一种利用毕赤酵母工程菌产壳聚糖酶并制备壳寡糖的方法与流程

1.本发明属于壳寡糖制备技术领域，具体涉及一种利用毕赤酵母工程菌产壳聚糖酶并制备壳寡糖的方法。


背景技术：

2.壳寡糖是由壳聚糖解聚而成，是甲壳素、壳聚糖产品的升级，制备壳寡糖的方法有化学法、物理法与生物法，其中采用生物酶解法制备壳寡糖是目前国内外普遍采用的先进技术，获得的壳寡糖具有分子量低、水溶性好、功能作用大、生物活性高等特点，应用于医药、保健、食品、农业等领域。
3.壳寡糖在农业上的功效表现为：改变土壤菌群，促进有益微生物的生长；诱导植物的抗病性，对多种真菌、细菌和病毒产生免疫和杀灭作用，如对小麦花叶病、棉花黄萎病、水稻稻瘟病、番茄晚疫病等病害具有良好的防治作用；促进植物前期生长，刺激作物生根；增加作物产量，提高农产品品质等。
4.生物酶降解法具有反应条件温和，降解过程及降解产物相对分子量分布容易控制等优势，但不同来源的酶降解壳聚糖的方式存在差异，导致壳寡糖的组分与分子量不同，而组分与分子量是影响壳寡糖生物活性的主要因素。
5.酶的活性是决定工业规模制备壳寡糖成本的主要因素之一，解决方法有：筛选高产壳聚糖酶的菌株，利用底物诱导产生高活性酶；或将壳聚糖酶基因克隆到大肠杆菌、毕赤酵母或其他宿主中异源表达，提高表达量。
6.本发明拟对草酸青霉来源的壳聚糖酶氨基酸序列进行突变，再将突变体在毕赤酵母中高活性异源表达，将表达的壳聚糖酶用于降解90％与70％脱乙酰度壳聚糖，制备不同组分与分子量大小的壳寡糖，可为壳寡糖的活性应用提供材料。


技术实现要素：

7.针对现有技术存在的问题，本发明为解决现有技术中存在的问题采用的技术方案如下：
8.一种利用毕赤酵母工程菌产壳聚糖酶的方法，其特征在于：
9.步骤1、利用草酸青霉[penicillium oxalicum，endochitosanase](genbank:qzp43727.1)作为原始氨基酸序列制备壳聚糖酶；突变得到突变体氨基酸序列；
[0010]
步骤2、对突变体氨基酸序列进行优化，并在末端加上终止密码子，使壳聚糖酶突变体在毕赤酵母中实现高效异源表达，优化后的基因序列如seq id no:3所示；
[0011]
步骤3、对突变体基因序列进行克隆，得到大肠杆菌阳性克隆子；
[0012]
步骤4、转化毕赤酵母，得到毕赤酵母阳性转化子；
[0013]
步骤5、毕赤酵母发酵异源表达壳聚糖酶。
[0014]
所述步骤1中原始氨基酸序列如seq id no:1所示，在原始序列的基础上，删除第2至第20个氨基酸，再将剩余氨基酸序列的第19、26、30的丝氨酸(s)分别突变成组氨酸(h)、
酪氨酸(y)及赖氨酸(k)，该突变体氨基酸序列如seq id no:2所示。
[0015]
所述步骤3中克隆步骤为：
[0016]
步骤3.1、为了便于克隆，在突变体基因序列5端加gaattc(限制性酶ecor1酶切位点序列)，3端加gcggccgc(限制性酶not 1酶切位点序列)；
[0017]
步骤3.2、化学合成上述优化后的基因序列；
[0018]
步骤3.3、设计f、r引物(f:gaattcatgcaatctgttaacggtgc；
[0019]
r:gcggccgcttacaaagaagaacaaacacc)，以合成的基因序列为模板，pcr扩增目的基因；
[0020]
步骤3.4、扩增后的目的基因用ecor 1与not 1限制性内切酶进行双酶切，回收酶切片段；
[0021]
步骤3.5、对ppic zαa质粒载体用ecor 1与not 1限制性内切酶进行双酶切，回收酶切后的质粒大片段；
[0022]
步骤3.6、分别取回收后的质粒片段与基因片段，按50ng:150ng比例混合，加入缓冲液，在t4 dna ligase作用下16℃连接1h；
