一种生长耦联的酵母定向进化筛选方法、装置及应用

1.本发明涉及定向进化技术领域，具体涉及一种生长耦联的酵母定向进化筛选方法、装置及应用。


背景技术：

2.2018年，诺贝尔化学奖的1/2份额颁发给使用定向进化技术进化酶的科学家frances h.arnold。arnold的代表性成果包括进化细胞色素p450，使其能够催化生物中不存在的化学反应，例如可获得抗抑郁药物前体物质手性顺环丙烷(wang,z.j.,et al.(2014).improved cyclopropanation activity of histidine-ligated cytochrome p450 enables the enantioselective formal synthesis of levomilnacipran.angew chem int ed engl 53(26):6810-3.)。她的突出成就在于使用定向进化技术，改造了蛋白酶的基因序列，提高化学反应的催化效率或创造新的化学反应，可应用于制药、新能源和环境领域。
3.在诺贝尔奖表彰定向进化技术之前，该技术已经历了三四十年的发展。重大技术进步多集中在上个世纪八九十年代，例如error-prone pcr技术(leung,d.w.,e.chen,andd.v.goeddel(1989).amethod for random mutagenesis of a defined dna segment using a modified polymerase chain reaction,.technique1.)，目前仍是最主流的进化方法。这种方法是使用一种低保真taq dna聚合酶，对一段dna片段进行pcr扩增，可以获得很多含有点突变的dna片段库，将这些dna片段构建到载体中，表达于大肠杆菌中，筛选，可得到想要的功能。再比如dna shuffling技术(stemmer,wp(1994).rapid evolution ofa protein in vitro by dna shuffling.nature 370(6488):389-91.)，是另一种可以与error-prone pcr技术互补的定向进化技术。在pcr反应中使用dnasei，将dna片段打散，在新一轮pcr反应中可发生引物错配，因此dna片段间可能发生重组，此方法可使dna碱基的顺序和dna片段的长短发生变化，更有可能创造新的基因。
4.目前定向进化技术已经发展成一种十分强大的技术手段，广泛应用在蛋白质工程等众多生物、化学领域，可用于科学研究和实际应用中。目前定向进化技术的全流程包括：突变引入、基因库的富集和筛选，根据需求，以上三步可能循环多次。突变的引入和富集多数在体外进行，但最近十年以来，在生物体内进行突变引入和富集的方法逐渐得到开发和推广。生物体内的定向进化有诸多优点：直接在生物体内进化，更贴近实际应用环境。体外进化的方式需要关注突变库的容量问题，在突变库的筛选方面需要较大工作量，筛选后获得的突变体可能不符合实际应用场景。而在细胞内直接获得突变库，方法简便，工作量较小，由此获得的突变体能直接适应在体应用环境。
5.生物体定向进化的原理依然是使用低保真taqdna聚合酶，但是这些低保真酶通常表达在生物体内部，dna片段也在生物体内以质粒或插入基因组的形式存在，低保真酶在体内目标位置引入点突变，利用生物自身的转录翻译系统获得突变后的蛋白，并在生物体内进行筛选，获得目标功能的蛋白才能使生物体存活，而未得到有义突变蛋白质的生物体将
被杀死。常见的生物体底盘包括，大肠杆菌，酵母菌和哺乳动物细胞。例如：david r.liu实验室发明的pace(phage-assisted continuous evolution)技术——使用噬菌体辅助的定向进化技术(esvelt,kevin m.,jacob c.carlson,and david r.liu(2011).asystem for the continuous directed evolution ofbiomolecules.nature 472(7344):499-503.)。该技术使用噬菌体作为媒介，对大肠杆菌进行工程化改造，在其中转入ap和mp质粒，ap质粒上表达噬菌体生长必备的geneiii，mp质粒上表达低保真dna聚合酶，使用噬菌体对工程化大肠杆菌进行侵染，噬菌体将自身基因注入大肠杆菌内，表示为sp，mp质粒上的低保真dna聚合酶对sp质粒上的基因进行易错复制，sp表达的蛋白只有符合目标功能才能启动ap质粒上的geneiii的表达，进而帮助组装成有侵染活性的新噬菌体，整个过程发生在不断流动的lagoon体系中，没有累积到有利突变因而不能组装成具有侵染能力的噬菌体便会随着液流被洗脱。
6.pace系统目前已成为较常用的生物体内定向进化系统。为了弥补pace系统突变发生区域比较分散的问题，david v.schaffer和john e.dueber开发了evolvr系统(halperin,s.o.,et al.(2018).crispr-guided dna polymerases enable diversification of all nucleotides in a tunable window.nature560(7717):248-252.)，将crispr-cas9定位的优势应用在定向进化领域，可以使突变集中在cas9的定位区域内。
7.真核细胞内进化，应用场景更广泛更高级。目前国内在体定向进化系统所用底盘细胞多为大肠杆菌和病毒，也即基于pace系统改造的一系列技术。制药、疫苗等针对真核生物的生物制品在此类定向进化系统中兼容性较小，与疾病相关的生物大分子的进化很难通过原核生物定向进化的方式获得。相比于大肠杆菌，酵母或哺乳动物细胞中筛选得到的蛋白可以直接应用在疾病预防和治疗中。
8.其中一个真核的进化系统是vegas(english,j.g.,et al.(2019).vegas as a platform for facile directed evolution in mammalian cells.cell 178(3):748-761.e17.)。与pace系统相同，使用病毒侵染哺乳动物的方式，利用sindbis病毒自身的高突变特质进行定向进化。
9.另外一个基于真核生物的定向进化系统orthorep(zhong,z.,ravikumar,a.,&liu,c.c.(2018).tunable expression systems for orthogonal dna replication.acs synthetic biology,7(12),2930
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2934.)具有独特的优势，orthorep系统是一种利用酿酒酵母为底盘细胞的定向进化系统。将来自乳酸克鲁维酵母的细胞质线性质粒转入酿酒酵母中，由于该套细胞质线性质粒自带dna复制，转录，翻译的全套元件，因此可以在细胞质中独立的进行蛋白质表达并且可以稳定存在。由于来源物种不同，该线性质粒的元件和基因组中的元件互相正交，因此可对该线性质粒自带的dna聚合酶进行改造，使其实现低保真dna复制，对线性质粒dna进行点突变，形成突变库，而改造后的dna聚合酶不会复制基因组上的基因，因此可以实现生物体内的定点突变。该方法不需要pace系统和vegas系统的病毒转染步骤，方法简便，同时融合了evolvr系统锁定区域的功能，并且orthorep系统为真核系统，可以进化只能在真核系统中表达的蛋白，应用空间巨大。
10.目前该系统存在以下缺陷：
11.缺乏一体化的筛选系统。该系统目前重点在于使用酵母自身获得突变库，得到突
变库后还需要复杂的筛选过程。对于不同的蛋白质可能需要设计不同的筛选办法，需要对整套系统进行较大改动。目前该系统能够进化功能改变后对表型有明显影响的蛋白质，例如进化抗生素抗性蛋白，进化催化酶类等等，很难进化表型不明显的蛋白质功能，例如蛋白质与dna的结合，蛋白质与蛋白质的结合，蛋白质和小分子的结合等等。
12.不能对功能复杂的蛋白质进行正负筛选。目前该系统对蛋白质的进化路径通常是单线程的，例如进化某种酶，使其催化某种底物的效率更高，只需要不断的筛选相同时间内能够产生更多产物的酶即可，但很难进化酶对不同底物的识别，因此获得的进化后的酶，可能同时对其他底物进行响应。另外，蛋白质通常具有多种结构域，在对某一结构域进行进化的时候很可能对该蛋白质其他的结构域也产生影响，因此蛋白质的整体功能可能减弱。
13.不能将流程自动化。像pace系统那样，可以在自动化的液流装置中进化将节省很多人力成本。目前该系统还未有自动进化的先例。
