一种糖基转移酶突变体及其应用

1.本发明涉及一种生物法合成罗汉果苷的方法，属于甜味剂的生物合成技术领域。


背景技术：

2.罗汉果苷是从罗汉果中分离得到的四环三萜类化合物，是其主要的甜味物质，具有零热量、高甜度的特点。除具有镇咳、治疗干咳等作用，罗汉果苷还被证明具有抗癌、抗肿瘤、抑菌的生物活性。由于罗汉果苷结构复杂且在自然界中含量低，同时罗汉果种植对环境要求苛刻，故传统的种植方法使得罗汉果苷的进一步应用受到限制。因此，亟待开发一种罗汉果苷的替代制备方法。
3.在罗汉果合成过程中，糖基转移酶催化的多级糖基化反应是此类物质具有高甜度的关键因素。目前文献已报道的能够对罗汉果苷进行糖基化修饰的糖基转移酶数量较少，且存在催化活性低等问题。因此，挖掘能够催化罗汉果苷糖基化修饰的糖基转移酶、同时提高此类酶的催化活性对甜味剂的开发以及开拓罗汉果苷的市场具有重要意义。
4.我们实验验证了糖基转移酶mg1和ms1在罗汉果苷合成中的应用。同时，设计构建并实验证实了罗汉果苷的合成路线。涉及到的过程为：糖基转移酶mg1突变体催化罗汉果醇先后生成罗汉果苷ie和罗汉果苷iie，随后在ms1的催化下先后形成罗汉果iiia、iiie，罗汉果苷iv和v。即利用上述酶成功实现了从罗汉果醇到罗汉果苷iv和罗汉果苷v的体外转化合成。此外，通过定点突变和组合突变，提高了ms1的催化活性，提高了罗汉果苷的转化率。


技术实现要素：

5.本发明通过定点突变技术，提高了糖基转移酶ms1对罗汉果苷的催化活性，并且与不同糖基转移酶组合进行催化作用，成功实现了转化罗汉果醇合成罗汉果苷，提供一种制备罗汉果苷的方法，其以罗汉果醇和udp-葡萄糖为底物，通过多酶反应体系催化生产罗汉果苷。验证并弥补了目前从罗汉果醇到罗汉果苷iv和v合成路径尚未实现的现状。
6.本发明采用以下技术方案：
7.本发明提供一种糖基转移酶ms1突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列包含在对应于seq id no.2的11、13、19、25、34、37、38、40、46、62、77、82、102、107、108、116、139、142、146、16、17、18、20、21、23、24、26、354、189、195、202、225、236、243、265、267、270、292、298、344、391、313、349、359、360、366、395、417、427、438、439、222、327中至少一个位点的氨基酸残基的突变。
8.根据本发明，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中至少一个位点的氨基酸残基的突变。
9.根据本发明，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中任意两个位点的氨基酸残基的突变。在一个实施方案中，所述突变体的氨基酸序列包含上述两个位点的突变，并且至少其中一个突变位点为146位点。优选地，所述突变体的氨基酸序列的其中一个突变位点为146a位点，另一突变位点为
34、77、122、144、225、265、298、344、391中任意一个。
10.根据本发明，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中任意三个位点的氨基酸残基的突变。在一个实施方案中，所述突变体的氨基酸序列包含146/77/34位点的突变。
11.根据本发明，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中任意四个位点的氨基酸残基的突变。在一个实施方案中，所述突变体的氨基酸序列包含146/77/34/344位点的突变。
12.根据本发明，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中任意五个位点的氨基酸残基的突变。在一个实施方案中，所述突变体的氨基酸序列包含146/77/34/344/391位点的突变。