[0023]
步骤3.7、转化培养大肠杆菌阳性克隆子。
[0024]
所述步骤3.7具体包括：步骤3.7.1、将要转化的dna片段加入到装有top10感受态细胞的管中(50μl感受态细胞需要25ng dna)，体积应不超过感受态细胞的5％，轻轻旋转几次混匀内容物，冰浴30min；
[0025]
步骤3.7.2、将离心管混合物放入加温至42℃的循环水中，热激90s，不要摇动管；
[0026]
步骤3.7.3、快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min；
[0027]
步骤3.7.4、每管加入200μl soc液体培养基，用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到设置为37℃的摇床上，220rpm培养45min，使细胞复苏并表达质粒编码的抗性标记基因；
[0028]
步骤3.7.5、将适当体积(每个90mm平板达200μl)已转化的感受态细胞转移到含有相应抗生素的lb培养基上；
[0029]
步骤3.7.6、倒置平板，于37℃培养，12～16小时后可出现菌落；
[0030]
步骤3.7.7、筛选获得大肠杆菌阳性克隆子。
[0031]
所述步骤4具体为：
[0032]
步骤4.1、阳性克隆子抽提质粒后，用pme i在37℃下酶切，获得线性化的片段，回收该片段；
[0033]
步骤4.2、回收后的线性化片段电转进入感受态毕赤酵母细胞，在含zeocin抗生素平板上筛选，生长的单菌落经pcr验证，获得毕赤酵母阳性转化子。
[0034]
所述步骤5具体为：步骤5.1、摇瓶表达目的蛋白：
[0035]
步骤5.1.1、挑取单菌落接种到100ml bmgy培养基(1000ml规格的三角瓶)，于220-250rpm、28-30℃培养40-48h，至菌体浓度od
600
为15-20；
[0036]
步骤5.1.2、将培养物于4000rpm 10min离心，收集菌体；
[0037]
步骤5.1.3、菌体转移至100ml bmmy培养基(1000ml规格的三角瓶)，于250rpm、20-25℃诱导4-6d，期间每24h加入1ml甲醇；
[0038]
步骤5.1.4、酶活性在20-30u/ml；
[0039]
步骤5.1.5、全部收集含菌体的发酵液，备用；
[0040]
步骤5.2、5l发酵罐表达目的蛋白：
[0041]
步骤5.2.1、配制摇瓶ypg种子培养基，配方：酵母浸粉1％，蛋白胨2％，甘油2％，自然ph，121℃灭菌30min；
[0042]
步骤5.2.2、种子培养：挑取单菌落接种到100ml ypg培养基中(用体积为500ml的三角瓶装液)，于28-30℃、250rpmin摇床上培养28h，作为种子液；
[0043]
步骤5.2.3、配制bsm初始发酵培养基：配方：85％磷酸26.7ml，硫酸钙0.93g，硫酸钾18.2g，七水硫酸镁14.9g，氢氧化钾4.13g，甘油40g，加水至总体积为1l，121℃灭菌20min；
[0044]
步骤5.2.4、在5l发酵罐内装入2l bsm培养基，于121℃灭菌20min；冷却至30℃左右，按4.35ml/l比例加入ptm1溶液(配方：6.0g五水硫酸铜，碘化钠0.08g，3.0g一水合硫酸锰，0.2g二水钼酸钠，0.02g硼酸，0.5g氯化钴，20.0g氯化锌，65.0g硫酸亚铁，0.2g生物素，5.0ml浓硫酸，加水至总体积为1l，0.22微米膜过滤除菌)，再流加氨水将ph调为5.0；
[0045]
步骤5.2.5、在火焰圈保护下接入100ml种子液：发酵过程中，控制发酵温度28
±
