一种同时检测Cd

一种同时检测cd
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和hg
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的电化学适配体传感器及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于电化学传感技术领域，具体涉及一种同时检测cd
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和hg
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的电化学适配体传感器及其制备方法和应用，即利用基于mb和银纳米团簇信号的电化学适配体传感器检测食品中cd
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和hg
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的应用。


背景技术：

2.重金属通过大气或食物链循环在人体器官中积累，导致慢性中毒。镉和汞是典型的重金属，镉的半衰期很长(10-30年)，容易通过破坏肠道菌群、诱导肠道炎症和细胞损伤对多个器官造成严重损害。汞是食品中最常见的重金属污染物之一，可对中枢神经系统造成不可逆的损害，导致退行性变病变。值得注意的是，食物和生物系统中多种重金属离子常常会共存，因此，迫切需要开发两种或多种重金属离子同时定量的检测方法。传统的重金属仪器检测方法包括原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、x射线荧光光谱法和电感耦合等离子体质谱法，这些方法操作复杂、成本较高且无法满足实时检测的要求。相比之下，生物传感器具有低成本、高灵敏度快速筛选的优点。
3.电化学技术以其基础理论成熟、操作简单、灵敏度高、检测过程快速等优点，在生物传感器分析中得到了广泛应用。电化学生物传感器结合了电化学传感器的低检出限和生物识别过程的高特异性，具有响应快、灵敏度高、易于操作、小型化等优点。多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物具有高机械强度和导电性，可有效提高电极电导率和比表面积。亚甲基蓝可通过氧化还原反应提供电化学信号，银纳米团簇因其低毒性、高生物相容性和优异的稳定性，可作为一种新型的电化学信号探针，在电化学分析中具有广阔的应用前景。目前，未见基于亚甲基蓝和银纳米团簇信号标签的电化学适配体传感器同时检测cd
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和hg
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的相关研究。


技术实现要素：

4.针对现有技术中的不足，本发明的第一方面提供一种同时检测cd
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和hg
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的电化学适配体传感器的制备方法，亚甲基蓝和原位生成的银纳米团簇作为电化学信号标签，以适配体作为特异性识别生物分子，以多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰的丝网印刷电极为反应基底，构建同时检测cd
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和hg
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的电化学适配体传感器。
5.本发明的第二方面提供一种同时检测cd
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和hg
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的电化学适配体传感器，通过上述制备方法得到。
6.本发明的第三方面提供上述同时检测cd
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和hg
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的电化学适配体传感器的应用。
7.为达到上述目的，本发明的技术方案是：
8.本发明的第一方面提供一种同时检测cd
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和hg
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的电化学适配体传感器的制备方法，包括如下步骤：
9.(1)检测过程中生化反应在丝网印刷电极上进行，电极以聚对苯二甲酸乙二醇酯
(pet)为衬底，通过丝网印刷在基底上固定工作电极、对电极和参比电极，其中工作电极和对电极由石墨和聚丙烯酸衍生物组成，参比电极由银/氯化银浆料组成；
10.(2)聚乙烯亚胺辅助溶解和还原制备多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物；
11.(3)制备的多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰丝网印刷电极以提高电导率和比表面积，得到多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰电极；
