陆地棉GhSKS13蛋白在棉花抗病中的应用

陆地棉ghsks13蛋白在棉花抗病中的应用
技术领域：
：1.本发明涉及植物学领域，具体涉及陆地棉ghsks13蛋白在棉花抗病中的应用。
背景技术：
：：2.棉花是世界上重要的经济作物之一，为我们提供了天然纤维原料、油料以及蛋白饲料等。目前，最主要的栽培品种为陆地棉(gossypiumhirsutum)。然而棉花在生产过程中经常遭受各种生物和非生物胁迫，主要由大丽轮枝菌(verticilliumdahliae)引起的棉花黄萎病是制约棉花生产的主要因素之一，严重损害了棉花纤维的产量与品质。挖掘棉花抵御v.dahiliae的抗性相关基因，解析其分子机制并通过基因工程技术培育抗病品种是一种有效控制棉花黄萎病的策略。3.sks(skewed5similar)基因编码蛋白属于多铜氧化酶类(multi-copper-oxidase-like)蛋白家族，最早发现于拟南芥中，其中共19个sks基因，包括sku5基因和18个sku5-like基因。sks蛋白拥有类似于漆酶和l-抗坏血酸氧化酶中的铜氧还蛋白结构域，且在序列上高度近似，但缺乏铜氧化酶特有的几个保守的铜结合基序，因此可能不具有铜氧化酶的功能。目前在水稻、报春花、玉米、烟草等植物中也发现了该类蛋白。研究发现sks蛋白在调控植物生长发育方面扮演重要角色：jacobs等发现拟南芥sks6参与调控子叶叶脉的分布，sks6t-dna插入突变体显著改变了子叶叶脉形状；zhou等研究发现拟南芥sks1，sks2、sks3和sku5蛋白通过控制细胞的极性扩张和细胞壁的合成调节根的发育；另外有研究发现拟南芥sks13通过调控茉莉酸(jasmonicacid)的生物合成和修饰细胞壁调节雌性组织花粉管生长，在sks13突变体中，ja的含量降低，雌蕊的花粉管生长迟缓，角果种子数量减少；duan等发现拟南芥sks11和sks12也在花粉管的完整性、生长和引导中起着重要的作用。近年来研究发现sks基因家族还参与植物抵御生物胁迫过程：chen等发现过表达拟南芥sks13基因可以提高转基因拟南芥对蚜虫(myzuspersicae)的抗性，与野生型相比，转基因株系中病程相关基因的表达水平显著提高。到目前为止，sks基因家族的研究依然较为匮乏，只有少数sks家族成员的功能特征得到了阐明，大多数sks家族成员的功能尚不清楚。技术实现要素：4.本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗病性。5.为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物抗病性中的应用。6.本发明提供的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在下述任一种中的应用：7.1)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物抗病性中的应用；8.2)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在制备调控植物抗病性的产品中的应用；9.3)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在培育抗病性改变的植物中的应用；10.4)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在制备培育抗病性改变的植物的产品中的应用；11.5)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在植物育种中的应用；12.所述蛋白质为如下任一所示蛋白质：13.a1)氨基酸序列为seqidno.2的蛋白质；14.a2)将seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；15.a3)a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；16.a4)a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。17.上述a1)所述蛋白质的名称为sks13。18.为了使a1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。19.上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。20.所述标签蛋白包括但不限于：gst(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、his6标签蛋白(his-tag)、mbp(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、flag标签蛋白、sumo标签蛋白、ha标签蛋白、myc标签蛋白、egfp(增强型绿色荧光蛋白)、ecfp(增强型青色荧光蛋白)、eyfp(增强型黄绿色荧光蛋白)、mcherry(单体红色荧光蛋白)或avitag标签蛋白。21.