14.因此，亟需开发一种能实现对不同功能蛋白一体化筛选、对功能复杂蛋白正负筛选的自动化定向进化蛋白筛选体系。


技术实现要素：

15.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
16.本发明第一方面提供一种生长耦联的酵母定向进化筛选方法，所述方法包括：
17.(a)、构建包含目标序列的外源质粒；
18.(b)、构建易错性dna聚合酶表达质粒；
19.(c)、构建生长相关基因表达质粒；
20.(d)、将步骤(a)所述外源质粒、步骤(b)所述易错性dna聚合酶表达质粒、步骤(c)所述生长相关基因表达质粒转入酵母菌，
21.其中，被进化目标序列表达的生物大分子能够通过所述生长相关基因的调控分子来驱动/抑制步骤(c)所述生长相关基因的表达，
22.(e)将所述酵母菌置于生长胁迫环境下，在所述生长胁迫环境下存活的酵母菌中含有的所述被进化目标序列为符合定向进化方向的目标序列。
23.本发明提供的生长耦联的酵母定向进化筛选方法，可以实现一体化筛选。生长耦联的进化筛选方法可对有利突变进行富集，简化中间流程。目前已有国际和国内专利筛选富集过程较复杂，还需要其他多种筛选方法一同使用才能得到真正有用的突变体。本发明可根据蛋白特点个性化的将功能与生长耦联，酵母生长相关基因被进化蛋白调控，可以对蛋白质的功能做逻辑判断。例如，进化某种酶的活性变好以后，可以产生更多小分子物质或与下游其他分子相互作用变强，诱导其他基因的表达，该基因可以与生长相关基因前面的调控序列相互作用，对生长相关基因的表达进行调控，只有进化出功能符合预期的蛋白的菌株才能表达更多生长相关基因从而繁殖存活，而进化失败的菌株将生长停滞，随着洗脱或传代逐渐稀释并消失，其中，这里的小分子物质可以是直接参与生长相关基因表达与否及表达强弱的调控分子，也可以是生物反应过程中的中间产物。
24.根据本发明的具体实施方案，所述目标序列包括一个或一个以上的基因的序列的至少一部分。
25.根据本发明的具体实施方案，所述生物大分子为蛋白质，所述蛋白质包括由单个
基因表达的蛋白质或多个基因共同表达的融合蛋白。
26.根据本发明的具体实施方案，所述蛋白质的分子量为4-400kd。
27.根据本发明的具体实施方案，所述蛋白质的分子量为8-200kd。
28.根据本发明的具体实施方案，所述蛋白质包括选自酶、受体、转录调节因子中的任意一种，或者，所述蛋白质包括酶、受体、转录调节因子中的任意蛋白组成的融合蛋白。
29.根据本发明的具体实施方案，所述融合蛋白为多种不同的酶组合而成的融合蛋白。
30.根据本发明的具体实施方案，所述融合蛋白为多种不同的受体组合而成的融合蛋白。
31.根据本发明的具体实施方案，所述融合蛋白为多种不同的转录调节因子组合而成的融合蛋白。
32.根据本发明的具体实施方案，所述融合蛋白为酶、受体或转录调节因子中的至少两种蛋白组合的融合蛋白。
33.根据本发明的具体实施方案，所述酶为具有催化活性的酶或与基因表达相关的酶。
34.根据本发明的具体实施方案，所述与基因表达相关的酶包括选自dna聚合酶、转录酶、基因编辑酶、加帽酶及与表观遗传修饰相关的酶。
35.根据本发明的具体实施方案，所述基因编辑酶包括选自cas9、cas12等cas家族蛋白、zfp、talen中的至少之一。
36.根据本发明的具体实施方案，所述与表观遗传修饰相关的酶包括选自组蛋白乙酰转移酶或去乙酰化酶、组蛋白甲基转移酶或去甲基化酶、泛素化酶或脱泛素化酶、dna甲基化酶或去甲基化酶中的至少之一。
37.根据本发明的具体实施方案，所述转录调节因子包括选自lysr、arac/xyls、tetr、luxr、laci、arsr、icir、merr、asnc、marr、ntrc(ebp)、ompr、deor、cold shock、gntr、crp、c2h2、bzip、基于dcas9、基于zfp、基于talen的转录调节因子中的至少之一。
38.根据本发明的具体实施方案，所述受体包括选自膜受体、细胞质受体、细胞核受体中的任意一种。
39.根据本发明的具体实施方案，所述受体为膜受体，所述膜受体包括选自离子通道形受体、g蛋白偶联受体、酪氨酸激酶偶联受体中的任意一种。
40.根据本发明的具体实施方案，所述外源质粒源自非宿主真核生物的细胞质线性质粒。
41.根据本发明的具体实施方案，所述非宿主真核生物包括乳酸克鲁维酵母。
42.根据本发明的具体实施方案，所述生长相关基因包括选自抗生素抗性基因、营养标记基因中的至少之一。
43.根据本发明的具体实施方案，所述抗生素抗性基因包括选自博莱霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、诺尔斯菌素、两性霉素中的至少之一。
44.根据本发明的具体实施方案，所述营养标记基因包括选自ura、leu、his、ade2、trp1、met17中的至少之一。
45.根据本发明的具体实施方案，所述步骤(e)进一步包括：
46.(1)所述生长相关基因表达使得所述酵母菌死亡作为负筛选，
47.所述生长相关基因表达使得所述酵母菌存活作为正筛选，
48.通过所述负筛选和/或正筛选的过程，获得含有符合定向进化方向的目标序列的酵母菌；
49.(2)基于步骤(1)中的酵母菌获得所述符合定向进化方向的目标序列，
50.其中，表达使得所述酵母菌死亡的生长相关基因为负筛选基因，表达使得所述酵母存活的生长相关基因为正筛选基因。
51.根据本发明的具体实施方案，步骤(e)中，在所述生长胁迫环境下，对所述酵母菌同时进行负筛选和正筛选，其中，所述负筛选和所述正筛选的筛选压力可调节。
52.根据本发明的具体实施方案，所述易错性dna聚合酶和所述外源质粒源自同一物种。
53.根据本发明的具体实施方案，所述易错性dna聚合酶仅作用于所述外源质粒进行易错复制。
54.根据本发明的具体实施方案，所述酵母包括选自酿酒酵母、奇异酵母、贝酵母、里约酵母、巴斯德酵母中的至少之一。
55.根据本发明的具体实施方案，所述酵母为酿酒酵母。
56.根据本发明的具体实施方案，所述生长相关基因的调控分子包括选自蛋白、核酸、第一小分子物质中的任意一种。
57.根据本发明的具体实施方案，所述核酸包括dna序列。
58.根据本发明的具体实施方案，所述dna序列包括选自启动子、绝缘子、增强子中的至少之一。
59.根据本发明的具体实施方案，所述第一小分子物质包括选自抗生素、酶底物、短肽、寡肽、糖类、脂类、维生素、无机物、生物碱、代谢物中的至少之一。
60.本发明提供的生长耦联的酵母定向进化筛选方法，可以实现正负筛选，可以有效将蛋白质的功能固定在某一范围内，符合实际应用所需。通常，蛋白质为多功能蛋白，受限于蛋白质的结构，某一功能的变化可能影响其他的功能，为了维持其他功能不变而专一性进化其中一个功能就需要正负筛选系统帮助。目前的正负筛选系统多为分隔的两套筛选系统，很难同时使用，分隔筛选效率较低，且增加了人力物力，而本发明提供的生长耦联的酵母定向进化筛选方法，能够实现正负筛选同时进行，无需在中途对工程菌做遗传操作，保持进化的连贯性。
61.本发明第二方面提供一种定向进化目标蛋白与第一蛋白互作能力的方法，所述方法包括：
62.利用上述生长耦联的酵母定向进化筛选的方法培养并筛选酵母，基于在所述生长胁迫环境下存活的酵母菌，获得与所述第一蛋白具有互作能力或互作能力提升或下降的目标蛋白，
63.其中，
64.所述目标蛋白与步骤(d)中所述生长相关基因的转录因子的bd融合表达形成第一融合蛋白，所述第一蛋白与所述生长相关基因的转录因子的ad融合表达形成第二融合蛋白；或
65.所述目标蛋白与步骤(d)中所述生长相关基因的转录因子的ad融合表达形成第一融合蛋白，所述第一蛋白与所述生长相关基因的转录因子的bd融合表达形成第二融合蛋白，
66.其中，所述bd为生长相关基因的启动子的上游激活序列的结合结构域，所述ad为生长相关基因的启动子的上游激活序列的激活结构域。
67.本发明第三方面提供一种定向进化目标蛋白与顺式作用元件互作能力的方法，所述方法包括：
68.利用第一方面所述的方法培养并筛选酵母，基于在所述生长胁迫环境下存活的酵母菌，获得与所述顺式作用元件具有互作能力或互作能力提升或下降的的目标蛋白，
69.其中，
70.所述顺式作用元件在步骤(c)中所述生长相关基因表达质粒上，所述顺式作用元件为所述生长相关基因的顺式作用元件；
71.表达所述目标蛋白的序列为步骤(a)中所述目标序列。
72.根据本发明的具体实施方案，所述目标蛋白包括选自转录因子、组蛋白、dna甲基化酶、基因编辑酶、dna结合蛋白中的至少之一。
73.本发明第四方面提供一种定向进化目标蛋白与第二小分子物质互作能力的方法，所述方法包括：
74.利用第一方面所述的方法培养并筛选酵母，基于在所述生长胁迫环境下存活的酵母菌，获得与所述第二小分子物质具有互作能力或互作能力提升或下降的目标蛋白，