12.(4)亚甲基蓝标记的cd
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适配体(mb-apt)一端的巯基与电极表面的金纳米粒子通过金硫键进行共价偶联，得到mb-apt修饰电极；
13.(5)待测物和ssdna同时滴加至mb-apt修饰电极上，然后在ssdna富c序列端原位生成银纳米团簇，通过测定mb和银纳米团簇的电化学信号分别实现对cd
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和hg
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的检测。
14.一些实施例中，步骤(1)中，所述丝网印刷电极的工作电极直径为3.5毫米。
15.一些实施例中，步骤(2)中，所述多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物的制备方法包括：多壁碳纳米管和聚乙烯亚胺分散在水溶液中，超声处理，得到多壁碳纳米管分散液；将氯金酸加入体系中，在水浴加热条件下，聚乙烯亚胺辅助将氯金酸还原成金纳米粒子，冷却至室温，离心洗涤，除去上清液，浓缩，避光低温保存。
16.一些实施例中，步骤(2)中，所述多壁碳纳米管和聚乙烯亚胺分散在水溶液中质量比为1:20-25，优选为1:20。
17.一些实施例中，步骤(2)中，超声处理时间为20-40min，优选为30min。
18.一些实施例中，步骤(2)中，氯金酸与多壁碳纳米管的质量比为10-15:1，优选为10:1。
19.一些实施例中，步骤(2)中，水浴加热温度为60-80℃，优选为70℃；加热时间为100-150min，优选为120min。
20.一些实施例中，步骤(2)中，离心转速为8000-10000rpm，优选为8000rpm；离心时间为10-15min，优选为15min。
21.一些实施例中，步骤(2)中，浓缩后浓度为1.5-2mg/ml，优选为2mg/ml。
22.一些实施例中，步骤(3)中，所述多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰电极的制备方法包括：稀释的多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物滴加至电极上，完全覆盖工作电极，烘干即得。
23.一些实施例中，步骤(3)中，多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物在电极上的滴加量为10-20μl，优选为10μl。
24.一些实施例中，步骤(3)中，多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物稀释后浓度为20-50ng/ml，优选为50ng/ml。
25.一些实施例中，步骤(3)中，烘干的温度为30-50℃，优选为40℃。
26.一些实施例中，步骤(4)中，所述mb-apt修饰电极的制备方法包括：在工作电极上滴加mb-apt，孵育反应后，用磷酸盐缓冲液冲洗除去未偶联的mb-apt，而后将电极浸入巯基己醇溶液中浸泡以封闭非特异性结合位点，然后用磷酸盐缓冲液冲洗晾干，得到mb-apt修饰电极，低温避光保存。
27.一些实施例中，步骤(4)中，mb-apt的浓度为0.8-1.2μm，优选为1μm；滴加量为10-20μl，优选为10μl。
28.一些实施例中，步骤(4)中，mb-apt在电极上的孵育温度为20-30℃，优选为25℃；
孵育时间为30-60min，优选为40min。
29.一些实施例中，步骤(4)中，巯基己醇溶液浓度为1-2mm，优选为2mm；浸泡封闭时间为40-60min，优选为60min。
30.一些实施例中，步骤(5)中，cd
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和hg
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的检测方法包括：将待测溶液和ssdna依次滴加至mb-apt修饰电极表面，室温下孵育后用磷酸盐缓冲液洗涤，然后加入agno3，避光孵育后加入nabh4溶液原位生成银纳米团簇，反应结束后电极用磷酸盐缓冲液冲洗，利用电化学法的dpv测定mb和银纳米团簇的信号，分别对应cd
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和hg
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。
31.一些实施例中，步骤(5)中，待测溶液的滴加量为5-10μl，优选为5μl。
32.一些实施例中，步骤(5)中，ssdna的滴加量为5-10μl，优选为5μl；浓度为0.5-1μm，优选为0.8μm。
33.一些实施例中，步骤(5)中，待测溶液和ssdna在电极上的孵育时间为30-60min，优选为30min。
34.一些实施例中，步骤(5)中，agno3的滴加量为5-10μl，优选为5μl；浓度为5-8mm，优选为5mm。
35.一些实施例中，步骤(5)中，nabh4溶液的滴加量为5-10μl，优选为5μl；浓度为10-20mm，优选为20mm。
36.一些实施例中，步骤(5)中，银纳米团簇原位生成反应时间为30-60min，优选为60min。
37.本发明的第二方面，提供一种同时检测cd