本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质sks13的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质sks13的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质sks13且具有蛋白质sks13功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。22.上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。23.本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gapexistencecost，perresiduegapcost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。24.本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。25.本文中，所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。26.上述应用中，所述蛋白质来源于陆地棉(gossypiumhirsutum)。27.本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质sks13。28.上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。29.本发明中，所述调控可为上调或增强或提高。所述调控也可为下调或减弱或降低。30.上述应用中，所述调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质可为与前文所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料可为下述任一种：31.c1)编码前文所述蛋白的核酸分子；32.c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；33.c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；34.c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物；35.c5)含有c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2)所述表达盒的转基因植物细胞系；36.c6)含有c1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2)所述表达盒的转基因植物组织；37.c7)含有c1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2)所述表达盒的转基因植物器官；38.e1)抑制或降低或沉默前文所述蛋白编码基因表达的核酸分子；39.e2)含有e1)所述核酸分子的表达盒；40.e3)含有e1)所述核酸分子的重组载体、或含有e2)所述表达盒的重组载体；41.e4)含有e1)所述核酸分子的重组微生物、或含有e2)所述表达盒的重组微生物、或含有e3)所述重组载体的重组微生物；42.e5)含有e1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有e2)所述表达盒的转基因植物细胞系；43.e6)含有e1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有e2)所述表达盒的转基因植物组织；44.e7)含有e1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有e2)所述表达盒的转基因植物器官。45.上述应用中，c1)所述核酸分子可为如下任一所示的dna分子，46.d1)核苷酸序列是seqidno.3所示的dna分子；47.d2)编码区序列是序列表中seqidno.1所示的dna分子；48.d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，来源于棉花且编码前文所述蛋白的dna分子；49.d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码前文所述蛋白的dna分子。50.上述应用中，e1)所述的核酸分子可为核苷酸序列是seqidno.1的第381-612位所示dna分子。51.本文所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如grna、mrna、sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。52.本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、ti质粒或病毒载体。具体可为载体pyl156载体。53.可用现有的植物表达载体构建含有sks13基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂合成酶nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。