基于海洋食品危害物数据库的免疫原结构模拟技术

1.本发明涉及检测技术领域，尤其涉及基于海洋食品危害物数据库的一种用于免疫分析的恩诺沙星完全抗原以及其单克隆抗体的制备与开发技术。


背景技术：

2.氟喹诺酮类(fluoroquinolones)为一族人工合成的杀菌性抗菌药物，属第3代喹诺酮类药物，广泛用于水产及畜禽养殖，现已经成为我国常用的渔药和兽药之一。恩诺沙星(enrofloxacin)又名乙基环丙沙星，是氟喹诺酮类药物的典型代表之一。由于氟喹诺酮类药物同时也应用于人类多种感染性疾病的治疗，关于该药物在临床应用时所产生的耐药性、残留毒性以及不良反应的报道越来越多，在食品中的残留的监测也引起人们的重视。
3.欧盟、美国、日韩等国家和地区对恩诺沙星在水产品中的使用和残留限量都有明确的标准。我国在农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中做出了对液态奶中恩诺沙星和环丙沙星的最高残留限量(mrl)的明确规定。同时，在《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》(gb 31650-2019)中规定恩诺沙星的adi(每日允许摄入量)为0～6.2μg/kg。
4.4.1.41恩诺沙星(enrofloxacin)
5.41.41.1兽药分类：喹诺酮类合成抗菌药。
6.4.1.41.2 adi：0-6.2μg/kg体重。
7.4.1.41.3残留标志物：恩诺沙星与环丙沙星之和(sum of enrofloxacin and ciprofloxacm)。
8.4.1.41.4最大残留限量：应符合表41的规定。
9.表41
[0010][0011]
目前，恩诺沙星的检测方法主要有高效液相色谱法、毛细血管电泳法、荧光光度
法、化学发光分析法及电化学分析法等。这些分析方法存在很多问题，比如，高效液相色谱法与毛细血管电泳法具有较高的准确度，但仪器昂贵，分析灵敏度低；荧光光度法与化学发光法虽然具有较高的灵敏度，但是其需要特殊试剂且方法的选择性较差；电化学分析法通常需对电极界面进行修饰，导致检测过程费时，且分析的重现性也较差。而免疫检测具有简单、快速、价格低廉、适用于现场检测等优点，是快速检测过程中最常用的一种方法，因而，研发出适用于现场快速检测且低成本的农兽药残留检测方法十分必要。
[0012]
免疫检测方法的发展一般遵循完全抗原合成、完全抗原蛋白偶联和抗体形成三个步骤，其中完全抗原合成和单克隆抗体制备通常被认为是关键步骤。如何制备出安全、高效、简便的恩诺沙星完全抗原合成方法，仍需进一步研究；如何制备稳定性强、灵敏度高、特异性好的单克隆抗体，也需进一步探索。


技术实现要素：

[0013]
本发明的目的正是基于上述现有技术状况提供一种基于海洋食品危害物数据库的恩诺沙星完全抗原的制备方法并提供一株分泌恩诺沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0014]
本发明的具体技术方案为：
[0015]
本发明提供了一种恩诺沙星完全抗原的制备方法，是用碳二亚胺法得到，其分子结构式为：
[0016][0017]
恩诺沙星完全抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0018]
取半抗原、nhs、edc以6:19:16的比例溶于适量dmf中，其中半抗原12g，室温振荡20℃左右(80-110rpm)过夜；4000r/min离心40s，取上清液50μl，加入2ml含5mg载体蛋白的pbs溶液(预先溶有33％的dmf)，室温振荡1.5h；4000r/min离心40s，取上清液50μl，加入2ml含bsa的pbs溶液(预先溶有33％的dmf)，恒温振荡过夜(110r/min、4℃)；将反应物装入透析带中，用含33％dmf的pbs溶液透析，逐步减少pbs中dmf的用量至完全使用pbs，透析完全后冻干，-80℃保存。