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和hg
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的电化学适配体传感器，其由上述同时检测cd
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和hg
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的电化学适配体传感器的制备方法得到。
38.本发明的第三方面，提供一种上述同时检测cd
2+
和hg
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的电化学适配体传感器在检测食品重金属离子cd
2+
和hg
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中的应用。
39.一些实施例中，检测茶叶和蔬菜中重金属离子cd
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和hg
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的方法，通过所述同时检测cd
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和hg
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的电化学适配体传感器实现，包括如下步骤：
40.(a)配制不同浓度梯度的cd
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和hg
2+
标准溶液，滴在所述同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器上，测定其电化学特征峰信号强度，拟合标准曲线；
41.(b)将茶叶和蔬菜经前处理，滴加至所述同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器上，根据线性模型测定cd
2+
和hg
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的浓度。
42.一些实施例中，步骤(a)中，cd
2+
和hg
2+
的标准曲线拟合的方法：将cd
2+
和hg
2+
标准品(1mg/ml)用超纯水稀释至不同浓度，将不同浓度的溶液滴加到同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器上，检测mb和银纳米团簇的电化学dpv信号i
mb
和i
agncs
，通过dpv峰强度值进行标准曲线拟合。
43.一些实施例中，步骤(a)中，cd
2+
溶液的不同浓度为0ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和200ng/ml。
44.一些实施例中，步骤(a)中，hg
2+
溶液的不同浓度为0ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml。
45.一些实施例中，步骤(b)中，在粉碎的茶叶粉末和蔬菜中加入硝酸和过氧化氢，然后于石墨消解炉中消解；消解完成后，用水定容，过滤除杂后作为检测所需溶液，滴加至所述同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器上，检测电化学信号，根据标准曲线计算茶叶
和蔬菜中cd
2+
和hg
2+
的含量。
46.由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
47.一、本发明制备的多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰丝网印刷电极，mb-apt与壁碳纳米管和金纳米粒子复合物可通过金硫键共价结合，mb-apt可特异性识别cd
2+
从而导致适配体发生构象变化，mb电化学信号的变化可实现对cd
2+
的检测；当hg
2+
存在时，ssdna与mb-apt之间可通过hg
2+
桥接形成t-hg-t结构实现hg
2+
的检测；在ssdna富c序列中原位生成银纳米团簇，通过银纳米团簇电化学信号的变化实现对hg
2+
的检测。
48.二、本发明多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物具有优异的导电性，可有效提高丝网印刷电极的电导率和比表面积；mb-apt在捕获cd
2+
时，适配体会发生构象变化，从而导致mb的电化学信号发生改变，实现cd
2+
的定量；ssdna只有在hg
2+
存在的情况下会通过与mb-apt之间形成t-hg-t结构固定在电极表面，ssdna中富c序列原位生成的银纳米团簇所产生的电化学信号强弱可有效对hg
2+
进行定量检测；本发明的电化学适配体传感器可通过mb和银纳米团簇电化学信号的变化实现cd
2+
和hg
2+
的同时检测，具有制备简单、便携、快速等优点。
49.三、本发明为高灵敏度、高特异性、同时检测多种重金属电化学生物传感器的制备提供新的方法，且制备方法新颖，制备过程简单，可应用于食品检测行业，例如可以快速检测茶叶和蔬菜样品中重金属的cd
2+
和hg
2+
含量，具有重要的实际应用价值。
附图说明
50.图1为本发明中同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器的制备原理示意图。