75.其中，表达所述目标蛋白的序列为步骤(a)中所述目标序列，所述第二小分子物质为所述生长相关基因的表达与否及表达强弱的开关。
76.根据本发明的具体实施方案，所述第二小分子物质促进/抑制所述目标蛋白与所述生长相关基因的结合。
77.根据本发明的具体实施方案，所述目标蛋白至少包含两个结合位点。
78.根据本发明的具体实施方案，所述目标蛋白的第一结合位点与所述第二小分子物质结合后，开启/关闭所述目标蛋白的第二结合位点与所述生长相关基因的调控分子的结合。
79.根据本发明的具体实施方案，所述目标蛋白的第一结合位点与所述第二小分子物质结合后，增强/减弱所述目标蛋白的第二结合位点与所述生长相关基因的调控分子的结合。
80.根据本发明的具体实施方案，所述第一结合位点与所述第二结合位点相同或不同。
81.根据本发明的具体实施方案，所述第二小分子物质包括选自抗生素、酶底物、寡肽、糖类、脂类、维生素、无机物、生物碱、激素、寡核苷酸、金属离子、短肽、药物分子、代谢物中的至少之一。
82.根据本发明的具体实施方案，所述调控分子包括dna序列或转录因子。
83.根据本发明的具体实施方案，所述dna序列包括选自乳糖操纵子、木糖操纵子、四环素操纵子中的任意一种。
84.根据本发明的具体实施方案，所述转录因子包括laci、xylr、tetr中的任意一种。
85.本发明第五方面提供一种定向进化酶催化能力的方法，所述方法包括：
86.利用第一方面所述的方法培养并筛选酵母，基于在所述生长胁迫环境下存活的酵母菌，获得符合定向进化方向的催化酶，
87.其中，表达所述催化酶的核酸序列为步骤(a)中所述的目标序列，
88.所述催化酶的酶底物或者所述催化酶催化酶底物后的产物能够激活/抑制生物传感器的功能，所述生物传感器为步骤(c)中所述生长相关基因的调控分子，所述生物传感器的功能激活后能够促进生长相关基因的表达，需要说明的是，这里的催化酶催化所述酶底物后的产物在一定情况下，也可以作为另一种酶的底物，产物跟底物只是反映过程中的参照不同，不代表物质的最终状态。
89.根据本发明的具体实施方案，所述酶底物能激活生物传感器的功能，当所述生长相关基因为负筛选基因时，进化后催化所述酶底物能力更强酶，在所述生长胁迫环境下更能存活。
90.根据本发明的具体实施方案，所述催化酶催化酶底物后的产物能够激活生物传感器的功能，当所述生长相关基因为正筛选基因时，进化后催化所述酶底物能力更强酶，在所述生长胁迫环境下更能存活。
91.根据本发明的具体实施方案，所述进化酶包括选自合成酶、转移酶、氧化还原酶、水解酶中的任意一种。
92.根据本发明的具体实施方案，所述进化酶为合成酶，所述合成酶包括选自trna合成酶、谷氨酰胺合成酶、dna连接酶中的任意一种。
93.根据本发明的具体实施方案，所述进化酶为转移酶，所述转移酶包括选自甲基转移酶、谷氨酰转移酶中的任意一种。
94.根据本发明的具体实施方案，所述进化酶为氧化还原酶，所述氧化还原酶包括选自脱氢酶、过氧物酶、加氧酶、氧化酶中的任意一种。
95.根据本发明的具体实施方案，所述水解酶包括选自胰蛋白酶、核酸酶中的任意一种。
96.根据本发明的具体实施方案，所述酶底物能够进入酵母菌内。
97.根据本发明的具体实施方案，所述调控分子包括转录因子。
98.本发明第六方面提供一种自动进化液流装置，所述装置包括进样区、进化区、出样区、注射区，
99.其中，
100.所述进样区控制培养基进入进化区；
101.所述进化区与所述进样区相连，接收从所述进样区输入的培养基，所述进化区内含有利用上述生长耦联的酵母定向进化筛选方法、定向进化目标蛋白与第一蛋白互作能力的方法、定向进化目标蛋白与顺式作用元件互作能力的方法、定向进化目标蛋白与第二小分子物质互作能力的方法、定向进化酶催化能力的方法培养的酵母以及维持所述酵母生长状态的组件；
102.所述出样区与所述进化区相连，接收从所述进化区排出的培养基；
103.所述注射区与所述进化区相连，通过对所述进化区注射筛选用小分子物质达到筛选进化后的所述酵母的目的。
104.本发明提供的自动进化液流装置，可以使酵母长期生长在恒温培养箱中，开放式培养系统可进液出液，使酵母的生长维持在固定的生长阶段，培养基中可逐渐增加抗生素或其他调控生长的筛选用小分子，随着进化的进行，酵母的生长速度变快，可以加速进液和出液的速度，增添酵母生长的压力，从多角度对进化系统的进化压力进行调控。根据本发明的一些实施方案，所述培养基进入进化区的体积及速率作为生长胁迫的一部分。
105.根据本发明的具体实施方案，所述培养基进入进化区的体积及速率作为生长胁迫的一部分。
106.根据本发明的具体实施方案，进入所述进化区的筛选用小分子物质的体积及速率作为生长胁迫的一部分。
107.根据本发明的具体实施方案，所述筛选用小分子物质包括选自抗生素、异丙基硫代半乳糖苷、酵母反筛选药物中的至少一种。
108.本发明第七方面提供一种基因产物，所述基因产物由生长耦联的酵母定向进化筛选方法、定向进化目标蛋白与第一蛋白互作能力的方法、定向进化目标蛋白与顺式作用元件互作能力的方法、定向进化目标蛋白与第二小分子物质互作能力的方法、定向进化酶催化能力的方法或上述的装置筛选获得的酵母表达产生。
109.根据本发明的具体实施方案，所述基因产物为蛋白质或rna。
110.本发明第八方面提供编码上述基因产物的核酸分子。
111.本发明第九方面提供一种细胞，所述细胞包含上述基因产物和/或上述核酸分子。
112.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
113.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
114.图1显示了本发明一个实施例中生长耦联的酵母定向进化筛选流程示意图；
115.图2显示了本发明一个实施例中生长耦联的酵母定向进化筛选方法示意图；
116.图3显示了本发明一个实施例中生长耦联的酵母定向进化酶催化能力示意图；
117.图4显示了本发明一个实施例中自动进化液流装置简图；
118.图5显示了本发明实施例1中生长素对酵母生长的影响示意图，使用iptg浓度变化模拟蛋白质的进化水平，横轴表示iptg处理时间，单位为小时(h)，纵轴为od600的数值，不同标记的线表示不同的iptg处理浓度，单位为毫摩尔(mm)；
119.图6显示了本发明实施例1中5-foa对酵母生长的影响示意图，横轴表示5-foa处理浓度，单位为毫克每毫升(mg/ml)，纵轴为od600的数值；
120.图7a-7c显示了本发明实施例1中抗生素和抗生素抗性蛋白表达量对酵母生长的影响示意图，图7a表示g418，图7b表示hygbr，图7c表示bleor，横轴表示iptg处理时间，单位为小时(h)，纵轴为od600的数值，不同标记的线表示不同的iptg处理浓度，单位为毫摩尔(mm)，针对同种抗生素，使用6种不同的抗生素浓度，分别为0，0.05，0.1，0.2，0.5，1mg/ml；
121.图8a-8c显示了本发明实施例2中构建的3中质粒示意图，其中图8a表示p1质粒表达np868r-t7融合蛋白的整合质粒，图8b表示error-prone tp-dnapol表达质粒，图8c表示
t7启动子驱动的bleor基因表达质粒；
122.图9显示了本发明实施例2中np868r-t7融合蛋白人工进化流程，横轴表示进化时间，单位为天(days)，纵轴表示抗生素的浓度，单位为毫克每毫升(mg/ml)；
123.图10显示了本发明实施例2中np868r-t7融合蛋白的最终进化测序结果；
124.图11显示了本发明实施例2中使用rt-pcr方法对突变体进行转录方面的验证结果示意图；
125.图12显示了本发明实施例2中使用流失细胞分析术对突变体进行蛋白表达方面的验证的结果示意图，其中t7 wt表示突变前蛋白表达量化，t7648722表示突变后蛋白表达量；
126.图13显示了本发明实施例3中自动进化np868r-t7融合蛋白进化流程；
127.图14显示了本发明实施例3中自动进化np868r-t7融合蛋白最终进化测序结果图；
128.图15显示了本发明实施例3中使用流式细胞分析术对突变体进行表达方面的验证图，直方图的3个比较组中，wt表示突变前酵母，位于直方图比较组左侧；np868r-t7
q648lh772r
代表实施例2所得突变株，位于直方图比较组中间；np868r-t7
i244vq648lh772r
代表在实施例2的基础上新获得的突变株，位于直方图比较组右侧；
129.图16显示了本发明实施例4中正负筛选进化载体的构建方式示意图；
130.图17显示了本发明实施例4中正负筛选进化方法示意图；
131.图18显示了本发明实施例4中正负筛选流程示意图；
132.图19显示了本发明实施例5中蛋白质与小分子互作机理图；
