shIL-27毕赤酵母高效表达基因及表达生产方法

shil-27毕赤酵母高效表达基因及表达生产方法
1.本专利申请是发明名称为“shil-27毕赤酵母高效表达基因及表达生产方法”的中国专利202211386037.3的分案申请，这里将其全文引用结合于此。
发明领域：
2.本发明涉及基因工程领域，尤其涉及单链人白细胞介素-27(shil-27)毕赤酵母高效表达基因以及相应表达生产方法的建立。


背景技术：

3.1996年，devergne等人发现了一种eb病毒调节的新的细胞基因ebi3，并提出ebi3以非共价的形式与p35或相关分子结合，形成一个分泌的异源二聚体。2002年，pflanz通过数据库计算发现了一个长链四螺旋束细胞因子的新家族成员，通过sds-page测定其摩尔质量为28，将其命名为p28。p28与ebi3结合形成可溶性异源二聚体，即白细胞介素-27(il-27)。1998年，sprecher等人成功克隆出新的ⅰ型细胞因子受体，因其c端结构域包含高度保守的trp-ser-x-trp-ser(wsxws)序列故命名为wsx-1。它与il-6/il-12细胞因子信号转导受体家族成员il-12受体β1、il-12受体β2、白血病抑制因子受体、抑瘤素受体、gp130和粒细胞集落刺激因子受体具有结构同源性，揭示了wsx-1在免疫应答调节中具有重要作用。随后，chen等鉴定出t细胞细胞因子受体(t-cell cytokine receptor,tccr)(同wsx)，证实小鼠脾脏中cd4+t细胞、cd8+t细胞、b细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell,nk cell)和巨噬细胞均表达tccr。il-27可与受体wsx-1单独结合却不足以传导信号。若wsx-1和gp130组成受体复合体，与配体il-27结合，就可向下游传递信号，引起细胞效应。
4.il-27主要由抗原提呈细胞分泌，参与适应性免疫应答和固有免疫应答。il-27可促进幼稚cd4+t细胞的快速克隆扩增，ifn-γ的产生及th1分化，对适应性免疫反应具有重要的调节作用。在单核细胞、dc细胞、t淋巴细胞、b淋巴细胞、nk细胞、肥大细胞中均发现wsx-1和gp130共表达。先前的研究认为，il-27通过促进treg细胞产生il-10发挥抗炎作用，或通过stat1通路抑制th17细胞的发育改善与th17有关的炎性疾病。近年来的研究表明，中和内源性il-27会促进单核细胞产生炎性细胞因子。il-27通过抑制cd4+t细胞分泌inf-γ，从而负向调节ly6c+单核细胞向tip-dcs的分化，改善非洲锥虫感染过程中肝脏的炎症反应。il-27显著抑制肥大细胞的活化、降低炎症细胞因子的表达水平，改善肥大细胞介导的炎症反应。此外，免疫调节药瑞喹莫德(resiquimod)减轻过敏性支气管哮喘的作用机制与il-27密切相关。瑞喹莫德刺激小鼠肺部的抗原提呈细胞分泌il-27，激活抗原提呈细胞分泌ifn-γ从而抑制th2细胞极化，并上调其表面的pdl-1增强免疫耐受性，说明il-27在th2细胞介导的过敏性哮喘中具有免疫保护作用。在淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染小鼠时，效应b细胞产生的il-27促进病毒特异性cd4+t细胞存活，维持滤泡辅助性t细胞功能。滤泡辅助性t细胞上的il-27r信号驱动产生ifn-γ和il-21，产生抗病毒抗体促进对病毒感染的控制。il-27作用的靶细胞并非只有免疫细胞。近年来研究表明，il-27在黑色素瘤、慢性b淋巴细胞白血病、子宫内膜癌、前列腺癌和肺癌等肿瘤中表现出显著的抗肿瘤活性。实验证
marker；m2：dl 2000dna marker；1：xho i、xba i双酶切结果；2：hindⅲ单酶切结果。
25.图2：提取ppiczα-il-27质粒转化酵母菌基因组dna进行pcr筛选重组子的琼脂糖凝胶电泳图谱。m：dl 2000dna marker；1-16：不同酵母转化子基因组pcr产物；17：阴性对照。
26.图3：不同时间点取样发酵液上清的sds-page结果。m：蛋白marker；1：甲醇诱导前培养液上清；2、3、4、5、6：甲醇诱导表达24h、48h、72h、96h、120h的发酵液上清。