0.5℃，do值20％以上，通过反馈流加氨水的方式将ph值控制在5.0
±
0.05；初始通风比为0.5vvm，转速为200rpmin，发酵12h后不断增加通气比和搅拌转速，确保do》20％；
[0046]
步骤5.2.6、甘油补料发酵：约18h～24h后，do值迅速上升至100％，表明bsm初始培养基中的甘油耗完，开始补加含12ml/l ptm1微量盐溶液的50％甘油；采用恒定溶氧补加甘油，通过调节通气量和搅拌转速，以及甘油流加速度为来维持do在20％左右；直至菌体浓度od
600
达到200，停止补料，等甘油耗完，do值迅速上升至90％以上，维持温度、转速、通气量、压力不变，碳源饥饿0.5h；
[0047]
步骤5.2.7、甲醇补料发酵：碳源饥饿结束后，开始流加含有12ml/l ptm1微量盐溶液的甲醇，调节搅拌转速、通气比，控制do在20％以上，同时不断调整甲醇流加速率；发酵过程中，控制温度25
±
0.5℃，通过反馈流加氨水的方式将ph值控制在5.0
±
0.05；罐压控制在0.04
±
0.01mpa；
[0048]
步骤5.2.8、甲醇诱导5d，结束发酵：上清中壳聚糖酶活性达300-400u/ml；
[0049]
步骤5.2.9、壳聚糖酶分子量大小约45kda,如图1所示。
[0050]
所述利用毕赤酵母工程菌产壳聚糖酶并制备壳寡糖的方法具体为：以90％脱乙酰度壳聚糖为原料：
[0051]
(1.1)用1％-6％的醋酸水溶液，将90％脱乙酰度壳聚糖配制浓度为2％-20％，搅拌或振荡，使其溶解均匀；
[0052]
(1.2)加入2-12u的壳聚糖酶，于30-50℃酶解2-12h；
[0053]
(1.3)产物为三糖～五糖为主的壳寡糖混合物，均分子量为800左右，如图2所示。
[0054]
所述利用毕赤酵母工程菌产壳聚糖酶并制备壳寡糖的方法具体为：以70％脱乙酰度壳聚糖为原料：
[0055]
(2.1)用1％-5％的醋酸水溶液，将70％脱乙酰度壳聚糖配制浓度为2％-10％，搅拌或振荡，使其溶解均匀；
[0056]
(2.2)加入4-20u的壳聚糖酶，于40-50℃酶解4-12h；
[0057]
(2.3)产物为四糖以上的壳寡糖混合物，均分子量为1800左右，如图2所示。
[0058]
本发明以草酸青霉来源的壳聚糖酶氨基酸序列为模板，删除其信号肽序列，并进行三个位点的氨基酸突变，获得新的壳聚糖酶突变体。经人工化学合成该突变体基因序列，克隆重组到毕赤酵母基因组上，获得产壳聚糖酶的基因工程菌株，该菌株经发酵诱导产酶，获得分子量约45kda的壳聚糖酶。该酶酶解90％脱乙酰度壳聚糖，得三糖～五糖为主的壳寡糖，均分子量约800；酶解70％脱乙酰度壳聚糖，得四糖以上的壳寡糖，均分子量约1800。
[0059]
本发明具有如下优点：
[0060]
利用本发明方法毕赤酵母工程菌产壳聚糖酶活性高，可工业规模高效制备壳寡糖；同时针对不同脱乙酰壳聚糖底物可制备不同组分、不同均分子量的壳寡糖，以应用于不同领域。
附图说明
[0061]
图1毕赤酵母工程菌表达壳聚糖酶的电泳检测图；
[0062]
图2 90％与70％脱乙酰度壳聚糖制备的壳寡糖检测图。
具体实施方式
[0063]
下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
[0064]
实施例1：
[0065]
(1)称取2g 90％脱乙酰度壳聚糖粉末，加入三角瓶装的98ml水中，搅拌让壳聚糖粉末分散均匀；
[0066]
(2)加入1ml冰醋酸，搅拌壳聚糖，促进溶解，溶解后壳聚糖成透明状胶体；
[0067]
(3)添加2u的壳聚糖酶液(约0.2ml摇瓶发酵液)；
[0068]
(4)将三角瓶放入30℃摇床内，200rpm振荡进行酶解；
