低氧型干细胞球的培养方法与流程

1.本发明涉及生物医药领域技术，尤其是指一种低氧型干细胞球的培养方法。


背景技术：

2.干细胞治疗是一种前沿的治疗方法，可应用于多种疾病的治疗。但传统的培养技术仍存在诸多缺陷：1、细胞稳定性差：传统的培养方法获得的细胞为2d细胞；而采用本技术提供的培养方法能够获得3d细胞球；2d培养条件下的干细胞容易受外界环境的影响，导致细胞稳定性较差。外界环境的变化可能会引起细胞功能的改变或丧失，从而影响治疗效果的一致性和可靠性；2、不稳定的治疗效果：2d培养的细胞容易受到外界因素的影响，如化学物质、机械力等，导致细胞功能的不稳定性；这会导致治疗效果的波动，难以保证每个患者的治疗效果一致性；3、有限的细胞寿命：2d培养的干细胞，因为酶消化处理后，细胞呈分散状态，导致寿命较短，限制了其长期应用的可行性；尤其，在骨关节炎治疗上，传统培养的2d细胞，因无法耐受低氧和炎症环境而导致细胞大量的死亡，无法稳定的发挥其治疗效果；4、受限的细胞分化能力：在2d培养中，干细胞的分化能力可能受到限制；细胞在平面上的生长环境无法提供必要的细胞信号和微环境来促进特定细胞类型的分化，这可能影响其在治疗中的应用潜力；5、有限的细胞存活率：2d培养可能导致细胞的存活率下降，这由于细胞与培养表面的接触、外界应力和缺乏合适的细胞支持结构等因素造成的；限制了2d培养在治疗中的应用和细胞的长期生存能力；因此，针对此现状，迫切需要开发一种低氧型干细胞球的培养方法，以满足实际需要。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明针对现有技术存在的缺陷，开发一种低氧型干细胞球的培养方法，其通过在低氧赋能培养条件获得的干细胞球表现出更高的细胞存活率和更好的功能表达；干细胞球提供了更接近体内骨关节组织的低氧环境，有助于维持干细胞的稳定性和功能。
4.为实现上述目的，本发明采用如下之技术方案：
5.一种低氧型干细胞球的培养方法，其包括如下步骤：
6.s1、细胞扩增与低氧赋能；从液氮中取出p0代干细胞，于35℃-40℃水浴锅中溶解1-2min，加入培养基稀释后混悬细胞，离心5-10min，离心结束后加入干细胞培养基进行铺板，铺板密度为8000个/cm2；干细胞在低氧条件下进行培养并传代，细胞传代时低氧环境维持在2％-8％的氧气体积浓度；重复操作，每隔2天换液，加入新鲜干细胞培养基；传至p4代后，收集赋能后的干细胞；
7.s2、诱导干细胞成细胞球；收集2％-8％赋能的p4代的干细胞转移至低氧条件连续进行培养，连续培养72d；诱导形成细胞球的条件为10％-15％的氧气体积浓度。
8.作为一种优选方案：所述s2中干细胞转移至低氧条件连续进行培养的具体步骤包括：
9.第一、预先用300-800μl抗粘附的包板液覆盖并浸润aggrewell孔板，离心5-10min使抗黏附液均匀包被aggrewell孔板；
10.第二、离心后吸取并弃去抗黏附液，使用37℃室温的无血清干细胞的完全培养基润洗孔板，弃除培养基；
11.第三、加入相应细胞密度的低氧环境下细胞悬液，细胞密度根据形成每个微球的细胞数量，以5
×
10
5-10
×
105个/ml密度接种，每孔加入无血清干细胞的完全培养基；
12.第四、离心3-5min使细胞富集在微孔中，离心结束后，每孔补充无血清干细胞的完全培养基至2ml；细胞在低氧条件下继续完成诱导成球步骤；
13.第五、在氧气的体积浓度为10％-15％的低氧环境下，用aggrewell孔板培养24h后，将已成型的细胞球转移至未处理的aggrewell孔板中悬浮培养，在不变的环境下，继续用摇床完成为期1-3天的诱导进程，每隔1天更换新鲜的无血清干细胞的完全培养基；
