一种等温聚合酶链反应分析仪校准试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种等温聚合酶链反应分析仪校准试剂盒及其应用。


背景技术：

2.聚合酶链式反应(pcr)，是一种用于扩增特定dna片段的分子生物学技术，通过引物和耐热酶的作用，在变性、退火和延伸步骤中完成扩增过程。相较于传统pcr仪，等温pcr仪不依赖温控精确的热循环仪，以恒定温度进行dna扩增，反应效率高，速度快，极大地满足了社会上对核酸检测的个性化需求；因此，不同类型的等温pcr仪不断涌现，并逐步推向市场。等温pcr仪将核酸检测的门槛大大降低，使核酸检测可以脱离专门的pcr实验室，并应用于更多的测试场景。因此，针对自动化、简单化、应用场景各异的等温pcr仪开展校准技术研究可以满足社会上等温pcr仪校准的极大需求，有效保障基于等温pcr检测的非洲猪瘟、禽流感疫情等检测结果准确有效的技术保障，社会经济效益显著。
3.虽然等温pcr仪的校准需求快速增加，但与等温pcr仪匹配的校准技术及标准试剂盒缺乏，校准程序缺失，严重阻碍了校准工作的开展。目前实时荧光定量pcr仪的校准方法和校准试剂盒不能用于等温pcr仪的校准，主要存在以下几个问题：(1)引物探针体系不适用，等温pcr仪校准需要专门设计；(2)扩增酶反应体系不适用，需要专门的适合等温扩增的酶反应体系；(3)校准项目不同，等温pcr反应恒温进行，不存在变温过程。
4.针对等温pcr仪的校准过程包括两部分：一种是对等温pcr仪的温场性能进行校准，涉及到温度的准确性、温度的均匀性等指标；另外一种是采用校准试剂对设备的光学性能、重复性、灵敏度等参数进行校准，全面评估设备性能。
5.等温pcr仪则无需温度改变，以恒定温度进行dna扩增，反应效率高，速度快，适于现场检测和即时诊断的应用场景。目前常见的等温核酸扩增技术包括：环介导等温扩增技术(lamp)、依赖核酸序列的扩增技术(nasba)、滚环扩增技术(rca)、重组酶聚合酶扩增技术(rpa)等。
6.lamp通过4-6个引物识别目标dna的6-8个区域，使用具有置换活性的dna聚合酶(bstdna聚合酶)在65℃左右进行反应，其中两个引物形成的环结构引发扩增反应。lamp具备扩增效率高、反应时间短等特点，适合现场检测和即时诊断等应用场景。
7.nasba通过一对带有t7启动子序列的引物引导扩增，使用t7 rna聚合酶在41℃左右进行反应。nasba具备特异性强、灵敏度高等特点；但其反应成本较高(需3种酶)，反应成分比较复杂。
8.rca通过一条引物在dna聚合酶的作用下与环状dna模板的链置换合成，实现环状dna模板的等温扩增。rca具备高通量、高灵敏度、高特异性等特点；但其琐式探针合成费用较高，且存在背景干扰问题。
9.rpa通过重组酶将引物结合到双链dna上，重组酶和单链结合蛋白形成d环重组结构，通过链置换dna聚合酶引发扩增，该反应可在37℃左右进行。rpa具备快速检测的特点，
但其难以避免部分非特异性扩增。
10.相较于其它三种等温扩增技术，lamp具备扩增效率高、反应时间短等特点，且市场中绝大多数是基于lamp扩增体系的试剂盒，因此基于lamp体系构建等温pcr仪的校准试剂盒以便形成校准方法迫在眉睫。并且，基于lamp的等温pcr仪校准试剂盒能全面评估等温pcr仪的检测性能，并且经过lamp的等温pcr仪校准试剂盒校准后的等温pcr仪可正常进行其他扩增体系的等温pcr反应。
11.目前对等温pcr仪的校准需求快速增加，但与等温pcr仪匹配的校准技术及标准用试剂盒缺乏，校准程序缺失；因此，建立与等温pcr仪匹配的校准方法，研发出等温pcr仪专用标准试剂盒，具有重要意义；其能有效支撑等温pcr仪性能的计量市场监管，有效保障市场中等温pcr仪的性能参数正常，支撑核酸检测结果准确可靠。


技术实现要素：

12.本发明的目的之一在于提供一种用于等温聚合酶链反应分析仪校准的引物组，所述引物组核苷酸序列如seq id no.1-6所示。
13.本发明的目的之二在于提供一种等温聚合酶链反应分析仪校准试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。
14.优选地，所述试剂盒还包括标准物质、反应缓冲液、聚合酶、染料。
15.更优选地，所述标准物质为质粒dna，梯度浓度水平为10
0-106copies/μl。
16.更优选地，所述质粒为pmd18质粒；质粒中插入的特定序列如seq id no.13所示。
17.seq id no.13：actcttccag ccttccttcc tgggtgagtg gagactgtaatcttggctcac cctcatgagggttacccctcggggctgtgctgtggaagctatctcctgccctcatttccctctcaggcatggagtcctgtggcatccacgtttctaccttcaactccatcatgaagtgtctggtggacatccgcaaagacctgtacgcaacacagtgctgtctccgcgcaccaccatccaaggggtggcattgccgacaggatgcagaaggagatcact gccctggcac ccagcacaatcttgatcttg。