[0069]
(5)30min可见壳聚糖胶体的粘度降低明显，继续酶解到2h；
[0070]
(6)酶解结束，获得壳寡糖，测定含量约1.8％，组分为三糖～五糖，均分子量约800左右。
[0071]
实施例2：
[0072]
(1)称取4g 90％脱乙酰度壳聚糖粉末，加入三角瓶装的96ml水中，搅拌让壳聚糖粉末分散均匀；
[0073]
(2)加入2ml冰醋酸，搅拌壳聚糖，促进溶解，溶解后壳聚糖成透明状胶体；
[0074]
(3)添加4u的壳聚糖酶液(约10ul发酵罐酶液)；
[0075]
(4)将三角瓶放入50℃摇床内，200rpm振荡进行酶解；
[0076]
(5)1h后壳聚糖胶体的粘度降低明显，继续加入4g壳聚糖粉末、1ml冰醋酸、2u壳聚糖酶；
[0077]
(6)然后分别在第3、6、9h再次加入4g壳聚糖粉末、1ml冰醋酸、2u壳聚糖酶；
[0078]
(7)第9h后，三角瓶内总共加入20g壳聚糖粉末、6ml醋酸及12u酶液，继续水解到12h；
[0079]
(8)酶解结束，获得壳寡糖，测定其含量约18.6％，组分为三糖～五糖，均分子量约800左右。
[0080]
实施例3：
[0081]
(1)称取2g 70％脱乙酰度壳聚糖粉末，加入三角瓶装的98ml水中，搅拌让壳聚糖粉末分散均匀；
[0082]
(2)加入1ml冰醋酸，搅拌壳聚糖，促进溶解，溶解后壳聚糖成透明状胶体；
[0083]
(3)添加4u的壳聚糖酶液(约0.4ml摇瓶发酵液)；
[0084]
(4)将三角瓶放入40℃摇床内，200rpm振荡进行酶解；
[0085]
(5)1h后可见壳聚糖胶体的粘度降低明显，继续酶解到4h；
[0086]
(6)酶解结束，获得壳寡糖，测定含量约1.7％，组分为四糖以上，均分子量约1800。
[0087]
实施例4：
[0088]
(1)称取2g 70％脱乙酰度壳聚糖粉末，加入三角瓶装的98ml水中，搅拌让壳聚糖粉末分散均匀；
[0089]
(2)加入1ml冰醋酸，搅拌壳聚糖，促进溶解，溶解后壳聚糖成透明状胶体；
[0090]
(3)添加4u的壳聚糖酶液(约10ul发酵罐酶液)；
[0091]
(4)将三角瓶放入50℃摇床内，200rpm振荡进行酶解；
[0092]
(5)1h后壳聚糖胶体的粘度降低明显，继续加入2g壳聚糖粉末、1ml冰醋酸、4u壳聚糖酶；
[0093]
(6)然后分别在第3、6、9h再次加入2g壳聚糖粉末、1ml冰醋酸、4u壳聚糖酶；
[0094]
(7)第9h后，三角瓶内总共加入10g壳聚糖粉末、5ml醋酸及20u酶液，继续水解到12h；
[0095]
(8)酶解结束，获得壳寡糖，测定其含量约9.1％，组分为四糖以上，均分子量约1800。
[0096]
本发明的保护范围并不限于上述的实施例，显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变形而不脱离本发明的范围和精神。倘若这些改动和变形属于本发明权利要求及其等同技术的范围内，则本发明的意图也包含这些改动和变形在内。

技术特征：
1.一种利用毕赤酵母工程菌产壳聚糖酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、利用草酸青霉作为原始氨基酸序列制备壳聚糖酶，突变得到突变体氨基酸序列；步骤2、对突变体氨基酸序列进行优化，并在末端加上终止密码子，使壳聚糖酶突变体在毕赤酵母中实现高效异源表达，优化后的基因序列如seq id no:3所示；步骤3、对突变体基因序列进行克隆，得到大肠杆菌阳性克隆子；步骤4、转化毕赤酵母，得到毕赤酵母阳性转化子；步骤5、毕赤酵母发酵异源表达壳聚糖酶。2.