51.图2为实施例1中多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物的透射电镜图。
52.图3为实施例1中不同浓度多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰丝网印刷电极的循环伏安图。
53.图4为实施例1中不同浓度多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰丝网印刷电极的阻抗图。
54.图5为实施例1中mb-apt修饰电极的计时库伦图。
55.图6为实施例1中检测cd
2+
的dpv图。
56.图7为实施例1中检测cd
2+
的标准曲线拟合图。
57.图8为实施例1中检测hg
2+
的dpv图。
58.图9为实施例1中检测hg
2+
的标准曲线拟合图。
具体实施方式
59.以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
60.如图1所示，本发明中同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器的制备方法包括如下步骤：
61.(1)检测过程中的生化反应主要在丝网印刷电极上进行，电极以在pet为衬底，通过丝网印刷技术在基底上固定工作电极、对电极和参比电极；其中工作电极和对电极由石墨和聚丙烯酸衍生物组成，参比电极由银/氯化银浆料组成；
62.(2)聚乙烯亚胺辅助溶解和还原制备多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物；
63.(3)多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰丝网印刷电极以提高电导率和比表面积；
64.(4)亚甲基蓝标记的cd
2+
mb-apt一端的巯基与电极表面的金纳米粒子通过金硫键进行共价偶联，得到mb-apt修饰电极；
65.(5)待测物和ssdna同时滴加至mb-apt修饰电极上，然后在ssdna富c序列端原位生成银纳米团簇，测定mb和银纳米团簇的电化学信号分别实现对cd
2+
和hg
2+
的检测。
66.实施例1：
67.本实施例利用同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器检测茶叶中cd
2+
和hg
2+
的过程包括如下步骤：
68.(1)制备多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物：
69.将多壁碳纳米管和聚乙烯亚胺按1:20的质量比分散在水溶液中，超声处理30min后得到多壁碳纳米管分散液；将氯金酸按与多壁碳纳米管质量比为10:1的比例加入体系中，在70℃条件下水浴加热120min，聚乙烯亚胺辅助将氯金酸还原成金纳米粒子，然后冷却至室温，离心(8000rpm，15min)洗涤三次，除去上清液浓缩至2mg/ml，避光低温保存。
70.(2)制备多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰的丝网印刷电极：
71.电极以在pet为衬底，通过丝网印刷技术在基底上固定工作电极、对电极和参比电极，其工作电极直径为3.5毫米。将制备的多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物稀释至50ng/ml，取10μl滴加至电极上，完全覆盖工作电极，于40℃下烘干后得到多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰的电极。
72.(3)制备mb-apt标记的电极：
73.在多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰的工作电极上滴加10μl mb-apt(1μm)，于25℃下孵育40min后，用磷酸盐缓冲液冲洗除去未偶联的mb-apt，然后将电极浸入2mm巯基己醇溶液中浸泡60min以封闭非特异性结合位点，然后用磷酸盐缓冲液冲洗晾干，得到mb-apt修饰电极，低温避光保存。
74.(4)拟合cd
2+
和hg
2+
标准曲线：
75.将cd
2+
和hg
2+
标准品(1mg/ml)用超纯水稀释至不同浓度(cd
2+
溶液的浓度为0ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和200ng/ml；hg
2+
溶液的浓度为0ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml)，将5μl不同浓度的待测液和5μl ssdna(0.8μm)依次滴加到电化学适配体传感器上，室温下孵育30min后用磷酸盐缓冲液洗涤，然后加入5μl agno3(5mm)，避光孵育后加入5μl nabh4(20mm)避光反应60min，原位生成银纳米团簇。反应结束后电极用磷酸盐缓冲液冲洗，检测mb和银纳米团簇的电化学dpv信号i
mb
和i
agncs
，通过dpv峰强度值进行标准曲线的拟合。
76.(5)检测茶叶中cd
2+
和hg
2+
的含量：
77.在0.5g粉碎的绿茶茶叶粉末中加入3ml硝酸和1ml过氧化氢(30％)，然后于石墨消解炉中加热到120℃消解90min。消解完成后，用水定容至25ml，过滤除杂后作为检测所需溶液，滴加至构建的电化学适配体传感器上，按照上述步骤反应并检测电化学信号，根据标准曲线计算绿茶茶叶中cd
2+
和hg
2+
