一种调控人卵巢颗粒细胞中PLPP3转录活性的方法

一种调控人卵巢颗粒细胞中plpp3转录活性的方法
技术领域
1.本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，具体涉及一种调控人卵巢颗粒细胞中plpp3转录活性的方法。


背景技术：

2.dna甲基化是最重要的表观遗传学修饰之一，dna甲基化发生在胞嘧啶的c5中，通过dna甲基转移酶(dnmts)添加甲基(-ch3)来促进胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(cpg)的胞嘧啶甲基化。dna甲基化通常与基因的转录抑制有关，抑制蛋白质与dna的结合，或重塑染色质的可及性以改变基因转录。研究表明，dna甲基转移酶抑制剂5-aza-cdr导致哺乳动物体内dna甲基化紊乱，阻碍卵泡成熟和延缓初情启动。dnmt1负责在dna复制过程中维持dna甲基化。在卵子发生过程中，约2％的cpg甲基化诱导是由dnmt1引起的。此外，有研究表明，dna甲基化通过调控rspo2和lncrna iffd的表达影响猪卵泡发育和青春期开始。在多囊卵巢综合征患者中，dnmt1通过介导cdkn1a启动子的低甲基化抑制颗粒细胞的增殖和卵泡的生长。综上所述，dna甲基化可能通过调节颗粒细胞中关键基因的表达参与卵泡发育调控。
3.磷脂磷酸酶3(plpp3)作为一种糖蛋白定位于细胞质膜上，可水解溶血磷脂酸和短链磷脂酸，把磷脂酸转化为二酰甘油，在甘油脂类的新生合成及受体激活的信号通路中发挥作用。此外，有报道称plpp3还可水解磷酸神经酰胺和磷酸醇。通过生成的这些产物，plpp3基因参与细胞黏附、细胞间互作、血管形成及其相关疾病炎症反应和细胞侵袭等。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种调控人卵巢颗粒细胞中plpp3转录活性的方法。
5.本发明的目的通过下述技术方案实现：
6.一种体外调控人卵巢颗粒细胞中plpp3基因转录活性的方法，通过降低plpp3基因的dna甲基化水平来促进人卵巢颗粒细胞中plpp3基因转录活性；或通过提高plpp3基因的dna甲基化水平来降低人卵巢颗粒细胞中plpp3基因转录活性。
7.进一步地，所述的降低plpp3基因的dna甲基化水平是通过dna甲基转移酶抑制剂5-aza-cdr或抑制dnmt1基因表达的sirna转染到人卵巢颗粒细胞的方式实现。
8.更进一步地，所述的抑制dnmt1基因表达的sirna的序列如下：5
′‑
ggaagaagaguuacuauaa-3
′
。
9.进一步地，所述的提高plpp3基因dna甲基化水平是通过对plpp3基因进行甲基化处理实现。
10.更进一步地，所述的plpp3基因dna甲基化水平为plpp3基因的f2区域的dna甲基化水平，其中，f2位于+50～+339bp。
11.更进一步地，所述的甲基化处理通过cpg甲基转移酶(m.sssi)或dcas9-dnmt1系统实现。
12.更进一步地，所述的甲基化处理的具体操作为：针对f2区域设计sgrna，将sgrna和dcas9-dnmt1质粒共转染到颗粒细胞中，实现定点上调目标区域的甲基化水平，sgrna序列为5
′‑
aaagtgcagaaaacaaaccc-3
′
。
13.一种人卵巢颗粒细胞plpp3基因的核心启动子功能调节区序列，如plpp3基因启动子+50～+339bp区域的核苷酸序列所示。
14.注：三种甲基转移酶的干扰片段序列如下
15.si-dnmt1：5
′‑
ggaagaagaguuacuauaa-3
′
16.si-dnmt3a：5
′‑
gccucagagcuauuaccca-3
′
17.si-dnmt3b：5
′‑
gaagaucaagcucgcgacu-3
′
。
18.本发明以dna甲基化表观遗传修饰为切入点，采用细胞生物学方法研究dna甲基化对颗粒细胞关键基因plpp3(gene id：8613)转录的影响。