133.图20显示了本发明实施例5中正负筛选流程示意图；
134.图21显示了本发明实施例5中使用流式细胞分析术统计突变体与核酸序列结合能力示意图，直方图的6个比较组中，wt表示突变前酵母，位于直方图比较组左侧；k54e代表一个位点的突变，位于直方图比较组中间；e103g代表又一位点的突变，位于直方图比较组右侧；
135.图22显示了本发明实施例5中使用流式细胞分析术统计突变体与乳酸结合能力示意图，直方图的3个比较组中，左侧代表当iptg浓度为0mm的情况，右侧代表当iptg浓度为20mm的情况。
具体实施方式
136.下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
137.需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
138.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
139.为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
140.在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
141.在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
142.在本文中，术语“融合蛋白”是指通过dna重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。
143.在本文中，术语“微流控”指使用微管道(尺寸为数十到数百微米)处理或操纵微小流体(体积为纳升到阿升)的系统所涉及的科学和技术。
144.在本文中，术语“5-氟乳清酸”(5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物；5-foa)用于酵母分子遗传学研究，检测ura3基因(编码乳清酸核苷-5'-单磷酸(omp)二羧化酶)的表达。具有ura3基因活性(ura+)的酵母可将5-foa转化为具有细胞毒性的氟脱氧尿苷。培养基中补充尿嘧啶时，只有ura3基因突变的酵母菌株才能在含有5-foa的培养基中生长。5-foa常用于酿酒酵母(ura3)、粟酒裂殖酵母(ura4和ura5)、白色念珠菌(ura3)和大肠杆菌(pyrf)实验。
145.在本文中，术语“异丙基-β-d-硫代半乳糖苷”(isopropyl-beta-d-thiogalactopyranoside，iptg)是一种有机物，化学式为c9h
18
o5s，是异乳糖模拟物，能够引起乳糖操纵子的转录过程，因此能够诱导乳糖操纵子下游基因对应蛋白的表达。
146.在本文中，术语“g418”(geneticin,遗传霉素)是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过抑制转座子tn601，tn5的基因，干扰80s核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常用的选择试剂。
147.在本文中，术语“hygbr”潮霉素b(hygromycin b)是由吸水链霉菌(streptomyces hygroscopicus)代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过干扰70s核糖体易位和诱导对mrna模板的错读而抑制蛋白合成，从而杀死原核(如细菌)、真核(如酵母菌，真菌)和高等哺乳动物真核细胞。
148.在本文中，术语“bleor”博来霉素，是由轮枝链霉菌(streptomyces verticillus)代谢产生的一种抗肿瘤糖肽抗生素大家族，该家族的成员目前使用比较多的是博莱霉素(bleomycin)家族和腐草霉素(phleomycin)家族，前者主要用做抗肿瘤化合物，与其他的抗癌剂联合使用，用于治疗淋巴瘤、鳞状细胞癌和睾丸癌等。后者主要用作分子遗传学研究中的一种选择性抗生素，用来筛选携带抗性基因sh ble等的稳定转染细胞。
149.在本文中，术语“np868r”源自非洲猪瘟病毒asfv，与mrna转录后修饰相关，可催化mrna加帽的过程。
150.在本文中，小分子物质是化学分子量小于900道尔顿的化合物，或者小单位的短肽或核酸。可通过自由扩散的方式进出酵母。文中提到的小分子主要有四类：第一小分子物质、第二小分子物质、第三小分子物质、筛选用小分子物质。其中，第一小分子物质是生长相关基因的调控分子，即可以直接影响生长相关基因表达与否/强弱的小分子，比如iptg和
laci结合、dapg与phlf结合、atc与tetr结合、木糖与xylr结合等，这里的iptg、dapg、atc、木糖即为前述第一小分子物质，这些第一小分子物质与后者结合后，会直接影响后者在dna上的结合情况；第二小分子物质是可以直接与待进化目标蛋白相互作用的小分子物质，其通过与目标蛋白结合来改变目标蛋白构象，进而影响目标蛋白与生长相关基因的调控分子的相互作用，达到影响生长相关基因表达与否/强弱的目的，比如神经递质、药物或激素的配体受体相互作用，例如β肾上腺素和β肾上腺素受体(β2ar)、五羟色胺和五羟色胺受体(5-htr)等，进化后的受体诱导下游信号通路的传导，例如camp/pka信号通路、jak/stat通路等，stat会诱导基因的表达，拮抗剂和蛋白质相互作用，例如adh-1(c22h34n8o6s2)和n钙粘蛋白(n-cadherin)，多种非单抗类小分子药物对pd-1/pd-l1的抑制等，进化pd-1/pd-l1，影响下游pi3k-akt信号通路，对foxo或creb等蛋白的修饰直接影响基因的表达，当生长相关基因的调控分子本身就是进化目标的时候，第一小分子物质就是第二小分子物质，如前所述，当需要定向进化目标蛋白与第二小分子物质结合能力，而第二小分子物质是iptg时，也就是第二小分子物质本身就是生长相关基因的调控分子时，这里的第二小分子物质可以与第一小分子物质部分重叠；第三小分子物质是指在生物反应过程中的中间产物，比如酶催化产物等，这类中间产物在特定条件下，可能会影响第一类小分子物质对所述生长相关基因的调控，比如糖酵解途径中，乳酸为最终产物，葡萄糖为起始底物，中间产物包括葡萄糖六磷酸、丙酮酸等的产量都有可能对乳酸的生产造成影响；第四类为筛选用小分子物质，主要是添加到酵母生长环境中，比如各种抗生素，使得最终存活的酵母的目标分子在胁迫环境下产生适应环境的突变。需要说明的是，特定情况下，所述第一小分子物质与所述第二小分子物质及所述筛选用小分子物质有部分重叠，比如抗生素、有毒物质等，例如，进化博来霉素抗性蛋白时，该蛋白既是生长相关基因，又是目标蛋白，因此博来霉素同时为第二小分子和筛选用小分子。
151.在本文中，术语“生物传感器”是由生物敏感元件(sensing element)与信号转换器(transducer)构成的分析装置，其中，生物敏感元件的作用是识别目标物质，主要包括：抗体、酶、核酸、细胞等生物物质，也包括一些类似于生物物质的合成的物质，如适配体(aptamer)、多肽(peptide)、mips聚合物(molecularly imprintedpolymers)；信号转换装置的作用是将生物敏感元件与目标分子之间的相互作用(interaction)转换成不同的信号，比如酶催化特定的物质发生化学反应，转换成电信号；生物抗体捕获特定的抗原，然后通过标记的荧光来转化成光信号。本文中的生物传感器是基于蛋白质的生物传感器，主要通过变构效应改变功能，或者形成多聚体的形式，感受到目标物质以后，通过变构效应或者形成多聚体的形式，影响下游报告基因的表达。
152.在本文中，术语“融合蛋白”是一种由至少两个结构域组成的蛋白质，这些结构域由单独的基因编码，这些基因已经连接在一起，因此它们作为一个单元被转录和翻译，从而产生一个多肽。
153.一种生长耦联的酵母定向进化筛选方法
154.根据本发明的一些实施方案，本发明提供一种生长耦联的酵母定向进化筛选方法，所述方法如图1所述，包括：
155.s110、构建包含目标序列的外源质粒；
156.s120、构建易错性dna聚合酶表达质粒；
157.s130、构建生长相关基因表达质粒；
158.s140、将步骤s110所述外源质粒、步骤s120所述易错性dna聚合酶表达质粒、步骤s130所述生长相关基因表达质粒转入酵母菌，
159.其中，被进化目标序列表达的生物大分子能够通过所述生长相关基因的调控分子来驱动/抑制步骤s130所述生长相关基因的表达，
160.s150、将所述酵母菌置于生长胁迫环境下，在所述生长胁迫环境下存活的酵母菌中含有的所述被进化目标序列为符合定向进化方向的目标序列。