13.根据本发明，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中任意六个位点的氨基酸残基的突变。在一个实施方案中，所述突变体的氨基酸序列包含146/77/34/344/391/313位点的突变。
14.根据本发明，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中任意七个位点的氨基酸残基的突变。在一个实施方案中，所述突变体的氨基酸序列包含146/77/34/344/391/313/360位点的突变。
15.根据本发明，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中任意八个位点的氨基酸残基的突变。在一个实施方案中，所述突变体的氨基酸序列包含146/77/34/344/391/313/360/122位点的突变。
16.根据本发明，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中任意九个位点的氨基酸残基的突变。在一个实施方案中，所述突变体的氨基酸序列包含146/77/34/344/391/313/360/122/144位点的突变。
17.根据本发明，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中任意十个位点的氨基酸残基的突变。在一个实施方案中，所述突变体的氨基酸序列包含146/77/34/344/391/313/360/122/144/225位点的突变。
18.根据本发明，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中任意十一个位点的氨基酸残基的突变。在一个实施方案中，所述突变体的氨基酸序列包含146/77/34/344/391/313/360/122/144/225/265位点的突变。
19.根据本发明，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中任意十二个位点的氨基酸残基的突变。在一个实施方案中，所述突变体的氨基酸序列包含146/77/34/344/391/313/360/122/144/225/265/298位点的突变。
20.根据本发明，所述突变体与seq id no.2所示的氨基酸序列具有70％以上的同源性，例如80％以上的同源性，再例如90％以上、95％以上、98％以上的同源性。
21.本发明还提供编码上述糖基转移酶ms1突变体的核酸。
22.本发明还提供包含编码上述糖基转移酶ms1突变体核酸的重组载体。
23.本发明还提供表达上述糖基转移酶ms1突变体的基因工程菌，其包含编码所述糖基转移酶ms1突变体的核酸。
24.根据本发明，所述基因工程菌是将所述核酸连接载体得到重组载体，再导入宿主菌中得到的重组菌株。
25.根据本发明，所述宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸菌、酵母菌或者中国仓鼠卵巢细胞中的任一种，例如可选用e.coli bl21(de3)、bl21(de3)plyss、rosetta(de3)、endotoxin-free bl21(de3)、bl21 trxb(de3)、jm109、dh5α、top10等。
26.根据本发明，所述载体可选用原核表达载体或真核表达载体，例如大肠杆菌表达载体、枯草芽孢杆菌表达载体和链霉菌表达载体中的任一种。优选地，所述载体选自pet15b，pet28a，pet32，pgex4t1，pgex-6p-1中的任一种。
27.根据本发明，所述核酸与载体通过连接酶或pcr重组的方式连接形成重组载体。
28.根据本发明，所述基因工程菌表达糖基转移酶ms1突变体。优选地，通过诱导表达，例如，iptg诱导表达。
29.本发明还提供上述基因工程菌的构建方法，包括将所述核酸连接载体得到重组载体，再导入宿主菌中得到的重组菌株的步骤。