19.本发明通过网站预测发现plpp3基因存在高cg区域，由此我们提出假设，dna高甲基化可能抑制plpp3的转录活性。选择dna甲基转移酶抑制剂5-aza-cdr(sigma，货号189825)，通过细胞western blot蛋白实验方法验证其对plpp3蛋白含量的影响；使用三种甲基转移酶的干扰片段si-dnmts(东泽生物公司合成)，探究影响plpp3蛋白含量的甲基转移酶；使用cpg甲基转移酶(m.sssl)对plpp3进行体外甲基化处理；通过双荧光素酶活性检测，探究甲基化对plpp3转录活性的影响；使用dcas9-dnmt1融合蛋白，通过wb实验探究其对plpp3蛋白含量的影响；使用dcas9-dnmt1融合蛋白，通过亚硫酸氢盐测序(bisulfite sequencing pcr,bsp)探究甲基转移酶1(dnmt1)对plpp3甲基化水平的影响。
20.本发明的验证结果如下：
21.体外环境下，通过5-aza-cdr实现低甲基化，能够显著提高颗粒细胞中plpp3的蛋白水平。
22.体外环境下，通过合成三种甲基转移酶干扰片段si-dnmt1、si-dnmt3a和si-dnmt3b实现低甲基化，能够确定只有si-dnmt1显著影响颗粒细胞中plpp3的蛋白水平。
23.体外环境下，通过cpg甲基转移酶m.sssl提高plpp3的甲基化水平，能够显著抑制plpp3的转录活性。
24.体外环境下，通过融合蛋白dcas9-dnmt1能够显著降低颗粒细胞中plpp3的蛋白含量，并且能够明显提高plpp3启动f2(+50to+339bp)区域的甲基化水平。
25.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
26.本发明技术方案设计周详，结果可靠。为证实dna甲基化对plpp3的转录调控，本发明从多层次、多角度验证，首先在细胞水平以及蛋白水平进行验证，并采用了dcas9-dnmt1-grna实现plpp3基因定点甲基化，探究dnmt1调控plpp3甲基化的具体区域。本发明对研究dna甲基化表观遗传修饰在卵巢卵泡发育、繁殖能力及卵巢相关疾病中的影响机制具有很好的应用价值。
附图说明
27.图1是降低dna甲基化对颗粒细胞中plpp3表达量影响情况研究结果图；其中，a、b是甲基转移酶抑制剂5-aza-cdr对颗粒细胞中plpp3的mrna和蛋白水平影响；c、d是三种甲基转移酶干扰片段si-dnmt1、si-dnmt3a及si-dnmt3b的干扰效果；e、f是三种甲基转移酶干
扰片段si-dnmt1、si-dnmt3a及si-dnmt3b对plpp3的mrna和蛋白表达量的影响。
28.图2是plpp3高cg和低cg区域截断示意图。
29.图3是dna高甲基化对plpp3转录活性的影响情况研究结果图；其中，使用cpg甲基转移酶(m.sssl)对plpp3进行体外甲基化处理，通过双荧光素酶活性检测dna甲基化对plpp3转录活性的影响。
30.图4是dcas9-dnmt1融合蛋白对颗粒细胞plpp3表达量及其甲基化水平的影响情况研究结果图；其中，a、b是dcas9-dnmt1对颗粒细胞中plpp3 mrna和蛋白含量的影响；c是dcas9-dnmt1对plpp3甲基化水平的影响。
具体实施方式
31.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
32.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
33.本发明中应用统计学方法，分析各实施例中3次独立实验的结果，分别计算“平均值
±
标准差”，使用单因素方差分析进行差异显著性分析(图中“*”表示p《0.05，“**”表示p《0.01)。
34.实施例1：人卵巢癌颗粒细胞cov434细胞系的培养
35.本发明使用的cov434细胞系购自atcc，采用完全培养基(含10％小牛血清和1％双抗)，置于37℃，5％co2培养箱进行培养，待细胞融合度达到50％-70％时，进行相应处理24h后，完成后续的实验。
36.实施例2：plpp3截断片段载体构建及转染
37.委托广州科易达生物科技有限公司(中国)，特异性扩增目的片段p1(-1000/+1234bp)，p2(-399/+1234bp)，p3(+50/+1234bp)，p4(+340/+1234bp)和p5(+681/+1314bp)，并连接至pgl3-basic载体，获得pgl3-p1，pgl3-p2，pgl3-p3，pgl3-p4和pgl3-p5重组载体。