14.第六、在未处理的aggrewell孔板中继续诱导24h，48h，72h后，收集细胞球。
15.作为一种优选方案：所述s1中加入4倍体积的无血清的完全培养基稀释后混悬细胞。
16.作为一种优选方案：所述s1中干细胞在2％-8％氧气体积浓度的低氧条件下于37℃的培养箱中进行培养并传代。
17.作为一种优选方案：所述s1中传代的条件为：当细胞汇合度达到80％时，生理盐水清洗2次，0.25％胰酶消化2min，进行传代。
18.作为一种优选方案：所述s1中干细胞包括脐带间充质干细胞、成体干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞和诱导多能干细胞。
19.作为一种优选方案：所述成体干细胞包括骨髓基质干细胞、脂肪干细胞和心肌干细胞。
20.作为一种优选方案：所述s2中干细胞转移至低氧条件连续进行培养时采用细胞聚集工具和培养系统。
21.作为一种优选方案：所述s2中细胞聚集工具包括aggrewell孔板，aggrewell孔板的涂层为聚合物或天然高分子物质。
22.作为一种优选方案：所述s2中培养系统包括细胞悬浮培养系统和转流式培养系统。
23.本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果，具体而言，由上述技术方案可知，通过采用本技术提供的低氧型干细胞球的培养方法，获得的低氧赋能培养的3d干细胞球相对于2d常氧培养的细胞，在骨关节治疗上具有以下优势：
24.1、模拟体内微环境：低氧赋能培养条件可以更好地模拟体内骨关节组织的微环境；骨关节组织在体内处于低氧环境下，而2d常氧培养无法提供此环境；低氧条件有助于细胞在3d球中形成更稳定和功能活性更高的细胞群体，更好地模拟体内的生物学特征。
25.2、促进细胞存活和功能表达：低氧赋能培养条件可增强干细胞的存活率和功能表达；骨关节组织中的细胞在低氧环境下能够更好地适应，并表现出更高的细胞存活率和更好的功能表达；3d干细胞球提供了更接近体内骨关节组织的低氧环境，有助于维持干细胞的稳定性和功能。
26.3、促进细胞分化软骨细胞：低氧赋能培养条件有助于促进干细胞向骨和软骨细胞
的分化；骨关节疾病，如骨关节炎，通常涉及骨和软骨的受损，3d干细胞球提供了更接近体内骨关节组织的环境，更好地促进干细胞向骨和软骨细胞的分化，从而有助于修复和重建受损组织。
27.4、提供细胞-细胞相互作用：低氧赋能培养的3d干细胞球提供了更好的细胞-细胞相互作用，细胞-细胞相互作用在组织工程和修复中起着重要的作用；在3d细胞球内，细胞可以更紧密地连接和相互作用，模拟体内细胞之间的信号传递和相互影响；这种细胞-细胞相互作用有助于增强干细胞的生物学活性和治疗效果。
28.为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。
附图说明
29.图1为本发明之实施例1、效果实施例和效果实施例2的工艺流程示意图；
30.图2为本发明之低氧条件下培养的干细胞促进细胞增殖结果示意图；
31.图3为本发明之低氧条件下培养的干细胞的cd73、cd90、cd105阳性表达率结果示意图；
32.图4为本发明之低氧条件下培养的干细胞的cd19、cd34和hl-dr的阳性表达率结果示意图；
33.图5为本发明之模拟骨关节炎环境下不同状态细胞的存活能力结果示意图。
具体实施方式
34.本发明如图1至图5所示，一种低氧型干细胞球的培养方法，其包括如下步骤：
35.s1、细胞扩增与低氧赋能；从液氮中取出p0代干细胞，于35℃-40℃水浴锅中溶解1-2min，加入培养基稀释后混悬细胞，离心5-10min，离心结束后加入干细胞培养基进行铺板，铺板密度为8000个/cm2；干细胞在低氧条件下进行培养并传代，细胞传代时低氧环境维持在2％-8％的氧气体积浓度；重复操作，每隔2天换液，加入新鲜干细胞培养基；传至p4代后，收集赋能后的干细胞；