[0019]
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
[0020]
(1)本发明参考恩诺沙星的合成路线及相关文献，提供了一种恩诺沙星完全抗原合成方法，与现有技术中的恩诺沙星完全抗原相比，本发明方法更安全、高效、简便的。此外，基于海洋食品危害物数据库，该改造过程保留了大部分官能团的完整，它们比现有技术中的完全抗原具有更高的结构保真度，因此更具特异性，也为氟喹诺酮类完全原改造提供了设计思路。
[0021]
(2)本发明提供了一种新的免疫原的合成方法，合成步骤更加简化、有效，为今后
人们的研究提供了合成免疫原的思路与方法。
[0022]
(3)本发明获得的恩诺沙星单克隆抗体，对恩诺沙星有较好的检测灵敏度(ic
50
值为15.28ng/ml)，对其他氟喹诺酮类农兽药无明显交叉反应，显示出极强的特异性。
[0023]
(4)本发明可实现对食品中恩诺沙星残留量的检测，为食品中恩诺沙星药物残留的免疫检测提供参考和技术支持。
[0024]
(5)引入算法软件，匹配恩诺沙星的合成原理和方法，模拟其与蛋白质等大分子载体偶联、形成人工合成的完全抗原的过程，指导恩诺沙星完全抗体的实际研制和开发。拟引入的算法软件主要有fastone、极视角等。
具体实施方式
[0025]
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。
[0026]
总实施例
[0027]
用于免疫分析的恩诺沙星，其分子结构式为：
[0028][0029]
恩诺沙星小分子化学物质本身是半抗原，只有反应原性而没有免疫原性，不能引起免疫反应，所以实验必须首先制备完全抗原。利用chemdraw等软件确定其结构，将其能量最小化，并通过在小分子物质部分基团上连接衍生手臂等方式制备出与原小分子手性结构一样的半抗原单体；并对其进行性能测试，能够满足一定的要求，为后续进一步研究提供参考。
[0030]
恩诺沙星完全抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0031]
取半抗原、nhs、edc以6:19:16的比例溶于适量dmf中，室温振荡20℃左右(80-110rpm)过夜；4000r/min离心40s，取上清液50μl，加入2ml含5mg载体蛋白的pbs溶液(预先溶有33％的dmf)，室温振荡1.5h；4000r/min离心40s，取上清液50μl，加入2ml含bsa的pbs溶液(预先溶有33％的dmf)，恒温振荡过夜(110r/min、4℃)；将反应物装入透析带中，用含33％dmf的pbs溶液透析，逐步减少pbs中dmf的用量至完全使用pbs，透析完全后冻干，-80℃保存。
[0032]
恩诺沙星单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0033]
(1)免疫小鼠的获得：对一批小鼠腹腔分多次注射恩诺沙星完全抗原，每次间隔14天；每只小鼠每次的免疫用量为100μg/0.05ml。其中，第一次注射的同时注射等量的完全弗氏佐剂；后续的注射用不完全弗氏佐剂代替完全弗氏佐剂；除首次注射外，小鼠均于每次注射后7天从小鼠尾静脉采血，以监测抗血清的效价；用酶联免疫法和间接竞争酶联免疫法测定各小鼠抗血清性能，以此确定是否有针对免疫抗原的抗体生成。
[0034]
(2)单克隆细胞制备：在冲刺免疫三天后，综合评价三组小鼠每组各个老鼠的血清效价以及其对恩诺沙星的特异性识别情况，选择每组中对恩诺沙星抑制效果最好的小鼠进行脾细胞与骨髓瘤细胞的融合，于37℃5％co2培养箱中培养；一周后半量换成hat培养液，两周后半量换成ht培养液对融合细胞进行培养；在扩大培养的过程中采用酶联免疫吸附和间接酶联免疫吸附测定细胞性能；选择性能好的细胞孔进行亚克隆，最终确定单克隆细胞株。