38.实施例3：qrt-pcr
39.本发明中基因的qrt-pcr检测采用yeasen公司的sybr green qpcr master mix(2x)试剂盒。实验采用比较ct值法检测样品基因的含量，具体计算公式如下：
40.基因相对表达量＝2-{〈﹙实验组目的基因ct值﹚-﹙实验组内参基因ct值﹚〉-〈﹙对照组目的基因ct值﹚-﹙对照组内参基因ct值﹚〉}
41.检测基因用gapdh做内参，本发明所用到的qrt-pcr引物为：
42.qplpp3 forward：5
′‑
ggaggagcaggaggagccg-3
′
；
43.qplpp3 reverse：5
′‑
agtccaaggggaagagagc-3
′
；
44.qgapdh forward：5
′‑
tcaccagggctgcttttaact-3
′
；
45.qgapdh reverse：5
′‑
cttgactgtgccgtggaact-3
′
；
46.细胞的总rna提取参照上海飞捷公司rna fast 200―总rna极速抽提试剂盒操作说明书，具体步骤如下：
47.(1)往用胰酶消化下来的颗粒细胞中，加入500μl ra2液，充分颠倒混匀1min。
48.(2)将样本裂解物吸入或倒入内套管，离心1min。
49.(3)弃去外套管中液体，内套管中加入500μl洗液，离心1min。再重复此过程洗一
次。
50.(4)取出内套管，弃去外套管中液体，仍然套回内套管，不加洗液，离心1min。
51.(5)将内套管移入新的eppendorf管中，在膜中央加入洗脱液(或ph》7.0的depc处理水)25-50μl，室温静置1min，离心1min，获得总rna。
52.使用takara公司的primescript
tm rt master mix(perfect real time)cdna反转录试剂盒反转录总rna。
53.实施例4：western blot
54.(1)细胞总蛋白抽提
55.①
配置蛋白裂解液：ripa蛋白裂解液(白鲨公司)中加入1％的蛋白酶体抑制剂，上下颠倒混匀。
56.②
每孔(六孔板)加入120μl蛋白裂解液，置于冰上裂解10-15min，中间拿出来轻轻晃动，促进细胞脱落。
57.③
收集裂解的血细胞，12,000g，4℃离心10min，小心吸取上清液，去除下层沉淀。
58.(2)sds-page：
59.①
蛋白定量(碧云天bca蛋白定量试剂盒)：使用多功能酶标仪测定a
562
波长的od值，绘制标准曲线，通过回归方程和各个蛋白标准的平均od值，计算各蛋白样品浓度；
60.②
样品制备：混合20μg总蛋白与5
×
上样缓冲液按5:1，煮沸10min；
61.③
制胶点样：每孔加入20ug蛋白，跑胶电压120～150v，约40分钟(当溴芬蓝跑至离胶底端1～2cm左右，停止电泳；或根据具体情况调整跑胶电压与时间)；
62.④
根据蛋白marker的分子量标准切下含有目的蛋白的胶条，选择转膜电流300ma，20min；
63.⑤
转膜结束后，用tbst轻轻冲洗膜5min，用5％的脱脂奶粉室温封闭2h；
64.⑥
用tbst轻轻冲洗膜2次，每次5min，用tbst按照1:1800的比例稀释一抗plpp3(购自北京博奥森公司)，4℃孵育过夜；
65.⑦
用tbst轻轻冲洗膜3次，每次10min，1:10000稀释二抗goat anti-rabbit igg(购自sab公司)，室温孵育2小时；
66.⑧
用tbst轻轻冲洗膜3次，每次10min；
67.⑨
用极超敏ecl化学发光试剂盒(购自碧云天公司)显色，使用天能成胶系统(购自天能公司)观察蛋白条带并进行拍照，采用image j软件分析胶片中的蛋白条带。
68.实施例5：bsp实验
69.用组织dna试剂盒(购自美国omega bio-tek)从颗粒细胞中抽提基因组dna。按照ez dnaez dna甲基化试剂盒(购自美国zymo research)操作步骤，将纯化的dna进行亚硫酸氢盐转化。以亚硫酸氢盐转化的dna为模板，用bsp引物扩增相应片段。最后，通过quma网站(http://quma.cdb.riken.jp/)将测序结果与原始序列进行比较并绘制点图。每个样品需要8-10个克隆来计算甲基化率。