36.s2、诱导干细胞成细胞球；收集2％-8％赋能的p4代的干细胞转移至低氧条件连续进行培养，连续培养72d；诱导形成细胞球的条件为10％-15％的氧气体积浓度。
37.该s2中干细胞转移至低氧条件连续进行培养的具体步骤包括：
38.第一、预先用300-800μl抗粘附的包板液覆盖并浸润aggrewell孔板，离心5-10min使抗黏附液均匀包被aggrewell孔板；
39.第二、离心后吸取并弃去抗黏附液，使用37℃室温的无血清干细胞的完全培养基润洗孔板，弃除培养基；
40.第三、加入相应细胞密度的低氧环境下细胞悬液，细胞密度根据形成每个微球的细胞数量，以5
×
10
5-10
×
105个/ml密度接种，每孔加入无血清干细胞的完全培养基；
41.第四、离心3-5min使细胞富集在微孔中，离心结束后，每孔补充无血清干细胞的完全培养基至2ml；细胞在低氧条件下继续完成诱导成球步骤；
42.第五、在氧气的体积浓度为10％-15％的低氧环境下，用aggrewell孔板培养24h后，将已成型的细胞球转移至未处理的aggrewell孔板中悬浮培养，在不变的环境下，继续
用摇床完成为期1-3天的诱导进程，每隔1天更换新鲜的无血清干细胞的完全培养基；
43.第六、在未处理的aggrewell孔板中继续诱导24h，48h，72h后，收集细胞球。
44.在s2中采用低氧培养件：在含氧浓度为2％-8％和10％-15％的环境下交替培养，用于培养和维持3d干细胞球的生长和功能发挥；提供低氧环境，赋能细胞更好地适应骨关节腔的微环境，进而增强干细胞存活能力、软骨方向的功能表达和分化。
45.该s1中加入4倍体积的无血清的完全培养基稀释后混悬细胞。
46.该s1中干细胞在2％-8％氧气体积浓度的低氧条件下于37℃的培养箱中进行培养并传代。
47.该s1中传代的条件为：当细胞汇合度达到80％时，生理盐水清洗2次，0.25％胰酶消化2min，进行传代。
48.该s1中干细胞包括脐带间充质干细胞、成体干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞和诱导多能干细胞。
49.使用人体来源的脐带间充质干细胞(mscs)，每个3d球中含有1
×
10
3-1
×
104个细胞；脐带间充质干细胞：作为治疗的主要细胞来源，干细胞具有自我更新和多向分化的能力，可以分化为骨和软骨细胞，促进骨关节组织的修复和再生。
50.该成体干细胞包括骨髓基质干细胞、脂肪干细胞和心肌干细胞。
51.除了脐带间充质干细胞，可以考虑使用其他类型的成体干细胞或细胞作为替代方案；如成体干细胞的其他类型，骨髓基质干细胞(bmscs)、脂肪干细胞(adscs)、心肌干细胞(cscs)等都有向软骨分化的潜能。此外，胚胎干细胞同样具有广泛的分化潜能，可以通过特定的诱导因子和培养条件，将其诱导向软骨细胞分化；多能干细胞和诱导多能干细胞也可以，它们通过重编程或转分化得到，并具备分化成多种细胞类型的能力；使用这些细胞作为替代方案，可以进一步探索软骨细胞的发生和功能。
52.该s2中干细胞转移至低氧条件连续进行培养时采用细胞聚集工具和培养系统。
53.该s2中细胞聚集工具包括aggrewell孔板，aggrewell孔板的涂层为聚合物或天然高分子物质。
54.使用生物相容性的聚合物涂层包被aggrewell孔板；该aggrewell孔板提供超低吸附的细胞培养环境，促进干细胞的细胞间的聚合成球和增强细胞-细胞相互作用。
55.该s2中培养系统包括细胞悬浮培养系统和转流式培养系统。
