日蟾毒它灵在制备治疗结直肠癌的药物中的应用

1.本发明属于癌症药物技术领域，尤其涉及日蟾毒它灵在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。


背景技术：

2.结直肠癌(colorectal cancer，crc)是最常见的消化道恶性肿瘤之一。结直肠癌的发病率呈现逐年上升的趋势，并且发病率随年龄增长呈上升趋势。早中期结直肠癌通过手术、放疗、化疗及靶向治疗等联合规范化综合治疗使得一部分患者达到根治，中晚期结直肠癌主要依赖于以化疗为核心的综合治疗模式延长生存时间。有30％-50％的患者在术后5年内出现复发及转移，故亟需深入研究治疗结直肠癌的有效方式。
3.中药蟾酥(cs)是蟾蜍科动物中华大蟾蜍(bufo bufo gargarizans cantor)或黑眶蟾蜍(bufo melanost-ictus schneider)的耳后腺或皮肤腺干燥分泌物，主归肝、肾经，具有解毒消肿、止痛的功效。中医临床将其用于麻醉、疮疖痈肿、中暑吐泻、咽喉肿痛、牙痛等。蟾酥主要的化学成分包括蟾毒内酯类、吲哚类生物碱、甾醇类等化合物，其中蟾蜍二烯酸内酯类化合物是cs中的主要抗肿瘤活性成分。
4.日蟾毒它灵(gamabufotalin,cs-6)是cs中一种主要的蟾蜍二烯内酯，与其他cs生物活性毒素相比，cs-6具有更稳定的代谢活性和较少的不良反应。在以往的研究和临床应用当中，虽然部分蟾酥制剂用于治疗白血病等，但未见有把蟾蜍二烯内酯类化合物用于结直肠癌的治疗中。