[0035]
(3)单克隆抗体制备：将单克隆细胞注射到小鼠腹腔内，取得小鼠腹水后进行蛋白a柱纯化处理制得单克隆抗体。
[0036]
具体实施例
[0037]
材料
[0038]
试剂：恩诺沙星标准品，含量99％，中国兽医药品监察所；完全弗氏佐剂(cfa)，不完全弗氏佐剂(ifa)，sigma公司；edc(1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)，sigma公司；二氧化硅凝胶(125～150μm)是购自上海阿拉丁生化科技有限公司有限公司(中国上海)；半抗原合成及与载体蛋白偶联的化学物质，牛血清白蛋白(bsa)、辣根过氧化物酶(hrp)，1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)；dmem培养基购自上海源培生物科技股份有限公司；hat培养液、ht培养液添加剂购自美国gibco公司；氨基喋呤、peg1500购自sigma-aldrich chemical co.(密尔沃基，美国)。
[0039]
实验动物：balb/c小鼠，山东大学模式动物研究中心动物房。
[0040]
仪器：酶联免疫吸附试验(elisas)在96孔板(3655号)中进行，这些微效板购自thermo fisher科学公司(马萨诸塞州沃尔瑟姆，美国)，用酶标仪读取吸光度。质谱和核磁共振(nmr)分析在青岛海洋生物医学研究所进行：uhplc-三重四极质谱仪(1290infinityii uhplc/6460qqq ms)和核磁共振光谱仪(pro pulse 500mhz)均来自安捷伦(美国)。核磁共振波谱仪(pro pulse 500mhz，agilent，usa)。maldi-tof分析在齐鲁理工大学(山东科学院)山东分析测试中心进行：rapiflex maldi-tof/tof来自德国bruker公司。
[0041]
算法提供：所有数据由originlab(马萨诸塞州北安普顿，美国)的origin 9.0、cambridgesoft(马萨诸塞州，美国)的chemdraw和chem3d制作。
[0042]
检测方法
[0043]
elisa程序：
[0044]
采用双抗体夹心elisa法检测其效价，方法与ferencszurdoki等报道的方法相同。96孔微量滴定板中加入10μg/毫升溶解在碳酸缓冲溶液(0.1m，ph值9.6，cbs)中的包被抗原，在37℃下孵育120min。用甲醇-pbs混合液(50∶50，v∶v)将抗血清稀释至不同浓度，加入孔中，37℃孵育1.5h。pbst洗3次，最后一次在吸水纸上拍干，每个微孔加入100μl羊抗鼠免疫球蛋白辣根过氧化物酶共轭物(pbs 1∶5000稀释)，37℃孵育120min。pbst洗3次，最后一次在吸水纸上拍干，每个微孔加入100μl底物显色液，37℃孵育10min，在490nm下测定光密度值(od)。elisa中阴性对照用阴性血清代替抗血清，空白对照用pbs代替抗血清。
[0045]
实施例1：恩诺沙星完全抗原的合成
[0046]
通过运用swiss-model、rossttafold等数据软件对海洋危害物分子信息资源库中半抗原的结构进行同源建模与深入学习，积累丰富的数据模型，据此获得适宜的载体蛋白，得到一系列小分子半抗原与载体蛋白化学偶联的方法及原理，通过autoduck vina进行分
子对接，将柔性的小分子物质转化半柔性的抗原，偶联后的产物偶联率均一稳定且易于纯化分离。
[0047]
恩诺沙星半抗原具有活性官能团羧基，为使免疫动物产生针对半抗原的抗体，需要将半抗原与载体蛋白结合，使用较为成熟的碳二亚胺法进行恩诺沙星完全抗原的制备，将羧基与载体蛋白进行连接，具体实验步骤如下：
[0048]