27.图4：sds-page电泳筛选目的蛋白shil-27融合蛋白最佳诱导ph值结果，其中m为蛋白marker；1：甲醇诱导前上清；2-7：分别为ph值2.2,2.8,3.4,4.0,4.6,5.2条件下诱导表达的发酵液上清。
28.图5：离子交换层析样品sds-page检测结果，m为蛋白marker；1-6为分部洗脱峰样品。
29.图6：300mmol/l nacl洗脱峰离子交换层析样品western blot检测结果，1-3为300mmol/l nacl洗脱峰样品。
30.图7：重组shil-27融合蛋白抑制肿瘤细胞pc-3增殖活性测定结果。
具体实施方式
31.下面结合具体实施例对本发明作进一步具体的阐述，应理解，引用实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
32.实施例1.人工合成编码shil-27融合蛋白的dna序列seq id no：1
33.根据文献报道人工合成编码shil-27蛋白的dna序列，其中il-27b为去除信号肽的人源成熟的il-27b，包含209个氨基酸残基；il-27a为去除信号肽的人源成熟的il-27a，包含215个氨基酸残基。il-27b和il-27a序列之间由“gggsgggsgggs”序列组成的linker相连接，依据酵母偏爱的密码子对上述氨基酸序列进行人工合成。发明人通过酵母密码子偏好的多种算法，先后设计了6种dna序列，经过进一步的筛选，最终确定了可以稳定高效表达shil-27的最佳序列为seq id no.1。序列进行合成时，在基因的上游引入xhoi位点和kex2切割位点glu-lys-arg序列，在基因的下游引入终止密码子和xbai位点。编码蛋白序列如seq id no.2所示。
34.实施例2.构建表达载体
35.分别用xhoⅰ、xbaⅰ双酶切合成的基因片段及载体ppiczα，37℃恒温过夜。将酶切产物使用琼脂糖凝胶电泳切下目的片段后，使用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收。将回收的酶切后目的基因与载体按照3：1的摩尔比例混匀，使用t4 dna ligase连接酶16℃pcr仪恒温连接过夜，构建ppiczα-shil-27重组质粒。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，转化的感受态细胞涂均匀于含有zeocin(25μg/ml)的低盐lb平板培养基上，待菌液被完全吸收后，37℃倒置培养12-16h。用无菌枪头从转化平板上挑取4-8个生长状态良好的单菌落，接种于5ml含zeocin(25μg/ml)的lb培养基中，37℃强烈振荡(225rpm)培养过夜。酶切位点xhoⅰ、xbaⅰ分别位于插入的基因片段的两端。重组载体中有两个hindⅲ酶切位点，其中一个位于插入目的片段中，另一个位于载体上。对经试剂盒提取的ppiczα-il-27重组质粒进行xhoι、xbaι双酶切和hindⅲ单酶切鉴定。使用快速质粒小提试剂盒提取质粒dna，分别用xhoι、xbaι双酶切和hindⅲ单酶双切鉴定重组质粒ppiczα-shil-27，37℃消化4h，根据内切酶谱鉴定
出正确克隆，xhoι、xbaι双酶切后，在3500bp和1300bp处出现两条带。hindⅲ单酶切后在3600bp和1200bp处出现两条带(如图1所示)。选取酶切图谱正确的克隆，送测序公司进行测序验证。
36.实施例3.表达与纯化shil-27融合蛋白
37.1.电转化毕赤酵母x-33并筛选阳性转化子
38.取测序结果正确的重组质粒ppiczα-shil-27 20μg，用限制性内切酶pme i消化质粒，电转化d-山梨醇法制备的毕赤酵母x-33感受态细胞。取50-100μl菌液均匀涂布于含zeocin(100μg/ml)的ypd平板上，30℃培养箱倒置培养2-3天，观察转化子的生长。选择zeocin抗性克隆接种于5ml ypd培养基里，230rpm震荡培养30h。离心收集菌体，使用“煮-冻-煮”法提取酵母的基因组dna，使用引物p1：5'-tcgctgttgactgttcttggactttg-3'(seq id no.3)和引物p2：5