的含量。
78.从图2可以看出，本实施例中多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物可成功合成，其中
多壁碳纳米管的直径约为10nm，金纳米粒子与多壁碳纳米管表面紧密结合，这是由于聚乙烯亚胺的高氨基密度和支链结构使其可以作为原位合成金纳米粒子的引物和还原剂。
79.从图3和4可以看出，未修饰的丝网印刷电极具有一对明确的可逆氧化还原峰，分别属于fe(cn)
63-和fe(cn)
64-的氧化和还原，氧化峰随着纳米粒子浓度的增加而增加，当达到50ng/ml时趋于平稳，未修饰的丝网印刷电极电荷转移电阻(rct)值为1669ω，当纳米材料浓度大于20ng/ml时，rct值小于400ω。这是由于多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物的高电子导电性，fe
3+
/fe
2+
的电子转移显著加速。
80.从图5可以看出，mb-apt修饰后的计时库伦图发生了显著变化，证明mb-apt成功地偶联到了电极表面。
81.从图6和7可以看出，在cd
2+
浓度从0ng/ml增加至200ng/ml时，mb的dpv特征峰由弱变强，拟合所得的线性范围为0.1-200ng/ml，检出限为94.01pg/ml。
82.从图8和9可以看出，在hg
2+
浓度从0ng/ml增加至20ng/ml时，银纳米团簇的dpv特征峰由弱变强，拟合所得的线性范围为0.05-20ng/ml，检出限为15.74pg/ml。
83.实施例2：
84.本实施例利用同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器检测茶叶中cd
2+
和hg
2+
的过程包括如下步骤：
85.(1)制备多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物：
86.将多壁碳纳米管和聚乙烯亚胺按1:22的质量比分散在水溶液中，超声处理20min后得到多壁碳纳米管分散液；将氯金酸按与多壁碳纳米管质量比为15:1的比例加入体系中，在60℃条件下水浴加热100min，聚乙烯亚胺辅助将氯金酸还原成金纳米粒子，然后冷却至室温，离心(9000rpm，12min)洗涤三次，除去上清液浓缩至1.5mg/ml，避光低温保存。
87.(2)制备多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰的丝网印刷电极：
88.电极以在pet为衬底，通过丝网印刷技术在基底上固定工作电极、对电极和参比电极，其工作电极直径为3.5毫米。将制备的多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物稀释至40ng/ml，取15μl滴加至电极上，完全覆盖工作电极，于35℃下烘干后得到多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰的电极。
89.(3)制备mb-apt标记的电极：
90.在多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰的工作电极上滴加15μl mb-apt(0.8μm)，于20℃下孵育60min后，用磷酸盐缓冲液冲洗除去未偶联的mb-apt，然后将电极浸入1.5mm巯基己醇溶液中浸泡60min以封闭非特异性结合位点，然后用磷酸盐缓冲液冲洗晾干，得到mb-apt修饰电极，低温避光保存。
91.(4)拟合cd
2+
和hg
2+
标准曲线：
92.将cd
2+
和hg
2+
标准品(1mg/ml)用超纯水稀释至不同浓度(cd
2+
溶液的浓度为0ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和200ng/ml；hg
2+
溶液的浓度为0ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml)，将8μl不同浓度的待测液和8μl ssdna(0.5μm)依次滴加到电化学适配体传感器上，室温下孵育40min后用磷酸盐缓冲液洗涤，然后加入8μl agno3(6mm)，避光孵育后加入8μl nabh4(15mm)避光反应40min，原位生成银纳米团簇。反应结束后电极用磷酸盐缓冲液冲洗，检测mb和银纳米团簇的电化学dpv信号i
mb
和i
agncs
，通过dpv峰强度值进行标准曲线的拟
合。
93.(5)检测茶叶中cd
2+
和hg
2+
的含量：
94.在0.5g粉碎的红茶茶叶粉末中加入3ml硝酸和1ml过氧化氢(30％)，然后于石墨消解炉中加热到120℃消解90min。消解完成后，用水定容至25ml，过滤除杂后作为检测所需溶液，滴加至构建的电化学适配体传感器上，按照上述步骤反应并检测电化学信号，根据标准曲线计算红茶茶叶中cd
2+
和hg
2+
的含量。
95.实施例3：
96.本实施例利用同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器检测茶叶中cd
2+
和hg
2+
的过程包括如下步骤：
97.(1)制备多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物：
98.将多壁碳纳米管和聚乙烯亚胺按1:25的质量比分散在水溶液中，超声处理40min后得到多壁碳纳米管分散液；将氯金酸按与多壁碳纳米管质量比为12:1的比例加入体系中，在80℃条件下水浴加热150min，聚乙烯亚胺辅助将氯金酸还原成金纳米粒子，然后冷却至室温，离心(8000rpm，15min)洗涤三次，除去上清液浓缩至1.8mg/ml，避光低温保存。