54.使用sks13基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。55.为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。56.利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的sks13基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得抗病性改变的转基因细胞系及转基因植株。携带sks13基因的表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。57.可选地，e2)所述的表达盒为具有seqidno.1的第381-612位所示dna分子的表达盒，例如所述表达盒序列如seqidno.4所示。58.e2)所述的重组载体可为trv:ghsks13载体。59.重组质粒trv:ghsks13的结构描述如下：为将pyl156载体序列的bamhi和kpni识别位点之间的片段替换为seqidno.4所示dna分子，保持pyl156载体的其它核苷酸不变得到的重组载体。60.本发明还提供了一种提高植物抗病性的方法，所述方法包括步骤m，所述步骤m为增强、提高或上调目的植物中前文所述蛋白的活性和/或含量，或/和，增强、提高或上调前文所述蛋白的编码基因的表达量，来提高植物抗病性。61.本发明还提供了一种降低植物抗病性的方法，所述方法包括步骤p，所述步骤p为抑制或降低或沉默目的植物中前文所述蛋白的活性和/或含量，或/和，抑制或降低或沉默前文所述蛋白的编码基因的表达量，来降低植物抗病性。62.上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质sks13的编码基因的表达量和/或活性可为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中所述蛋白质sks13的编码基因活性下降或失活。63.本发明提供一种培育抗病性降低的植物的方法，包括抑制或降低或沉默目的植物中上述蛋白的编码基因的表达和/或上述蛋白的含量和/或活性，或/和抑制或降低或沉默上述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到抗病性降低的植物。64.在本发明的一个实施方案中，所述培育抗病性降低植物的育种方法包括如下步骤：65.(1)构建抑制或降低或沉默前文所述蛋白质的编码基因的重组表达载体；66.(2)将步骤(1)构建的重组表达载体转入受体植物(如作物或棉花)中，获得抗病性低于所述受体植物的植物。67.本发明中，所述植物育种的目的可包括培育抗病性增加的植物。68.本发明中，所述抗病性可为抗棉花黄萎病害。69.所述棉花黄萎病害由大丽轮枝菌(verticilliumdahliae)引起。70.所述大丽轮枝菌(verticilliumdahliae)可为大丽轮枝菌v991。71.前文所述的蛋白质和/或所述的生物材料也属于本发明要求保护的范围。72.本发明中，所述植物可为如下任一种：73.n1)双子叶植物：74.n2)锦葵目植物；75.n3)锦葵科植物；76.n4)棉属植物；77.n5)棉花。78.上文中，所述棉花可为陆地棉品种tm-1。79.棉花作为重要的经济作物，对棉花sks家族展开研究具有重要的理论和实践价值。本研究通过生物信息学的方法在全基因组水平鉴定陆地棉sks家族成员，对其进化关系，基因结构，染色体位置、共线性关系和理化性质等进行了系统分析，并利用病毒诱导的基因沉默技术(virus-inducedgenesilencing)初步验证了黄萎病抗性相关基因ghsks13的生物学功能，为后续深入研究陆地棉sks基因功能鉴定基础，并为陆地棉抗病育种提供了候选基因。附图说明80.图1为陆地棉sks基因家族在染色体上的分布与共线性。81.图2为陆地棉sks家族蛋白的保守基序(a)和基因结构(b)。82.图3为ghsks13表达模式分析，其中a：ghsks13在陆地棉中不同组织中的相对表达水平；b：v.dahliae处理后ghsks13在陆地棉根系中表达情况。83.图4为ghsks13沉默植株对v.dahliae抗性分析，其中a：农杆菌侵染后14天后沉默植株中ghsks13基因相对表达量；b-f：v.dahliae处理21天后trv:00植株和trv:ghsks13植株发病表型、发病指数统计、茎段切片、相对真菌生物量、病程相关基因表达情况。**：p《0.01；***：p《0.001。84.图5为v.dahliae处理6h后trv:00和trv:ghsks13植株叶片中ros检测。具体实施方式85.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本
技术领域：