18.更优选地所述反应缓冲液由以下组分组成：20mm tris-hcl、10mm(nh4)2so4、50mm kcl、8mm mgso4、0.1％tween 20、dntps每种1.4mm each；聚合酶为bst dna聚合酶，lamp荧光染料对应的检测通道为green i或fam通道。
19.更优选地，所述试剂盒还包括阴性对照。
20.本发明的目的之三在于提供一种用于等温pcr仪校准的lamp反应体系，所述lamp反应体系为25μl，包括：12.5μl的2
×
反应缓冲液，1μl的bst dna聚合酶，0.5μl的50
×
lamp染料，5pmol的seq id no.1，5pmol的seq id no.2，40pmol的seq id no.3，40pmol的seq id no.4，10pmol的seq id no.5，10pmol的seq id no.6，1μl上述标准物质，再加入超纯水补足至25μl。
21.本发明的目的之四在于提供上述引物组在等温聚合酶链反应分析仪校准中的应用。
22.本发明的目的之五在于提供上述试剂盒在等温聚合酶链反应分析仪校准中的应用。
23.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
24.(1)本发明提供了专属等温pcr仪校准用试剂盒，且适用于所有型号的等温pcr仪；
25.(2)本发明提供了等温pcr仪专属校准技术；
26.(3)本发明等温pcr仪校准用试剂盒和校准技术满足了等温pcr仪校准需求。
附图说明
27.图1为本发明等温pcr校准试剂盒示意图。
28.图2为实施例1中lamp重复实验3组基础引物扩增效果图。
29.图3为实施例2中lamp重复实验引物组扩增效果图。
30.图4为实施例4中不同浓度下lamp扩增效果图。
31.图5为实施例4中lamp反应测量范围图。
32.图6为实施例5中针对等温pcr仪lamp反应测量范围图。
具体实施方式
33.本发明采用环介导等温扩增(lamp)技术，基于primerexplorerv5软件，基于标准物质目标序列的tm值、dg值、gc含量、引物间距离等进行优化后设计基础引物和环引物；然后，将标准物质、扩增引物、扩增试剂和水配置成25μl的lamp反应体系，在65℃下进行等温扩增，在40分钟内获取指数级扩增拐点时间(min)。
34.等温pcr校准试剂盒(图1)的组成包括：
35.表1
[0036][0037][0038]
(1)标准物质:
[0039]
为质粒dna，其特性量值采用数字pcr方法进行了准确定值，浓度水平为(10
0-106)copies/μl，作为标准在校准试剂盒中用于等温pcr仪灵敏度、重复性等参数的校准。
[0040]
扩增引物组：
[0041]
表2
[0042][0043]
(2)反应体系(25μl)：
[0044]
表3
[0045][0046][0047]
(3)反应程序:
[0048]
65℃恒温保持60min。现有技术方案是采用环介导等温扩增(lamp)技术，基于primerexplorer v5软件，根据tm值、dg值、gc含量、引物间距离等进行优化后设计基础引物和环引物；然后，将标准物质、扩增引物、扩增试剂和水配置成25μl的lamp反应体系，在65℃下进行等温扩增，在40分钟内获取指数级扩增拐点时间(min)值。
[0049]
以下所有实施例中使用的pcr仪都为roche罗氏lightcycler 480ⅱ荧光定量pcr仪。
[0050]
实施例1基础引物的设计及优化
[0051]
本发明针对pmd18-t质粒dna序列的特定序列区域设计环介导等温扩增(lamp)体系的引物。采用primerexplorer v5软件设计基础引物(f3、b3、fip、bip)，通过对tm值、dg值、gc含量、引物间距离进行优化后得到基础引物。
[0052]
特定序列如下：
[0053]
seq id no.13：actcttccag ccttccttcc tgggtgagtg gagactgtaatcttggctcac cctcatgagggttacccctcggggctgtgctgtggaagctatctcctgccctcatttccctctcaggcatggagtcctgtggcatccacgtttctaccttcaactccatcatgaagtgtctggtggacatccgcaaagacctgtacgcaacacagtgctgtctccgcgcaccaccatccaaggggtggcattgccgacaggatgcagaaggagatcact gccctggcac ccagcacaatcttgatcttg。
[0054]
以质粒dna为模板，将其拷贝数浓度稀释为102copies/μl，按照表4组成配置反应体系：
[0055]
表4
[0056][0057][0058]
lamp反应的温度循环过程如下表5中所示：
[0059]
表5
[0060]
温度(℃)时间循环数等温扩增651min60
[0061]
lamp扩增时基于roche lightcycler 480ⅱ荧光定量pcr仪实时读数。在基础引物组的反应体系中，模板dna的扩增现象明显。且经过仪器自动读取的指数级扩增拐点时间(min)如下表6-9中所示，扩增结果参见图2：
[0062]
表6
[0063][0064]
基础引物组重复实验，扩增效果如图2所示，重复性良好。
[0065]
表7 1号基础引物组序列
[0066]