70.本发明所用到的bsp引物为：
71.f1(-399～+49bp)forward：5
′‑
tatggattaataaattaag-3
′
；
72.reverse：5
′‑
ttcctcacctacaaaccta-3
′
；
73.f2(+50～+339bp)forward：5
′‑
aactacactaaacccaaca-3
′
；
74.reverse：5
′‑
atttgagttaagtaaggag-3
′
；
75.f3(+340～+680bp)forward：5
′‑
ttggattttagaatgatttagg-3
′
；
76.reverse：5
′‑
atcccacaacaacaaccac-3
′
。
77.实施例6：双荧光素酶活性分析
78.使用双萤光素酶报告基因检测试剂盒(购自碧云天公司)进行双荧光素酶活性检测，具体操作步骤如下：
79.①
用pbs清洗细胞之后，每孔(96孔板)加入80μl的报告基因细胞裂解液，室温充分裂解后，10,000-15,000g离心3-5min，取上清用于后续测定。
80.②
使用不透光的96孔板，每孔加入100μl细胞裂解液样品，再加入100μl萤火虫萤光素酶检测试剂，混匀后在biotek公司synergy 2多功能酶标仪上检测发光值，对应于萤火虫荧光素酶的表达水平。
81.③
在完成上述测定萤火虫萤光素酶步骤后，再往每孔中加入100μl海肾萤光素酶检测工作液，混匀后在biotek公司synergy 2多功能酶标仪上检测发光值，对应于对应于海肾荧光素酶的表达水平。荧火虫荧光素酶与海肾荧光素酶表达量的比值为萤火虫荧光素酶相对活性。
82.实施例7：体外甲基化处理
83.使用cpg甲基转移酶(m.sssl)(new england biolabs，英国)对plpp3截断片段的pgl3重组质粒进行体外甲基化处理。室温下，轻微混合2μl 10
×
m.sssl buffer、0.4μl50
×
sam、1μg dna、1μlm.sssl及一定的nuclear-free water，总共体积为20μl。37℃孵育15min后，接着65℃孵育20min以终止反应。实施例2中获得的pgl3-p1，pgl3-p2，pgl3-p3，pgl3-p4和pgl3-p5重组质粒使用甲基化处理后，转染至颗粒细胞完成后续的双荧光素酶活性检测(具体操作参考实施例6)。
84.实施例8：定点甲基化检测
85.使用dcas9-dnmt1(来自yonglun luo实验室，https://www.addgene.org/66818/)和dcas9-tet1(来自ronggui hu实验室，https://www.addgene.org/83340/)实现plpp3目标区域定点甲基化和去甲基化。针对f2区域(+50～+339bp)设计sgrna，将sgrna和dcas9-dnmt1及dcas9-tet1质粒分别共转染到细胞中，实现定点上调和下调目标位点的甲基化水平，抽提细胞dna进行bsp检测(具体操作参考实施例5)。
86.结果：
87.1、降低dna甲基化提高了颗粒细胞中plpp3的表达量
88.使用dna甲基转移酶抑制剂5-aza-cdr和三种甲基转移酶干扰片段si-dnmt1、si-dnmt3a及si-dnmt3b处理颗粒细胞24h，利用qrt-pcr和wb方法分析plpp3的mrna及蛋白含量变化。
89.qrt-pcr和wb结果显示，5-aza-cdr显著提高了颗粒细胞中plpp3的mrna和蛋白水平(图1中的a、b)；三种甲基转移酶干扰片段均有显著的干扰效果(图1中的c、d)，但只有si-dnmt1显著提高了plpp3的mrna和蛋白表达量(图1中的e、f)，而si-dnmt3a及si-dnmt3b对颗粒细胞中plpp3的蛋白含量并无显著影响。综上，dnmt1可能是调控plpp3表达的主要甲基转移酶。
90.2、通过生物信息学网站预测了plpp3的高甲基化区域
91.plpp3(-1000/+1234bp)中的(+50/+1234bp)区域为高cg区域(图1)。我们对plpp3的高cg和低cg区域进行分段扩增，分别为p1(-1000/+1234bp)，p2(-399/+1234bp)，p3(+50/+1234bp)，p4(+340/+1234bp)和p5(+681/+1234bp)，这些片段成功扩增后连接到pgl3-basic载体上获得pgl3-p1，pgl3-p2，pgl3-p3，pgl3-p4和pgl3-p5重组质粒(图2)。