99.(2)制备多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰的丝网印刷电极：
100.电极以在pet为衬底，通过丝网印刷技术在基底上固定工作电极、对电极和参比电极，其工作电极直径为3.5毫米。将制备的多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物稀释至30ng/ml，取20μl滴加至电极上，完全覆盖工作电极，于50℃下烘干后得到多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰的电极。
101.(3)制备mb-apt标记的电极：
102.在多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰的工作电极上滴加20μl mb-apt(0.8μm)，于30℃下孵育30min后，用磷酸盐缓冲液冲洗除去未偶联的mb-apt，然后将电极浸入1mm巯基己醇溶液中浸泡40min以封闭非特异性结合位点，然后用磷酸盐缓冲液冲洗晾干，得到mb-apt修饰电极，低温避光保存。
103.(4)拟合cd
2+
和hg
2+
标准曲线：
104.将cd
2+
和hg
2+
标准品(1mg/ml)用超纯水稀释至不同浓度(cd
2+
溶液的浓度为0ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和200ng/ml；hg
2+
溶液的浓度为0ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml)，将10μl不同浓度的待测液和10μl ssdna(0.5μm)依次滴加到电化学适配体传感器上，室温下孵育60min后用磷酸盐缓冲液洗涤，然后加入10μl agno3(8mm)，避光孵育后加入10μl nabh4(10mm)避光反应50min，原位生成银纳米团簇。反应结束后电极用磷酸盐缓冲液冲洗，检测mb和银纳米团簇的电化学dpv信号i
mb
和i
agncs
，通过dpv峰强度值进行标准曲线的拟合。
105.(5)检测茶叶中cd
2+
和hg
2+
的含量：
106.在0.5g粉碎的黑茶茶叶粉末中加入3ml硝酸和1ml过氧化氢(30％)，然后于石墨消解炉中加热到120℃消解90min。消解完成后，用水定容至25ml，过滤除杂后作为检测所需溶液，滴加至构建的电化学适配体传感器上，按照上述步骤反应并检测电化学信号，根据标准曲线计算黑茶茶叶中cd
2+
和hg
2+
的含量。
107.实施例4：
108.本实施例利用同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器检测蔬菜中cd
2+
和hg
2+
的过程包括如下步骤：
109.(1)制备多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物：
110.将多壁碳纳米管和聚乙烯亚胺按1:20的质量比分散在水溶液中，超声处理20min后得到多壁碳纳米管分散液；将氯金酸按与多壁碳纳米管质量比为12:1的比例加入体系中，在75℃条件下水浴加热100min，聚乙烯亚胺辅助将氯金酸还原成金纳米粒子，然后冷却至室温，离心(8000rpm，12min)洗涤三次，除去上清液浓缩至2mg/ml，避光低温保存。
111.(2)制备多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰的丝网印刷电极：
112.电极以在pet为衬底，通过丝网印刷技术在基底上固定工作电极、对电极和参比电极，其工作电极直径为3.5毫米。将制备的多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物稀释至50ng/ml，取10μl滴加至电极上，完全覆盖工作电极，于40℃下烘干后得到多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰的电极。
113.(3)制备mb-apt标记的电极：
114.在多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰的工作电极上滴加10μl mb-apt(1.2μm)，于25℃下孵育40min后，用磷酸盐缓冲液冲洗除去未偶联的mb-apt，然后将电极浸入1.8mm巯基己醇溶液中浸泡50min以封闭非特异性结合位点，然后用磷酸盐缓冲液冲洗晾干，得到mb-apt修饰电极，低温避光保存。
115.(4)拟合cd
2+
和hg
2+
标准曲线：
116.将cd
2+
和hg
2+
标准品(1mg/ml)用超纯水稀释至不同浓度(cd
2+
溶液的浓度为0ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和200ng/ml；hg
2+
溶液的浓度为0ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml)，将5μl不同浓度的待测液和5μl ssdna(1μm)依次滴加到电化学适配体传感器上，室温下孵育50min后用磷酸盐缓冲液洗涤，然后加入5μl agno3(7mm)，避光孵育后加入5μl nabh4(20mm)避光反应45min，原位生成银纳米团簇。反应结束后电极用磷酸盐缓冲液冲洗，检测mb和银纳米团簇的电化学dpv信号i
mb
和i
agncs
，通过dpv峰强度值进行标准曲线的拟合。