30.本发明提供该基因工程菌在制备糖基转移酶ms1突变体中的应用。
31.本发明进一步提供一种糖基转移酶ms1突变体的制备方法，包括培养所述基因工程菌，使其表达编码所述糖基转移酶ms1突变体的核酸的步骤。
32.根据本发明，所述培养的温度为35-40℃，优选37℃；培养时间为1-3h，优选2h。
33.根据本发明，所述培养还包括诱导表达步骤，加入诱导物后，温度为10-20℃，优选16℃；培养时间为16-24h。
34.根据本发明，所述培养在搅拌或振荡条件下进行，例如搅拌转速为100-1000rpm，优选200rpm。
35.根据本发明，所述制备方法还包括从培养物中分离和/或纯化糖基转移酶ms1突变体的步骤。
36.本发明还提供上述糖基转移酶ms1突变体在制备罗汉果苷中的应用。
37.进而本发明还提供了一种罗汉果苷的生产方法。
38.根据本发明，其中，所述罗汉果苷为罗汉果苷ie、iie、iiie、iiia、iva、sia i或v中的一种或多种。
39.根据本发明，所述突变体以罗汉果醇、罗汉果苷ie、iie、iiie、iiia、ive或sia i为底物进行催化反应。优选地，所述突变体以罗汉果苷iie、iiie、iiia、ive或sia i为底物进行催化反应。
40.根据本发明，所述方法还包括使用糖基转移酶mg1。其中，所述糖基转移酶mg1以罗汉果醇或罗汉果苷ie为底物进行催化反应。
41.本发明还提供了罗汉果甜味剂合成方法，其中罗汉果甜味剂为罗汉果苷ie、iie、iiie、iiia、iva、sia i或v中的一种或多种，其特征在于，所述方法包括使上述糖基转移酶ms1突变体与以罗汉果醇、罗汉果苷ie、iie、iiie、iiia、ive或sia i接触，进行催化反应。优选地，与罗汉果苷iie、iiie、iiia、ive或sia i接触。
42.根据本发明，上述方法还包括糖基转移酶mg1催化的一级糖基化修饰。
43.根据本发明，所述糖基转移酶mg1以罗汉果醇或罗汉果苷ie为底物进行催化反应。优选地，所述糖基转移酶mg1的氨基酸序列为seq id no.4所示。
44.本发明还提供了上述糖基转移酶及其突变体酶法生物合成罗汉果苷方法及应用。
45.根据本发明，所述合成罗汉果苷方法及应用包括如下步骤：
46.1)培养本发明所述基因工程菌，使其表达编码所述糖基转移酶ms1突变体的核酸；
47.2)培养物中分离和/或纯化糖基转移酶ms1突变体；
48.3)加入罗汉果醇、罗汉果苷ie、iie、iiie、iiia、ive或sia i，与2)步得到的糖基转移酶ms1突变体，进行催化反应，得到罗汉果苷。
49.根据本发明，所述方法或应用中还包括udp-葡萄糖或udp和蔗糖。优选地，所述蔗糖是由蔗糖合成酶合成的。其中，所述蔗糖合成酶的氨基酸序列为seq id no.6所示。
50.本发明还提供了上述糖基转移酶及其突变体全细胞生物合成罗汉果苷方法及应用。
51.根据本发明，所述合成罗汉果苷方法及应用包括如下步骤：
52.1)培养本发明所述基因工程菌，使其表达编码所述糖基转移酶ms1突变体的核酸；
53.2)收集细胞；
54.3)加入罗汉果醇、罗汉果苷ie、iie、iiie、iiia、ive或sia i，与2)步收集的细胞，进行反应。
55.根据本发明的方法或应用，所述糖基转移酶ms1突变体优选对应于seq id no.2的s34a/f77l/v146a/a313v/t344v/m360l/a391v或s34a/f77l/v146a突变体。
56.根据本发明的方法或应用，还包括使用糖基转移酶mg1。其中，所述糖基转移酶mg1的氨基酸序列为seq id no.4所示。
57.有益效果
58.本发明提供了影响糖基转移酶ms1活性的突变位点；同时本发明提供了在一个多酶反应体系中，以罗汉果醇和udp-葡萄糖(或udp和蔗糖)为原料，通过体外多酶催化罗汉果醇转化为多种罗汉果苷iv以及罗汉果苷v。在整个罗汉果苷合成途径中，只需要补充蔗糖和罗汉果醇或中间产物，就能够实现罗汉果苷iv和v的高效合成。本发明方法成本低，过程简单，转化效率高，可提高未成熟罗汉果果实提取物的甜度，可作为传统种植获得罗汉果苷的替代方法。