引物名序列f3(seqidno.1)ctgggtgaaaggagactgtb3(seqidno.2)agacagggctgtgttggcfip(seqidno.3)tgagagggaaatgatttcaggacatgagggttacccctcggbip(seqidno.4)ggcatggagtcctcacccatcgtacaggtctttgcggatgt
[0067]
表8 2号基础引物组(指数级扩增拐点时间(min)：21.98)
[0068]
引物名序列f3(seqidno.5)atgagggttacccctcggb3(seqidno.6)tgcatcctgtcggcaatgfip(seqidno.7)gccacaggactccatgcctggctgtgctgtggaagctaagbip(seqidno.8)tgaagtgtgacgtggacatccgcagggtacatggtggtgc
[0069]
表9 3号基础引物组(未实现扩增)
[0070][0071][0072]
实施例2环引物的设计及优化
[0073]
本发明针对质粒dna序列的特定序列区域设计环介导等温扩增(lamp)体系的引物。采用primerexplorerv5软件设计基础引物(f3、b3、fip、bip)，通过对tm值、dg值、gc含量、引物间距离进行优化后得到环引物组。
[0074]
pmd18-t质粒；特定序列如下：
[0075]
seq id no.13：actcttccag ccttccttcc tgggtgagtg gagactgtaatcttggctcac cctcatgagggttacccctcggggctgtgctgtggaagctatctcctgccctcatttccctctcaggcatggagtcctgtggcatccacgtttctaccttcaactccatcatgaagtgtctggtggacatccgcaaagacctgtacgcaacacagtgctgtctccgcgcaccaccatccaaggggtggcattgccgacaggatgcagaaggagatcact gccctggcac ccagcacaatcttgatcttg。
[0076]
以质粒dna为模板，将其拷贝数浓度稀释为102copies/μl，按照下表10组成配置反应体系：
[0077]
表10
[0078]
组成工作浓度体积(μl)反应缓冲液1
×
12.5bstdna聚合酶320u/ml1lamp染料1
×
0.5f3200nm1b3200nm1
fip1600nm1bip1600nm1lf400nm0.25lb400nm0.25标准物质/1te0.1/5.5总体系25
[0079]
lamp反应的温度循环过程如下表11中所示：
[0080]
表11
[0081]
温度(℃)时间循环数等温扩增651min60
[0082]
lamp扩增完成后进行读数。在所有包含基础引物和环引物的反应体系中，模板dna的扩增现象明显，且经过仪器自动读取的指数级扩增拐点时间(min)如下表12-15中所示：
[0083]
表12
[0084][0085]
重复实验，扩增效果图如图3所示，重复性效果良好。
[0086]
表13lamp 1-1引物组序列
[0087]
引物名序列f3(seqidno.1)ctgggtgaaaggagactgtb3(seqidno.2)agacagggctgtgttggcfip(seqidno.3)tgagagggaaatgatttcaggacatgagggttacccctcggbip(seqidno.4)ggcatggagtcctcacccatcgtacaggtctttgcggatgtlf(seqidno.14)tagcttaatcaggagagcclb(seqidno.15)accttcttctccatcatgaagtg
[0088]
表141-2引物组(指数级扩增拐点时间(min)：16.87)
[0089]
引物名序列f3(seqidno.1)ctgggtgaaaggagactgtb3(seqidno.2)agacagggctgtgttggcfip(seqidno.3)tgagagggaaatgatttcaggacatgagggttacccctcggbip(seqidno.4)ggcatggagtcctcacccatcgtacaggtctttgcggatgtlf(seqidno.16)ttagcttccacagcacagcclb(seqidno.17)ttcaactccatcatgaagtgtgac
[0090]
表151-3引物组(指数级扩增拐点时间(min)：22.75)
[0091][0092][0093]
实施例3扩增温度的优化
[0094]
本实施例对lamp反应的扩增温度进行优化，设置扩增温度的梯度包括：64℃、65℃、66℃。
[0095]
以质粒dna为模板，将质粒dna拷贝数浓度稀释为102copies/μl，引物使用seq id no.1-6，按照下表16组成配置反应体系：
[0096]
表16
[0097]
组成工作浓度体积(μl)反应缓冲液1
×
12.5bstdna聚合酶320u/ml1lamp染料1
×
0.5f3200nm1b3200nm1fip1600nm1bip1600nm1lf400nm0.25lb400nm0.25标准物质/1te0.1/5.5总体系25
[0098]
lamp反应的温度循环过程如下表17中所示：
[0099]
表17
[0100]
