一种生产赖氨酸产品的方法与应用与流程

1.本发明涉及氨基酸产品制备技术领域，具体地说，涉及一种生产赖氨酸产品的方法与应用。


背景技术：

2.蛋白是饲料最昂贵的原料，主要来源于动物(鱼粉、鸡肉粉)、植物(豆粕、菜粕、棉仔粕、杂粕)。加大饲料原料降解，氮循环和绿色降解饲料研究，提升蛋白原料的消化吸收率，提升养殖行业的闭环氮循环效率，降低环境氮排放，是绿色养殖的未来。
3.饲料蛋白含量成为行业饲料攀比的金标准，蛋白减量与行业需要的快速生长成为一对很难平衡的矛盾。减量的唯一渠道在于提升动物对蛋白原料的消化吸收。目前有两种途径，即体内和体外提升。氨基酸是动物营养和饲料中最重要的营养成分，通过平衡氨基酸，降低粗蛋白水平，促进了合成氨基酸在饲料中的用量大幅度增加。
4.在以玉米豆粕为基础的日粮中，赖氨酸是猪的第一限制性氨基酸，家禽的第二限制性氨基酸，添加赖氨酸和其它必需氨基酸的平衡日粮在提高动物健康水平和生长性能以及降低氮排放方面都有重要作用。l-氨基酸硫酸盐是一种复合型氨基酸，产品中还含有其他种的氨基酸和未知生长因子(ugf)等，这些氨基酸共同作用提高了断奶仔猪的消化性能，从而使其消化率提高，是一种绿色纯天然复合型营养添加剂。
5.饲料级l-赖氨酸硫酸盐的生产过程包括：利用大肠杆菌等赖氨酸生产菌株进行发酵，发酵结束后将发酵液加热后，用硫酸调ph，然后陶瓷膜过滤，截留液进行喷雾造粒，形成包含有赖氨酸在内的高蛋白复合赖氨酸硫酸盐，其中赖氨酸含量≥55％，其还含有菌体、硫酸根，其它氨基酸、维生素等。因制备工艺的限制，菌体中含有的游离赖氨酸未被完全释放出来且菌体直接烘干，使动物对粗蛋白的利用率降低。且硫酸盐产品所含硫酸根浓度过高，容易造成饲料的结块现象，也容易加重幼年动物的下痢现象。
6.因此，有必要对l-赖氨酸产品进行进一步研究。


技术实现要素：

7.本发明提供了一种可提升以生物发酵生产的赖氨酸产品的利用率及有效成分含量的方法。
8.为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
9.一种生产赖氨酸产品的方法，其包括：
10.(1)对赖氨酸生产菌株发酵后形成的发酵液进行匀浆处理，裂解菌体获得匀浆液，所述发酵液中含有镁离子；
11.(2)在钙离子存在下，以碱性蛋白酶对所述匀浆液进行第一次酶解，获得第一酶解液；
12.(3)在锰离子存在下，以中性蛋白酶和溶菌酶对所述第一酶解液进行第二次酶解，获得第二酶解液；
13.(4)在铜离子存在下，以酸性蛋白酶对所述第二酶解液进行第三次酶解，获得终酶解液。
14.本发明的发酵液由本领域公知方法制备获得，具体采用公知的赖氨酸生产菌株，以公知培养方法进行发酵获得，发酵液ph值在7.2-7.5之间。
15.常规赖氨酸生产菌株发酵生产赖氨酸时，菌体干基含有50％蛋白质，大量的氨基酸和维生素，但是包裹在菌体中，做成饲料后动物利用速度慢、利用率低，此问题暂时没有较好的解决方案。为此，本发明通过菌体破碎、以不同酶依次按顺序进行特定酶解赖氨酸发酵菌体的方式，使菌体中的赖氨酸得以释放出来，并将菌体蛋白酶解为氨基酸和短肽，释放菌体内的氨基酸和维生素，从而提高了产品的营养价值，其可作为一种新型饲料原料，替换豆粕，极大的提高了蛋白的利用率。
16.本发明在酶解时，配合不同酶所需的激活剂，特别设计了酶解顺序，从而保证了每一步酶的作用效果，提升了产品的有效活性物质含量和利用率。具体在第一次酶解时，以钙离子和镁离子来解决碱性蛋白酶活力低和稳定性差的问题。在第二次酶解时，以钙离子、镁离子和锰离子来提升中性蛋白酶和溶菌酶的作用效果。在第三次酶解时，以锰离子和铜离子来提升酸性蛋白酶的处理效果。三次酶解依次按顺序进行，可保证各个酶处于适宜的离子环境下，提升了综合处理效果。