56.细胞悬浮培养系统，其中细胞以悬浮状态生长，并形成聚集体；这种方法可以通过调整细胞密度、培养时间和培养基组分等参数，创建一个支持间充质干细胞软骨化的三维环境。转流式培养系统，通过在流动培养条件下培养细胞，可以模拟体内流体力学环境，促进软骨化过程。还可以考虑使用多孔材料支架作为培养基质，为细胞提供结构支持和更大的生长表面积。此外，低氧环境也可以用其他化学反应，降低氧气浓度。
57.实施例1
58.一种低氧型干细胞球的培养方法，其包括如下步骤：
59.s1、细胞扩增与低氧赋能；
60.在不同氧浓度条件下培养人脐带间充质干细胞(uc-msc)
61.从液氮中取出p0代uc-msc，37
°
水浴锅中溶解1-2min，加入4倍体积的无血清完全培养基进行稀释后，混悬细胞，500g，离心3min，离心结束后加入msc培养基进行铺板，铺板
密度为8000个/cm2；将实验分为常氧组与低氧组，之后uc-msc分别在常氧(21％o2体积浓度)、低氧(2～8％o2体积浓度)条件下的5％co2，37℃培养箱培养，当细胞汇合度达到80％时，生理盐水清洗，胰酶消化后，传代；重复操作，每隔2天换液，加入新鲜msc培养基；传至p4代后，收集细胞，进行下一步msc成软骨实验；同时，p4代时收集细胞，利用流式细胞技术检测msc细胞表面标志物cd73、cd90、cd105的阳性表达率以及cd19、cd34、hl-dr的阴性表达率。
62.s2、诱导干细胞成细胞球；
63.实验使用aggrewell孔板(24孔)进行诱导uc-msc成球形干细胞实验，具体实验步骤如下：
64.第一、预先用500μl抗粘附的包板液覆盖并浸润aggrewell孔板(24孔)，1300g离心5min使抗黏附液均匀包被孔板。
65.第二、离心后吸取弃去抗黏附液，使用1ml37℃室温的无血清干细胞的完全培养基润洗孔板，弃除培养基。
66.第三、分别加入相应细胞密度的常氧组与低氧组细胞悬液，细胞密度根据形成每个微球的细胞数量，以5
×
105个/ml密度接种，每孔加入1ml无血清干细胞的完全培养基。
67.第四、离心3min使细胞富集在微孔中，离心结束后，每孔补充无血清干细胞的完全培养基至2ml；之后常氧与低氧两组细胞均在常氧条件下继续完成诱导分化步骤。
68.第五、在10％的低氧环境下，用aggrewell孔板培养24h后，将已成型的细胞球转移至未处理aggrewell孔板中悬浮培养，在不变的环境下，继续用摇床完成为期3天的诱导进程，每隔1天更换新鲜的无血清干细胞的完全培养基。
69.第六、在诱导24h，48h，72h后，分别收集常氧培养的2d平面细胞与低氧组诱导的3d干细胞球。
70.效果实施例1
71.低氧对msc的功能影响分析：
72.1、常氧条件下培养干细胞：首先对脐带组织进行处理，以便后续分离出脐带间充质干细胞；通常包括对脐带进行清洗、消毒和切割等操作；然后分离脐带间充质干细胞：利用酶消化法或物理方法对处理过的脐带组织进行分离，以获得纯化的uc-msc；最后扩增uc-msc：将分离得到的uc-msc在常规培养条件下进行扩增，以达到所需的细胞数量；
73.2、低氧条件下培养干细胞：首先低氧条件设置：设置实验培养的环境，低氧条件下的细胞培养设备包括氧气调节器、co2调节器、湿度调节器和恒温器；然后将干细胞培养在体积百分比为2％-8％o2的条件下持续培养至p4代，然后将收集细胞，利用流式细胞技术进行了msc细胞表面标志物cd73、cd90、cd105的阳性表达率以及cd19、cd34、hl-dr的阴性表达率，以验证低氧条件(体积百分比为2％-8％o2)培养uc-msc并不会影响细胞表面标志物表达的稳定性。
