仪并进行反应：37℃，15min。反应结束后将96孔板立即置于磁力板上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入1
×
tm杂交液50μl，震荡混匀20s，之后置于磁力板30-60s后弃去上清，重复1次。最后分别向每个反应孔中加入1
×
tm杂交液75μl，震荡混匀20s。
[0419]
4)液相芯片平台检测：步骤3)得到的产物使用luminex200液相芯片平台进行检测，检测操作步骤及参数设置按照luminex200操作说明书操作。
[0420]
5)检测结果判定：样本检测结果与阴性标准品结果进行比对，如果某一基因的检测数值大于或等于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因为阳性，如果样本一基因的检测数值小于阴性标准品数值的三倍，则判定为阴性。
[0421]
7.实验结果如表12所示，nc为阴性对照，pc为阳性对照。
[0422]
表12本实施例9胰腺癌样本多重检测结果
[0423][0424]
检测结果中，阳性对照几个位点的检测结果均大于其对应nc值的3倍，证明该方法可以同时进行多个位点的检测；3个患者样本均有不少于1个位点为阳性，而对照均为阴性，证明该方法能够较好地将胰腺癌样本区分出来。
[0425]
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本技术所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。

技术特征：
1.一种甲基化检测的方法，其包括以下步骤：a)获得探针和特异性于目的基因的甲基化位点的pcr引物，其中所述pcr引物包括上游引物以及下游引物，所述下游引物的5’端带有标记；其中所述探针的5’端有氨基修饰，且所述探针的5’端与载体偶联；b)将所述上游引物与所述下游引物对样本进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；将所述pcr扩增产物与所述探针杂交，获得杂交产物；c)检测所述杂交产物的信号。2.根据权利要求1所述的方法，，其中所述目的基因选自下组：a)sept9、foxe1和vim；b)runx3、p16和rassfia；和，c)apc和nptx2。3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述下游引物包含seq id no.3,8，10,15,19,21,26,27中任一项所示的核苷酸序列。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述上游引物包含seq id no.2，7，9,14,18,20,23,25中任一项所示的核苷酸序列。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述探针包含seq id no.1,4,6,13,16,17,24中任一项所示的核苷酸序列。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述载体与所述探针通过所述氨基修饰功能基团连接。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述标记包括生物素标记和/或荧光标记。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中步骤b)所述的pcr扩增的次数为1次。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：a)获得内参探针和非特异性于目的基因的甲基化位点的内参引物和内参探针，其中所述内参引物包括内参上游引物和内参下游引物，所述内参下游引物的5’端带有标记；其中所述内参探针的5’端有氨基修饰，且所述内参探针的5’端与载体偶联；b)将所述内参上游引物与所述内参下游引物对样本进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；将所述pcr扩增产物与所述内参探针杂交，获得杂交产物；c)检测所述杂交产物的信号。10.引物对，其包含权利要求1-9中任一项所述的上游引物，和，权利要求1-9中任一项所述的下游引物。

技术总结
本申请涉及一种甲基化检测方法，其包括以下的步骤：a)获得探针和特异性于目的基因的甲基化位点的PCR引物，其中所述PCR引物包括上游引物以及下游引物，所述下游引物的5’端带有标记；其中所述探针的5’端有氨基修饰，且所述探针的5’端与载体偶联；b)将所述上游引物与所述下游引物对样本进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；将所述PCR扩增产物与所述探针杂交，获得杂交产物；c)检测所述杂交产物的信号。所述甲基化检测方法仅需一能PCR扩增就高特异性、高灵敏度地检测一个以上基因的甲基化位点，有广泛的应用价值。的应用价值。


技术研发人员：高蕾 贺綦 陈晨 张若寒
受保护的技术使用者：昂凯生命科技（苏州）有限公司
技术研发日：2022.03.18
技术公布日：2023/9/23