161.根据本发明的一些实施方案，本发明提供一种生长耦联的酵母定向进化筛选方法。如图2所示，利用该方法所得的酵母包含一种携带细胞质线性质粒，tp-dnapol易错性dna聚合酶，多种可整合在基因组中的生长相关基因及其调控序列，调控序列与被进化生物大分子的功能发生耦联，诱导下游基因的表达与阻遏实现筛选富集的目的。该方法可用于进化筛选活性更强的酶、蛋白质与核酸的相互作用，蛋白质与蛋白质的相互作用，蛋白质多结构域之间的协同效应等。利用该方法进化得到的蛋白质或核酸功能发生改变，可反映在生长相关基因的表达上，可自动连续富集有利突变，因此，该方法可在自动化液流系统中使用，包括微流控系统。
162.根据本发明的一些实施方案，所有能影响酵母生长速率的可控因素，如抗生素的浓度，培养基的更换频率等，均可以作为此筛选方法的一部分，当所述可控因素作为本筛选方法一部分时，同时也在本发明的保护范围内。
163.根据本发明的一些实施方案，所示筛选压力可调节，包括增加/降低抗生素浓度，加快/减缓培养基更换频率、酵母菌流动速度，新增/减少抗生素种类等所有酵母筛选体系中的本领域已知的可变因素。
164.根据本发明的一些具体实施方案，进行酵母生长相关基因的筛选，可以先敲除掉酵母内源与生长相关的基因，并导入新的生长相关基因，以便精准获得所需的生长相关基因。
165.根据本发明的一些实施方案，本领域已知的任何与生长相关的基因，包括ura，leu，his，bleor，kanr，hygbr基因，可以单个基因使用，也可多个基因串联使用，无论是哪种使用方法，均可做为本筛选方法的一部分来使用，当所述生长相关基因做为本筛方法一部分时，同时也在本发明的保护范围内。
166.根据本发明的一些实施方案，本领域已知任何可使不同基因连接的方法，包括基因融合、基因串联的方法，如自剪切多肽2a(self-cleaving 2apeptide,2a)，当其做为本筛选方法的一部分，均受到本发明的保护。
167.根据本发明的一些具体实施方案，本领域已知的任何与生长相关的基因表达后，能与酵母特定生长环境相互作用并杀死酵母的，均可做为本发明的负筛选基因，例如具有ura3基因活性(ura+)的酵母可将5-foa转化为具有细胞毒性的氟脱氧尿苷，从而杀死酵母。
168.根据本发明的一些具体实施方案，本领域已知的任何与生长相关的基因表达后，能使酵母在特定生长环境下存活的基因，均可做为本发明的正筛选基因，例如具有kanr基因活性(kan+)的酵母可以在生长环境中具有kan抗生素的情况下存活。
169.根据本发明的一些具体实施方案，当所述负筛选基因与所述正筛选基因串联使用，且两基因的表达均受所述被进化目标序列表达的大分子调控时，改变相应的生长胁迫
压力，可实现同一酵母菌内的正负筛选的同时进行。
170.根据本发明的一些具体实施方案，利用本发明提供一种生长耦联的酵母定向进化筛选方法，当转入酵母菌内的所述生长相关基因及所述目标序列的基因在两个或两个以上时，仅需改变相应的生长胁迫压力，便可以实现多种目标序列的基因的同时进化。
171.根据本发明的一些实施方案，本发明提供一种生长耦联的酵母定向进化筛选方法，所进化的目标序列表达的生物大分子可以结合核酸序列，所述核酸序列可以是已知的自然界中存在的operator，也可以是自然界从来没有存在过的人工的operator。
172.根据本发明的一些实施方案，在培养时间足够久的情况下，所述生物大分子可以脱离原本结合的operator，去结合新的operator，例如，将有利的突变通过质粒提取再转染的方法，代代积累相传直至符合所述定向进化方向。
173.根据本发明的一些实施方案，本发明提供一种生长耦联的酵母定向进化筛选方法，所进化的目标序列表达的生物大分子可以结合蛋白，例如，利用酵母双杂交原理，ad和bd分别与目标蛋白融合表达，其中一个与所述外源质粒整合，另一个可以与所述外源质粒整合，也可以整合到酵母菌基因组上，优选为转到酵母菌基因组上，如果进化得到的目标蛋白之间有更强的相互作用，则ad和bd连接，进而启动下游生长相关基因的表达。
174.根据本发明的一些实施方案，所述bd为生长相关基因的启动子的上游激活序列的结合结构域，所述ad为生长相关基因的启动子的上游激活序列的激活结构域，所述上游激活序列为半乳糖代谢酶系gal基因启动子的上游激活序列(upstream activating sequence，uas)。
175.根据本发明的一些实施方案，所述包含目标序列的外源质粒，只要能转化进酵母菌内，均可以进行定向进化与筛选，而对目标序列长度并无明显限制。
176.根据本发明的一些实施方案，本发明提供一种生长耦联的酵母定向进化筛选方法，所进化的目标序列表达的生物大分子是可以催化化学反应的酶，例如，代谢过程中的催化酶，所述催化酶的催化产物，能诱导下游生长相关基因的表达。
177.根据本发明的一个具体的实施方案，本发明提供一种生长耦联的酵母定向进化筛选方法，所述方法能定向进化酶的催化能力，所述酶对应的核酸序列为所述目标序列，将所述酶催化的蛋白对应的核酸序列整合在酵母基因组中，与所述酶催化的蛋白的产物相互作用的分子作为所述生长相关基因的调控分子，其中，符合进化方向的酶，单位时间内在所述生长胁迫环境下能生长出更多的酵母。
178.根据本发明的一个更具体的实施方案，本发明提供一种生长耦联的酵母定向进化筛选方法，所述方法能定向进化酶的催化能力，例如，提高ectabc催化l-aspartate-β-semialdehyde(asa)的能力：halomonas elongata菌株有一条基因簇ectabc，可以将l-aspartate-β-semialdehyde(asa)催化成ectoine，ectb酶为其中关键的限速酶，进化后的ectb酶能产生更多中间产物l-2,4-diaminobutyric acid(daba)，进而提高ectoine的产量，arac-ect作为生物传感器可以来感受ectoine，同时arac-ect也是一种转录激活因子，当ectoine产量提高以后可以促进下游基因的表达(https://doi.org/10.1016/j.ymben.2015.05.004)。如图3所示，在本发明中，可将ectb或ectabc作为目标序列重组在细胞质p1质粒上，将arac-ect生物传感器与所述生长相关基因一起整合在基因组中，突变ectb或ectabc，使其产生更多的ectoine，可以与arac-ect共同诱导所述生长基因的表达，
使得酵母在生长基因对应的胁迫环境下得以存活。如果获得一种l-aspartate-β-semialdehyde(asa)的生物传感器，可通过感知asa的浓度变化影响生长相关基因的表达，例如当asa的浓度降低，生物传感器信号变弱，下游生长相关基因的表达降低，生长相关基因设计为毒性蛋白，毒性蛋白降低，酵母生长更好。
179.根据本发明的一个具体实施方案，本发明提供一种生长耦联的酵母定向进化筛选方法，所述方法能定向进化目标蛋白与第二小分子物质互作能力，当所述目标蛋白与所述第二小分子物质结合时，蛋白构象发生改变，进而使得蛋白与所述生长相关基因的调控分子结合能力更强或更弱，比如，当所述生长相关基因为抗生素抗性基因，所述生长相关基因的调控分子能使所述抗生素抗性基因表达时，符合定向进化方向的目标蛋白为与所述第二小分子物质结合后能进一步激活所述调控分子的功能的目标蛋白，反之亦然。
180.根据本发明的一个更具体的实施方案，本发明提供一种生长耦联的酵母定向进化筛选方法，所述方法能定向进化目标蛋白与第二小分子物质互作能力，所述定向进化目标蛋白一方面能与生长相关基因的调控序列结合，抑制所述生长相关基因的表达，另一方面能与所述第二小分子物质结合，当其与所述第二小分子物质结合时，蛋白构象发生改变，使得所述生长相关基因表达，通过调节生长胁迫环境的压力，使得所述蛋白与所述第二小分子的结合能力更强，符合进化方向的蛋白，使得酵母在所述生长胁迫环境下存活。
181.根据本发明的一个更具体的实施方案，本发明提供一种生长耦联的酵母定向进化筛选方法，所述方法能定向进化蛋白与第二小分子互作能力，例如，利用反向四环素控制转录激活系统(rtta)，其中，所述第二小分子物质为dox(四环素衍生物)，待进化的目标蛋白为rtta，是突变的tetr和vp16的融合蛋白，调控分子是tre(多个tetr的四环素反应元件串联组成)。当没有dox的时候，rtta不结合tre，当dox存在时，促进rtta结合在tre上，从而启动下游基因的表达。可以通过进化目标蛋白rtta与dox的结合能力，来提高酵母在所述生长胁迫环境下的存活能力。
182.根据本发明的又一具体实施方案，本发明提供一种生长耦联的酵母定向进化筛选方法，所述方法能定向进化蛋白与第二小分子互作能力，所述定向进化蛋白的能同时作用于两个或两个以上的生长相关基因的调控分子，当转入的生长相关基因同时包含正筛选基因及负筛选基因时，可以使得所述进化蛋白在进化与所述第二小分子互作能力的同时，也进化与所述调控分子的不同亲和力。