17.本发明的碱性蛋白酶、中性蛋白酶、溶菌酶、酸性蛋白酶可采用本领域公知的可裂解菌体的相关市售产品，例如，可分别为安琪碱性蛋白酶ap-20，安琪中性蛋白酶np-5，夏盛溶菌酶sdg-2447，安琪酸性蛋白酶ap-5。
18.本发明的方法中，所述第一次酶解时，ph值为8.0-10.0，时间为5-6h，温度为40℃-50℃，钙离子的浓度为1-5mmol/l，镁离子的浓度为3-8mmol/l，碱性蛋白酶的加入量为菌体蛋白干重(质量)的5-8％。
19.本发明的方法中，所述第二次酶解时，ph值为5.0-8.0，时间为5-6h，温度为40℃-50℃，锰离子的浓度为3-5mmol/l，中性蛋白酶和溶菌酶的总加入量为菌体蛋白干重的5-10％，中性蛋白酶和溶菌酶的质量比为(2-3)：1。
20.本发明的方法中，所述第三次酶解时，ph值为3.0-5.0，时间为5-6h，温度为40℃-50℃，铜离子的浓度为1-5mmol/l，酸性蛋白酶的加入量为菌体蛋白干重的5-8％。
21.本发明通过对各次酶解条件的控制，保证了酶解效果。
22.本发明的方法中，所述第一次酶解时，采用液氨调节ph值；所述第二次酶解和第三次酶解时，采用硫酸调节ph值，优选采用30％硫酸进行调节；
23.和/或，所述匀浆处理的条件为：压力50-100mpa，温度18-22℃，处理时间60-100min。
24.本发明中，也可采用超声匀浆的方式进行菌体裂解。菌体裂解越充分，其中的物质释放越充分，越有利于产品利用价值的提升。
25.本发明的方法中，在对赖氨酸生产菌株发酵后形成的发酵液进行匀浆处理前，还包括对所述发酵液进行加热、过滤浓缩的步骤，优选，加热、过滤浓缩后所述发酵液的酸固比(赖氨酸盐酸盐与发酵液中干固质量的比值)为69-71％。
26.本发明加热、过滤浓缩的具体方式为，在温度40℃-50℃下进行过膜处理，如可以陶瓷膜进行过滤浓缩，以获得的发酵液过膜后的截留液进行后续匀浆处理。此步骤对发酵
液浓度的调整，可保留菌体和部分发酵培养基中的离子、营养元素，获得满足市场常规70赖氨酸硫酸盐对赖氨酸含量的基本要求。
27.本发明的方法还包括使用钙离子与所述终酶解液进行反应，之后取上清液的步骤。
28.钙离子的加入，可去除终酶解液中的硫酸根，改善产品的质量，提高饲料利用率。
29.本发明可通过在终酶解液中加入氧化钙、氯化钙、氢氧化钙等方式在反应体系中引入钙离子，使钙离子与硫酸根发生反应，产生硫酸钙沉淀，从而使硫酸根从终酶解液中被去除。
30.分离硫酸钙沉淀的方法可采用本领域公知手段，如自然沉淀、离心、过滤等。
31.本发明的方法中，与所述终酶解液进行反应时，所述钙离子与所述终酶解液中的硫酸根的摩尔比为(1-1.2):1；
32.所述反应的温度控制在30℃以下，优选在搅拌转速200-400rpm下进行。
33.本发明可通过控制加料速度配合搅拌，对反应温度进行控制。
34.本发明还提供一种赖氨酸产品，其由上述方法制备获得。
35.本发明还可将上述赖氨酸产品制备为固体颗粒。
36.具体将终酶解液或与钙离子反应后的终酶解液的上清液(去除了反应生成的硫酸钙沉淀)制备为固体颗粒。
37.所述固体颗粒的制备可通过本领域常规方法进行，具体可先将终酶解液/上清液进行真空浓缩，之后再进行喷雾干燥。
38.真空浓缩的压力为-0.07～-0.09mpa，浓缩温度为70-80℃，待真空浓缩到固含物50％-60％(w/w)时进行喷雾干燥。
39.本发明另提供一种赖氨酸产品在制备动物饲料添加剂中的应用。
40.本发明的有益效果至少在于：
41.本发明提供了一种以生物发酵方式生产的赖氨酸发酵液的处理方法，该方法可制备获得赖氨酸、游离氨基酸、维生素含量高的产品，当将其作为动物饲料添加剂使用时，可提升动物的消化利用率。