温度(℃)时间循环数等温扩增64/65/661min60
[0101]
lamp扩增完成后进行读数。在64/65/66℃的反应体系中，模板dna的扩增现象明显，且经过仪器自动读取的指数级扩增拐点时间(min)如下表18中所示：
[0102]
表18
[0103]
[0104]
基于此，最终确定反应体系的扩增温度为65℃。
[0105]
实施例4lamp反应测量范围确定
[0106]
以质粒dna为模板，将其拷贝数浓度梯度稀释为100～106copies/μl，引物使用seq id no.1-6，按照下表19组成配置反应体系：
[0107]
表19
[0108]
组成工作浓度体积(μl)反应缓冲液1
×
12.5bstdna聚合酶320u/ml1lamp染料1
×
0.5f3200nm1b3200nm1fip1600nm1bip1600nm1lf400nm0.25lb400nm0.25标准物质/1te0.1/5.5总体系25
[0109]
lamp反应的温度循环过程如下表20中所示：
[0110]
表20
[0111]
温度(℃)时间循环数等温扩增651min60
[0112]
lamp扩增完成进行读数，其扩增效果参见图4，经重复实验后，获得的平均指数级扩增拐点时间(min)(图5)如下表21中所示：
[0113]
表21
[0114][0115]
[0116]
因此，此等温pcr仪校准试剂盒反应测量范围为100～106copies/μl。
[0117]
实施例5等温扩增pcr仪校准实例
[0118]
依据发明的校准试剂盒和校准方法，对等温pcr仪进行了计量校准，校准体系按照下表22组成配置反应体系：
[0119]
表22
[0120]
组成工作浓度体积(μl)反应缓冲液1
×
12.5bstdna聚合酶320u/ml1lamp染料1
×
0.5f3200nm1b3200nm1fip1600nm1bip1600nm1lf400nm0.25lb400nm0.25标准物质/1te0.1/5.5总体系25
[0121]
lamp反应的温度循环过程如下表23中所示：
[0122]
表23
[0123]
温度(℃)时间循环数等温扩增651min60
[0124]
lamp扩增完成进行读数。经重复实验后，获得的平均指数级扩增拐点时间(min)(图6)如下表24中所示：
[0125]
表24
[0126]
dna浓度(copies/μl)指数级扩增拐点时间(min)10312.3210214.3810125.2610040.20
[0127]
校准结果：
[0128]
(1)灵敏度：100copies/μl；(2)测量范围：100copies/μl-103copies/μl；(3)测量重复性。
[0129]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种用于等温聚合酶链反应分析仪校准的引物组，其特征在于，所述引物组核苷酸序列如seq id no.1-6所示。2.一种等温聚合酶链反应分析仪校准试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1中所述的引物组。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准物质、反应缓冲液、聚合酶、染料。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述标准物质为dna质粒，梯度浓度水平为10
0-106copies/μl。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述dna质粒为pmd18质粒；特定序列如seq id no.13所示。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液由以下组分组成：20mm tris-hcl、10mm(nh4)2so4、50mm kcl、8mm mgso4、0.1％tween 20、dntps每种1.4mm each；聚合酶为bst dna聚合酶。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照。8.一种用于等温pcr仪校准的lamp反应体系，其特征在于，所述lamp反应体系为25μl，包括：12.5μl的2
×
反应缓冲液，1μl的bst dna聚合酶，0.5μl的50
×
lamp染料，5pmol的seq id no.1，5pmol的seq id no.2，40pmol的seq id no.3，40pmol的seq id no.4，10pmol的seq id no.5，10pmol的seq id no.6，1μl权利要求5中的标准物质，再加入超纯水补足至25μl。9.权利要求1中所述的引物组在等温聚合酶链反应分析仪校准中的应用。10.权利要求2-7中任一项所述的试剂盒在等温聚合酶链反应分析仪校准中的应用。

技术总结
本发明公开了一种等温聚合酶链反应分析仪校准试剂盒及其应用，属于基因工程技术领域。该试剂盒包括标准物质、扩增引物组、反应缓冲液、聚合酶、染料以及阴性对照；其中所述标准物质为质粒DNA，梯度浓度水平为10


技术研发人员：高运华 陈娴 王迪 费悦 王志栋 吴枭 卢嵩
受保护的技术使用者：中国计量科学研究院
技术研发日：2023.07.05
技术公布日：2023/9/22