74.结果见图2、图3和图4，结果表明，与常氧条件下培养的干细胞相比较，低氧处理可以增强细胞的增殖速率，减缓细胞衰老的能力，且并不会对干细胞表面标志物的表达产生影响。
75.效果实施例2
76.炎性膝关节微环境模拟与细胞活性验证：
77.1、3d干细胞球培养：首先收集2％-8％赋能的p4代的uc-msc转移到，低氧条件控制在10％-15％的aggrewell孔板连续进行培养，连续培养72d；3d干细胞球培养器包括一个支架和一个透明的培养皿，支架上附有多个悬挂式微孔，用于促进细胞球体的形成；然后收集成熟的低氧型脐带间充质干细胞球：在培养一定时间后，观察并记录细胞球的形态学变化，收集成熟的低氧型脐带间充质干细胞球；
78.2、对干细胞球进行干性功能与细胞活性验证：首先调节三气培养箱，使其氧气浓度满足人骨关节腔微环境的低氧浓度，区间值为2％-8％；然后，准备干细胞的无血清的基础培养基，并补加骨关节炎中经典的炎症因子如肿瘤坏死因子-α(tnf-α)和白介素-1β(il-1β)，使其终浓度分别为10ng/ml与50ng/ml，4℃保藏备用；最后将收集到的相同培养天数的2d培养的常氧(21％)细胞与上述制备的低氧赋能的干细胞球，统一放置上述低氧与炎症因子的环境连续培养24h，48h和72h；然后收集各个时间节点进行细胞的活性验证，结果见图5。
79.比较干细胞分别在2d常氧培养和3d低氧赋能培养条件下培养，比较存活率；结果显示，在3d低氧赋能培养条件下，干细胞的存活率显著提高，达到90％。
80.本发明的设计重点在于，通过本技术提供的低氧型干细胞球的培养方法获得的细胞球：
81.1、能够改善治疗效果：低氧环境可模拟膝关节内缺氧的微环境，更符合骨关节炎等疾病的病理特征；相比于常氧的2d细胞，低氧型干细胞球可以更好地适应膝关节腔内的环境，并发挥治疗潜力。
82.2、能够提高细胞存活率：低氧环境有助于提高干细胞的存活率；在膝关节腔内，常氧环境下的2d细胞容易受到氧气的限制，导致细胞凋亡和功能丧失；而低氧型干细胞球可以提供更适宜的氧气水平，增加细胞的存活率，并保持其治疗潜力。
83.3、能够增强细胞功能：低氧环境能够促进干细胞的多向分化和分泌活性因子的能力，进一步增强其治疗效果；相对于常氧的2d细胞，低氧型干细胞球在膝关节腔内能够更有效地分泌生长因子和细胞外基质，促进关节组织的再生和修复。
84.4、能够提供更好的细胞-细胞交互作用：低氧型干细胞球在结构上更接近组织的三维构建，为细胞-细胞之间的相互作用提供了更好的环境。这种细胞-细胞交互作用可以促进细胞增殖、分化和功能表达，并在治疗过程中产生协同效应。
85.5、实验方法简单：本技术提供的低氧型干细胞球的培养方法简单，从干细胞的收集、低氧驯化培养到干细胞球的形成，步骤清晰明确；相比于现有的培养方法，本技术的培养方法步骤少，方法高效、可重复。
86.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术范围作任何限制，故凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何细微修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

技术特征：