附图说明
59.图1.糖基转移酶sds-page图(1：mg1；2：ms1)。
具体实施例
60.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
61.下文中，仅仅是为说明，只在实施例中描述了其中一少部分，然而不应将其理解为对本发明的限制。除非特殊说明，否则本发明中所使用的试剂都是市售可购买的。
62.实施例1.突变体设计
63.首先，将罗汉果来源的糖基转移酶ms1(核苷酸序列如seq id no:1，氨基酸序列如seq id no:2)与其他具有三萜类二级糖基化修饰的糖基转移酶进行氨基酸多序列比对分
析，鉴别糖基转移酶ms1序列中与催化功能和底物识别功能的重要氨基酸残基位点。
64.同时，对糖基转移酶ms1进行结构预测。利用swiss-model、phyre2、discovery studio等软件对ms1蛋白进行同源建模，并利用罗汉果醇或罗汉果苷等底物进行分子对接，从而预测酶的催化位点及底物结合位点，并分析这些位点附近氨基酸残基的作用。
65.最后，对上述同源比对分析和蛋白结构模拟挖掘出的关键位点进行定点突变，并在大肠杆菌中表达这些突变酶，进行活性测定。
66.实施例2.突变体活性测定
67.酶活性反应体系：0.2mm罗汉果苷iie、1mm udp-葡萄糖、mgcl
2 5 mm并加入约100μgms1或其突变体的纯酶液，50mm tris-hcl(ph 8)补齐反应液至300μl，35℃水浴锅反应30-120min(根据不同突变体活性而定)。反应结束后加入等体积色谱级甲醇终止反应。14000rpm离心5min并经过0.22μm滤膜过滤后利用高效液相色谱aglilent 1260进行检测。分析方法：c18分析型色谱柱(4.6
×
250mm，5μm)；进样量20μl；流动相a(乙腈+0.1％甲酸)和b(水+0.1％甲酸)，梯度洗脱条件为：0-25min，a泵25％-85％梯度洗脱；流动相流速为1ml/min，紫外检测波长为203nm。
68.经过筛选发现，位点11、13、19、25、34、37、38、40、46、62、77、82、102、107、108、116、139、142、146、16、17、18、20、21、23、24、26、354、189、195、202、225、236、243、265、267、270、292、298、344、391、313、349、359、360、366、395、417、427、438、439、222、327突变后对酶的催化活性影响较大。
69.其中，t11r、l13a、n37a、s46w、s108d、h116e、v225t、q243g、f267a的相对酶活为野生型的1.1、1.3、1.3、1.5、1.6、3.1、1.7、1.4、1.5倍。此外，获得与活性密切相关的10个位点，其在序列总的位置编号为34、77、122、144、146、225、265、298、344、391。对上述与活性密切相关的10个位点进行单点饱和突变，具体操作如下：以重组质粒pet32-ms1为模板，以带有突变位点的一对引物，用高保真酶进行全质粒pcr扩增，获得指定突变位点的重组质粒。扩增产物用dpni酶在37℃条件下消化2h，降解初始模板。消化产物转化至e.coli bl21，涂布到含有100μg/ml氨苄霉素lb琼脂平板上，37℃过夜培养，每个位点筛选200个阳性克隆。
70.建立突变体通量筛选方法，分析测定酶的催化活性，将催化活性提高的糖基转移酶突变体进行测序分析相应位置氨基酸突变为何种氨基酸。活性提高的突变体的突变位点及相对活性如表1所示，野生型相对活性为1。
71.表1
[0072][0073]
实施例3.组合突变
[0074]
由于v146a的相对活性将上述单突变位点进行组合，获得不同组合方式的双突变体，并以其中相对活性较高的突变体进一步与其他位点进行逐轮的组合突变，并测定相对
活性，表2-3列举了相对活性提高的组合突变体的相对活性，野生型相对活性为1.