’‑
tgtggaatctagcagcaccttgtctc-3'(seq id no.4)，进行pcr，对扩增的产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。观察是否能够得到414bp左右的基因片段，分析基因是否整合到酵母基因组(如图2所示)。
39.2.重组毕赤酵母x-33的诱导表达及高表达shil-27融合蛋白菌株的筛选
40.(1)选择阳性重组菌接种于10ml bmgy培养基中，30℃振荡培养24h，至od
600
达2.0-6.0时收集细胞；
41.(2)等体积(10ml)bmmy重悬细胞沉淀，30℃振荡培养，诱导表达。诱导过程中，每24h补充一次甲醇直至其终浓度0.5％，同时补充灭菌蒸馏水，使发酵液保持总体积不变；
42.(3)连续诱导培养5天，每24h取1ml发酵液，离心菌体，分离上清与沉淀，上清用于sds-page蛋白分析，筛选高表达目的蛋白的菌株，并确定最佳发酵时间长度，结果表明诱导第1天即有目的蛋白的表达，随着诱导时间的延长，表达量升高，第3天时表达量达到峰值(如图3所示)。
43.3.毕赤酵母x-33诱导表达shil-27融合蛋白最佳ph值的确定及分析
44.(1)选取shil-27融合蛋白高表达量的毕赤酵母工程菌，在10mlypd培养基中30℃、225rpm振荡培养24h；
45.(2)将扩增的毕赤酵母工程菌接种于10ml bmgy中，ph值为6.0、28℃、220rpm振荡培养24h左右，使其od
600
达2.0-6.0。此方法使酵母扩增的起始条件相同，为以后确定诱导最佳ph值奠定基础；
46.(3)室温离心(4000rpm)5min，弃去上清，加入前述未加缓冲液的bmmy 9ml，按下表的量加入1mol/l na2hpo4和0.5mol/l柠檬酸配制成不同ph值的bmmy，30℃、225rpm振荡培养，诱导过程中每24h补充一次甲醇至终浓度为0.5％，同时补充灭菌蒸馏水，使发酵液总体积保持不变；
47.ph值1mol/l na2hpo4(μl)0.5mol/l柠檬酸(μl)2.2209802.81608403.42907104.03906104.64705305.2540460
48.(4)取第3d各个ph值样品上清进行sds-page分析，确定最佳诱导的ph值，结果显示最佳诱导的ph值为ph4.6(如图4所示)。
49.经过对发酵表达条件的初步优化，通过image j软件对sds-page的结果进行计算，结果表明可以实现400mg/l的表达量。
50.4.shil-27融合蛋白的纯化
51.1)发酵液浓缩
52.(1)发酵结束后，将菌液4℃，4000rpm离心取上清。
53.(2)将发酵液上清使用10kda的超滤膜进行超滤浓缩10倍左右，并置换缓冲液为50mm的磷酸盐缓冲液(ph6.4)进行后续的凝胶层析纯化。
54.2)离子交换层析
55.使用3-5倍柱床体积的50mmol/l磷酸钠(ph6.4)缓冲液平衡sp sepharose f.f层析柱，而后上样，使用3-5倍柱床体积的50mmol/l磷酸盐(ph6.4)缓冲液冲至基线，依次使用0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1mol/lnacl-50mmol/l磷酸钠(ph6.4)洗脱液，进行梯度洗脱。
56.分部收集各个蛋白峰，sds-page确定目的蛋白所在的峰位置，结果发现0.3mol/l的nacl可以较好地洗脱shil-27融合蛋白，获得纯度大于95％的目的蛋白(如图5所示)。将含有目的蛋白的组分使用超滤膜(截留分子量10kda)进行浓缩处理。
57.3)凝胶过滤层析
58.用3-5倍柱床体积的50mmol/l磷酸钠(ph7.0)缓冲液冲洗superdex 75prep grade凝胶柱至基线稳定。将上述含有目的蛋白组分的洗脱液使用superdex 75prep grade凝胶柱进行进一步纯化处理，定量后用于生物活性检测。
59.实施例4.鉴定shil-27融合蛋白