：普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。86.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。87.以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。88.下述实施例中的陆地棉品种tm-1由中国农业科学院棉花所提供，已记载于：鲁黄钧,马家璋.陆地棉标准系tm—1与二倍体棉杂交研究[j].中国棉花,1990(03):6-7.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。[0089]下述实施例中的强落叶型黄萎病致病菌株大丽轮枝菌v991由中国农业科学院植物保护研究所简桂良研究员提供，已记载于：张昕,简桂良,林玲等.土壤中落叶型棉花黄萎病菌的分子检测方法[j].江苏农业学报,2011,27(05):990-995.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。[0090]下述实施例中的病毒诱导的基因沉默载体pyl156和pyl192由清华大学刘玉乐教授提供，已记载于：liuy,schiffm,marather,dinesh-kumarsp.tobaccorar1,eds1andnpr1/nim1likegenesarerequiredforn-mediatedresistancetotobaccomosaicvirus.plantj.2002may；30(4):415-29.doi:10.1046/j.1365-313x.2002.01297.x.pmid:12028572.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。[0091]实验材料处理步骤：[0092]陆地棉tm-1棉花种子用浓硫酸脱绒处理后，在水中浸泡过夜，转移至培养皿，保持湿润，28℃培养箱避光培养48h-72h，待胚芽萌发至2cm左右时，种植到营养土与蛭石混合物(质量比例为2:1)或者hoagland’s营养液中，然后转移至光照培养箱。培养条件：光照16h/黑暗8h，相对湿度60％，温度25℃。[0093]取出-80℃保存的大丽轮枝菌v991，涂布到pda平板上，28℃生化培养箱，避光培养5d-7d，挑取萌发的菌丝到察氏培养基中，28℃，避光振荡培养5d左右，用4-6层纱布过滤菌液，血球计数板计数后用蒸馏水将孢子液浓度稀释至1×106个/ml。[0094]挑取长势一致的两叶一心期水培tm-1棉苗，在稀释好的大丽轮枝菌孢子液(浓度稀释至1×106个/ml)中浸泡50min，然后放回营养液中，以水处理为对照，分别在处理后0h、1h、3h、6h、12h取根部样品，液氮速冻后置于-80℃备用。[0095]实施例1、陆地棉sks13蛋白的生物信息学分析挖掘[0096]1、陆地棉sks基因家族成员鉴定和系统发育分析[0097]为鉴定棉花sks基因家族成员，从cottonfgd(http://www.cottonfgd.org/)网站下载了四个棉花品种g.raimondii(jgi)、g.arboreum(cri)、g.hirsutum(cri)和g.barbadense(hau)的基因组序列以及相应的gff3格式注释文件，利用软件tbtools(https://github.com/cj-chen/tbtools)工具转化为蛋白质序列文件。从tair(http://www.arabidopsis.org)网站中搜索获得拟南芥中19个sks基因家族的蛋白序列。通过ncbi的blast+工具包(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/latest/)对四种棉花的蛋白序列进行本地blastp搜索，e值临界值设置为1.0×e-5，得到预测的棉花的sks蛋白。然后通过blastp把这些蛋白与拟南芥的蛋白组比较，只保留最相似序列为19种拟南芥sks蛋白的结果。为了进一步验证这些蛋白，在pfam数据库中进行结构域验证，只保留包含三个铜氧还蛋白结构域(cu-oxidase、cu-oxidase_2、cu-oxidase_3)的蛋白质。[0098]使用软件mega11的“alignbymuscle”对齐拟南芥和四种棉花的sks基因序列，然后选择最大似然法(maximunlikelihood，ml)构建进化树，模型选择“jtt+g”模型，并进行1000次bootstrap检验，其他参数均使用默认参数。此外，还在mega11中选择“jtt+g”模型和1000次bootstrap检验的方法构建了另一个邻接(neighbor-joining，nj)树作为对照，以验证ml树的可靠性。[0099]通过查询gff3格式的注释文件，获取陆地棉ghsks基因家族成员在染色体上的位置、基因结构以及染色体上的基因分布密度。使用软件mcscanx分析sks基因间的共线性关系。把48个ghsks基因提交到meme网站(http://meme-suite.org/)来分析保守motif。最后，使用tbtools软件对以上结果进行可视化处理。使用在线工具protparam(https://web.expasy.org/protparam/)预测陆地棉sks蛋白的理化性质。[0100]陆地棉sks家族基因分别分布在19条染色体上，有7条染色体上没有分布该基因。这些sks基因多集中在染色体靠近末端的位置，暗示这些基因在遗传上交换率较高，属于活跃基因家族(图1)。此外，在a08染色体上有sks基因分布，而d08染色体上没有，说明陆地棉基因进化从二倍体棉花获得是不均匀的。