[0075]
表2
[0076][0077]
表3
[0078]
[0079][0080]
实施例4.糖基转移酶的诱导表达
[0081]
为得到糖基转移酶，分别将含有pet32-mg1(核苷酸序列如seq id no:3，氨基酸序列如seq id no:4)、和ms1质粒的大肠杆菌接种到含有100mg/ml氨苄霉素的lb液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养过夜得到种子液。按1％的接种量接种到50ml新鲜的lb培养基中，37℃、200rpm培养2h。当od
600
值达0.7左右时，向培养基中添加终浓度0.4mm的异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖(iptg)，16℃、200rpm下诱导16到24h。6000rpm离心收菌，用1ml的tris
·
hcl(ph＝8.0)重悬菌液超声破碎，14000rpm离心1h，取上清作为粗酶液。采用ni柱亲和层析的方法进行纯化，并进一步用50kda的超滤管进行超滤，得到浓缩纯化的野生型及突变体蛋白(如图1所示)。
[0082]
实施例5.糖基转移酶酶活性评价
[0083]
tris-hcl(ph＝8.0)，0.2mm的罗汉果醇或罗汉果苷，1mm的udp-葡萄糖，10mm mgcl2，100μg ms1或其突变体的纯酶液，40℃反应12h。糖基化反应结束后，加入等体积甲醇终止反应，利用液相与质谱进行测定。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，色谱柱为c18色谱柱，流动相：水+0.1％甲酸，乙腈+0.1％甲酸，流速：1ml/min，上样量为20μl。梯度洗脱条件为0-30min，25％-80％乙腈(0.1％甲酸)流速1ml/min，紫外检测波长为203nm。质谱条件为正离子模式，esi离子源。
[0084]
实施例6.罗汉果苷iie的酶法合成
[0085]
10ml反应体系中，包括底物罗汉果醇10mg，50mg udp-葡萄糖，糖基转移酶mg1酶液25mg、10mm mgcl2、50mm tris-hcl缓冲液(ph＝8.0)。反应2-5小时后，取300μl样品加入等体积甲醇终止反应，离心过滤进行hplc检测(实施例5)。结果显示罗汉果醇先生成罗汉果苷ie随后生成罗汉果苷iie，最终罗汉果醇完全转化为单一产物罗汉果苷iie。
[0086]
实施例7.罗汉果苷iie的全细胞生物合成
[0087]
诱导表达完成后，收集大肠杆菌细胞(含有pet32-mg1)，采用pb缓冲液(50mm，ph＝8.0)重悬，加入罗汉果醇10mg，葡萄糖5％，37℃反应12-24小时后，进行hplc检测。结果显示
25mg、ms1-s34a/f77l/v146a/a313v/t344v/m360l/a391v突变体酶液50mg、ms2(核苷酸序列如seq id no:9，氨基酸序列如seq id no:10)50mg、10mm mgcl2、50mm tris-hcl缓冲液(ph＝8.0)。反应12、16、24小时后，取300μl样品加入等体积甲醇终止反应，离心过滤进行hplc检测。结果显示16小时底物完全转化，且产物中罗汉果苷v占比为99％以上。与实施例14相比，反应达到最终反应状态所用时间缩短。
[0104]
实施例16.蔗糖合酶供给udp-葡萄糖与罗汉果苷v的生物合成
[0105]
采用pet21质粒，借助bamhi和xhoi等酶切位点，构建蔗糖合酶(arabidopsis thaliana蔗糖合成酶简称atsus1，核苷酸序列如seq id no:5，氨基酸序列如seq id no:6)的表达载体，并导入大肠杆菌bl21。根据实施例4中的方法对含有糖基转移酶mg1、ms1和蔗糖合酶atsus1的菌株分别进行诱导表达，完成后收集菌体，并破碎纯化获得上述酶蛋白。构建基于udp-葡萄糖循环的罗汉果苷的生物合成体系(10ml)：底物罗汉果醇为10mg、udp 10mg、糖基转移酶mg1 25 mg、ms1-s34a/f77l/v146a突变体酶液50mg、蔗糖合酶atsus1 10mg、10mm mgcl2、50mm tris-hcl缓冲液(ph＝7.0)。反应6-24小时，取样进行液相检测，结果显示转化效率好且底物转化效率比实施例14中的转化效率快。表明与蔗糖合酶的配合使用更有利于苷的合成。
[0106]
实施例17.罗汉果苷v的酵母全细胞生物合成
[0107]