如权利要求1所述的一种利用毕赤酵母工程菌产壳聚糖酶的方法，其特征在于：所述步骤1中原始氨基酸序列如seq id no:1所示，在原始序列的基础上，删除第2至第20个氨基酸，再将剩余氨基酸序列的第19、26、30的丝氨酸分别突变成组氨酸、酪氨酸及赖氨酸，该突变体氨基酸序列如seq id no:2所示。3.如权利要求1所述的一种利用毕赤酵母工程菌产壳聚糖酶的方法，其特征在于，所述步骤3中克隆步骤具体为：步骤3.1、为了便于克隆，在突变体基因序列5端加gaattc，3端加gcggccgc；步骤3.2、化学合成上述优化后的基因序列；步骤3.3、设计f、r引物，以合成的基因序列为模板，pcr扩增目的基因；步骤3.4、扩增后的目的基因用ecor 1与not 1限制性内切酶进行双酶切，回收酶切片段；步骤3.5、对ppic zαa质粒载体用ecor 1与not 1限制性内切酶进行双酶切，回收酶切后的质粒大片段；步骤3.6、分别取回收后的质粒片段与基因片段，按50ng:150ng比例混合，加入缓冲液，在t4 dna ligase作用下16℃连接1h；步骤3.7、转化培养大肠杆菌阳性克隆子。4.如权利要求3所述的一种利用毕赤酵母工程菌产壳聚糖酶的方法，其特征在于，所述步骤3.7具体包括：步骤3.7.1、将要转化的dna片段加入到装有top10感受态细胞的管中，体积不超过感受态细胞的5％，轻轻旋转几次混匀内容物，冰浴30min；步骤3.7.2、将离心管混合物放入加温至42℃的循环水中，热激90s；步骤3.7.3、快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min；步骤3.7.4、每管加入200μl soc液体培养基，用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到设置为37℃的摇床上，220rpm培养45min，使细胞复苏并表达质粒编码的抗性标记基因；步骤3.7.5、将适当体积已转化的感受态细胞转移到含有相应抗生素的lb培养基上；步骤3.7.6、倒置平板，于37℃培养，12～16小时后出现菌落；步骤3.7.7、筛选获得大肠杆菌阳性克隆子。5.如权利要求3所述的一种利用毕赤酵母工程菌产壳聚糖酶的方法，其特征在于，所述步骤4具体为：步骤4.1、阳性克隆子抽提质粒后，用pme i在37℃下酶切，获得线性化的片段，回收该
片段；步骤4.2、回收后的线性化片段电转进入感受态毕赤酵母细胞，在含zeocin抗生素平板上筛选，生长的单菌落经pcr验证，获得毕赤酵母阳性转化子。6.如权利要求1所述的一种利用毕赤酵母工程菌产壳聚糖酶的方法，其特征在于，所述步骤5具体为：步骤5.1、摇瓶表达目的蛋白：步骤5.1.1、挑取单菌落接种到100ml bmgy培养基，于220-250rpm、28-30℃培养40-48h，至菌体浓度od
600
为15-20；步骤5.1.2、将培养物于4000rpm 10min离心，收集菌体；步骤5.1.3、菌体转移至100ml bmmy培养基，于250rpm、20-25℃诱导4-6d，期间每24h加入1ml甲醇；步骤5.1.4、酶活性在20-30u/ml；步骤5.1.5、全部收集含菌体的发酵液，备用；步骤5.2、5l发酵罐表达目的蛋白：步骤5.2.1、配制摇瓶ypg种子培养基，配方：酵母浸粉1％，蛋白胨2％，甘油2％，自然ph，121℃灭菌30min；步骤5.2.2、种子培养：挑取单菌落接种到100ml ypg培养基中，于28-30℃、250rpmin摇床上培养28h，作为种子液；步骤5.2.3、配制bsm初始发酵培养基：配方：85％磷酸26.7ml，硫酸钙0.93g，硫酸钾18.2g，七水硫酸镁14.9g，氢氧化钾4.13g，甘油40g，加水至总体积为1l，121℃灭菌20min；步骤5.2.4、在5l发酵罐内装入2l