使用mcscan软件分析陆地棉sks基因家族的共线性关系，并使用tbtools软件对结果进行可视化处理。结果表明：除了gh_a08g092100外，其他基因均存在明确的共线性关系(图1)。共线性关系可以分为三类(表3)：一类是由于陆地棉的染色体异源多倍化事件造成a、d染色体对应基因之间的全基因组复制(wgd)，共20组复制；二类是染色体上的串联复制，即在染色体上连续的基因间的复制，一共存在3组；三类是其他的复制，包括共25对重复。这些同源基因对的ka/ks值均小于0.5，说明陆地棉sks基因家族在进化过程中存在强烈的纯化选择。[0101]通过gff3注释文件分析陆地棉sks基因结构，结果表明group1、2、4和group5四个组的sks基因通常具有6-8个内含子，但group3的sks基因大多含有2个内含子，内含子最多的两个基因含有4个内含子，有一个基因无内含子(即gh_a13g237600.1)，相比其他组的基因内含子数量明显更少(图2中a)。使用meme在线工具分析48个ghsks基因中保守基序，结果表明陆地棉ghsks基因共包含8个motif，各成员间motif组成基本一致(图2中b)。陆地棉sks基因家族有高度相似的motif表明陆地棉sks基因功能比较保守，成员之间可能存在功能冗余。此外，gh_d05g294500.1拥有重复的基序，且基因结构上也暗示该基因可能是由两个连续的基因拼接形成。[0102]gh_a13g237600.1属于group3成员，基因长度为1918bp，其中cds片段长度为1653bp，不具备内含子，进化分析显示该基因与拟南芥atsks13聚类与同一支，将该基因命名为陆地棉ghsks13。[0103]2、rna提取、反转录和qpcr[0104]取约50-100mg的陆地棉不同组织(两叶一心时期水培陆地棉的根、茎、叶组织)样品，液氮充分研磨后用多糖多酚植物总rna提取试剂盒(擎科，tsp412)提取rna。利用nanodrop2000(thermoscientific)测定rna浓度，然后使用反转录试剂盒(擎科，tsk302s)进行反转录。使用qpcrmix(擎科，tse401)进行qpcr反应。每个样品设置三次技术重复，扩增仪器使用cfx96荧光定量pcr仪(bio-rad)，将实验数据导入excel，使用2-δδct方法计算基因相对表达量[15]。以陆地棉泛素蛋白基因ghubq7为内参，扩增引物见表1。[0105]表1本研究所用引物列表[0106][0107][0108]结果显示：ghsks13在陆地棉根中表达量最高，其次是茎，在叶片中表达量最低，约为根中表达量的1/4(图3中a)。[0109]为探究ghsks13在感染v.dahliae后的表达模式，在0、1、3、6、12h时取接种v.dahliae后的棉花根部样品进行检测，qpcr结果显示：v.dahliae处理后ghsks13表达量呈上升趋势，3h以后表达量显著高于对照组，在6h时表达量达到最高值，约为对照组的2.5倍(图3中b)。上述结果暗示ghsks13可能参与调控棉花抵御v.dahliae入侵。[0110]实施例2、陆地棉ghsks13蛋白的抗病性研究[0111]1、ghsks13目的基因的vigs载体构建[0112]通过vigs技术验证ghsks13的功能。ghsks13基因在陆地棉tm-1编码序列(cds)是seqidno.1，编码氨基酸序列是seqidno.2的ghsks13蛋白。陆地棉tm-1的基因组dna中，编码ghsks13蛋白的基因组序列如序列表的seqidno.3所示。利用在线工具sgnvigstool(https://vigs.solgenomics.net/)选取特异性的ghsks13基因片段，根据ghsks13基因设计扩增引物，引物为如下：v-ghsks13-f：5’‑cctccatggggatccatccacagctttacataggg-3’；v-ghsks13-r：5’‑cgtgagctcggtaccttgtttaaccccaactttac-3’。[0113]通过pcr技术扩增该片段，获得的pcr产物进行测序，pcr产物为序列表中序列1的第381-612位。[0114]通过同源克隆方法将上述pcr片段连接至trv:00(pyl156)载体上获得重组载体trv:ghsks13。[0115]重组质粒trv:ghsks13的结构描述如下：为将pyl156载体序列的bamhi和kpni识别位点之间的片段替换为seqidno.4所示dna分子，保持pyl156载体的其它核苷酸不变得到的重组载体。[0116]将鉴定后的重组质粒trv:ghsks13热击转化法转化农杆菌菌株gv3101，得到含有trv:ghsks13载体质粒的菌液的侵染缓冲液和含trv:ghsks13载体质粒的农杆菌gv3101，命名为根癌农杆菌gv3101/trv:ghsks13。[0117]将trv:00采用热击转化法转化农杆菌菌株gv3101，得到含有trv:00载体质粒的菌液的侵染缓冲液和含trv:00载体质粒的农杆菌gv3101，命名为根癌农杆菌gv3101/trv:00。[0118]将trv:pds(阳性对照)采用热击转化法转化农杆菌菌株gv3101，得到含有trv:pds(阳性对照)载体质粒的菌液的侵染缓冲液和含trv:pds(阳性对照)载体质粒的农杆菌gv3101，命名为根癌农杆菌gv3101/trv:pds(阳性对照)。