技术实现要素：

5.本发明实施例目的在于提供了日蟾毒它灵在制备治疗结直肠癌的药物中的应用，本发明实施例证明日蟾毒它灵可用于结直肠癌的治疗，可用于治疗结直肠癌的抗肿瘤药品制备。
6.本发明的目的通过下述技术方案实现的：
7.本发明的目的是提供日蟾毒它灵治疗结直肠癌的新用途，从体内实验上证实日蟾毒它灵对肠癌细胞增殖的抑制作用，日蟾毒它灵对肠癌细胞的凋亡诱导作用，以及日蟾毒它灵对人肠癌细胞的集落形成抑制作用，从体外实验上证实日蟾毒它灵对结直肠癌肿瘤在肿瘤体积和肿瘤重量的抑制作用。从而证明日蟾毒它灵可用于结直肠癌的治疗和改善。
8.经过本发明实施例证实，日蟾毒它灵在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
9.所述的日蟾毒它灵的分子式：c
26h36
o6分子量：402.53，结构式如式i所示：
[0010][0011]
上述日蟾毒它灵在制备治疗结直肠癌的药物中的应用，可单独给药或者联合治疗。
[0012]
所述的联合治疗，包括放疗，化疗，手术治疗。
[0013]
所述日蟾毒它灵可以为任何药物治疗学上可接受的剂型。
[0014]
所述日蟾毒它灵可以为任何药物治疗学上可接受的剂量；优选的，所述日蟾毒它灵的用量为20mg/kg～30mg/kg。
[0015]
本发明与现有技术相比具有以下的有益效果：
[0016]
1、本发明实施例证明日蟾毒它灵cs-6对人肠癌细胞增殖的抑制作用。
[0017]
2、本发明实施例证明日蟾毒它灵cs-6对人结直肠癌动物模型的治疗作用。
[0018]
3.本发明实施例中日蟾毒它灵cs-6(20mg/kg～30mg/kg)给药后能够显著降低人结直肠癌肿瘤的体积和重量，具有显著的抑制结直肠癌肿瘤的效果，可以在制备治疗结直肠癌药物中应用，应用于人结直肠癌的治疗中，开拓了日蟾毒它灵的新用途，为拓展结直肠癌治疗新型药物提供了选择。
附图说明
[0019]
图1为日蟾毒它灵对人肠癌hct8、hct116和ht29细胞的增殖抑制作用的结果图。其中数据以“各作用浓度平均抑制率
±
标准偏差”表示。
[0020]
图2为日蟾毒它灵各剂量组处理hct116细胞以后的凋亡率结果图。其中数据以“平均值
±
标准偏差”表示；用单因素方差分析(one-wayanova)以及dunnett's multiple comparisons test检验比较对照组与各剂量组之间细胞凋亡率的显著性差异，p值小于0.05被认为具有显著性差异。
[0021]
图3为日蟾毒它灵各剂量组处理hct116细胞以后的集落形成率结果图。
[0022]
其中数据以“平均值
±
标准偏差”表示，用单因素方差分析(one-wayanova)以及dunnett's multiple comparisons test检验比较对照组与各剂量组之间细胞凋亡率的显著性差异，p值小于0.05被认为具有显著性差异。
[0023]
图4为给药完成以后人肠癌hct116皮下移植肿瘤模型中各实验组肿瘤拍照结果图。
[0024]
图5为人肠癌hct116皮下移植肿瘤模型中各组肿瘤生长情况结果图。其中数据以“平均值
±
标准偏差”表示；用单因素方差分析(one-wayanova)以及dunnett's multiple comparisons test检验比较对照组与各治疗组之间相对肿瘤体积显著性差异。p值小于
0.05被认为具有显著性差异。
[0025]
图6为日蟾毒它灵完成裸鼠hct116移植肿瘤给药后的瘤重结果图。其中数据以“平均值
±
标准偏差”表示；用单因素方差分析(one-wayanova)以及dunnett's multiple comparisons test检验比较溶媒对照组与日蟾毒它灵给药组之间瘤重的显著性差异。p值小于0.05被认为具有显著性差异。
具体实施方式
[0026]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0027]
目前，结直肠癌的治疗缺乏天然产物药物的有效治疗，为了解决上述技术问题，本发明提出了一种日蟾毒它灵在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
[0028]
以下实施例所使用的实验材料如下：细胞株：人肠癌细胞系hct8、hct116和ht29由河南省工业微生物菌种工程技术研究中心提供；96孔板购自costar公司(目录号：3599)；rpmi1640培养基购自gibco公司(目录号：c11995500bt)；胎牛血清购自gibco公司(目录号：10270-106)；cck-8试剂盒购自美仑生物(目录号：ma0218)；dmso购自北京索莱宝科技有限公司(目录号：d8370)；日蟾毒它灵(cs-6)购自南京春秋生物工程有限公司，hplc纯度大于98％，-20℃密封保存。
[0029]
以下实施例所使用的实验仪器如下：
[0030]