首先，利用抗性基因将酿酒酵母中的exg水解酶基因替换、敲除，获得酵母工程菌株s.g-01，然后将含有糖基转移酶mg1和ms1-s34a/f77l/v146a/a313v/t344v/m360l/a391v突变体的酵母表达质粒转化至菌株s.g-01中，通过缺陷型筛选，获得菌株s.g-02。分别挑取重组酵母接种于5ml sd培养基中，30℃培养过夜，之后按照1％的接种量，接种于50ml新鲜sd培养基(500ml三角瓶)中，30℃、220rpm培养96h，离心收菌，并用pbs缓冲液(ph 8.0)洗涤菌体。利用1ml pbs缓冲液(ph 8.0，含有2％葡萄糖)重悬菌体，加入0.2mm罗汉果醇，转化温度为40℃、700rpm反应48h，生成罗汉果苷v。
[0108]
实施例18.udp-葡萄糖生物合成途径优化与ms1酵母菌株转化罗汉果苷
[0109]
首先，利用合成udp-葡萄糖基因gpd1(核苷酸序列如seq id no:7)和pgm2(核苷酸序列如seq id no:8)连同各自启动子和终止子插入至exg水解酶基因处，获得udp-葡萄糖含量提高且敲除糖苷水解酶基因的酵母工程菌株s.g-03，然后将含有糖基转移酶mg1和ms1-s34a/f77l/v146a/a313v/t344v/m360l/a391v突变体的酵母表达质粒转化至菌株s.g-03中，通过缺陷型筛选，获得菌株s.g-04。分别挑取重组酵母接种于5ml sd培养基中，30℃培养过夜，之后按照1％的接种量，接种于50ml新鲜sd培养基(500ml三角瓶)中，30℃、220rpm培养96h，离心收菌，并用pbs缓冲液(ph 8.0)洗涤菌体。利用1ml pbs缓冲液(ph 8.0，含有2％葡萄糖)重悬菌体，加入0.2mm罗汉果醇，转化温度为40℃、700rpm反应48h，生成罗汉果苷v，且产物生成速度较菌株s.g-02的生成速度快。
[0110]
实施例19.udp-葡萄糖生物合成途径优化与ms1酵母菌株转化罗汉果苷
[0111]
首先，利用合成udp-葡萄糖基因gpd1(核苷酸序列如seq id no:7)和pgm2(核苷酸序列如seq id no:8)连同各自启动子和终止子插入至exg水解酶基因处，获得udp-葡萄糖含量提高且敲除糖苷水解酶基因的酵母工程菌株s.g-03，然后将含有糖基转移酶mg1、ms1-s34a/f77l/v146a/a313v/t344v/m360l/a391v突变体和ms2的酵母表达质粒转化至菌株s.g-03中，通过缺陷型筛选，获得菌株s.g-05。分别挑取重组酵母接种于5ml sd培养基中，
30℃培养过夜，之后按照1％的接种量，接种于50ml新鲜sd培养基(500ml三角瓶)中，30℃、220rpm培养96h，离心收菌，并用pbs缓冲液(ph 8.0)洗涤菌体。利用1ml pbs缓冲液(ph 8.0，含有2％葡萄糖)重悬菌体，加入0.2mm罗汉果醇，转化温度为40℃、700rpm反应48h，生成罗汉果苷v。
[0112]
实施例19.增加糖基转移酶ms1拷贝数的酵母菌株构建与罗汉果苷转化
[0113]
将含有2-4个糖基转移酶ms1-s34a/f77l/v146a/a313v/t344v/m360l/a391v突变体拷贝的酵母表达质粒转化至菌株s.g-03中，通过缺陷型筛选，获得菌株s.g-06到s.g-08。挑取重组酵母接种于5ml sd培养基中，30℃培养过夜，之后按照1％的接种量，接种于50ml新鲜sd培养基(500ml三角瓶)中，30℃、220rpm培养96h，离心收菌，并用pbs缓冲液(ph 8.0)洗涤菌体。利用1mlpbs缓冲液(ph 8.0，含有2％葡萄糖)重悬菌体，加入0.2mm罗汉果苷iie，转化温度为40℃、700rpm反应24-48h，生成罗汉果苷v，且随着拷贝数的增加产物生成速度逐步增加。
[0114]
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种糖基转移酶ms1突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列包含在对应于seq id no.2的11、13、19、25、34、37、38、40、46、62、77、82、102、107、108、116、139、142、146、16、17、18、20、21、23、24、26、354、189、195、202、225、236、243、265、267、270、292、298、344、391、313、349、359、360、366、395、417、427、438、439、222、327中至少一个位点的氨基酸残基的突变。优选地，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中至少一个位点的氨基酸残基的突变。