[0119]将pyl192采用热击转化法转化农杆菌菌株gv3101，得到含有pyl192载体质粒的菌液的侵染缓冲液和含pyl192载体质粒的农杆菌gv3101，命名为根癌农杆菌gv3101/pyl192。[0120]2、ghsks13基因沉默植株的获得[0121]当土培棉花子叶完全展开时，过夜培养农杆菌gv3101/trv:ghsks13、gv3101/trv:00、gv3101/trv:pds(阳性对照)和gv3101/pyl192，离心收集重组农杆菌菌体，用mma缓冲液(10mmmes[ph5.6]，10mmmgcl2，100μmacetosyringone)调整菌液od600至1.2，室温放置3h，然后将农杆菌trv:ghsks13、gv3101/trv:00、gv3101/trv:pds(阳性对照)的菌液分别与含pyl192载体的菌液按1:1比例混合，混匀后注射棉花子叶下表皮，将注射后的棉花幼苗黑暗放置12h后转移至光照培养箱继续培养，获得棉花植株trv:pds、trv:00和trv:ghsks13。当注射上述农杆菌14d时，含有trv:pds棉花植株(阳性对照)表现出明显白化现象，表明vigs系统正常工作。此时，取trv:00和trv:ghsks13第二片真叶检测ghsks13基因的沉默效率。结果显示：相比对照组，trv:ghsks13沉默植株中ghsks13表达量下调约71％(图4中a)。[0122]3、ghsks13基因沉默的转基因棉花植株的抗病性研究[0123]采用蘸根法用v.dahliae孢子液处理trv:00对照植株(简称trv:00)和trv:ghsks13沉默植株(简称trv:ghsks13)，处理完成后将棉苗放回穴盘中继续培养。[0124]利用dab染色方法检测棉花接菌后ros爆发和积累情况：接菌6h后取ghsks13沉默植株与阴性对照植株第二片真叶分别放入适量dab染色液(1mg/ml)中，0.1pa压强，真空泵抽真空15min，然后室温避光染色12h，用蒸馏水冲洗dab染液，将叶片放入95％乙醇中，煮沸祛除叶绿素，更换95％乙醇，重复三次，最后将叶片置于70％甘油中，用体式显微镜拍照。接种v.dahliae21d后观察发病表型、统计发病指数、观察茎段维管束颜色、检测相对真菌生物量以及病程相关基因ghpr1(gh_d12g2819)，ghpr2(gh_d06g2277)，ghpr3(gh_d01g1683)，ghpr5(gh_a05g1689)的表达情况。扩增引物见表1。[0125]黄萎病病级的统计标准为：[0126]1级：植株健康，棉株叶片无明显黄化、萎蔫或叶片发黄面积小于10％；[0127]2级：棉株叶片发黄程度大于10％且小于40％；[0128]3级：棉株叶片发黄程度大于40％且小于70％；[0129]4级：棉株叶片发黄程度大于70％，甚至脱落造成植株死亡。[0130]发病率(％)＝发病株数/调查总株数×100％[0131]病情指数(diseaseindex，di)＝∑(感染植株数量×发病等级)/(总植株数×[0132]4)×100％[0133]接种v.dahliae21d后发现，trv:ghsks13沉默植株表现出严重的叶片发黄、萎蔫症状，而trv:00对照植株发病程度较轻(图4中b)。另外trv:ghsks13沉默植株发病指数高于对照组(图4中c)，茎段颜色观察发现trv:ghsks13沉默植株茎段维管束颜色更深(图4中d)，相对真菌生物量结果与茎段颜色观察结果一致(图4中e)。[0134]检测病程相关基因表达情况发现，接种v.dahlliae后，trv:ghsks13植株中病程相关基因ghpr1、ghpr2、ghpr3、ghpr5表达量均显著低于对照组(图4中f)。上述结果表明沉默ghsks13降低了棉花对v.dahliae的抗性，说明ghsks13是一个正向调控棉花抵御v.dahliae的基因。[0135]经v.dahliae处理6h后，对trv:00对照和trv:ghsks13沉默植株真叶检测ros爆发情况。dab染色结果显示，对照组叶片中褐色沉淀较多，trv:ghsks13沉默植株中褐色沉淀较少(图5)，表明h2o2在两种材料之间发生了显著的变化，说明沉默ghsks13抑制了v.dahliae诱导的ros爆发。[0136]以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在下述任一种中的应用：1)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物抗病性中的应用；2)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在制备调控植物抗病性的产品中的应用；3)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在培育抗病性改变的植物中的应用；4)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在制备培育抗病性改变的植物的产品中的应用；5)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在植物育种中的应用；所述蛋白质为如下任一所示蛋白质：a1)氨基酸序列为seq id no.2的蛋白质；a2)将seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；a3)与a1)-a2)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；a4)在a1)-a3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质来源于棉花。