实验仪器：超净工作台(苏州净化型号bhc-1000iia2)，co2培养箱(thermo型号:3111)，酶标仪(thermo multiscan mk3)。
[0031]
实施例一：日蟾毒它灵对人肠癌细胞增殖的影响
[0032]
供试品：称量2mg，加入2.5ml dmso溶解，配制成2mm/l日蟾毒它灵溶液。
[0033]
处理方法：使用cck-8法评价日蟾毒它灵对人肠癌细胞的增殖抑制作用：将人肠癌细胞(hct8、hct116和ht29)用胰酶进行消化、计数、用完全培养基(10％胎牛血清+90％rpmi1640培养基)混匀制成浓度为2
×
104个/ml的细胞悬液。将96孔板中每孔加入100μl细胞悬液(每孔2
×
103个细胞)，然后置于37℃，5％co2培养箱中培养16小时；用完全培养基稀释药物至所需的不同梯度浓度(1.95nm/l-2000nm/l)，每孔加入100μl相应的含药培养基，同时设立溶媒(dmso)对照组和无细胞培养液对照，再将96孔板置于37℃，5％co2，培养箱中培养72小时。然后每孔加入20μl cck-8溶液，继续培养2小时，在λ＝450nm波长下用酶标仪检测每孔的吸光度即od
450
值，以各复孔的平均值减去无细胞培养液平均值作为该组细胞的od值，计算药物的抑制率。
[0034]
结果如图1所述，日蟾毒它灵对人肠癌hct8、hct116和ht29细胞具有显著的增殖抑制作用，其半数抑制浓度(ic
50
)均小于20nm/l，分别为17.23nm/l、8.82nm/l和11.53nm/l。
[0035]
实施例二：日蟾毒它灵对人肠癌细胞的凋亡诱导作用
[0036]
供试品：所述日蟾毒它灵溶液由实施例一中所述方法制备而成。
[0037]
处理方法：将人肠癌细胞hct116用胰酶进行消化、计数、用完全培养基(10％胎牛血清+90％rpmi1640培养基)混匀制成浓度为2
×
104个/ml的细胞悬液，加入预先置有盖玻
片的12孔板，每孔加入1ml细胞悬液，然后置于37℃，5％co2培养箱中培养16小时。设置溶剂对照组(dmso)、cs-6高剂量组(20nm/l)和cs-6低剂量组(5nm/ml)。药物处理hct116细胞72小时后，pbs洗涤1次，加入4％多聚甲醛固定细胞爬片，然后加入100μl tunel标记液标记凋亡细胞，避光孵育，使用防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察细胞凋亡情况，每个细胞爬片在20
×
物镜视野下随机计数6个视野的tunel阳性细胞。
[0038]
结果如图2所示，tunel实验结果表明，日蟾毒它灵各剂量组(5nm/l和20nm/l)对hct116细胞的凋亡率均显著高于溶媒(dmso)对照组(cs-6(5nm/l)vs.溶媒，p＝0.0136；cs-6(20nm/l)vs.溶媒，p《0.0001)。
[0039]
实施例三：日蟾毒它灵对人肠癌细胞的集落形成抑制作用
[0040]
供试品：所述日蟾毒它灵溶液由实施例一中所述方法制备而成。
[0041]
处理方法：将人肠癌细胞hct116用胰酶进行消化、计数、用完全培养基(10％胎牛血清+90％rpmi1640培养基)混匀制成浓度为1
×
102个/ml的细胞悬液，加入6厘米培养皿，每孔加入5ml细胞悬液，然后置于37℃，5％co2培养箱中培养16小时。设置溶剂对照组(dmso)、cs-6高剂量组(20nm/l)和cs-6低剂量组(5nm/ml)，每组设定3个平行孔。药物处理hct116细胞10天后，pbs洗涤1次，加入4％多聚甲醛固定30分钟，然后加入2ml 0.3％结晶紫染液染色10分钟，然后计数培养皿中的细胞集落数量。克隆形成率＝(每孔集落数/500)
×
100％。
[0042]
结果如图3所示，集落形成实验结果表明，与溶媒(dmso)对照组比较，日蟾毒它灵各剂量组(5n m/l和20nm/l)均显著抑制hct116细胞的集落形成能力(cs-6(5nm/l)vs.溶媒，p《0.0001；cs-6(20nm/l)vs.溶媒，p《0.0001)。
[0043]
实施例四：裸鼠皮下移植肠癌细胞系hct116肿瘤模型的药效实验
[0044]
实验动物：balb/c裸鼠，雌性，4周龄，体重约17g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号：scxk(湘)2019-0004，动物合格证编号：430727221102447121。饲养环境：spf级。
[0045]
实验动物均饲养于恒温恒湿的独立通风盒内，饲养室温度20-26℃，湿度40-70％，10-20次/小时换气，昼夜明暗交替时间12h/12h；持续供给钴60放射灭菌鼠全价颗粒饲料，不限量自由摄取，饮用自来水(高压蒸汽灭菌后使用)，饮水瓶不间断供水，自由摄取。饲养鼠盒是聚砜鼠盒，高压灭菌后使用，规格为325mm
×
210mm
×
180mm；垫料是高压灭菌玉米芯，每盒5只动物；实验动物打耳标进行标记。
[0046]