60.10％的sds-page分离目的蛋白，而后湿法转膜。将pvdf膜在使用前在甲醇中活化30秒，在转膜液中按从下到上海绵、滤纸、胶、pvdf膜、滤纸、海绵的顺序夹好放入转膜槽，避免产生气泡，200ma恒流冰浴转膜30min。转膜结束后取出pvdf膜，置于tbst中漂洗，以免pvdf干燥影响实验结果。常温下1％bsa摇床封闭1h，除去封闭液，根据抗体说明比例使用1％bsa稀释抗hil-27的特异性抗体，4℃摇洗孵育过夜。一抗回收后，tbst洗3次，10min/次。根据二抗说明书按比例使用tbst稀释二抗。室温孵育1h。tbst洗3次，10min/次。吸弃tbst洗液，加入ecl显影液孵育片刻，成像仪器下显影，分析结果。结果在预期分子量位置出现条带，表明重组蛋白可以与hil-27特异性抗体结合(如图6所示)。
61.实施例5.检测shil-27融合蛋白的生物活性
62.1)shil-27融合蛋白抑制肿瘤细胞增殖活性检测
63.(1)pc-3细胞培养：培养基选用含10％(v/v)fbs的dmem/f12，在37℃、5％二氧化碳条件下培养；
64.(2)细胞接种：传代24-36小时后，细胞消化离心，用含10％(v/v)fbs的dmem/f12培养基重悬，稀释到每100μl含3.0
×
103个细胞的浓度，接种于96孔板，每孔加入100μl上述稀释好的细胞悬液，37℃、5％二氧化碳条件下培养24小时；
65.(3)添加shil-27融合蛋白：用培养基将重组shil-27融合蛋白稀释成不同的浓度(25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml)，替换原来的培养基，对照组加入不含参考品及供试品的培养基，37℃、5％二氧化碳条件下培养96小时；
66.(4)检测细胞活性：弃去培养基，pbs洗两遍，然后用细胞活性试剂盒检测细胞的增殖情况。每孔加入含20μl细胞活性检测试剂的100μl维持培养基，37℃、5％二氧化碳条件下孵育1-2小时，用酶标仪在490nm波长下检测细胞增殖情况，并记录和计算(如图7所示)。

技术特征：
1.一种shil-27毕赤酵母高效表达基因，其特征在于，所述基因包含kex2信号切割位点编码序列、il-27b的编码序列、linker序列和il-27a的编码序列；所述基因的核苷酸序列为seq id no.1；该seq id no.1稳定高效表达shil-27达到400mg/l的表达量。2.高表达shil-27的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述毕赤酵母菌株中转入了根据权利要求1所述的基因。3.根据权利要求2所述的菌株在制备shil-27中的应用，其特征在于，所述高表达shil-27的毕赤酵母菌株中转入了核苷酸序列如seq id no.1所示的shil-27毕赤酵母高效表达基因，所述shil-27毕赤酵母高效表达基因包含kex2信号切割位点编码序列、il-27b的编码序列、linker序列和il-27a的编码序列；所述高表达shil-27的毕赤酵母菌株的制备方法包括：1)人工合成序列为seq id no.1的shil-27毕赤酵母高效表达基因；2)构建ppiczα表达载体；3)表达与纯化shil-27蛋白；4)鉴定shil-27，并检测其生物活性；所述应用中使用bmmy培养基发酵培养所述高表达shil-27的毕赤酵母菌株，发酵培养的起始ph为4.6，发酵培养时间为72小时。4.根据权利要求3所述的应用，其中所述shil-27用于抗肿瘤治疗、免疫调节、抑制炎症、减肥或者糖尿病治疗。

技术总结
本发明提供了shIL-27毕赤酵母高效表达基因以及相应的表达生产方法，所述毕赤酵母高表达基因包含Kex2信号切割位点编码序列、IL-27B的编码序列、linker序列和IL-27A的编码序列。本发明通过使用构建的shIL-27毕赤酵母表达载体，转化毕赤酵母X-33进行胞外分泌表达，可获得400mg/L的表达量。获得的shIL-27具有很好的纯度与活性，可用于抗肿瘤治疗、免疫调节、抑制炎症、减肥和糖尿病治疗等方面。减肥和糖尿病治疗等方面。减肥和糖尿病治疗等方面。


技术研发人员：马杰 王伟 焦平 孙丹丹 赵赫 孟祥锋
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2022.11.07
技术公布日：2023/9/22