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述任一种：c1)编码权利要求1或2中所述蛋白质的核酸分子；c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物；c5)含有c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2)所述表达盒的转基因植物细胞系；c6)含有c1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2)所述表达盒的转基因植物组织；c7)含有c1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2)所述表达盒的转基因植物器官；e1)抑制或降低或沉默权利要求1或2中所述蛋白的编码基因表达的核酸分子；e2)含有e1)所述核酸分子的表达盒；e3)含有e1)所述核酸分子的重组载体、或含有e2)所述表达盒的重组载体；e4)含有e1)所述核酸分子的重组微生物、或含有e2)所述表达盒的重组微生物、或含有e3)所述重组载体的重组微生物；
e5)含有e1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有e2)所述表达盒的转基因植物细胞系；e6)含有e1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有e2)所述表达盒的转基因植物组织；e7)含有e1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有e2)所述表达盒的转基因植物器官。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：c1)所述核酸分子为如下任一所示的dna分子，d1)核苷酸序列是seq id no.3所示的dna分子；d2)编码区序列是序列表中seq id no.1所示的dna分子；d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白的dna分子；d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的dna分子。5.一种提高植物抗病性的方法，其特征在于：所述方法包括步骤m，所述步骤m为增强、提高或上调目的植物中权利要求1或2中所述蛋白的活性和/或含量，或/和，增强、提高或上调权利要求1或2中所述蛋白的编码基因的表达量，来提高植物抗病性。6.一种降低植物抗病性的方法，其特征在于：所述方法包括步骤p，所述步骤p为抑制或降低或沉默目的植物中权利要求1或2中所述蛋白的活性和/或含量，或/和，抑制或降低或沉默权利要求1或2中所述蛋白的编码基因的表达量，来降低植物抗病性。7.一种培育抗病性降低的植物的育种方法，其特征在于：包括抑制或降低或沉默目的植物中权利要求要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量，和/或，所述蛋白质的活性和/或含量得到抗病性降低的植物，所述抗病性降低的植物的抗病性低于所述受体植物。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)构建抑制或降低或沉默权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的重组表达载体；(2)将步骤(1)构建的重组表达载体转入受体植物(如作物或棉花)中，获得植物抗病性低于所述受体植物的植物。9.权利要求1或2中所述的蛋白质和/或权利要求3或4中所述的生物材料。10.如权利要求1-4中任一权利要求所述的应用，和/或，权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于：所述植物为如下任一种：n1)双子叶植物：n2)锦葵目植物；n3)锦葵科植物；n4)棉属植物；n5)棉花。

技术总结
本发明公开了陆地棉GhSKS13蛋白在棉花抗病中的应用。本发明涉及植物学领域，具体涉及陆地棉GhSKS13蛋白在棉花抗病中的应用。本发明的蛋白质GhSKS13是氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质，是一个正向调控棉花抵御大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)感染的蛋白，可应用于调控植物抗病性，培育抗病性改变的植物，并且在植物育种领域也有广阔的应用前景。并且在植物育种领域也有广阔的应用前景。


技术研发人员：吴家和 贾培 唐叶
受保护的技术使用者：中国科学院微生物研究所
技术研发日：2023.07.06
技术公布日：2023/9/22