1.取半抗原、nhs、edc以6:19:16的比例溶于适量dmf中，室温振荡20℃左右(80-110rpm)过夜。
[0049]
2.4000r/min离心40s，取上清液50μl，加入2ml含5mg载体蛋白的pbs溶液(预先溶有33％的dmf)，室温振荡90min。
[0050]
3.4000r/min离心40s，取上清液50μl，加入2ml含bsa的pbs溶液(预先溶有33％的dmf)，恒温振荡过夜(110r/min、4℃)。
[0051]
4.将反应物装入透析带中，用含33％dmf的pbs溶液透析，逐步减少pbs中dmf的用量至完全使用pbs，透析完全后冻干，-80℃保存。
[0052]
实施例2：恩诺沙星单克隆抗体的制备
[0053]
(1)免疫小鼠的获得：对一批小鼠腹腔分多次注射恩诺沙星完全抗原，每次间隔14天，每只小鼠每次的免疫用量为100μg/0.05ml；200μl浓度为1毫克/毫升的恩诺沙星完全抗原以及完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂。其中，第一次注射的同时注射完全弗氏佐剂；后续的注射用不完全弗氏佐剂代替完全弗氏佐剂；除首次注射外，小鼠均于每次注射后7天从小鼠尾静脉采血，以监测抗血清的效价；用酶联免疫法和间接竞争酶联免疫法测定各小鼠抗血清性能。
[0054]
(2)单克隆细胞制备：在冲刺免疫三天后，综合评价三组小鼠每组各个老鼠的血清效价以及其对恩诺沙星的特异性识别情况，选择每组中对恩诺沙星抑制效果最好的小鼠进行脾细胞与骨髓瘤细胞的融合。
[0055]
a)将两种细胞按照脾细胞：骨髓瘤细胞＝5:1～10:1的比例混合均匀，去除细胞聚团；把混合后的细胞悬液离心(1000r/min，5分钟)，离心结束后倒掉离心管中的上清液，将离心管底部的细胞轻轻弹散，使底部细胞略微分散；
[0056]
b)在37℃水浴锅中将peg1500、dmem完全培养基预热，使用灭菌过的滴管将1ml的peg1500溶液加入到混合细胞的离心管中，完毕后将离心管放入37℃水浴锅中孵育3分钟后取出；
[0057]
c)将预热过的完全培养基加入到混合细胞的离心管中，首先应该在1分钟内加完1ml的dmem完全培养基，其次加培养基的速逐渐加快直到5分钟内加完10ml，最后，在培养基加入量在15ml～25ml时可以将其一次性加到50ml，通过观察体系中是否絮状沉淀可以初步判断细胞融合是否成功；
[0058]
d)将整个50ml离心管放在37℃的co2培养箱里面，孵育30分钟后取出并观察溶液状态；
[0059]
e)孵育结束后，取出融合液体并将该离心置于1000r/min条件下离心5分钟，离心结束后将上清液去除并轻敲底部沉淀。
[0060]
f)配置hat培养基：dmem完全培养基：氨基喋呤＝50：1。采用梯度稀释的方法将细胞铺满96孔培养板并将其放置于37℃的co2培养箱里面，定期观察细胞状态，及时更换培养
基。
[0061]
(3)单克隆细胞性能测定：在扩大培养的过程中采用酶联免疫吸附和间接酶联免疫吸附测定细胞性能；选择性能好的细胞孔进行亚克隆，测定单克隆抗体的亚型、特异性及灵敏度，最终确定单克隆细胞株。
[0062]
(4)单克隆抗体制备：将单克隆细胞注射到小鼠腹腔内，取得小鼠腹水后进行蛋白a柱纯化处理制得单克隆抗体。
[0063]
实施例3：恩诺沙星单克隆抗体的应用
[0064]
将实施例3得到的单克隆抗体应用于恩诺沙星的elisa检测试验，具体步骤如下：
[0065]
(1)elisa程序：采用双抗体夹心elisa法检测其效价，方法与ferenc szurdoki等报道的方法相同；
[0066]
(2)96孔微量滴定板中加入10μg/ml溶解在碳酸缓冲溶液(0.1m，ph值9.6，cbs)中的包被抗原，在37℃下孵育120min。
[0067]