183.一种自动进化液流装置
184.根据本发明的一些实施方案，本发明提供一种自动进化液流装置，如图4所示，所述装置包括进样区、进化区、出样区、注射区；
185.其中，
186.所述进样区控制培养基进入进化区；
187.所述进化区与所述进样区相连，接收从所述进样区输入的培养基，所述进化区内包含有上述生长耦联的酵母及维持所述酵母生长状态的组件；
188.所述出样区与所述进化区相连，接收从所述进化区排出的培养基；
189.所述小分子注射区与所述进化区相连，通过对所述进化区注射筛选用小分子物质达到筛选进化后的所述酵母的目的。
190.根据本发明的一些实施方案，所述进化区包括维持酵母生长状态的组件，如维持
30℃的控温装置，磁力搅拌器，进化专用瓶，橡胶瓶塞，滤膜。
191.根据本发明的一些实施方案，所述培养基注射区和出样区包括：蠕动泵，多规格软管，多规格注射针头。
192.根据本发明的一些实施方案，所述注射区包括：注射泵，注射器，多规格软管，多规格注射针头。
193.根据本发明的一些具体实施方案，通过蠕动泵挤压空气将培养基从瓶中吸入进化区，可调节蠕动泵的速率控制培养基的流入体积，正筛选和负筛选需要的筛选用小分子可通过注射区进行注射，可通过注射泵控制流入小分子的体积，可通过流入体积和进化区中的进化瓶体积进行等比例配比，增加或减少培养基和筛选用小分子流入的量控制筛选压力。筛选用小分子浓度和流入培养基的速率都可作为调节筛选压力的一部分，相较手动进化，流入培养基的速率是自动化的特有优势。
194.根据本发明的一些实施方案，所述筛选用小分子物质包括选自抗生素、异丙基硫代半乳糖苷、酵母反筛选药物中的至少一种。
195.根据本发明的一些实施方案，所述培养基和筛选用小分子流入的量及流入速率可以通过微流控来控制。
196.下面将结合实施例对本公开的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本公开，而不应视为限定本公开的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，需说明的是，本技术实验所用的gay319酵母菌株，来源于uci大学(garc
í
a-garc
í
a,j.d.,et al.,using continuous directed evolution to improve enzymes for plant applications.plant physiol,2022.188(2):p.971-983.)。
197.实施例1酵母生长相关基因的筛选
198.1.营养标记基因的筛选
199.使用iptg诱导生长相关营养标记基因的表达模拟进化状态，得到的结果如图5所示，表明ura、leu在iptg诱导下，生长速率变化明显，可做为本发明生长耦联酵母筛选方法的一部分。需要说明的是，本实验是在iptg的诱导下进行的，当诱导剂不同时，筛选到的生长相关基因也可能有所不同，故而，不代表his基因不适用于本发明。
200.2.负筛选
201.在固定ura3表达量的情况下使用不同浓度的5-氟乳清酸(5-foa)处理酵母(gay319菌株)，得到的结果如图6所示，显示在酵母固定表达ura3的情况下，随着5-foa浓度的增高，对细胞的毒性更加明显的效果，可以作为负筛选使用。
202.3.抗性基因的筛选
203.使用iptg诱导生长相关营养标记基因的表达模拟进化状态，得到的结果如图7a到7c所示，所有的抗生素相关基因(g418,hygbr和bleor)都能够随目标蛋白的进化表现出逐渐增强的阻遏抗生素的效果，且随着抗生素浓度的变化，抗生素抗性基因的表达对酵母生长的影响情况不同，两种变量共同作用，对酵母生长产生协同影响。
204.本发明用不同iptg浓度诱导模拟目标蛋白进化的不同状态，当iptg浓度增高时，表示目标蛋白进化程度较高，离目标功能接近，能够更有效诱导下游生长相关基因的表达。
205.实施例2np868r-t7融合蛋白的进化
206.使用bleor为生长耦联的筛选压力，进化np868r-t7融合蛋白使其转录翻译活性增强。需要构建的质粒如图8a到8c所示，包括：p1质粒表达np868r-t7融合蛋白的整合质粒(图8a)，error-prone tp-dnapol表达质粒(购自addgene)(图8b)，t7启动子驱动的bleor基因表达质粒(图8c)三种质粒。
207.将上述三个质粒构建成功以后，转化入gay319菌株中，其中，p1质粒表达np868r-t7融合蛋白的整合质粒与gay319的基因组和p1质粒发生同源重组后整合到gay319菌株中。改造后的新菌株通过以下路径进行进化。
208.使用96孔板进行进化，每次进化设6组平行，每孔500ul菌液。最初进化的筛选压力为0.05mg/ml bleomycin，在进化了5天以后，如图9所示，其中一个孔生长速度明显加快，显示为进化成功，逐步提高筛选压力，直到抗生素浓度达到1mg/ml时，生长已达到最大速率，表示已经达到最大进化空间。
209.将最终得到的菌液进行p1质粒的提取，对提取后的质粒进行pcr后测序，发现两处点突变，如图10所示。
210.对突变体np868r-t7 q648lh772r
进行功能验证。使用rt-pcr和流式细胞分析仪进行分析，分别观察突变体的转录活性变化和蛋白表达变化，rt-pcr结果如图11所示(wt为突变前转录表达量，mut为突变后转录表达量)突变后转录表达量较突变前明显升高；流失细胞分析术对突变体前后蛋白表达方面的验证结果如图12所示(t7 wt表示突变前蛋白表达量化，t7648722表示突变后蛋白表达量)。从图11、图12中可看出，进化后的np868r-t7比未进化前在转录活性和蛋白质表达水平都有明显提高。
211.本发明可使用生长相关的基因的表达对目标蛋白的进化状态做筛选，可以实现生物体内的突变-筛选一体化。节省了挑选突变体、重新构建筛选系统、大规模筛选几个步骤。进化的最终产物在6个孔之内就能获得有利突变，相较传统的突变筛选方法可能需要上百个突变体的筛选，要方便很多。对于突变位点较少的蛋白，从设计目标蛋白突变载体与生长相关基因表达启动子开始到最终筛到有利突变所需时间大约一个月(构建载体1周，进化2-3周，验证筛选结果1周)，极大节省获得突变体的时间。
212.实施例3自动进化np868r-t7融合蛋白
213.将实施例2中得到的突变株作为本次实例的进化底物，使用自动化液流系统进行自动进化，流程如图13所示，通过为期半个月的自动进化，将最终培养体系中的菌液按照实例2中的质粒提取方式进行提取，pcr测序，如图14所示，获得一个新的突变位点，接着对突变体np868r-t7 i244vq648lh772r
进行功能验证，使用流式细胞分析仪进行分析，观察突变体的蛋白表达变化，结果如图15所示(直方图的3个比较组中，wt表示突变前酵母，位于直方图比较组左侧；np868r-t7
q648lh772r
代表实施例2所得突变株，位于直方图比较组中间；np868r-t7
i244vq648lh772r
代表在实施例2的基础上新获得的突变株，位于直方图比较组右侧)，从荧光结果可见，自动进化后得到的新的突变使蛋白质的表达功能增强。实验表明，在人工进化到最大筛选空间以后，自动进化系统可以继续提高筛选压力，使蛋白质的功能进一步增强，流速对酵母的生长也有一定的影响，也可作为筛选压力的一种。
214.自动进化液流系统增添了对培养基和小分子流动速率的控制，比人工进化的最高筛选压力更大，比人工传代的精度更高。在使用人工进化得不到有效结果的时候可以追加
自动进化方式。此方法无需对酵母进行工程改造，可以直接搭建自动化系统，从搭建到开始进化仅需1-2h。从开始进化到获得有利突变总时长不超过1个月。
215.实施例4正负筛选进化lmra蛋白
216.lmra是一种转录因子，可以同时结合在两段dna序列(operator)中。为了开发lmra为更好用的合成生物学元件，因此需要提高lmra的正交性。使lmra只结合一个operator，设计载体如图16所示。
217.正负筛选方法如图17所示，使用博来霉素抗性基因(bleor)为正筛选，使用乳清苷5-磷酸脱羧酶(ura)为负筛选。进化lmra与lmro有更强的结合能力与qaco有更弱的结合能力。将两段operator(lmro和qaco)插入标准启动子序列的非保守区，当lmra与lmro结合时，启动子不能驱动下游ura的表达，而ura可以分解底物五氟乳清酸(5-foa)为有毒物质五氟尿嘧啶(5-fu)，可能杀死酵母菌；当lmra与qaco结合时，启动子不能驱动bleor的表达，无法阻遏博来霉素杀死酵母。