优选地，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中任意两个位点的氨基酸残基的突变。更优选地，所述突变体的氨基酸序列包含上述两个位点的突变，并且至少其中一个突变位点为146位点。优选地，所述突变体的氨基酸序列的其中一个突变位点为146a位点，另一突变位点为34、77、122、144、225、265、298、344、391中任意一个。优选地，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中任意三个位点的氨基酸残基的突变。更优选地，所述突变体的氨基酸序列包含146/77/34位点的突变。优选地，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中任意四个位点的氨基酸残基的突变。更优选地，所述突变体的氨基酸序列包含146/77/34/344位点的突变。优选地，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中任意五个位点的氨基酸残基的突变。更优选地，所述突变体的氨基酸序列包含146/77/34/344/391位点的突变。优选地，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中任意六个位点的氨基酸残基的突变。更优选地，所述突变体的氨基酸序列包含146/77/34/344/391/313位点的突变。优选地，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中任意七个位点的氨基酸残基的突变。更优选地，所述突变体的氨基酸序列包含146/77/34/344/391/313/360位点的突变。优选地，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中任意八个位点的氨基酸残基的突变。更优选地，所述突变体的氨基酸序列包含146/77/34/344/391/313/360/122位点的突变。优选地，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中任意九个位点的氨基酸残基的突变。更优选地，所述突变体的氨基酸序列包含146/77/34/344/391/313/360/122/144位点的突变。优选地，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中任意十个位点的氨基酸残基的突变。更优选地，所述突变体的氨基酸序列包含146/77/34/344/391/313/360/122/144/225位点的突变。优选地，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中任意十一个位点的氨基酸残基的突变。更优选地，所述突变体的氨基酸序列包含146/77/34/344/391/313/360/122/144/225/265位点的突变。
优选地，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no.2的34、77、122、144、146、225、265、298、344、391中任意十二个位点的氨基酸残基的突变。更优选地，所述突变体的氨基酸序列包含146/77/34/344/391/313/360/122/144/225/265/298位点的突变。优选地，所述突变体与seq id no.2所示的氨基酸序列具有70％以上的同源性，例如80％以上的同源性，再例如90％以上、95％以上、98％以上的同源性。2.编码权利要求1所述糖基转移酶ms1突变体的核酸。3.包含权利要求2所述糖基转移酶ms1突变体的核酸的重组载体和基因工程菌。优选地，所述基因工程菌是将所述核酸连接载体得到重组载体，再导入宿主菌中得到的重组菌株。优选地，所述宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸菌、酵母菌或者中国仓鼠卵巢细胞中的任一种，例如可选用e.colibl21(de3)、bl21(de3)plyss、rosetta(de3)、endotoxin-free bl21(de3)、bl21 trxb(de3)、jm109、dh5α、top10等。优选地，所述载体可选用原核表达载体或真核表达载体载体，例如大肠杆菌表达载体、枯草芽孢杆菌表达载体和链霉菌表达载体中的任一种。优选地，所述载体选自pet15b，pet28a，pet32，pgex4t1，pgex-6p-1中的任一种。优选地，所述核酸与载体通过连接酶或pcr重组的方式连接形成重组载体。