具体实施方式
42.下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
43.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或按本领域常规方法制备。
44.实施例1
45.本实施例提供一种赖氨酸产品生产方法，具体如下：
46.1、发酵生产赖氨酸，获得发酵液：
47.采用产l-赖氨酸的菌株：大肠埃希氏菌mhz-0914(公开于中国专利cn114875090a)进行发酵生产。具体如下：
48.种子培养基：葡萄糖40g/l，kh2po
4 1.5g/l，mgso
4 1.5g/l，糖蜜12g/l，玉米浆25g/
l，硫酸铵12g/l，mnso
4 0.002g/l和feso40.002g/l。
49.发酵培养基：葡萄糖20g/l，h3po
4 1.5g/l，kcl 0.5g/l，mgso40.7g/l，糖蜜10g/l，玉米浆60g/l，豆粕水解液30g/l，mnso
4 0.002g/l，feso
4 0.002g/l，生物素200μg/l和vb
1 60μg/l。
50.流加的葡萄糖溶液(可发酵型糖)浓度为600g/l，流加的硫酸铵溶液浓度为500g/l，流加的苏氨酸溶液浓度为4g/l。上述发酵底物均于121℃灭菌20min。
51.种子罐中分别接入上述l-赖氨酸生产菌株，待od
600
值达到20时接入50l发酵罐中进行发酵，发酵罐的装液量为15l，接种比为20v/v％，初始发酵底糖(葡萄糖)浓度20g/l，发酵温度36-38℃，发酵压力控制0.08mpa，通气量1vvm，发酵至残糖为0.1g/l，开始连续向发酵罐中流加可发酵型糖、硫酸铵溶液和苏氨酸溶液。苏氨酸溶液的添加量占糖液添加量体积的22％；发酵体系中葡萄糖浓度控制在1g/l，发酵氨氮(无机游离氨nh
4+
，由硫酸铵和氨水供应)浓度控制在1.0g/l；以氨水进行ph调控，将发酵体系的ph值控制在6.9。当发酵罐中的培养液体积至发酵罐体积的70％时放料，放料体积为培养基体积的5％，发酵总周期36h。发酵过程中，测定发酵过程酸，游离氨。
52.发酵结果：产酸180g/l，转化率68.4％，理论酸为6880g。
53.2、取50l的上述l-赖氨酸的发酵液，进行加热到50℃，经陶瓷膜过滤浓缩得到截留液15l，酸固比为70％，镁离子的浓度为5mmol/l(来源于原发酵培养基中)。取7.5l截留液，不加酶液，进行真空浓缩，压力为-0.086mpa，浓缩温度75℃，真空浓缩到固含物55％(w/w)时喷雾干燥，制备成赖氨酸硫酸盐作为对照。利用hplc检测赖氨酸含量。经检测，赖氨酸的含量为55.5g/100g。
54.另取上述截留液7.5l，先进行细胞破碎获得匀浆液。细胞破碎采用高压匀浆机匀浆破碎，条件为70mpa压力，温度20℃，破碎处理时间为80min。破碎率可达98％。匀浆液利用hplc检测赖氨酸含量为185g/l。
55.取1l匀浆液用氨水将其ph调节到8.5，其中菌体蛋白干重为30g/l，加入2g安琪碱性蛋白酶ap-20进行酶解，在碱性蛋白酶酶解时，加入cacl，使其在酶解液中的浓度为3mmol/l，酶解温度为45℃，维持时间为5.5h，酶解结束后利用hplc检测赖氨酸含量为192g/l。
56.接着加入30％硫酸将ph值调节到7.0，接入2g安琪中性蛋白酶np-5+1g夏盛溶菌酶sdg-2447进行酶解，在上述酶酶解时，加入mnso4，使其在酶解液中的浓度为4mmol/l，酶解温度为45℃，时间6h，酶解结束后利用hplc检测赖氨酸为198g/l。