218.正负筛选进化流程如图18所示，首先用0.5mg/ml的5-foa处理7天时间，当观察到酵母生长达到od600＝0.7-0.8时提高5-foa的浓度，可见，酵母生长加快，只需4天时间即可达到相同od值，接下来进行一次负筛选，后继续进行正筛选，仅需要1天的时间便可以生长达到od600＝0.7-0.8，接下来提高5-foa的浓度并同时添加bleomycin，在保持5-foa浓度的情况下不断提高bleomycin的浓度并观察酵母生长情况。当在最高浓度的bleomycin和5-foa的培养条件下，仍然可以在1天之内生长到所需od值，此时认为lmra的进化达到最大空间。
219.通过流式细胞分析仪对进化得到的结果进行验证，其他提取酵母线性质粒和pcr的流程皆与实施例2、实施例3相同。分别使用0mm iptg与20mm iptg对进化前后的lmra蛋白进行诱导表达，将两种培养状态下的荧光值相除，得到倍数值，进化结果倍数变化如表1所示。
220.表1
221.进化后的lmra命名为lmrad9。由表1可知，进化前后，lmra与qaco的结合强度减弱22倍，lmrad9与qaco的结合强度近乎消失；进化前后lmra与lmro的结合强度稍有下降，下降了1.6倍，但是影响不大；进化后lmrad9与两种operator的结合强度相差35倍，显著的拉大lmra与两种operator的结合能力，使lmra的正交性变得更好。
222.实施例5蛋白质与小分子互作
223.lldr是一种原核细胞中的乳酸代谢调控蛋白，lldr结合在启动子上的两个operator区域，抑制下游基因的表达，当乳酸与之结合后可以改变构象，使下游基因表达，为了构建乳酸生物传感器，使lldr对乳酸具有更强的灵敏度。
224.正负筛选方法如图19所示，使用博来霉素抗性基因(bleor)为正筛选，使用乳清苷5-磷酸脱羧酶(ura)为负筛选
225.正负筛选进化流程如图20所示：首先在含有20mm乳酸的环境中不断增加博来霉素的浓度做正筛选，从0.05mg/ml逐渐增加到0.8mg/ml，接下来在去掉乳酸的环境下加入0.5mg/ml 5-foa进行负筛选，并在正负筛选中反复进行两次，最后在20mm乳酸环境下使用1mg/ml的博来霉素做最后的正筛选，直到od值达到0.7左右。
226.突变后的酵母测序得到突变位点占比最大的两个位点k54e和e103g。通过流式细胞分析仪对进化得到的结果进行验证，其他提取酵母线性质粒和pcr的流程皆与实施例2、实施例3相同。在不加乳酸的情况下单独观察lldr与operator的结合能力：用0mm-20mm iptg分为6个浓度梯度，对进化前后的lldr蛋白进行诱导表达，结果如图21所示，表明进化后，大多数突变体丢失了一部分operator的结合能力。
227.通过流式细胞分析仪对进化得到的结果进行验证，其他提取酵母线性质粒和pcr的流程皆与实施例2、实施例3相同。在添加乳酸的情况下，观察lldr两个突变体对乳酸的响应情况：分别使用0mm iptg与20mm iptg对进化前后的lldr蛋白进行诱导表达，结果如图22所示，表明进化后，k54e突变体在对乳酸的感受方面有一定的提升。
228.本次进化得到了与乳酸结合能力更强的生物传感器lldr，但是整体结果有改进空间，与operator结合能力的丢失可能由于进化过程存在一定的问题，可能因为使用的负筛选浓度较低。但是经过资料检索和建模的分析，如果想进化得到对乳酸感受能力更强的生物传感器，构象的改变一定会导致丢掉一部分operator的结合功能。
229.本发明首次的将正负筛选同时应用，在体系中同时添加两种小分子，实现正负筛选对目标蛋白进行同时筛选，正负筛选系统的转换非常便捷，只需将所有进化相关基因全部转入同一个酵母菌株中，不需要准备多种转化用工程菌，只需组合使用不同的小分子处理单一菌株即可完成正负双重筛选。正负筛选可以同时进行，多种小分子使用不同的浓度配比进行处理，操作简单，极大的节省进化流程，节省人力和时间成本。
230.相较于传统的进化方法，主要用来进化酶类，本发明可用于进化更加多样的蛋白质。可用于进化突变后表型不外显的蛋白质，例如蛋白质与蛋白质的相互作用、蛋白质与小分子的相互作用、蛋白质与dna的相互作用，膜外蛋白互作，蛋白质生物传感器等等。由于本发明可将蛋白质的功能转化成诱导其他基因的表达，所以可以间接将蛋白质的表型显露出来，使用酵母的生长作为表现形式。进化后的蛋白质功能可成倍发生变化，最大可达到几十倍。
231.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一些实施方案”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
232.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

技术特征：
1.一种生长耦联的酵母定向进化筛选方法，其特征在于，所述方法包括：(a)、构建包含目标序列的外源质粒；(b)、构建易错性dna聚合酶表达质粒；(c)、构建生长相关基因表达质粒；(d)、将步骤(a)所述外源质粒、步骤(b)所述易错性dna聚合酶表达质粒、步骤(c)所述生长相关基因表达质粒转入酵母菌，其中，被进化目标序列表达的生物大分子能够通过所述生长相关基因的调控分子来驱动/抑制步骤(c)所述生长相关基因的表达，(e)将所述酵母菌置于生长胁迫环境下，在所述生长胁迫环境下存活的酵母菌中含有的所述被进化目标序列为符合定向进化方向的目标序列。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标序列包括一个或一个以上的基因的序列的至少一部分；任选地，所述生物大分子为蛋白质，所述蛋白质包括由单个基因表达的蛋白质或多个基因共同表达的融合蛋白；任选地，所述蛋白质的分子量为4-400kd；任选地，所述蛋白质的分子量为8-200kd；任选地，所述蛋白质包括选自酶、受体、转录调节因子中的任意一种，或者，所述蛋白质包括酶、受体、转录调节因子中的任意蛋白质组成的融合蛋白；任选地，所述酶包括具有催化活性的酶或与基因表达相关的酶；任选地，所述与基因表达相关的酶包括选自dna聚合酶、转录酶、基因编辑酶、加帽酶及与表观遗传修饰相关的酶；任选地，所述基因编辑酶包括选自cas9、cas12等cas家族蛋白、zfp、talen中的至少之一；任选地，所述与表观遗传修饰相关的酶包括选自组蛋白乙酰转移酶或去乙酰化酶、组蛋白甲基转移酶或去甲基化酶、泛素化酶或脱泛素化酶、dna甲基化酶或去甲基化酶中的至少之一；任选地，所述受体包括选自膜受体、细胞质受体、细胞核受体中的至少之一；任选地，所述受体为膜受体，所述膜受体包括选自离子通道形受体、g蛋白偶联受体、酪氨酸激酶偶联受体中的任意一种；任选地，所述转录调节因子包括选自lysr、arac/xyls、tetr、luxr、laci、arsr、icir、merr、asnc、marr、ntrc(ebp)、ompr、deor、coldshock、gntr、crp、c2h2、bzip、基于dcas9、基于zfp、基于talen的转录调节因子中的至少之一。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源质粒源自非宿主真核生物的细胞质线性质粒；任选地，所述非宿主真核生物包括乳酸克鲁维酵母。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生长相关基因包括选自抗生素抗性基因、营养标记基因中的至少之一。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗生素抗性基因包括选自博莱霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、诺尔斯菌素基因、两性霉素基因中的至少之