117.(5)检测蔬菜中cd
2+
和hg
2+
的含量：
118.在0.5g粉碎的上海青中加入3ml硝酸和1ml过氧化氢(30％)，然后于石墨消解炉中加热到120℃消解90min。消解完成后，用水定容至25ml，过滤除杂后作为检测所需溶液，滴加至构建的电化学适配体传感器上，按照上述步骤反应并检测电化学信号，根据标准曲线计算上海青中cd
2+
和hg
2+
的含量。
119.实施例5：
120.本实施例利用同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器检测蔬菜中cd
2+
和hg
2+
的过程包括如下步骤：
121.(1)制备多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物：
122.将多壁碳纳米管和聚乙烯亚胺按1:25的质量比分散在水溶液中，超声处理30min后得到多壁碳纳米管分散液；将氯金酸按与多壁碳纳米管质量比为15:1的比例加入体系中，在65℃条件下水浴加热120min，聚乙烯亚胺辅助将氯金酸还原成金纳米粒子，然后冷却至室温，离心(10000rpm，10min)洗涤三次，除去上清液浓缩至1.5mg/ml，避光低温保存。
123.(2)制备多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰的丝网印刷电极：
124.电极以在pet为衬底，通过丝网印刷技术在基底上固定工作电极、对电极和参比电极，其工作电极直径为3.5毫米。将制备的多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物稀释至20ng/ml，取20μl滴加至电极上，完全覆盖工作电极，于45℃下烘干后得到多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰的电极。
125.(3)制备mb-apt标记的电极：
126.在多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰的工作电极上滴加12μl mb-apt(1μm)，于30℃下孵育30min后，用磷酸盐缓冲液冲洗除去未偶联的mb-apt，然后将电极浸入1.2mm巯基己醇溶液中浸泡45min以封闭非特异性结合位点，然后用磷酸盐缓冲液冲洗晾干，得到mb-apt修饰电极，低温避光保存。
127.(4)拟合cd
2+
和hg
2+
标准曲线：
128.将cd
2+
和hg
2+
标准品(1mg/ml)用超纯水稀释至不同浓度(cd
2+
溶液的浓度为0ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和200ng/ml；hg
2+
溶液的浓度为0ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml)，将8μl不同浓度的待测液和8μl ssdna(0.8μm)依次滴加到电化学适配体传感器上，室温下孵育40min后用磷酸盐缓冲液洗涤，然后加入8μl agno3(5mm)，避光孵育后加入8μl nabh4(15mm)避光反应60min，原位生成银纳米团簇。反应结束后电极用磷酸盐缓冲液冲洗，检测mb和银纳米团簇的电化学dpv信号i
mb
和i
agncs
，通过dpv峰强度值进行标准曲线的拟合。
129.(5)检测蔬菜中cd
2+
和hg
2+
的含量：
130.在0.5g粉碎的上海青中加入3ml硝酸和1ml过氧化氢(30％)，然后于石墨消解炉中加热到120℃消解90min。消解完成后，用水定容至25ml，过滤除杂后作为检测所需溶液，滴加至构建的电化学适配体传感器上，按照上述步骤反应并检测电化学信号，根据标准曲线计算上海青中cd
2+
和hg
2+
的含量。
131.上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)检测过程中生化反应在丝网印刷电极上进行，电极以聚对苯二甲酸乙二醇酯为衬底，通过丝网印刷在基底上固定工作电极、对电极和参比电极，其中所述工作电极和对电极由石墨和聚丙烯酸衍生物组成，所述参比电极由银/氯化银浆料组成；(2)聚乙烯亚胺辅助溶解和还原制备多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物；(3)步骤(2)制得的多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰丝网印刷电极以提高电导率和比表面积，得到多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰电极；(4)亚甲基蓝标记的mb-apt一端的巯基与电极表面的金纳米粒子通过金硫键进行共价偶联，得到mb-apt修饰电极；(5)待测物和ssdna同时滴加至所述mb-apt修饰电极上，然后在ssdna富c序列端原位生成银纳米团簇，测定mb和银纳米团簇的电化学信号分别实现对cd
2+
和hg
2+