57.最后加入30％硫酸将ph值调节到4.0，接入2g安琪酸性蛋白酶ap-5在酸性蛋白酶酶解时，加入cuso4，使其在酶解液中的浓度为3mmol/l。酶解温度为45℃，时间为5.5h，制成终酶解液。酶解结束后利用hplc检测赖氨酸为202g/l，硫酸根为52g/l。
58.将终酶解液真空浓缩，压力为-0.086mpa，浓缩温度为75℃，真空浓缩到固含物55％(w/w)时进行喷雾干燥，制备成赖氨酸硫酸盐。利用hplc检测赖氨酸含量。经检测，赖氨酸的含量为58.3g/100g。
59.此外，本实施例还在上述每一步处理后，测定每100g干基中的氨基酸和维生素的含量，统计结果见表1和表2。
60.从中可知，与未经处理的截留液制成的赖氨酸硫酸盐对照相比，以上述特定匀浆、
酶处理后的赖氨酸含量增加5.0％，其它氨基酸总含量由0.14g/100g增加到1.26g/100g，维生素含量由0.04mg/100g增加到8mg/100g。
61.表1截留液处理前后干基中的氨基酸浓度变化(g/100g)
[0062][0063][0064]
表2截留液处理前后干基中的维生素浓度变化(mg/100g)
[0065]
物质名称处理前匀浆破碎碱性蛋白酶中性蛋白酶酸性蛋白酶b10.000.400.500.500.60b20.001.201.201.301.50b50.040.700.700.800.90b60.001.601.802.102.30b70.002.202.302.402.70
[0066]
实施例2
[0067]
在实施例1中获得的终酶解液中按与硫酸根摩尔比为1:1的用量比例加入生石灰(cao)，控制加入生石灰的速度，并进行搅拌，使反应温度保持在30℃以下，搅拌转速200rpm，时间为3h。使用离心机对反应后的液体进行离心，离心转速4000rpm，时间10min，获得上清液，利用hplc检测赖氨酸含量为230g/l，硫酸根为2g/l，赖氨酸含量进一步提升，同时去除了大量硫酸根，工艺的副产品硫酸钙有着广泛的用途，提高了终产品的附加值。
[0068]
将上述获得的上清液进一步真空浓缩，压力为-0.086mpa，浓缩温度75℃，真空浓缩到固含物55％(w/w)时喷雾干燥，制备成赖氨酸产品。利用hplc检测赖氨酸含量。经检测，赖氨酸的含量为66.9g/100g。相比实施例1中制备的赖氨酸硫酸盐的58.3g/100g，提高了14.75％。
[0069]
对比例1
[0070]
本对比例提供一种赖氨酸产品生产方法，具体与实施例1基本相同，区别仅在于改
变实施例1中酶处理的顺序，具体如下：
[0071]
取实施例1中制备获得的1l匀浆液，加入30％硫酸将ph值调节到7.0，接入2g安琪中性蛋白酶np-5+1g夏盛溶菌酶sdg-2447进行酶解，在上述酶酶解时，加入mnso4，使其在酶解液中的浓度为4mmol/l，酶解温度为45℃，时间6h，酶解结束后利用hplc检测赖氨酸为188g/l。
[0072]
接着用氨水将其ph调节到8.5，加入2g安琪碱性蛋白酶ap-20进行酶解，在碱性蛋白酶酶解时，加入cacl，使其在酶解液中的浓度为3mmol/l，酶解温度为45℃，维持时间为5.5h，酶解结束后利用hplc检测赖氨酸含量为191g/l。
[0073]
最后加入30％硫酸将ph值调节到4.0，接入2g安琪酸性蛋白酶ap-5，在酸性蛋白酶酶解时，加入cuso4，使其在酶解液中的浓度为3mmol/l。酶解温度为45℃，时间为5.5h，制成终酶解液。将最终获得的终酶解液利用hplc方法进行检测，赖氨酸为195g/l，硫酸根为55g/l。