一；任选地，所述营养标记基因包括选自ura、leu、his、ade2、trp1、met17中的至少之一。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(e)进一步包括：(1)所述生长相关基因表达使得所述酵母菌死亡作为负筛选，所述生长相关基因表达使得所述酵母菌存活作为正筛选，通过所述负筛选和/或正筛选的过程，获得含有符合定向进化方向的目标序列的酵母菌；(2)基于步骤(1)中的酵母菌获得所述符合定向进化方向的目标序列，其中，表达使得所述酵母菌死亡的生长相关基因为负筛选基因，表达使得所述酵母存活的生长相关基因为正筛选基因。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(e)中，在所述生长胁迫环境下，对所述酵母菌同时进行负筛选和正筛选，其中，所述负筛选和所述正筛选的筛选压力可调节。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述易错性dna聚合酶和所述外源质粒源自同一物种；任选地，所述易错性dna聚合酶仅作用于所述外源质粒进行易错复制。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母包括选自酿酒酵母、奇异酵母、贝酵母、里约酵母、巴斯德酵母中的至少之一；任选地，所述酵母为酿酒酵母。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生长相关基因的调控分子包括选自蛋白、核酸、第一小分子物质中的任意一种；任选地，所述核酸包括dna序列；任选地，所述dna序列包括选自启动子、绝缘子、增强子中的至少之一；任选地，所述第一小分子物质包括选自抗生素、酶底物、短肽、寡肽、糖类、脂类、维生素、无机物、生物碱、代谢物中的至少之一。11.一种定向进化目标蛋白与第一蛋白互作能力的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求1-10中任一项所述的方法培养并筛选酵母，基于在所述生长胁迫环境下存活的酵母菌，获得与所述第一蛋白具有互作能力或互作能力提升或下降的目标蛋白，其中，所述目标蛋白与步骤(d)中所述生长相关基因的转录因子的bd融合表达形成第一融合蛋白，所述第一蛋白与所述生长相关基因的转录因子的ad融合表达形成第二融合蛋白；或所述目标蛋白与步骤(d)中所述生长相关基因的转录因子的ad融合表达形成第一融合蛋白，所述第一蛋白与所述生长相关基因的转录因子的bd融合表达形成第二融合蛋白，其中，所述bd为生长相关基因的启动子的上游激活序列的结合结构域，所述ad为生长相关基因的启动子的上游激活序列的激活结构域。12.一种定向进化目标蛋白与顺式作用元件互作能力的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求1-10中任一项所述的方法培养并筛选酵母，基于在所述生长胁迫环境下存活的酵母菌，获得与所述顺式作用元件具有互作能力或互作能力提升或下降的目标蛋白，
其中，所述顺式作用元件在步骤(c)中所述生长相关基因表达质粒上，所述顺式作用元件为所述生长相关基因的顺式作用元件；表达所述目标蛋白的序列为步骤(a)中所述目标序列。13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白包括选自转录因子、组蛋白、dna甲基化酶、基因编辑酶、dna结合蛋白中的至少之一。14.一种定向进化目标蛋白与第二小分子物质互作能力的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求1-10中任一项所述的方法培养并筛选酵母，基于在所述生长胁迫环境下存活的酵母菌，获得与所述第二小分子物质具有互作能力或互作能力提升或下降的目标蛋白，其中，表达所述目标蛋白的序列为步骤(a)中所述目标序列，所述第二小分子物质为所述生长相关基因的表达与否及表达强弱的开关。15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述第二小分子物质促进/抑制所述目标蛋白与所述生长相关基因的调控分子的结合；任选地，所述目标蛋白至少包含两个结合位点；任选地，所述目标蛋白的第一结合位点与所述第二小分子物质结合后，开启/关闭所述目标蛋白的第二结合位点与所述生长相关基因的调控分子的结合；任选地，所述目标蛋白的第一结合位点与所述第二小分子物质结合后，增强/减弱所述目标蛋白的第二结合位点与所述生长相关基因的调控分子的结合；任选地，所述第一结合位点与所述第二结合位点相同或不同；任选地，所述第二小分子物质包括选自抗生素、酶底物、寡肽、糖类、脂类、维生素、无机物、生物碱、激素、寡核苷酸、金属离子、短肽、药物分子、代谢物中的至少之一。16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述调控分子包括dna序列或转录因子；任选地，所述dna序列包括选自乳糖操纵子、木糖操纵子、四环素操纵子中的任意一种；任选地，所述转录因子包括laci、xylr、tetr中的任意一种。17.一种定向进化酶催化能力的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求1-10中任一项所述的方法培养并筛选酵母，基于在所述生长胁迫环境下存活的酵母菌，获得符合定向进化方向的催化酶，其中，表达所述催化酶的核酸序列为步骤(a)中所述的目标序列，所述催化酶的酶底物或者所述催化酶催化酶底物后的产物能够激活/抑制生物传感器的功能，所述生物传感器为步骤(c)中所述生长相关基因的调控分子，所述生物传感器的功能激活后能够促进生长相关基因的表达。18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述进化酶包括选自合成酶、转移酶、氧化还原酶、水解酶中的任意一种；任选地，所述进化酶为合成酶，所述合成酶包括选自trna合成酶、谷氨酰胺合成酶、dna连接酶中的任意一种；任选地，所述进化酶为转移酶，所述转移酶包括选自甲基转移酶、谷氨酰转移酶中的任意一种；
任选地，所述进化酶为氧化还原酶，所述氧化还原酶包括选自脱氢酶、过氧物酶、加氧酶、氧化酶中的任意一种；任选地，所述水解酶包括选自胰蛋白酶、核酸酶中的任意一种。19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述酶底物能够进入酵母菌内。20.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述调控分子包括选自转录因子。21.一种自动进化液流装置，其特征在于，所述装置包括进样区、进化区、出样区、注射区，其中，所述进样区控制培养基进入进化区；所述进化区与所述进样区相连，接收从所述进样区输入的培养基，所述进化区内含有利用权利要求1-10中任一项所述的生长耦联的酵母定向进化筛选方法、权利要求11所述的定向进化目标蛋白与第一蛋白互作能力的方法、权利要求12或13所述的定向进化目标蛋白与顺式作用元件互作能力的方法、权利要求14-16任一项所述的定向进化目标蛋白与第二小分子物质互作能力的方法、权利要求17-20任一项所述的定向进化酶催化能力的方法培养的酵母以及维持所述酵母生长状态的组件；所述出样区与所述进化区相连，接收从所述进化区排出的培养基；所述注射区与所述进化区相连，通过对所述进化区注射筛选用小分子物质达到筛选进化后的所述酵母的目的。22.根据权利要求21所述的装置，其特征在于，所述培养基进入进化区的体积及速率作为生长胁迫的一部分。23.根据权利要求22所述的装置，其特征在于，进入所述进化区的筛选用小分子物质的体积及速率作为生长胁迫的一部分；任选地，所述筛选用小分子物质包括选自抗生素、异丙基硫代半乳糖苷、酵母反筛选药物中的至少一种。24.一种基因产物，其特征在于，由权利要求1-10中任一项所述的生长耦联的酵母定向进化筛选方法、权利要求11所述的定向进化目标蛋白与第一蛋白互作能力的方法、权利要求12或13所述的定向进化目标蛋白与顺式作用元件互作能力的方法、权利要求14-16任一项所述的定向进化目标蛋白与第二小分子物质互作能力的方法、权利要求17-20任一项所述的定向进化酶催化能力的方法或权利要求21-23中任一项所述的装置筛选获得的酵母表达产生。25.根据权利要求24所述的基因产物，其特征在于，所述基因产物为蛋白质或rna。26.编码权利要求24或25所述的基因产物的核酸分子。27.一种细胞，其特征在于，包含权利要求24或25所述的基因产物和/或权利要求26所述的核酸分子。

技术总结
本发明涉及定向进化技术领域，具体涉及一种生长耦联的酵母定向进化筛选方法、装置及应用。本发明所提供的生长耦联的酵母，包含一种携带细胞质线性质粒、TP-DNApol易错性DNA聚合酶、多种可整合在基因组中的生长相关基因及其调控分子的酵母。调控分子与被进化生物大分子的功能发生耦联，诱导下游基因的表达与阻遏实现筛选富集的目的，利用本发明提供的方法，可进化更多种类的蛋白，可在同一体系内实现被进化蛋白的正负筛选，并可实现对进化的菌株自动化筛选，较传统方法而言，操作简单，极大的节省进化流程，节省人力和时间成本。节省人力和时间成本。节省人力和时间成本。


技术研发人员：张数一 沈达
受保护的技术使用者：清华大学
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/9/22