实验材料：日蟾毒它灵购自南京春秋生物工程有限公司，hplc纯度大于98％，-20℃密封保存。peg300购自江苏省海安石油化工厂；pbs购自天津灏洋华科生物科技有限公司；dmso购自北京索莱宝科技有限公司。
[0047]
药物配制：称取日蟾毒它灵粉末，溶解于溶媒溶液中(10％dmso+30％peg300+60％pbs)中。
[0048]
实验方法：人肠癌hct116细胞培养在含10％胎牛血清的rpmi-1640培养液(购自美国gibco公司)中。收集指数生长期的hct116细胞，pbs重悬至适合浓度(2
×
107/ml)细胞悬液用于雄性裸鼠皮下肿瘤接种。裸鼠右侧腋下接种100μl细胞悬液(含2
×
106hct116细胞)。待肿瘤生长至平均体积大约50mm3时，根据肿瘤大小随机分组，分组当天给药，给药当天定义为第0天。裸鼠通过口服灌胃给药，给药体积为100μl/裸鼠。每隔一天用游标卡尺测量肿
瘤长径a和短径b，给药方案见表1。
[0049]
表1.给药方案说明书
[0050]
组别动物数给药组给药剂量给药方式给药周期16溶媒对照-口服灌胃每天一次，连续10天26cs-6(20mg/kg)20mg/kg口服灌胃每天一次，连续10天36cs-6(30mg/kg)30mg/kg口服灌胃每天一次，连续10天
[0051]
给药10天以后，人肠癌hct116皮下移植肿瘤模型中各组肿瘤生长情况的裸鼠拍照结果图如图4所示。
[0052]
实验结果：给药期间无裸鼠死亡，可以耐受给药。分组给药的第11天，溶媒对照组瘤体积842.84
±
75.70mm3，结束试验，取瘤并称瘤重。肿瘤体积计算公式：肿瘤体积(mm3)＝1/2
×
(a
×
b2)(其中a表示长径，b表示短径)。结束试验时，日蟾毒它灵20mg/kg和30mg/kg治疗组的平均瘤体积为385.11
±
198.29mm3和190.81
±
103.45mm3，相较对照组有统计学上的显著性差异(p值均小于0.0001)(如图5所示)。
[0053]
在实验终点采集肿瘤样本并测量瘤重(g)，其结果与瘤体积测量结果一致。各治疗组和对照组瘤重见图6。与溶剂对照瘤重(0.530
±
0.093g)相比，日蟾毒它灵20mg/kg和30mg/kg给药后的瘤重分别为0.277
±
0.035g和0.139
±
0.071g，差异均具有显著意义(p＝0.0003和p《0.0001)。结果表明，日蟾毒它灵在肠癌移植肿瘤模型中具有良好的体内抗肠癌肿瘤活性。
[0054]
本发明与现有技术相比具有以下的有益效果：
[0055]
1、本发明实施例证明日蟾毒它灵cs-6对人肠癌细胞增殖的抑制作用。
[0056]
2、本发明实施例证明日蟾毒它灵cs-6对人结直肠癌动物模型的治疗作用。
[0057]
3.本发明实施例中日蟾毒它灵cs-6(20mg/kg～30mg/kg)给药后能够显著降低人结直肠癌肿瘤的体积和重量，具有显著的抑制结直肠癌肿瘤的效果，可以在制备治疗结直肠癌药物中应用，应用于人结直肠癌的治疗中，开拓了日蟾毒它灵的新用途，为拓展结直肠癌治疗新型药物提供了选择。
[0058]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.日蟾毒它灵在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的日蟾毒它灵在制备治疗结直肠癌的药物中的应用，其特征在于：所述的日蟾毒它灵的结构式如式i所示：3.根据权利要求1所述的日蟾毒它灵在制备治疗结直肠癌的药物中的应用，其特征在于：可单独给药或者联合治疗。4.根据权利要求3所述的日蟾毒它灵在制备治疗结直肠癌的药物中的应用，其特征在于：所述的联合治疗，包括放疗，化疗，手术治疗。5.根据权利要求1所述的日蟾毒它灵在制备治疗结直肠癌的药物中的应用，其特征在于：所述日蟾毒它灵可以为任何药物治疗学上可接受的剂型。6.根据权利要求1所述的日蟾毒它灵在制备治疗结直肠癌的药物中的应用，其特征在于：所述日蟾毒它灵可以为任何药物治疗学上可接受的剂量。

技术总结
本发明公开了日蟾毒它灵在制备治疗结直肠癌的药物中的应用，属于癌症药物技术领域。本发明实施例证实了日蟾毒它灵在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。所述日蟾毒它灵的用量为20mg/kg～30mg/kg。本发明实施例证明日蟾毒它灵CS-6对人肠癌细胞增殖的抑制作用，日蟾毒它灵CS-6对人结直肠癌动物模型的治疗作用。日蟾毒它灵CS-6(20mg/kg～30mg/kg)给药后能够显著降低人结直肠癌肿瘤的体积和重量，具有显著的抑制结直肠癌肿瘤的效果，可以在制备治疗结直肠癌药物中应用，应用于人结直肠癌的治疗中，开拓了日蟾毒它灵的新用途，为拓展绒癌治疗新型药物提供了选择。疗新型药物提供了选择。疗新型药物提供了选择。


技术研发人员：彭伟军 史达尊 付军
受保护的技术使用者：中南大学湘雅医院
技术研发日：2023.01.07
技术公布日：2023/9/22