[0074]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.一种生产赖氨酸产品的方法，其特征在于，包括：(1)对赖氨酸生产菌株发酵后形成的发酵液进行匀浆处理，裂解菌体获得匀浆液，所述发酵液中含有镁离子；(2)在钙离子存在下，以碱性蛋白酶对所述匀浆液进行第一次酶解，获得第一酶解液；(3)在锰离子存在下，以中性蛋白酶和溶菌酶对所述第一酶解液进行第二次酶解，获得第二酶解液；(4)在铜离子存在下，以酸性蛋白酶对所述第二酶解液进行第三次酶解，获得终酶解液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一次酶解时，ph值为8.0-10.0，时间为5-6h，温度为40℃-50℃，钙离子的浓度为1-5mmol/l，镁离子的浓度为3-8mmol/l，碱性蛋白酶的加入量为菌体蛋白干重的5-8％。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第二次酶解时，ph值为5.0-8.0，时间为5-6h，温度为40℃-50℃，锰离子的浓度为3-5mmol/l，中性蛋白酶和溶菌酶的总加入量为菌体蛋白干重的5-10％，中性蛋白酶和溶菌酶的质量比为(2-3)：1。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述第三次酶解时，ph值为3.0-5.0，时间为5-6h，温度为40℃-50℃，铜离子的浓度为1-5mmol/l，酸性蛋白酶的加入量为菌体蛋白干重的5-8％。5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述第一次酶解时，采用液氨调节ph值；所述第二次酶解和第三次酶解时，采用硫酸调节ph值；和/或，所述匀浆处理的条件为：压力50-100mpa，温度18-22℃，处理时间60-100min。6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，在对赖氨酸生产菌株发酵后形成的发酵液进行匀浆处理前，还包括对所述发酵液进行加热、过滤浓缩的步骤，优选，加热、过滤浓缩后所述发酵液的酸固比为69-71％。7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，还包括使用钙离子与所述终酶解液进行反应，之后取上清液的步骤。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，与所述终酶解液进行反应时，所述钙离子与所述终酶解液中的硫酸根的摩尔比为(1-1.2):1；所述反应的温度控制在30℃以下，优选在搅拌转速200-400rpm下进行。9.一种赖氨酸产品，其特征在于，由权利要求1-8任一项所述的方法制备获得。10.权利要求9所述的赖氨酸产品在制备动物饲料添加剂中的应用。

技术总结
本发明涉及氨基酸产品制备技术领域，具体公开了一种生产赖氨酸产品的方法与应用。本发明的生产赖氨酸产品的方法包括：(1)对赖氨酸生产菌株发酵后形成的发酵液进行匀浆处理，裂解菌体获得匀浆液，所述发酵液中含有镁离子；(2)在钙离子存在下，以碱性蛋白酶对所述匀浆液进行第一次酶解，获得第一酶解液；(3)在锰离子存在下，以中性蛋白酶和溶菌酶对所述第一酶解液进行第二次酶解，获得第二酶解液；(4)在铜离子存在下，以酸性蛋白酶对所述第二酶解液进行第三次酶解，获得终酶解液。本发明方法可制备获得赖氨酸、游离氨基酸、维生素含量高的产品，当将其作为动物饲料添加剂使用时，可提升动物的消化利用率。动物的消化利用率。


技术研发人员：张苏龙 宫卫波 杨帆 付文博
受保护的技术使用者：廊坊梅花生物技术开发有限公司
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/9/22