bsm培养基，于121℃灭菌20min；冷却至30℃左右，按4.35ml/l比例加入ptm1溶液(配方：6.0g五水硫酸铜，碘化钠0.08g，3.0g一水合硫酸锰，0.2g二水钼酸钠，0.02g硼酸，0.5g氯化钴，20.0g氯化锌，65.0g硫酸亚铁，0.2g生物素，5.0ml浓硫酸，加水至总体积为1l，0.22微米膜过滤除菌)，再流加氨水将ph调为5.0；步骤5.2.5、在火焰圈保护下接入100ml种子液：发酵过程中，控制发酵温度28
±
0.5℃，do值20％以上，通过反馈流加氨水的方式将ph值控制在5.0
±
0.05；初始通风比为0.5vvm，转速为200rpmin，发酵12h后不断增加通气比和搅拌转速，确保do>20％；步骤5.2.6、甘油补料发酵：约18h～24h后，do值迅速上升至100％，表明bsm初始培养基中的甘油耗完，开始补加含12ml/l ptm1微量盐溶液的50％甘油；采用恒定溶氧补加甘油，通过调节通气量和搅拌转速，以及甘油流加速度为来维持do在20％左右；直至菌体浓度od
600
达到200，停止补料，等甘油耗完，do值迅速上升至90％以上，维持温度、转速、通气量、压力不变，碳源饥饿0.5h；步骤5.2.7、甲醇补料发酵：碳源饥饿结束后，开始流加含有12ml/l ptm1微量盐溶液的甲醇，调节搅拌转速、通气比，控制do在20％以上，同时不断调整甲醇流加速率；发酵过程中，控制温度25
±
0.5℃，通过反馈流加氨水的方式将ph值控制在5.0
±
0.05；罐压控制在0.04
±
0.01mpa；步骤5.2.8、甲醇诱导5d，结束发酵：上清中壳聚糖酶活性达300-400u/ml；步骤5.2.9、壳聚糖酶分子量大小约45kda。7.如权利要求1-6任一项所述的一种利用毕赤酵母工程菌产壳聚糖酶并制备壳寡糖的
方法，其特征在于，具体为：以90％脱乙酰度壳聚糖为原料：(1.1)用1％-6％的醋酸水溶液，将90％脱乙酰度壳聚糖配制浓度为2％-20％，搅拌或振荡，使其溶解均匀；(1.2)加入2-12u的壳聚糖酶，于30-50℃酶解2-12h；(1.3)产物为三糖～五糖为主的壳寡糖混合物，均分子量为800左右。8.如权利要求1-6任一项所述的一种利用毕赤酵母工程菌产壳聚糖酶并制备壳寡糖的方法，其特征在于，具体为：以70％脱乙酰度壳聚糖为原料：(2.1)用1％-5％的醋酸水溶液，将70％脱乙酰度壳聚糖配制浓度为2％-10％，搅拌或振荡，使其溶解均匀；(2.2)加入4-20u的壳聚糖酶，于40-50℃酶解4-12h；(2.3)产物为四糖以上的壳寡糖混合物，均分子量为1800左右。

技术总结
本发明提供了一种利用毕赤酵母工程菌产壳聚糖酶并制备壳寡糖的方法，以草酸青霉来源的壳聚糖酶氨基酸序列为模板，删除其信号肽序列，并进行三个位点的氨基酸突变，获得新的壳聚糖酶突变体。经人工化学合成该突变体基因序列，克隆重组到毕赤酵母基因组上，获得产壳聚糖酶的基因工程菌株，该菌株经发酵诱导产酶，获得壳聚糖酶。该酶酶解90％脱乙酰度壳聚糖，得三糖～五糖为主的壳寡糖，均分子量约800；酶解70％脱乙酰度壳聚糖，得四糖以上的壳寡糖，均分子量约1800。本发明的毕赤酵母工程菌产壳聚糖酶活性高，可工业规模高效制备壳寡糖；同时针对不同脱乙酰壳聚糖底物可制备不同组分、不同均分子量的壳寡糖，可应用于不同领域。可应用于不同领域。可应用于不同领域。


技术研发人员：揭金兵 梁利军 方德军 常卫平 王艳利
受保护的技术使用者：湖北京晟生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.01.06
技术公布日：2023/9/22