92.3、dna高甲基化抑制plpp3的转录活性
93.使用cpg甲基转移酶(m.sssl)对plpp3进行体外甲基化处理，通过双荧光素酶活性检测dna甲基化对plpp3转录活性的影响。
94.双荧光素酶活性检测结果显示，dna甲基化显著降低了plpp3截断片段重组质粒的荧光素酶活性(图3)，但是p4段的荧光素酶活性稍有回复，推测dna甲基化可能发生在p3段富含cg的f2区域。
95.4、plpp3的dna甲基化主要发生在plpp3的f2区域
96.使用dcas9-dnmt1融合蛋白，通过qrt-pcr，wb和bsp实验分别检测plpp3目标区域定点甲基化对plpp3表达量及甲基化水平的影响。
97.qrt-pcr和wb实验结果显示，dcas9-dnmt1显著降低了颗粒细胞中plpp3 mrna和蛋白含量(图4中的a、b)；bsp结果显示，dcas9-dnmt1显著提高了plpp3f2区域的甲基化水平(图4中的c)，而对其他区域无显著影响。
98.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种体外调控人卵巢颗粒细胞中plpp3基因转录活性的方法，其特征在于：通过降低plpp3基因dna甲基化水平来提高人卵巢颗粒细胞中plpp3基因转录活性；或通过提高plpp3基因dna甲基化水平来降低人卵巢颗粒细胞中plpp3基因转录活性。2.根据权利要求1所述的体外调控人卵巢颗粒细胞中plpp3基因转录活性的方法，其特征在于：所述的降低plpp3基因dna甲基化水平是通过dna甲基转移酶抑制剂5-aza-cdr或抑制dnmt1基因表达的sirna转染到人卵巢颗粒细胞的方式实现。3.根据权利要求2所述的体外调控人卵巢颗粒细胞中plpp3基因转录活性的方法，其特征在于：所述的抑制dnmt1基因表达的sirna的序列如下：5
′‑
ggaagaagaguuacuauaa-3
′
。4.根据权利要求1所述的体外调控人卵巢颗粒细胞中plpp3基因转录活性的方法，其特征在于：所述的提高plpp3基因dna甲基化水平是通过对plpp3基因进行甲基化处理实现。5.根据权利要求4所述的体外调控人卵巢颗粒细胞中plpp3基因转录活性的方法，其特征在于：所述的plpp3基因dna甲基化水平为plpp3基因f2区域的dna甲基化水平，其中，f2位于+50～+339bp。6.根据权利要求5所述的体外调控人卵巢颗粒细胞中plpp3基因转录活性的方法，其特征在于：所述的甲基化处理通过cpg甲基转移酶或dcas9-dnmt1系统实现。7.根据权利要求6所述的体外调控人卵巢颗粒细胞中plpp3基因转录活性的方法，其特征在于：所述的甲基化处理的具体操作为：针对f2区域设计sgrna，将sgrna和dcas9-dnmt1共转染到颗粒细胞中，实现定点上调目标位点的甲基化水平，sgrna序列为5
′‑
aaagtgcagaaaacaaaccc-3
′
。8.一种人卵巢颗粒细胞plpp3基因的核心启动子功能调节区序列，其特征在于：如plpp3基因+50～+339bp区域的核苷酸序列所示。

技术总结
本发明公开一种调控人卵巢颗粒细胞中PLPP3转录活性的方法。本发明以PLPP3基因DNA甲基化以及PLPP3为研究对象，通过分析PLPP3在卵泡发育过程中的潜在调控作用，利用5-Aza-CdR或DNMT1-siRNA验证PLPP3低甲基化促进其表达，而通过CpG甲基化处理带来PLPP3高甲基化则抑制了其表达。最后通过dCas9-DNMT1和gRNA实现定点甲基化找到PLPP3甲基化水平发生变化的具体区域。本发明通过探究DNA甲基化调控PLPP3转录表达机制的应用，对研究PLPP3基因的DNA甲基化参与卵泡发育调控及卵巢衰老分子机制研究具有具有很好的应用价值。究具有具有很好的应用价值。究具有具有很好的应用价值。


技术研发人员：袁晓龙 全洪燕 张哲 李硕 何颖婷 黄恩媛 张柳红 陈永财
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/9/22