优选地，所述基因工程菌表达糖基转移酶ms1突变体。优选诱导表达，例如，iptg诱导表达。4.权利要求3所述基因工程菌的构建方法，包括将所述核酸连接载体得到重组载体，再导入宿主菌中得到的重组菌株的步骤。5.权利要求3所述基因工程菌在制备糖基转移酶ms1突变体中的应用。6.一种糖基转移酶ms1突变体的制备方法，包括培养所述基因工程菌，使其表达编码所述糖基转移酶ms1突变体的核酸的步骤。优选地，所述培养的温度为35-40℃，优选37℃；培养时间为1-3h，优选2h。优选地，所述培养还包括诱导表达步骤，加入诱导物后，温度为10-20℃，优选16℃；培养时间为16-24h培养。优选地，所述培养在搅拌或振荡条件下进行，例如搅拌转速为100-1000rpm，优选200rpm。优选地，所述制备方法还包括从培养物中分离、纯化糖基转移酶ms1突变体的步骤。7.权利要求1所述的糖基转移酶ms1突变体在制备罗汉果苷中的应用。优选地，其中，所述罗汉果苷为罗汉果苷ie、iie、iiie、iiia、iva、sia i或v中的一种或多种。优选地，所述突变体以罗汉果醇、罗汉果苷ie、iie、iiie、iiia、ive或sia i为底物进行催化反应。优选地，所述突变体以罗汉果苷iie、iiie、iiia、ive或sia i为底物进行催化反应。优选地，所述方法还包括使用糖基转移酶mg1以罗汉果醇或罗汉果苷ie为底物进行催化反应。优选地，所述糖基转移酶mg1的氨基酸序列为seq id no.4所示。8.罗汉果甜味剂合成方法，其中罗汉果甜味剂为罗汉果苷ie、iie、iiie、iiia、iva、sia i或v中的一种或多种，其特征在于，所述方法包括使权利要求1所述的糖基转移酶ms1突变
体与以罗汉果醇、罗汉果苷ie、iie、iiie、iiia、ive或sia i接触，进行催化反应。优选地，权利要求1所述的糖基转移酶ms1突变体与罗汉果苷iie、iiie、iiia、ive或sia i接触，进行催化反应。优选地，所述方法还包括糖基转移酶mg1催化的一级糖基化修饰，其特征在于，所述糖基转移酶mg1以罗汉果醇或罗汉果苷ie为底物进行催化反应。优选地，所述糖基转移酶mg1的氨基酸序列为seq id no.4所示。9.权利要求1所述的糖基转移酶突变体酶法生物合成罗汉果苷方法或应用。优选地，所述合成罗汉果苷方法或应用包括如下步骤：1)培养权利要求3所述基因工程菌，使其表达编码所述糖基转移酶ms1突变体的核酸；2)培养物中分离、纯化所述糖基转移酶ms1突变体；3)加入罗汉果醇、罗汉果苷ie、iie、iiie、iiia、ive或sia i，与2)步得到的糖基转移酶ms1突变体，进行催化反应，得到目标罗汉果苷。优选地，所述方法或应用中还包括udp-葡萄糖或udp和蔗糖。优选地，所述蔗糖是由蔗糖合成酶合成的。其中，所述蔗糖合成酶的氨基酸序列为seq id no.6所示。优选地，所述方法或应用中还包括使用糖基转移酶mg1。其中，所述糖基转移酶mg1的氨基酸序列为seq id no.4所示优选地，所述糖基转移酶ms1突变体对应于seq id no.2的s34a/f77l/v146a/a313v/t344v/m360l/a391v或s34a/f77l/v146a突变体。10.权利要求1所述的糖基转移酶突变体全细胞生物合成罗汉果苷方法或应用。优选地，所述合成罗汉果苷方法或应用包括如下步骤：1)培养权利要求3所述基因工程菌，使其表达编码所述糖基转移酶ms1突变体的核酸；2)收集细胞；3)加入罗汉果醇、罗汉果苷ie、iie、iiie、iiia、ive或sia i，与2)步收集的细胞，进行反应。优选地，所述方法或应用中还包括使用糖基转移酶mg1。其中，所述糖基转移酶mg1的氨基酸序列为seq id no.4所示。优选地，所述糖基转移酶ms1突变体对应于seq id no.2的s34a/f77l/v146a/a313v/t344v/m360l/a391v或s34a/f77l/v146a突变体。

技术总结
本发明涉及糖基转移酶MS1突变体；同时本发明提供了在一个多酶反应体系中，以罗汉果醇和UDP-葡萄糖(或UDP和蔗糖)为原料，通过体外多酶催化罗汉果醇转化为多种罗汉果苷IV以及罗汉果苷V。在整个罗汉果苷合成途径中，只需要补充蔗糖和罗汉果醇或中间产物，就能够实现罗汉果苷IV和V的高效合成。本发明方法成本低，过程简单，转化效率高，可提高未成熟罗汉果果实提取物的甜度，可作为传统种植获得罗汉果苷的替代方法。替代方法。


技术研发人员：李娇 穆事成 杨建刚 朱玥明 孙媛霞
受保护的技术使用者：中国科学院天津工业生物技术研究所
技术研发日：2022.03.18
技术公布日：2023/9/23