1.一种低氧型干细胞球的培养方法，其特征在于；包括如下步骤：s1、细胞扩增与低氧赋能；从液氮中取出p0代干细胞，于35℃-40℃水浴锅中溶解1-2min，加入培养基稀释后混悬细胞，离心5-10min，离心结束后加入干细胞培养基进行铺板，铺板密度为8000个/cm2；干细胞在低氧条件下进行培养并传代，细胞传代时低氧环境维持在2％-8％的氧气体积浓度；重复操作，每隔2天换液，加入新鲜干细胞培养基；传至p4代后，收集赋能后的干细胞；s2、诱导干细胞成细胞球；收集2％-8％赋能的p4代的干细胞转移至低氧条件连续进行培养，连续培养72d；诱导形成细胞球的条件为10％-15％的氧气体积浓度。2.根据权利要求1所述的低氧型干细胞球的培养方法，其特征在于；所述s2中干细胞转移至低氧条件连续进行培养的具体步骤包括：第一、预先用300-800μl抗粘附的包板液覆盖并浸润aggrewell孔板，离心5-10min使抗黏附液均匀包被aggrewell孔板；第二、离心后吸取并弃去抗黏附液，使用37℃室温的无血清干细胞的完全培养基润洗孔板，弃除培养基；第三、加入相应细胞密度的低氧环境下细胞悬液，细胞密度根据形成每个微球的细胞数量，以5
×
10
5-10
×
105个/ml密度接种，每孔加入无血清干细胞的完全培养基；第四、离心3-5min使细胞富集在微孔中，离心结束后，每孔补充无血清干细胞的完全培养基至2ml；细胞在低氧条件下继续完成诱导成球步骤；第五、在氧气的体积浓度为10％-15％的低氧环境下，用aggrewell孔板培养24h后，将已成型的细胞球转移至未处理的aggrewell孔板中悬浮培养，在不变的环境下，继续用摇床完成为期1-3天的诱导进程，每隔1天更换新鲜的无血清干细胞的完全培养基；第六、在未处理的aggrewell孔板中继续诱导24h，48h，72h后，收集细胞球。3.根据权利要求1所述的低氧型干细胞球的培养方法，其特征在于；所述s1中加入4倍体积的无血清的完全培养基稀释后混悬细胞。4.根据权利要求1所述的低氧型干细胞球的培养方法，其特征在于；所述s1中干细胞在2％-8％氧气体积浓度的低氧条件下于37℃的培养箱中进行培养并传代。5.根据权利要求1所述的低氧型干细胞球的培养方法，其特征在于；所述s1中传代的条件为：当细胞汇合度达到80％时，生理盐水清洗2次，0.25％胰酶消化2min，进行传代。6.根据权利要求1所述的低氧型干细胞球的培养方法，其特征在于；所述s1中干细胞包括脐带间充质干细胞、成体干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞和诱导多能干细胞。7.根据权利要求6所述的低氧型干细胞球的培养方法，其特征在于；所述成体干细胞包括骨髓基质干细胞、脂肪干细胞和心肌干细胞。8.根据权利要求1所述的低氧型干细胞球的培养方法，其特征在于；所述s2中干细胞转移至低氧条件连续进行培养时采用细胞聚集工具和培养系统。9.根据权利要求8所述的低氧型干细胞球的培养方法，其特征在于；所述s2中细胞聚集工具包括aggrewell孔板，aggrewell孔板的涂层为聚合物或天然高分子物质。10.根据权利要求8所述的低氧型干细胞球的培养方法，其特征在于；所述s2中培养系统包括细胞悬浮培养系统和转流式培养系统。

技术总结
本发明公开一种低氧型干细胞球的培养方法，涉及生物医药技术领域，该低氧型干细胞球的培养方法包括如下步骤：S1、细胞扩增与低氧赋能；向干细胞加入培养基稀释后混悬细胞，离心，离心结束后加入干细胞培养基进行铺板；干细胞在低氧条件下进行培养并传代，细胞传代时低氧环境维持在2％-8％的氧气体积浓度；传至P4代后，收集赋能后的干细胞；S2、诱导干细胞成细胞球；收集2％-8％赋能的P4代的干细胞转移至低氧条件连续进行培养；通过在低氧赋能培养条件获得的干细胞球表现出更高的细胞存活率和更好的功能表达；干细胞球提供了更接近体内骨关节组织的低氧环境，有助于维持干细胞的稳定性和功能。定性和功能。定性和功能。


技术研发人员：裴可 颉丽英 蔺宝 何跃腾 刘春桃 蔡车国 胡隽源
受保护的技术使用者：深圳市北科源细胞科技有限公司
技术研发日：2023.07.04
技术公布日：2023/9/22