(3)用甲醇-pbs混合液(10∶90，v∶v)将抗血清稀释至不同浓度，加入孔中，37℃孵育90min；
[0068]
(4)pbst洗3次，每个微孔加入100μl羊抗鼠免疫球蛋白辣根过氧化物酶共轭物(pbs 1∶5000稀释)，37℃孵育120min；
[0069]
(5)pbst洗3次，每个微孔加入100μl底物显色液，37℃孵育10min，在490nm下测定光密度值(od)；
[0070]
(6)elisa中阴性对照用阴性血清代替抗血清，空白对照用pbs代替抗血清。
[0071]
采用ic-elisa检测对恩诺沙星的灵敏度，得到ic-elisa测定单克隆抗体对恩诺沙星的ic
50
为15.28ng/ml，说明对恩诺沙星有很好的灵敏度，可用于恩诺沙星免疫分析检测。
[0072]
结果与讨论
[0073]
本发明设计了一种恩诺沙星完全抗原合成方法，与现有技术中的恩诺沙星完全抗原相比，本发明方法更安全、高效、简便的。此外，该改造过程保留了大部分官能团的完整，它们比现有技术中的完全抗原具有更高的结构保真度，因此更具特异性，也为氟喹诺酮类完全抗原改造提供了设计思路。
[0074]
本发明获得的恩诺沙星单克隆抗体，对恩诺沙星有较好的检测灵敏度(ic
50
值为15.28ng/ml)，对其他氟喹诺酮类农兽药无明显交叉反应，显示出极强的特异性，可实现对食品中恩诺沙星残留量的检测，为食品中恩诺沙星药物残留的免疫检测提供参考和技术支持。
[0075]
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0076]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

技术特征：
1.一种海洋食品危害物(以恩诺沙星为例)抗原的结构模拟与合成，其特征在于通过运用swiss-model、rossttafold等数据软件对海洋危害物分子信息资源库中半抗原的结构进行同源建模与深入学习，积累丰富的数据模型，据此获得适宜的载体蛋白，得到一系列小分子半抗原与载体蛋白化学偶联的方法及原理，通过autoduckvina进行分子对接，将柔性的小分子物质转化半柔性的抗原，偶联后的产物偶联率均一稳定且易于纯化分离，具体过程如下：取半抗原、nhs、edc以6:19:16的比例溶于适量dmf中，其中半抗原12g，室温振荡20℃左右(80-110rpm)过夜；4000r/min离心40s，取上清液50μl，加入2ml含5mg载体蛋白的pbs溶液(预先溶有33％的dmf)，室温振荡1.5h；4000r/min离心40s，取上清液50μl，加入2ml含bsa的pbs溶液(预先溶有33％的dmf)，恒温振荡过夜(110r/min、4℃)；将反应物装入透析带中，用含33％dmf的pbs溶液透析，逐步减少pbs中dmf的用量至完全使用pbs，透析完全后冻干，-80℃保存。2.根据权利要求书1所述的危害物抗原的结构模拟与合成，其特征为危害物的选择基于海洋食品危害物数据库。3.根据权利要求书1所述的危害物抗原的结构模拟与合成，其特征为危害物的结构通过计算机软件进行了深度学习。4.根据权利要求书1所述的危害物抗原的结构模拟与合成，其特征为危害物抗原合成过程载体蛋白的选择借助了分子对接模型。

技术总结
本发明涉及检测技术领域，公开了一种基于海洋食品危害物数据库的免疫原结构模拟技术，其特征在于：所述危害物来源于发明人研究构建完成的海洋食品危害物数据库；所述危害物免疫原结构是通过计算机学习和模拟软件获得，结构准确性高；所述单克隆抗体是由骨髓瘤细胞与免疫性能良好的小鼠脾脏细胞融合获得单克隆抗体分泌制得。该抗体对危害物具有良好的识别效果(IC


技术研发人员：50
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：2023.07.04
技术公布日：2023/9/22