的检测。2.根据权利要求1所述同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述丝网印刷电极的工作电极直径为3.5毫米。3.根据权利要求1所述同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物的制备方法包括：多壁碳纳米管和聚乙烯亚胺分散在水溶液中，超声处理，得到多壁碳纳米管分散液；将氯金酸加入体系中，在水浴加热条件下，聚乙烯亚胺辅助将氯金酸还原成金纳米粒子，冷却至室温，离心洗涤，除去上清液，浓缩，避光低温保存；其中：所述多壁碳纳米管和聚乙烯亚胺分散在水溶液中质量比为1:20-25；和/或所述超声处理时间为20-40min；和/或所述氯金酸与多壁碳纳米管的质量比为10-15:1；和/或所述水浴加热温度为60-80℃，加热时间为100-150min；和/或所述离心转速为8000-10000rpm，离心时间为10-15min；和/或所述浓缩后浓度为1.5-2mg/ml。4.根据权利要求1所述同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物修饰电极的制备方法包括：将稀释的多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物滴加至电极上，完全覆盖工作电极，烘干即得；其中：和/或所述多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物在电极上的滴加量为10-20μl；和/或所述多壁碳纳米管和金纳米粒子复合物稀释后浓度为20-50ng/ml；和/或所述烘干温度为30-50℃。5.根据权利要求1所述同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述mb-apt修饰电极的制备方法包括：在工作电极上滴加mb-apt，孵育反应后，用磷酸盐缓冲液冲洗除去未偶联的mb-apt，而后将电极浸入巯基己醇溶液中浸泡以封闭非特异性结合位点，然后用磷酸盐缓冲液冲洗晾干，得到mb-apt修饰电极，低温避光保存；其中：和/或所述mb-apt的浓度为0.8-1.2μm，滴加量为10-20μl；和/或所述mb-apt在电极上的孵育温度为20-30℃，孵育时间为30-60min；
和/或所述巯基己醇溶液浓度为1-2mm，浸泡封闭时间为40-60min。6.根据权利要求1所述同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述cd
2+
和hg
2+
的检测方法包括：待测溶液和ssdna依次滴加至mb-apt修饰电极表面，室温下孵育后用磷酸盐缓冲液洗涤，加入agno3，避光孵育后加入nabh4溶液原位生成银纳米团簇，反应结束后电极用磷酸盐缓冲液冲洗，利用电化学法的dpv测定mb和银纳米团簇的信号分别对应cd
2+
和hg
2+
；其中：和/或所述待测溶液的滴加量为5-10μl；和/或所述ssdna的滴加量为5-10μl，浓度为0.5-1μm；和/或所述待测溶液和ssdna在电极上的孵育时间为30-60min；和/或所述agno3的滴加量为5-10μl，浓度为5-8mm；和/或所述nabh4溶液的滴加量为5-10μl，浓度为10-20mm；和/或所述银纳米团簇原位生成反应时间为30-60min。7.一种同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器，其特征在于，通过权利要求1至6任一项所述同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器的制备方法得到。8.权利要求7所述同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器在检测食品重金属离子cd
2+
和hg
2+
中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，检测茶叶和蔬菜中重金属离子cd
2+
和hg
2+
通过所述同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器实现，包括如下步骤：(a)配制不同浓度梯度的cd
2+
和hg
2+
标准溶液，滴在所述同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器上，测定其电化学特征峰信号强度，拟合标准曲线；(b)将茶叶和蔬菜经前处理，滴加至所述同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器上，根据线性模型测定cd
2+
和hg
2+
的浓度。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤(a)中，cd
2+
和hg
2+
的标准曲线拟合的方法：将cd
2+
和hg
2+
标准品用超纯水稀释至不同浓度，将不同浓度的溶液滴加到所述同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器上，检测mb和银纳米团簇的电化学dpv信号i
mb
和i
agncs
，通过dpv峰强度值进行标准曲线拟合；其中：cd
2+
溶液的不同浓度为0ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和200ng/ml；和/或hg
2+
溶液的不同浓度为0ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml；和/或步骤(b)中，在粉碎的茶叶粉末和蔬菜中加入硝酸和过氧化氢，然后于石墨消解炉中消解；消解完成后，用水定容，过滤除杂后作为检测所需溶液，滴加至所述同时检测cd
2+
和hg
2+
的电化学适配体传感器上，检测电化学信号，根据标准曲线计算茶叶和蔬菜中cd
2+
和hg
2+
的含量。

技术总结
本发明公开了一种同时检测Cd


技术研发人员：魏新林 潘怡 王丽 陈守慧 韦阳
受保护的技术使用者：上海交通大学
技术研发日：2023.07.05
技术公布日：2023/9/22